Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Visualisera cellulära Gibberellin nivåer med hjälp av NlsGPS1 Förster resonans energi överföring (bandet) Biosensor

Published: January 12, 2019 doi: 10.3791/58739
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Sainsbury Laboratory, University of Cambridge

Summary

Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) är den första Förster resonans energi överföring-baserade biosensor för att mäta de cellulära nivåerna av gibberellin fytohormoner med en spatiotemporal högupplöst. Detta protokoll rapporter om metoden för att visualisera och kvantifiera cellulära gibberellin nivåer med hjälp av genetiskt kodade nlsGPS1 biosensor i Arabidopsis hypocotyls och roten tips.

Abstract

Den phytohormone gibberellin (GA) är en liten, mobila signalmolekyl som spelar en nyckelroll i frögroning, cellulära töjning och utvecklingsmässiga övergångar i växter. Gibberellin Perception Sensor 1 (GPS1) är den första Förster resonans energiöverföringen (bandet)-baserat biosensor som tillåter övervakning av cellulära GA nivåer invivo. Genom att mäta förhållandet fluorescens utsläpp av nukleära lokaliserade-GPS1 (nlsGPS1), är spatiotemporal kartläggning av endogent och exogent medföljande GA lutningar i olika vävnadstyper genomförbar på en cellulär nivå. Detta protokoll ska beskriva hur man bild nlsGPS1 utsläpp nyckeltal i tre exempel experiment: steady state, före och efter exogen gibberellin A4 (GA4) behandlingar, och över en tid-behandlingskur. Vi erbjuder även metoder för att analysera nlsGPS1 utsläpp nyckeltal använder både Fiji och en kommersiell tredimensionell (3-D) Mikrograf visualisering och analys programvara och förklara begränsningar och sannolikt fallgroparna med att använda nlsGPS1 för att kvantifiera gibberellin nivåer.

Introduction

Växt hormoner spelar en grundläggande roll i växternas tillväxt och utveckling. Dessa små, mobila signalmolekyler regleras vanligtvis på flera nivåer, till exempel biosyntes, katabolism och kort - och längre sträckor transport1,2,3,4. Förståelsen av hormon signalvägar och nedströms transkriptionell Svaren har vässat under åren. Men om du vill länka de olika cellulära svar av signalvägar som hormon med föreskrivande ingångarna styra hormon distributioner, kräver vi en spatiotemporal kvantifiering av hormonnivåer på en cellulär nivå. BANDET-baserade biosensorer som kan upptäcka fytohormoner kan avancera forskarnas förmåga att kvantifiera hormonnivåer på en cellulär nivå. BANDET-baserade biosensorer består av en FRET par (givare och acceptor fluorescerande proteiner) kopplad till en sensorisk domän som binder en specifik ligand eller svarar på en biologisk stimulans. För liten molekyl biosensorer utlöser ligand bindande en conformationaländring av den sensoriska domän som resulterar i en förändring av avstånd och/eller orientering mellan de två fluorescerande proteinerna av bandet parar. En proportionerlig analys av en FRET biosensor åstadkoms genom spännande givaren och mäta förhållandet fluorescens utsläpp av acceptor över givare5,6. Ligand bindande är upptäckas som en förändring i detta utsläpp baserat på7.

Vi har nyligen utvecklat en FRET-baserade biosensor för växten hormonet GA. GAs är en klass av hormoner som kan främja frögroning, cellulära töjning och utvecklingsmässiga övergången från vegetativt till blommande faser. Den nlsGPS1 biosensor är kärnvapen lokaliserade och ger spatiotemporal insikter GA dynamics i olika växt vävnader. I Arabidopsis celler, GA binder till lösliga receptorer, gibberellin-okänsliga dvärg (GID), och komplexet inducerar nedbrytning av DELLA proteiner som fungerar som negativa regulatorer av GA signalering2. GA sensoriska domänen för nlsGPS1 består av Arabidopsis GA receptorn (AtGID1C) kopplad till en 74-amino acid trunkering av ett DELLA protein (AtGAI) och en FRET par bestående av förbättrad dimerization varianter av Cerulean som givare fluorescerande protein och Afrodite (ett kodon-diversifierad Venus) som acceptor fluorescerande protein8. Den nlsGPS1 biosensor är en hög affinitet sensor för bioaktiva GA4 (Kd = 24 nM för GA4) och det kan utnyttjas i olika vävnadstyper att kartlägga och kvantifiera GA övertoningar. För att undvika feltolkning av Arabidopsis GA nivåer i vivo, vi har också utvecklat en nonresponsive variant av nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) för att använda som en negativ kontroll. Proteinet nlsGPS1-NR bär mutationer i GA-bindande fickan som stör bindningen av GA och mutationer i proteinet DELLA som stör samspelet med GID receptor protein7,9. Utsläpp baserat på mönster eller förändringar som observerats i både nlsGPS1 och nlsGPS1-NR linjer kan anses artefakter som inte direkt relaterar till GA-bindande händelser. Det är också viktigt att notera att nlsGPS1 bindningen till GA4 inte är snabbt reversibel, och därför cellulära nlsGPS1 utsläpp nyckeltal bör tolkas som representerar den högsta senaste koncentrationen av GA i en viss kärna i stället för i realtid steady-state-nivåer. En analys av fallande GA nivåer är följaktligen inte möjligt med nlsGPS1.

Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att utnyttja en nlsGPS1 biosensor i celler av modell växten Arabidopsis, med confocal imaging-baserade metoder på en högupplöst. Protokollet ger information om imaging växternas rötter och hypocotyls både vid steady state och över tid-kurser. NlsGPS1 sensorn skulle potentiellt kunna utnyttjas i olika vävnadstyper, liksom över växtarter, att kartlägga och kvantifiera GA distributioner.

Protocol

1. förberedelser

  1. Förbereda ½ Murashige och Skoog agar pH 5,7 med ingen sackaros (1 L).
    1. Lös 2,2 g Murashige och Skoog (MS) basala medium i 950 mL av ultrarent vatten. Justera pH till 5,7 med 5 M KOH.
    2. Späd lösningen till en slutlig volym av 1 L med ultrarent vatten. Dela den i två 500 mL flaskor, varje innehållande 1% växt-agar. Autoklav vid 121 ° C i 20 min.
  2. Förbereda ¼ MS vätska vid pH 5,7 med ingen sackaros (1 L).
    1. Lös upp 1,1 g MS i 950 mL av ultrarent vatten. Justera pH till 5,7 med 5 M KOH. Späd lösningen till en slutlig volym av 1 L med ultrarent vatten. Dela den i två 500 mL flaskor. Autoklav vid 121 ° C i 20 min.
  3. Förbereda GA4.
    1. Lös det GA4 i etanol 70% att göra en slutlig koncentration på 100 mM GA4 lager.
    2. För att förbereda fungerande lösning, späd GA4 beståndet till 0,1 – 1 µM i ¼ MS flytande pH 5,7.

2. växternas tillväxt

  1. Sterilisera Arabidopsis frön.
    1. Arbeta med en kemisk huva. Alikvot frön (cirka 200 frön) i 2 mL mikrocentrifugrör. Använd en markör med klor-resistent bläck och placera rören med öppet lock inuti sterilisering fartyget (en stor låda som kan förseglas).
    2. Placera en 250 mL glasbägare innehållande 50 mL av ultrarent vatten och 50 mL natriumhypokloritlösning inuti sterilisering fartyget.
    3. Lägga till 3 mL koncentrerad saltsyra (HCl) i bägaren. Omedelbart försegla fartyget och möjliggöra sterilisering av klorgas för 6 – 16 h.
    4. Efter öppna fartyget, Stäng locken av alla mikrocentrifugrör i utsäde rack. Steriliserade frön kan lagras torrt fram till tidpunkten för plätering.
  2. Så ungefär 20 steriliserad Arabidopsis frön på ½ MS agar fyrkantiga tallrikar. Förslut plattorna med porösa kirurgisk tejp och Linda in dem med aluminiumfolie. Inkubera dem vid 4 ° C i 1 – 3 dagar för stratifiering.
  3. För root imaging, överföra plattorna till tillväxt kammaren i vertikal position i 3 dagar med följande tillväxten villkorar: lång-dag villkor (LD, 16 h ljus/8 h av mörka); 120 µmol⋅m-2s-1 ljusintensitet; temperatur 22 ° C (under ljus cykel) eller 18 ° C (under mörka cykel) 65% relativ luftfuktighet (RH).
  4. För mörka-växt hypocotyl: överföra plattorna till tillväxt kammaren för en ljuspuls på 1 – 4 h att synkronisera grobarhet. Wrap plattorna med aluminiumfolie och placera dem i tillväxt kammaren i vertikal position i 3 dagar.

3. provberedning

  1. Steady-state mätningar (figur 1A)
    1. På ett rent objektglas, tillsätt 50 µL av ¼ MS vätska (som hädanefter kallas mock lösning). Försiktigt överför plantor att uttrycka nlsGPS1 från plattan till bild.
    2. Ta en ren täckglas och spot en droppe av vakuum fett på varje hörn av täckglaset. Placera försiktigt täckglaset över plantorna och tillsätt försiktigt extra håna lösning för att avlägsna eventuella luftbubblor.
  2. GA4 behandling: kemiska exchange experiment (figur 1B).
    1. Innan GA4 , Använd en 20 mL spruta fylld med vakuum fett (bifogas en Pipettera spets) för att rita en rektangel (längd: 3,5 cm, höjd: 2,5 cm) med en enhetlig lager vakuum fett på ett rent objektglas (figur 1B). För att möjliggöra en fin linje vakuum fett är kapas Pipettera spetsen för att ha en öppning på 1 mm i diameter.
    2. Tillsätt 50 µL av mock lösning till glas bild. Med ren pincett, plocka nlsGPS1 plantor och försiktigt placera dem på mock lösningen. För att förhindra skador, överföra plantorna genom att stödja undersidan av hjärtbladen utan greppa plantan med tången.
    3. Ta en ren täckglas och spot en droppe av vakuum fett på varje hörn av täckglaset. Använd tången, placera täckglaset i mitten av vakuum fett rektangeln. Nu är täckglaset förseglad på de två sidorna som motsvarar de långa kanterna på vakuum fett rektangeln.
    4. Tillsätt försiktigt extra håna lösning för att fylla reservoaren och avlägsna eventuella luftbubblor i behållaren utan att störa seedling(s) inuti.
    5. Förvärva bilderna innan GA4 behandling med confocal Mikroskop. Följ instruktionerna som beskrivs i avsnitt 4 i detta protokoll.
    6. För GA4 behandling, ta bort confocal scenen på objektglas. Ställa in en timer för 20 min.
    7. Efter starta timern, utbyta buffertlösningen med ¼ MS vätska innehåller 1 µM GA4. Lägg till GA4 lösningen (cirka 50 µL) från vänster sida av täckglaset och ta bort den föregående (mock) lösningen från höger sida. Hålla på att utbyta lösningen att ersätta håna lösningen helt, vilket tar cirka 10 min (figur 1B).
    8. Placera glasskiva tillbaka på Mikroskop scenen. Vänta en annan 10 min innan han efter-GA bilden.
  3. Ställa in en tid naturligtvis för vävnaden av intresse
    Obs: Vävnaden i intresse kan vara, till exempel hypocotyls eller rötter. Vi utför rutinmässigt tidsförlopp för imaging nlsGPS1 biosensor använder kommersiella perfusion (figur 1 c, se Tabell för material) eller en RootChip7,10,11.
    1. Tillsätt 200 µL av mock lösning till mitten av kanalen perfusion av klibbig-bilden (se Tabell för material). Försiktigt plocka nlsGPS1 plantor och placera dem på mock lösningen i den klibbiga-bilden.
    2. Med pincett, försiktigt placera täckglaset och använda baksidan av tången, tryck försiktigt på ytterkanterna av täckglaset så att det bildar ett starkt band med det klibbiga materialet på peripheryen av klibbig-bilden.
    3. Använda två armbågar Luer ansluta kopplingar (med en inre diameter [ID] av 0,8 mm) och silikon slangar (med 0.8 mm ID), klibbig-bilden till en 20 mL spruta och en outlet-behållare som samlar utflöde lösningen. Använda Luer lås kontakten (med 0.8 mm ID) att Anslut sprutan till silikon slangar.
    4. Tryck försiktigt på sprutan som innehåller håna lösningen manuellt för att låta tillräckligt lösning passera kammaren så att det inte finns några luftbubblor kvar i kammaren. Placera och håll sprutan på programmerbara sprutpumpen.
    5. Ange parametrarna pump för sprutan används (i.e., diameter och volym) tillsammans med flödet enligt handboken medföljer pumpen.
      Obs: I detta protokoll, en flödeshastighet 1 – 3 mL/h användes, och detta kan ändras enligt de experimentella krav. Initiera tid kursen genom att starta pumpen.
    6. GA4 behandling under en tid (figur 1 c), stoppa perfusionen genom att pausa pumpen och ändra sprutan med en ny en som innehåller ¼ MS vätska kompletteras med GA4. Fortsätt med confocal imaging som visas i nästa avsnitt.

4. mikroskopi

Obs: Vi utför confocal laser mikroskopi.

  1. Hämta bilder med confocal Mikroskop utrustat med lasrar för att utföra bandet imaging.
    Obs: För nlsGPS1, är varianter av cyan fluorescerande protein (GFP) och gula fluorescerande protein (YFP) avbildade. I detta protokoll används kommersiella Mikroskop (se Tabell för material, som anges som Mikroskop 1 och 2) med 10 x eller 20 x torr 0.70 harmonisk förening planerar APO mål.
  2. För Mikroskop 1, Använd 448 nm och 514 nm våglängd lasrar att excitera GFP och YFP, respektive. Förvärva sekventiella sökningar. Ställ in detektorer (t.ex. HyD SMD) för att upptäcka 460-500 nm för GFP (givare utsläpp) och 525 – 560 nm för YFP (bandet utsläpp) efter excitation av GFP. Använda en andra sekvens, in en detektor för att upptäcka 525 – 560 nm för YFP (YFP utsläpp) efter excitation av YFP.
    Obs: Detta YFP fluorescens används som ett uttryck-kontroll, liksom i segmentera kärnor, för att generera ytor med en kommersiell 3D-Mikrograf visualisering och analysprogramvara.
  3. För Mikroskop 2, Använd 440 nm och 514 nm våglängd laserlinjerna att excitera GFP och YFP, respektive. Förvärva två spår. För spår 1, ställs detektorer (t.ex.., ChS) att upptäcka 464 – 500 nm för GFP (givare utsläpp) och 526 – 562 nm för YFP (bandet utsläpp) efter excitation av GFP. För spår 2, ställa in en detektor för att upptäcka 526 – 562 nm för YFP (YFP utsläpp) efter excitation av YFP.
    Obs: Detta YFP fluorescens används som ett uttryck-kontroll, liksom i segmentera kärnor, för att generera ytor i programvaran för 3D-visualisering och analys.
  4. Skaffa bilder med hjälp av ett format av 512 x 512 pixlar och en upplösning på 12 bitar.
  5. Vinsten måste anpassas till ett empiriskt fastställda värde som möjliggör en bra signal medan inte mättar pixlar. Förstärkningen bör inte ändras mellan den gemensamma fiskeripolitiken och FRET utsläpp över experimentet. Ange pinhole 1 luftiga enhet (AU). Placera den klibbiga IBIDI bilden i skedet av confocal mikroskopet, och fortsätt med imaging som tidigare visat.
  6. I mikroskopet 1 programvara, medan i en aktiv live scan, utnyttja glöd över/under ligger på den övre delen av bilden på skärmen för att fastställa underexponering och mättnad i regionen av intresse. I mikroskopet 2-programvaran Använd Utbud indikatorn ligger på undersidan av bilden på skärmen för att fastställa underexponering och mättnad i regionen av intresse. För någon kvantitativ bildanalys, bör det finnas ingen pixel mättnad.
  7. Ange z-stackarna med steg 1 μm. Stegstorlek kan minskas för en ökad z-upplösning eller ökade för en ökad hastighet av förvärv eller för att öka antalet positioner/prov som kan avbildas. Ställa in tiden tillsammans med z-stackarna (xyzt läge från fliken förvärv läge) för att förvärva bilderna ange tidsintervall för automatiserad tid kursen.

5. bildanalys med Fiji

Obs: Med ImageJ (Fiji) är det möjligt att bearbeta imaging data och producera tvådimensionella (2D) bilder av förhållandet nlsGPS1 utsläpp i Arabidopsis plantor. För exempel på bilder, se figur 2A, 2 C, 2E, 2 Goch 3A. I ImageJ är det möjligt att hitta varje kommando i detta protokoll med hjälp av sökfunktionen. Tryck på mellanslagstangenten och L på tangentbordet. Ett nytt fönster kommer att öppnas; Skriv kommandot krävs i sökfältet.

  1. Dra filen (antingen .lif eller .lsm filer) till Fiji (bild J) och öppna bilderna som hyper-stack.
  2. Från huvudmenyn, Välj bild > Stack > Z project och välj summan skivor för att fånga alla pixlar i stället för bara de ljusaste pixlarna som i Max projektion.
  3. Från huvudmenyn, Välj Process > subtrahera bakgrunden och uppsättning rullande boll radien till 50 pixlar. Avmarkera alla andra alternativ och behandla alla tre bilder. Detta steg tar bort bakgrunden med ”rullande boll” algoritm.
    Obs: 50 pixlar bestämdes empiriskt att inkludera atomkärnor som förgrund.
  4. Från huvudmenyn, Välj bild > färg > Split kanaler. Tre nya fönster öppnas: C1-summan (GFP kanal); C2-summan (Bandet kanal), och C3-summan (YFP kanal).
  5. Välj fönstret C3-summan och, från huvudmenyn, Välj Process > filter > Gaussisk oskärpa och tillämpa en Gaussisk oskärpa 1 för att minska bildbrus.
  6. Från huvudmenyn, Välj bild > Justera > Ljusstyrka/kontrast och välj auto.
  7. Från huvudmenyn, Välj Process > Förbättra kontrast, och ange mättade = 0,35.
  8. Från huvudmenyn, Välj bild > typ > 8-bitars och omvandla stackarna till en 8-bitars bild.
  9. Från huvudmenyn, Välj bild > Justera > Auto-lokala tröskel. I Auto-lokala tröskel, väljer du följande parametrar: Phansalkar metod, radie = 15, parametern 1 = 0, parameter 2 = 0och vita stack. I det här steget, används YFP stackar för att göra en binär mask.
  10. Välj fönstret C2-summan och, från huvudmenyn, Välj Process > filter > Gaussisk oskärpa och tillämpa en Gaussisk oskärpa 1.
  11. Välj fönstret C1-summan och, från huvudmenyn, Välj Process > filter > Gaussisk oskärpa och tillämpa en Gaussisk oskärpa 1.
  12. Om du vill skapa utsläpp baserat på stacken från två kanaler, från huvudmenyn, Välj Process > Bild kalkylator. I det nya fönstret som visas, Välj C2-summan som bild 1, Välj dela som operatör och välj C1 summan som bild 2.
  13. Se till att välja skapa ett nytt fönster och 32-bitars format. Ett nytt fönster visas namngivna Resultatet av C2-summan.
  14. Från huvudmenyn, Välj bild > uppslagstabell > LUT 16_colors.
  15. Från huvudmenyn, Välj Process > Bild kalkylator. I det nya fönstret som visas, Välj Resultatet av C2-summan som bild 1, Välj multiplicera som operatör och välj C3-summan som bild 2. I det här steget multipliceras YFP binära masken med YFP/CFP stacken att visa endast pixlar i YFP kontrollkanalen.
  16. Från huvudmenyn, Välj Process > matematik > dela och ange värdet till 255. I det nya fönstret som öppnas, Välj Ja att analysera alla bilder i bunten. En ny bild visas namngivna Resultatet av resultatet av C2-summan.
  17. Från huvudmenyn, Välj bild > Justera > Ljusstyrka/kontrast och välj Auto.
  18. Från huvudmenyn, Välj Process > Förbättra kontrast, och välj typen mättad = 0,35.
  19. Från huvudmenyn, Välj bild > Justera > Ljusstyrka/kontrast, och ange lägsta och högsta värdena för att fånga GA distribution. Valfritt steg: från huvudmenyn, Välj analysera > verktyg > Kalibrering Bar och Visa LUT-kalibrering bar, och spara Resultatet av resultatet av C2-summan som en TIFF-fil.
  20. För att erhålla värden av utsläppet nyckeltal, från huvudmenyn, Välj analysera > ställa mätning och välj grå medelvärde och Standardavvikelse.
  21. Välj rektangelformen från verktygsfältet och rita en region av intresse (ROI). Från huvudmenyn, Välj analysera > mått. Ett nytt fönster kommer att rapportera medelvärdet från de valda ROI.
  22. Kopiera och klistra in de erhållna värdena i kalkylprogram (t ex Excel eller OriginPro) och antingen ett histogram för en4 före och efter GA behandling experimentera eller ett linjediagram för en dags kurs experimentera.

6. bild analys med hjälp av 3D-visualisering och analysprogramvara

Obs: Fördelen med att använda vald programvara (se Tabell för material) är att segmentera objekt (t.ex. kärnor) och skapa 3D-bilder från en confocal z-stack. För exempel på bilder, se figur 2B, 2D, 2F, 2 Hoch 3B.

  1. Öppna programvaran och importera filen (antingen .lif eller .lsm filer).
  2. Segmentet atomkärnor baserat på YFP utsläpp kontrollkanalen med hjälp av ytor guiden. Segmenterade objekt kallas ”ytor”. Denna segmentering steg möjliggör analys av alla voxlar i en kärna som ett objekt samtidigt som det eliminerar bakgrund från voxlar utanför kärnan.
  3. Ytor guidenange bakgrunden subtraktionen (lokal kontrast) till 3 µm och tröskelvärde till standard. Maskera den gemensamma fiskeripolitiken utsläpp (givare excitation givare utsläpp [DxDm]) och bandet utsläpp (givare excitation acceptor utsläpp [DxAm]) kanaler baserat på de ytor som skapats med kanalen YFP utsläpp (acceptor excitation acceptor utsläpp [AxAm]).
  4. Använda tillägget XT menar intensitet baserat för att beräkna en kvot på givaren excitation acceptor utsläppen dividerat med givare excitation givare utsläpp (DxAm/DxDm) mellan genomsnittliga intensitetsvärdena för de enskilda ytorna i de två kanalerna.
    Obs: Denna förlängning är tillgänglig online för nedladdning.
  5. För att färga de enskilda ytorna med förhållandet nlsGPS1 utsläpp, Välj färgkodning med statistik, som representeras som en färg hjul ikon. Välj menar intensitet baserat som statistik typ.
  6. Exportera nyckeltalen av enskilda värden från tabellen, som finns under ikonen statistik .
  7. Kopiera och klistra in värden i ett kalkylblad och antingen ett histogram för före och efter GA4 behandling experiment eller en linjär graf för gången kursen experiment.

7. statistisk analys

Obs: Se figur 3D för en beeswarm och box plot av nlsGPS1 utsläpp nyckeltal.

  1. Öppna programmet och klistra in förhållandet utsläpp av atomkärnor ytor som Y kolumner.
  2. Välj kolumnerna i intresse och statistik > Statistik Beskrivning > normalitet testa för att veta om proverna är normalfördelade. Köra testet normalitet och ett nytt fönster kommer att öppna och rapportera resultaten.
  3. Om proverna är normalfördelade, använder t-test som statistiska test. Välj statistik > hypotesprövning > två-sampel t-test på rader och kör t-test.
  4. Om proverna inte är normalfördelade, Välj statistik > statistik hypotesprövning > testa två sampel för varians veta om variansen mellan proverna inte är signifikant olika.
  5. Om variansen inte är avsevärt annorlunda, använda den Mann-Whitney U test som statistiska test. Välj statistik > Icke-parametriska Test > Mann-Whitney test och kör testet.
  6. Om variansen är väsentligt annorlunda, använda Kruskal-Wallis ANOVA testa som statistiska test. Välj statistik > Icke-parametriska Test > Kruskal-Wallis ANOVA testa och kör testet.

Representative Results

Med nlsGPS1, är det möjligt att mäta cellulära GA4 nivåer i vävnader mottagliga för fluorescens imaging, inklusive roten tips och mörka odlade hypocotyls (figur 2). I Arabidopsis roten är nlsGPS1 utsläpp baserat på gradient vägledande för låga GA nivåer i zonerna meristematic och division och höga GA i zonen sen töjning (figur 2A och 2B). Däremot observerades inte en utsläpp baserat på lutning i nlsGPS1-NR rötter, vilket tyder på att den endogena GA lutningen inte är en artefakt (figur 2 c och 2D). NlsGPS1 utsläpp baserat på toning bildades också i mörkret-växt hypocotyls, med låga nivåer i hjärtbladen och den apikala krok och höga nivåer i regionen snabbt förlängning basala i hypocotyl (figur 2E och 2F). Däremot observerades en utsläpp baserat på lutning inte i de nlsGPS1-NR hypocotyls (figur 2 g och 2 H). I både Arabidopsis rötter och mörka odlade hypocotyl celler, endogena GA ackumulering korrelerade med cellulära töjning.

Dessutom ackumuleras exogent medföljande GA4 företrädesvis i zonen töjning jämfört med division zonen av Arabidopsis roten (figur 3), vilket indikerar att nlsGPS1 kan användas för att studera endogena och exogena GA mönstring.

Under tiden kursen experiment, nlsGPS1 plantor placerades i klibbig-slide chambers och perfusion med ¼ MS vätska, följt av en behandling med 0.1 µM GA4 i 30 min. Videon visar en snabbare ackumulering av exogena GA4 i töjning rotzonen jämfört med division zonen (Video 1).

Figure 1
Figur 1: provberedning för confocal imaging. Dessa paneler visar en schematisk representation av provberedningen för (A) ett steady state experiment, (B) före och efter exogen GA4 behandlingar, och (C), en behandling tid kursen experiment med klibbig-slides (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: GA övertoningen i Arabidopsis rötter och mörka odlade hypocotyls. Tvådimensionella bilder av (A) nlsGPS1 och (C) nlsGPS1-NR rötter analyserades med hjälp av ImageJ programvara och tredimensionella bilder av (B) nlsGPS1 och (D) nlsGPS1-NR analyserades med hjälp av en kommersiell tredimensionella bild analys programvara. Båda analyserna visade en endogen GA4 gradient i Arabidopsis rötter. Tvådimensionella bilder av (E) nlsGPS1 och (G) nlsGPS1-NR mörka odlade hypocotyl analyserades med hjälp av ImageJ programvara och tredimensionella bilder av (F) nlsGPS1 och (H) nlsGPS1-NR analyserades med hjälp av den kommersiella tredimensionell bild analys programvara. Båda analyserna visade en endogen GA4 gradient i mörkret-växt hypocotyls. LUT baren visar falska färgning av nlsGPS1 utsläpp nyckeltal. YFP bilder redovisas som uttryck kontroller. Hypocotyl bilder förvärvades använder två skede positioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: den exogena GA lutningen i rötter. De första två paneler Visa (A) tvådimensionella och (B) tredimensionella bilder av en nlsGPS1 rot innan och 20 min efter behandling av exogena GA4 (1 µM). YFP bilder redovisas som uttryck kontroller. De sista två paneler Visa (C), medelvärdet och standardavvikelsen och (D) beeswarm och box plot av nlsGPS1 utsläpp nyckeltal för kärnor av zonen töjning (regionen som definieras med en vit ram). I zonen töjning, nlsGPS1 utsläpp förhållandet var signifikant högre efter GA4 behandling (Mann-Whitney U test, *** P-värdet < 0,0001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1
Video 1: Perfusion experiment av nlsGPS1 root med sticky-Skjut. Denna video visar tredimensionella bilder av nlsGPS1 perfusion med ¼ MS vätska och behandlade med 0.1 µM GA4 i 30 min. I kursen tid imaging förvärvades varje 10 min för 3 h med följande intervall: 30 min håna lösning (Rama t = 1, t = 2, t = 3), 30 min GA4 behandling (Rama t = 4, t = 5, t = 6), 2 h av mock så lution (Rama t = 7 till t = 18) lösning. Före förvärvet, var provet perfusion med mock lösning för 2 h. vänligen klicka här att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Discussion

Det bandet-baserade GA biosensor nlsGPS1 ger en kvantitativ metod för att rapportera och mäta GA hormon lutningar i flercelliga växter. BANDET-baserade biosensorer kan kvantifiera dynamics med en förbättrad spatiotemporal upplösning över direkt upptäckt av masspektrometri och indirekt mätning av transkriptionell reportrar eller signalering-nedbrytning-proteinbaserade metoder12, 13. Högupplösta cellular imaging i olika vävnadstyper kan ge meningsfulla insikter i GA biologi och spark nya hypoteser angående reglering och funktion av GA ansamlingar i flercelliga sammanhang. Till exempel, vara bevaka förändringar i den nlsGPS1 biosensor under särskilda GA biosyntetiska, katabola och transport mutanter och under spatiotemporally inducerad störningar, mycket informativ att testa specifikt hur GA övertoningar etableras i roten och adress rot cell Svaren till GA övertoningar. Sensorn kan användas i andra modell och gröda arter för att testa bevarande av de mekanismer som styr kontrollen GA-medierad av frögroning, cellulära töjning och blommande.

De kritiska steg i det bandet-baserad avbildning av den nlsGPS1 biosensor är att 1) pixlar inte bör vara mättad under bandet kvantitativ analys, 2) imaging parametrar såsom ”detektor gain” bör hållas konstant för givare utsläpp (DxDm) och acceptor utsläpp (DxAm) förvärv, 3) kontroll nlsGPS1-NR linjer bör användas för att utesluta artefakter, och 4) prover bör vara beredd att minimera drift och fokal-ändra frågor. Dessutom är de miljöförhållanden som odlas prover viktiga att kontrollera eftersom GA nivåer är känsliga för miljöförhållanden som ljus varaktighet och ljusintensitet14,15,16 ,17. En viktig begränsning av denna typ av analys är att det krävs en hög signal-brus-förhållande för imaging på grund av ökningen av buller inneboende i proportionerlig imaging. Således nlsGPS1 imaging inte kommer vara användbar för vävnader och organ som inte är mottagliga för proportionerlig fluorescensmikroskopi använder cyan och gult fluorescerande proteiner — exempelvis djupare vävnader där fluorescerande proteiner upptäcks dåligt. Däremot, föredras proportionerlig utläsningar ofta över intensiometric avläsning, eftersom intern kontroll är bra att utesluta artefakter som härrör från förändringar i biosensor uttryck, stabilitet, ljusstyrka eller upptäcktsrisken i en viss cell, vävnad , eller villkor. Till exempel GRÄMA biosensor imaging och image analyser har också använts för att studera en mängd ligander i en mängd olika vävnader5,6,18,19,20,. De imaging experiment och image analyser redovisas här kan ändras för att passa nya bildgivande metoder, såsom lätta blad mikroskopi, som kan ge nya insikter i, till exempel djupare rot-vävnadstyper.

Första generationens nlsGPS1 biosensor är en hög affinitet-sensor som ger en högupplöst karta av GA övertoningar som kan även rapportera på intracellulära ökar i GA efter exogen GA behandlingar. En av de nuvarande begränsningarna av nlsGPS1 är att sensorn inte är snabbt reversibel och, således, rapporterar inte på steady state GA nivåer utan sannolikt, på den högsta senaste GA koncentrationen i lösningen av intresse. Exakt omsättningshastigheten för sensorn är också inte kända och detta, i kombination med låg reversibilitet, utgör hinder för detektion av endogena GA depletions som kan hända inom minuter till några timmar i vissa vävnadstyper. Det är också viktigt att notera att nlsGPS1 har en hög affinitet för GA4 (Kd = 24 nM) jämfört med andra GA former (GA3 Kd= 240 nM, GA1Kd = 110 nM) när imaging andra bioaktiva GAs 7. framtida generationer av GA biosensorer kan vara konstruerad att öka reversibilitet bibehållen hög affinitet eller uppvisar olika särdrag för de olika föregångare, bioaktiva, eller catabolite GAs. 

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete har fått finansiering från de Europeiska forskningsrådet (ERC) under EU: s Horizon 2020 forskning och innovation-programmet (grant avtalet n ° 759282).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107735
Gibberellin A4 (GA4) Sigma G7276 dissolve in EtH 70% , and keep at -20 °C
sodium hypochlorite solution (Bleach) Fisher S/5040 HSRA 064
Hydrogen cloride HCl Sigma 31434
Micropore tape 3M 1530-1
ibidi sticky-slide Ibidi 81128 Luer 0.1 for root imaging
ibidi sticky-slide Ibidi 80168 Luer 0.2 for hypocotyl imaging
glass coverslip for sticky slides Ibidi 10812
Elbow Luer Connectors Ibidi 10802
silicone tubing Ibidi 108401
Luer Lock Connector Ibidi 10826
programmable syringe pump World Precision Instruments AL-1000
Vacuum grease Sigma 18405
Murashige and Skoog Basal Salts Duchefa M0221
Agar plant, 1 kg Melford P1001
Microscope slide ground edges, 76 mm x 26 mm, 1.0 mm to 1.2 mm thick Fisher Scientific 12383118
Cover slip No.1 1/2 glass 22 mm x 22 mm Fisher Scientific 12363138
Luer-slip Syringe 20 mL Fisher Scientific 10785126
3M Micropor Surgical Paper Tape Fisher Scientific 12787597
Potassium Hydroxide, 500 g Sigma Aldrich 221473-500G-D
Absolute Ethanol Fisher Scientific 10428671
Forceps Watchmaker 5 StSteel Scientific Laboratory Supplies INS4340
Scissors, 125 mm, stainless steel Fisher Scientific 12338099
Fitting reducer 0.5 to 1.6 Ibidi 10829
Leica SP8 Confocal laser microscope 1
Zeiss LSM 780 Confocal laser microscope 2
Imaris Bitplane 3D visualization and Analysis software
Fiji image analysis software
OriginPro Origin Lab Statistical Analysis Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binenbaum, J., Weinstain, R., Shani, E. Gibberellin Localization and Transport in Plants. Trends in Plant Science. 23 (5), 410-421 (2018).
  2. Sun, T. Gibberellin Metabolism, Perception and Signaling Pathways in Arabidopsis. The Arabidopsis Book. 6, 0103 (2008).
  3. Rieu, I., et al. Genetic Analysis Reveals That C19-GA 2-Oxidation Is a Major Gibberellin Inactivation Pathway in Arabidopsis. The Plant Cell Online. 20 (9), 2420-2436 (2008).
  4. Regnault, T., et al. The gibberellin precursor GA12 acts as a long-distance growth signal in Arabidopsis. Nature Plants. 1, 15073 (2015).
  5. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors. Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 663-706 (2012).
  6. Walia, A., Waadt, R., Jones, A. M. Genetically Encoded Biosensors in Plants: Pathways to Discovery. Annual Review of Plant Biology. 69 (1), 497-524 (2018).
  7. Rizza, A., Walia, A., Lanquar, V., Frommer, W. B., Jones, A. M. In vivo gibberellin gradients visualized in rapidly elongating tissues. Nature Plants. 3 (10), 803-813 (2017).
  8. Rizzo, M. A., Springer, G., Segawa, K., Zipfel, W. R., Piston, D. W. Optimization of pairings and detection conditions for measurement of FRET between cyan and yellow fluorescent proteins. Microscopy and Microanalysis. 12 (3), 238-254 (2006).
  9. Ueguchi-Tanaka, M., et al. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature. 437, 693-698 (2005).
  10. Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. Journal of Visualized Experiments. (65), 34290 (2012).
  11. Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
  12. Brunoud, G., et al. A novel sensor to map auxin response and distribution at high spatio-temporal resolution. Nature. 482, 103-106 (2012).
  13. Wang, N. N., Shin, M. C., Li, N. The GUS reporter-aided analysis of the promoter activities of Arabidopsis ACC synthase genes AtACS4, AtACS5, and AtACS7 induced by hormones and stresses. Journal of Experimental Botany. 56 (413), 909-920 (2005).
  14. Alabadi, D. Gibberellins Repress Photomorphogenesis in Darkness. Plant Physiology. 134 (3), 1050-1057 (2004).
  15. De Lucas, M., et al. A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation. Nature. 451 (7177), 480-484 (2008).
  16. Strasser, B., Sanchez-Lamas, M., Yanovsky, M. J., Casal, J. J., Cerdan, P. D. Arabidopsis thaliana life without phytochromes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (10), 4776-4781 (2010).
  17. Feng, S., et al. Coordinated regulation of Arabidopsis thaliana development by light and gibberellins. Nature. 451, 475-479 (2008).
  18. Choi, W. G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. Plant Journal. 70 (1), 118-128 (2012).
  19. Lanquar, V., et al. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytologist. 202 (1), 198-208 (2014).
  20. Krebs, M., Schumacher, K. Live cell imaging of cytoplasmic and nuclear Ca2+ dynamics in Arabidopsis roots. Cold Spring Harbor. 2013 (8), 776-780 (2013).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 143 växter biokemi Life sciences Life Sciences (allmänt) gibberellin Phytohormone Spatiotemporal växt utveckling Cell tillväxt Biosensor bandet
Visualisera cellulära Gibberellin nivåer med hjälp av NlsGPS1 Förster resonans energi överföring (bandet) Biosensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rizza, A., Walia, A., Tang, B.,… More

Rizza, A., Walia, A., Tang, B., Jones, A. M. Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor. J. Vis. Exp. (143), e58739, doi:10.3791/58739 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter