本方案旨在演示如何结合 体外 将微电极阵列与微流控装置结合，用于研究神经元培养物中的动作电位传递。数据分析，即传播性动作电位的检测与表征，采用一种新型的先进且用户友好的免费计算工具完成。
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本文内容
摘要
摘要
微电极阵列（MEAs）被广泛用于研究神经元功能 体外这些设备能够长期同步进行电生理活动的无创记录和刺激。然而，在试图理解神经回路中的信息传递与信号传播时，每个微电极会同时感知其周围所有来源信号的特性可能成为不利因素。在神经网络中，多个神经元可能被同时激活并产生重叠的动作电位，导致难以区分和追踪信号的传播路径。鉴于这一局限性，我们已建立了一种 体外 专注于评估电生理信号传导的实验装置，能够以高空间和时间分辨率分离并放大轴突信号。通过将微流控装置与多电极阵列（MEA）相连接，可实现神经元培养的区室化，并使轴突与微电极实现良好对齐的精确控制。该装置可在数周时间内以高信噪比记录动作电位的传播过程。结合专用的数据分析算法，可对多种与信号传导相关的特性进行详细量化，包括传播速度、传导失败、放电频率、顺行性动作电位及编码机制等。
本方案演示了如何在基底集成式微电极阵列（MEAs）上构建分区神经元培养系统，如何在此系统中培养神经元，以及如何成功记录、分析和解读此类实验的结果。本文展示了该成熟系统如何简化对神经元间通信及轴突信号传导过程的理解。这些平台为新研究方向奠定了基础 体外 具有可设计和可控神经元网络拓扑结构的模型。这些模型可用于均一神经元培养环境，或共培养体系，例如监测和评估感觉神经元与其他细胞类型之间的通讯。该体系为研究神经发育、神经回路、信息编码、神经退行性变以及神经再生策略提供了非常有价值的实验条件。
引言
理解神经回路中的电通信是揭示正常功能以及制定治疗策略以应对功能障碍的基本步骤。神经元整合、计算并传递沿其细长轴突传播的动作电位（APs）。传统的电生理技术（例如， 膜片钳技术是研究神经元活动的有力手段，但通常仅限于较大的细胞结构，如胞体或树突。成像技术为高空间分辨率研究轴突信号提供了替代方案，但其技术操作难度较高，且难以实现长期测量1在此背景下，微电极阵列（MEAs）与微流控技术的结合可在揭示神经元网络中神经元活动及信号传递的基本特性方面发挥重要作用 体外2,3.
MEA 技术依赖于对神经元培养物的细胞外记录。该电生理学方法的主要优势在于能够以非侵入性方式，在多个位点同时进行长期刺激和记录3。MEA 由嵌入玻璃晶圆基底中的生物相容性高、导电性强且耐腐蚀的微电极构成。它们可与常规细胞培养生物涂层兼容，这些涂层通过促进细胞黏附，显著提高了基底与细胞之间的封接电阻3,4。此外，MEA 在设计上具有高度灵活性，微电极的尺寸、几何形状和密度均可变化。总体而言，MEA 可作为常规细胞培养容器使用，同时具备支持同步活细胞成像与电....
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方案
所有涉及动物的实验操作均依照欧洲联盟（EU）指令2010/63/EU（已通过葡萄牙第113/2013号法令转化为本国法律）的规定进行 法令 113/2013）。实验方案（0421/000/000/2017）已获得葡萄牙动物福利与实验官方机构（Direção-Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV）以及 Hosting Institution 伦理委员会的批准。
1. 培养基及其他溶液的制备
注意：包被液需在使用当天新鲜配制。未使用的包被液和培养基可根据下述说明保存于 -20 °C 或 4 °C。
- 配制 10 mL 的 0.05% (v/v) 聚乙烯亚胺 (PEI) 工作液。
- 通过将纯化的 PEI（参见 材料表）溶解于无菌水中，配制 20 mL 的 0.25% (w/v) PEI 储存液。
- 取 2 mL 的 0.25% (w/v) PEI 储存液，加入 8 mL 无菌蒸馏水中稀释。充分混匀后使用。未用完的溶液可在 4 °C 下保存。
- 配制 1 mL 的 5 µg/mL 层粘连蛋白 (laminin) 溶液。
- 取 5 µL 的 1 mg/mL 层粘连蛋白储存液，加入 995 µL....
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结果
采用此处所述方案，接种在 µEF 上的 E-18 大鼠皮层神经元可在这些培养条件下存活并保持健康超过一个月。培养 3 至 5 天后，皮层神经元即可通过微沟槽生长轴突，延伸至 µEF 的轴突区（图 1）。培养 15 天后，预期在 µEF 上培养的皮层神经元表现出稳定的电活动水平，并沿微沟槽传播动作电位。较老的培养物（>14 DIV）往往以爆发式放电活动为主，类似于传统的 MEA 记录结果18,19。
记录与数据分析
使用 µSpikeHunter 进行原始数据分析（图2
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讨论
本文所示方案介绍了如何组装一个微电场（µEF）系统，该系统由采用标准商用设计的微流控装置和微电极阵列（MEA）组成，以及如何分析所记录的数据。
在设计实验时，研究人员必须考虑到这一点 体外 该模型受限于MEA的固定网格，从而限制了微沟槽的排列方式。特定微流控或MEA设计的选择取决于具体的实验需求，但通常而言，相同的操作步骤适用于不同的µEF构型。
在进行µEF组装之前，一个关键的决策是确定用户是否计划在未来的实验中重复使用已组装的µEF。可通过在两个表面进行氧气等离子体处理，以共价键合的方式将微流控装置与MEA20连接。然而，这种封合方式通常会导致MEA芯片无法用于后续实验，因为拆卸微流控装置会不可逆地损坏钝化层。为避免这一问题，研究团队倾向于重复使用已安装的µEF，尽管可能存在一些缺点（例如，来自先前实验的残留物）。通过严格遵循本方案中所述的从一个实验到下一个实验的操作步骤，可以在不损坏MEA的前提下安全地安装和拆卸微流控装置。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由欧洲区域发展基金（FEDER）通过“竞争力与国际化运营计划”（COMPETE 2020）、葡萄牙2020计划，以及葡萄牙科学技术基金会（FCT）/科学、技术和高等教育部通过项目PTDC/CTM-NAN/3146/2014（POCI-01-0145-FEDER-016623）资助。José C Mateus 获FCT（PD/BD/135491/2018）资助。Paulo Aguiar 获“科学计划”（Programa Ciência）—人力资源潜力运营计划（POPH）—科研岗位促进项目、欧洲社会基金（ESF）和科技教育部（MCTES）以及FCT研究员计划（Investigador FCT）、POPH和欧洲社会基金资助。微流控器件在葡萄牙INESC微系统与纳米技术研究所，在João Pedro Conde和Virginia Chu的指导下制备完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| B-27 添加剂（50X） | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| 支化聚乙烯亚胺（PEI），25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | 使用截留分子量为2.5 kDa的透析膜，在4°C条件下对5 mM HCl溶液（每日更换）透析纯化支化PEI，持续3天。将纯化后的PEI进行冻干处理。 |
| 细胞筛（40 µm） | Falcon | 352340 | |
| 锥形微量离心管（1.5 ml） | VWR | 211-0015 | |
| 一次性尿布，60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| 杜蒙特#5直头镊子 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| 杜蒙特#5/45镊子 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 杜蒙特#7弯头镊子 | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| 热灭活优质胎牛血清 | Biowest | S181BH-500ML | |
| Engelbreth-Holm-Swarm来源层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | 通过将粉末溶解于适量无添加培养基中，配制浓度为1 mg/mL的层粘连蛋白储备液。将层粘连蛋白溶液分装成小份（20 µL），于-20 °C保存，以避免反复冻融。 |
| L-谷氨酰胺 200 mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| 改进型Neubauer计数板（血细胞计数器） | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal 培养基（1X） | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | 用于神经元培养的基础培养基 |
| PDMS微流控装置 | 不适用 | 不适用 | 由两个细胞接种室组成，通过20条微沟槽相互连接，微沟槽尺寸为450 μm长 × 10 μm高 × 14 μm宽，两室之间间隔86 µm（总间距为100 μm）。 |
| 青霉素-链霉素（P/S）溶液（100X） | Biowest | L0022-100 | |
| PES针筒式滤器单元（Ø 30 mm），0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| 聚丙烯锥形管，15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 聚丙烯锥形管，50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 聚苯乙烯一次性移液管，10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 聚苯乙烯一次性移液管，5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 标准再生纤维素膜（2 kDa） | Spectrum labs | 132107 | |
| 标准外科剪刀 | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| 基底集成平面微电极阵列（MEA，256个微电极） | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 包含252个氮化钛（TiN）记录电极和4个内部参考电极，排列成16×16的方形网格。每个记录电极直径为30 µm，电极间距为100 µm。 |
| 鲁尔锁式针筒头，10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| 鲁尔锁式针筒头，50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | 一种含酶活性的粉状清洁剂，用于MEA的清洗 |
| 组织培养皿，35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| 组织培养皿，90 mm | Frilabo | 900095 | |
| 台盼蓝溶液（0.4%） | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 胰蛋白酶（1:250） | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| 乙烯基胶带 471 | 3M | B40071909 |
参考文献
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
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