本方案旨在演示如何结合 体外 将微电极阵列与微流控装置结合，用于研究神经元培养物中的动作电位传递。数据分析，即传播性动作电位的检测与表征，采用一种新型的先进且用户友好的免费计算工具完成。
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摘要
摘要
微电极阵列（MEAs）被广泛用于研究神经元功能 体外这些设备能够长期同步进行电生理活动的无创记录和刺激。然而，在试图理解神经回路中的信息传递与信号传播时，每个微电极会同时感知其周围所有来源信号的特性可能成为不利因素。在神经网络中，多个神经元可能被同时激活并产生重叠的动作电位，导致难以区分和追踪信号的传播路径。鉴于这一局限性，我们已建立了一种 体外 专注于评估电生理信号传导的实验装置，能够以高空间和时间分辨率分离并放大轴突信号。通过将微流控装置与多电极阵列（MEA）相连接，可实现神经元培养的区室化，并使轴突与微电极实现良好对齐的精确控制。该装置可在数周时间内以高信噪比记录动作电位的传播过程。结合专用的数据分析算法，可对多种与信号传导相关的特性进行详细量化，包括传播速度、传导失败、放电频率、顺行性动作电位及编码机制等。
本方案演示了如何在基底集成式微电极阵列（MEAs）上构建分区神经元培养系统，如何在此系统中培养神经元，以及如何成功记录、分析和解读此类实验的结果。本文展示了该成熟系统如何简化对神经元间通信及轴突信号传导过程的理解。这些平台为新研究方向奠定了基础 体外 具有可设计和可控神经元网络拓扑结构的模型。这些模型可用于均一神经元培养环境，或共培养体系，例如监测和评估感觉神经元与其他细胞类型之间的通讯。该体系为研究神经发育、神经回路、信息编码、神经退行性变以及神经再生策略提供了非常有价值的实验条件。
引言
理解神经回路中的电通信是揭示正常功能以及制定治疗策略以应对功能障碍的基本步骤。神经元整合、计算并传递沿其细长轴突传播的动作电位（APs）。传统的电生理技术（例如， 膜片钳技术是研究神经元活动的有力手段，但通常仅限于较大的细胞结构，如胞体或树突。成像技术为高空间分辨率研究轴突信号提供了替代方案，但其技术操作难度较高，且难以实现长期测量1在此背景下，微电极阵列（MEAs）与微流控技术的结合可在揭示神经元网络中神经元活动及信号传递的基本特性方面发挥重要作用 体外2,3.
MEA 技术依赖于对神经元培养物的细胞外记录。该电生理学方法的主要优势在于能够以非侵入性方式，在多个位点同时进行长期刺激和记录3。MEA 由嵌入玻璃晶圆基底中的生物相容性高、导电性强且耐腐蚀的微电极构成。它们可与常规细胞培养生物涂层兼容，这些涂层通过促进细胞黏附，显著提高了基底与细胞之间的封接电阻3,4。此外，MEA 在设计上具有高度灵活性，微电极的尺寸、几何形状和密度均可变化。总体而言，MEA 可作为常规细胞培养容器使用，同时具备支持同步活细胞成像与电生理记录/刺激的优势。
多电极阵列（MEA）技术的应用已促进了对神经网络重要特征的研究5。然而，MEA在研究神经元回路中的通信及动作电位（APs）传播时，其性能受到一些固有特性的限制。MEA能够记录单个细胞甚至轴突等亚细胞结构的信号，但与胞体信号相比，轴突信号的信噪比（SNR）极低6。此外，由于每个微电极会感应其周围所有来源的细胞外场电位，这一特性阻碍了对神经元回路中信号传播路径的追踪。
然而，近期研究表明，通过将微电极排列在轴突可生长的狭窄微通道内，可以获得更佳的记录条件。这种构型显著提高了信噪比（SNR），使得传播中的轴突信号能够被轻松检测到7,8,9,10,11,12,13。将微流控装置与MEA技术相结合的策略，可构建出电学隔离的微环境，有利于放大轴突信号11。此外，在微沟道中设置多个传感微电极，对于检测和表征轴突信号的传播至关重要。
这种具有高度可控神经元网络拓扑结构的体外平台可适用于多种研究问题14。这些平台适用于神经元培养体系，也可进一步拓展用于构建共培养系统，以监测和评估神经元与其他细胞类型之间的相互作用。因此，该体系为开展多种与神经系统相关的研究提供了非常有价值的条件，例如神经发育、神经环路、信息编码、神经退行性变以及神经再生研究。此外，若将其与新兴的人源诱导多能干细胞模型相结合15,16，将有望为影响神经系统的各类人类疾病的潜在治疗策略开辟新的研究途径。
本实验室正在利用微电极与微流控技术（µEF）相结合的平台，研究神经元在细胞和网络水平的活动过程，以及这些过程在神经系统生理与病理状态中的作用。鉴于该平台在神经科学领域的重要价值，本实验方案旨在演示如何在基底集成的微电极阵列（MEAs）上构建分区化的神经元培养体系，如何在此平台上培养神经元，以及如何成功记录、分析并解读此类实验的结果。本方案必将丰富神经元培养的研究工具，推动神经通讯领域的研究进展。
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方案
所有涉及动物的实验操作均依照欧洲联盟（EU）指令2010/63/EU（已通过葡萄牙第113/2013号法令转化为本国法律）的规定进行 法令 113/2013）。实验方案（0421/000/000/2017）已获得葡萄牙动物福利与实验官方机构（Direção-Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV）以及 Hosting Institution 伦理委员会的批准。
1. 培养基及其他溶液的制备
注意：包被液需在使用当天新鲜配制。未使用的包被液和培养基可根据下述说明保存于 -20 °C 或 4 °C。
- 配制 10 mL 的 0.05% (v/v) 聚乙烯亚胺 (PEI) 工作液。
- 通过将纯化的 PEI（参见 材料表）溶解于无菌水中，配制 20 mL 的 0.25% (w/v) PEI 储存液。
- 取 2 mL 的 0.25% (w/v) PEI 储存液，加入 8 mL 无菌蒸馏水中稀释。充分混匀后使用。未用完的溶液可在 4 °C 下保存。
- 配制 1 mL 的 5 µg/mL 层粘连蛋白 (laminin) 溶液。
- 取 5 µL 的 1 mg/mL 层粘连蛋白储存液，加入 995 µL 基础培养基中（参见 材料表）。充分混匀后使用。未用完的溶液可在 -20°C 冻存 1-2 周。
- 配制 1 L 的 HEPES 缓冲 Hank's 平衡盐溶液 (H-HBSS)。
- 将 11.9 g HEPES 粉末溶解于 50 mL 超纯水中，配制成 1 M HEPES 溶液，并调节 pH 至 7.2。
- 在 800 mL 超纯水中溶解 5.33 mM 氯化钾、0.44 mM 一水合磷酸二氢钾、138 mM 氯化钠、0.3 mM 磷酸氢二钠和 5.6 mM 葡萄糖，配制不含钙和镁的 H-HBSS 溶液。
- 加入 15 mL 的 1 M HEPES 溶液（终浓度为 15 mM）。
- 使用 1 N HCl 或 1 N NaOH 将 pH 调节至比目标 pH 7.4 低 0.2-0.3 个单位，然后用超纯水定容至最终体积。
注：过滤过程中 pH 通常会上升。 - 使用孔径为 0.22 µm 的聚醚砜 (PES) 膜过滤除菌。
- 配制 10 mL 含 10% 热灭活胎牛血清 (hiFBS) 的 H-HBSS 溶液。
- 将 1 mL hiFBS 加入 9 mL H-HBSS 中稀释。充分混匀后使用。未用完的溶液可在 4 °C 下保存 3-4 周。
- 配制 5 mL 的 1.5 mg/mL 胰蛋白酶溶液。
- 使用前立即取 7.5 mg 胰蛋白酶溶于 5 mL H-HBSS 中，并通过孔径为 0.22 µm 的 PES 膜过滤除菌。
- 配制 50 mL 添加剂培养基。
- 在 50 mL 锥形管中混合 48.5 mL 基础培养基（参见 材料表）、2% (v/v) B-27 添加剂、0.5 mM L-谷氨酰胺和 1% 青霉素-链霉素溶液（含 10,000 U/mL 青霉素和 10,000 µg/mL 链霉素）。添加剂培养基可在 4 °C 下保存 3-4 周。
2. 微流控与MEA器件的制备
注意：在细胞接种前一天完成步骤 2.1-2.11。
- 使用乙烯基胶带清洁微流控装置，以去除制造残留物和其他碎屑。轻轻将胶带按压在装置表面，确保覆盖装置的所有区域。
- 对MEA进行3分钟的空气等离子体清洗（0.3 mbar），以清洁表面并增强其亲水性。
- 将微流控装置短暂浸入70%乙醇中，随后在超净工作台内自然晾干。
- 将每片MEA置于无菌的90 mm培养皿中，并通过15分钟的紫外光（UV）照射进行灭菌。
- 在MEA中央表面区域加入500 µL的0.05%（v/v）PEI溶液，于37 °C孵育至少1小时，以完成包被。
注意：如其他研究者所述17，与聚赖氨酸包被相比，MEA的PEI包被可减少细胞聚集现象。 - 吸除MEA表面的PEI包被液，并用1 mL无菌蒸馏水清洗MEA 4次。清洗过程中应避免接触MEA表面，以防损坏电极。
- 在超净工作台内的体视显微镜引导下，将MEA芯片居中放置，并向其中央区域加入1 mL无菌水。
- 将微流控装置放置在MEA表面之上。
- 仔细对齐微流控装置的微沟槽与MEA的微电极阵列网格。
- 正确对齐后，小心吸除多余水分，过程中避免触碰MEA或微流控装置。
- 将µEFs在37 °C下孵育过夜，使其干燥并实现完全贴附。为促进贴附，可轻柔地将微流控装置压向MEA。
注意：步骤2.12应在细胞接种当天进行。 - 待µEFs完全干燥后，向微流控孔中加入150 µL浓度为5 µg/mL的层粘连蛋白包被溶液，并在细胞接种前于37 °C孵育至少2小时。
注意：向µEF中加入层粘连蛋白溶液时，应确保溶液充满微沟槽。可使用真空法去除微沟槽中可能存在的气泡。
3. 前额叶皮层解剖
- 准备用于取出胚胎的解剖区域。
- 使用70%乙醇对工作台面和手术器械进行消毒。
注意：尽管该解剖操作并非无菌过程，但消毒有助于降低污染风险。 - 使用一张干净的一次性尿布划定解剖区域，并摆放好用于取出胚胎的手术器械。
- 准备4个直径为90 mm的培养皿，盛满预冷的H-HBSS，并将其放置在靠近解剖区域的冰盘上。
- 使用70%乙醇对工作台面和手术器械进行消毒。
- 通过吸入二氧化碳（CO2）处死一只妊娠18天（E-18）的Wistar大鼠。
- 操作完成后，将动物从CO2舱中取出，并通过第二种安乐死方法（如放血）确认动物死亡。
- 将动物仰卧放置于一次性尿布上，用70%乙醇喷洒下腹部，在镊子和剪刀的协助下，沿皮肤做U形切口以暴露子宫。
- 剪除连接组织，小心地将胚胎从子宫中取出，并放入盛有预冷H-HBSS的培养皿之一中。
- 将每个胚胎从其胚囊中取出，并借助镊子和剪刀将其头部切除。
- 将胚胎的头部转移至第二个盛有预冷H-HBSS的培养皿中。
- 对每个胚胎重复步骤3.6至3.7。
- 解剖前额叶皮层。
- 将一个胚胎的头部转移至第三个培养皿中。
- 使用一对镊子暴露脑组织。
- 将脑组织从颅腔中取出，并用预冷的H-HBSS覆盖。
- 若存在嗅球，则将其去除并丢弃。解剖分离前额叶皮层，并去除脑膜。
- 将前额叶皮层组织碎片转移至第四个盛有预冷H-HBSS的培养皿中。
- 对每个胚胎重复步骤3.9.1至3.9.5。
4. 皮层神经元的分离及在µEF上的培养
注意：以下操作均在层流罩内进行，且在完成15分钟紫外灭菌循环后。工作表面区域以及放置在罩内的所有材料均应事先用70%乙醇消毒。
- 如步骤1.5所述，将先前称重的胰蛋白酶溶解于5 mL H-HBSS中，并过滤溶液。
- 收集先前解剖得到的皮质组织块，总体积为5 mL H-HBSS，转移至无菌的15 mL锥形离心管中。
- 向含有皮质组织碎片的离心管中加入2.3 mL新配制的1.5 mg/mL胰蛋白酶溶液。
- 混匀悬浮液，在37 °C孵育15分钟（每5分钟轻轻振荡一次）。
- 终止组织消化并去除胰蛋白酶。
- 弃去含有胰蛋白酶的上清液，加入5 mL含10% hiFBS的H-HBSS以灭活残留的胰蛋白酶，轻轻振荡。
- 让皮质组织碎片自然沉降，随后弃去上清液。
- 加入5 mL H-HBSS以去除hiFBS残留物，待皮质组织碎片沉降后弃去上清液。
- 用5 mL H-HBSS再次洗涤皮质组织碎片。
- 让皮质组织碎片沉降，弃去上清液，加入5 mL补充神经元培养基。
- 使用5 mL移液管通过缓慢吹打10–15次对皮质组织碎片进行机械解离。如有必要，更换小口径移液管重复操作，直至细胞悬液均匀。
- 通过40 µm细胞筛过滤细胞悬液，去除未完全解离的组织残留。
- 计数活细胞并确定细胞密度。
- 在微量离心管中，向20 µL细胞悬液中加入20 µL 0.4% (w/v) 台盼蓝溶液，充分混匀后取10 µL加入血球计数板（Neubauer计数室）。
- 计数活细胞，并计算活细胞的细胞密度。
- 将细胞密度调整至3.6 × 107 cells/mL（如需要，可离心细胞悬液进行浓缩）。
- 在接种细胞前立即从µEF的所有孔中去除层粘连蛋白包被。向µEF轴突室的每个孔中加入50 µL补充培养基。
- 在µEF胞体室中接种5 µL细胞悬液。于37 °C孵育1小时，使细胞充分贴附于基质表面。
- 轻柔地向µEF的每个孔中加入预热的补充培养基至满。将µEF转移至37 °C、5% CO2的加湿培养箱中。
注意：为避免培养基快速蒸发，可在承载µEF的培养皿内放置一支装有水的开口微量离心管。 - 通过每隔两到三天更换50%的培养基，维持培养至所需时间。
注意：实验结束后，可将µEF浸泡于水中过夜，使微流控装置从MEA上脱离。如有需要，可用镊子轻轻剥离微流控部分。MEA可通过在1% (v/v) 商业酶解清洁剂中过夜孵育进行清洗（参见材料表）。
5. 记录自发性神经元活动
注意：MEA 上的胚胎皮层神经元培养物通常在体外培养 7 天（DIV）后即开始出现自发活动，但需要 2-3 周（14-21 DIV）才能成熟并表现出稳定的活动。何时开始电生理记录应由实验人员根据研究目标自行决定。在本方案中，使用一种商用记录系统（硬件详情见材料表）并结合加热模块，演示了来自 µEF 的神经元活动记录。进行记录时，我们使用了一款免费软件（软件详情见材料表）。
- 开启MEA记录系统和温度控制器，使前置放大器的加热底板达到37 °C。
注意：对于长期记录（>30分钟）应使用可维持CO2环境的系统。 - 将µEF放置在前置放大器（头级）上。
注意：确保MEA芯片与左上角的参考编号正确对齐。我们使用的MEA芯片具有旋转对称性，但此对齐方式可确保电极引脚布局和硬件ID的正确方向。 - 关闭并扣紧前置放大器盖。
- 开始记录时，打开记录软件，设定记录参数及数据流保存路径（详见软件手册中关于如何设置记录方案的说明）。
注意：通常20 kHz的采样率已足以满足大多数应用。若需要更高的时间精度记录动作电位，建议使用更高的采样频率。若仅记录动作电位，可设置300 Hz的高通滤波器，以衰减信号中的低频成分。若同时记录原始信号和滤波信号，将显著增加数据文件大小。原始数据可在后期进行离线滤波处理。为减小数据文件大小，也可限制记录的微电极数量（例如，仅记录微沟槽内的微电极）。 - 点击 Start DAQ 开始数据采集。检查显示界面是否出现连续的活动轨迹，然后开始记录。
注意：对应于微沟槽的微电极通常噪声水平略高。若多个微电极的噪声水平过高（峰峰值幅度 >50 µV）或不稳定，可能是由于污物阻碍了引脚与接触垫的良好连接。该问题通常可通过使用蘸有70%乙醇的棉签轻轻清洁MEA接触垫和前置放大器引脚来解决。 - 在分析软件中打开已记录的文件（参见 材料表），以快速浏览数据。
6. 数据分析
注意：以下步骤展示了如何使用 µSpikeHunter 软件——由 Aguiar 实验室开发的一种计算工具（可通过发送邮件至 pauloaguiar@ineb.up.pt 免费获取）——来分析使用 µEF 记录的数据。该软件提供图形用户界面（图2），用于加载数据、识别传播性尖峰波、确定其传播方向（顺行性或逆行性），并估算传播速度。µSpikeHunter 兼容使用 MEA2100 系列系统获得的记录所生成的 HDF5 文件，这些系统可与 60、120 和 256 电极的多电极阵列（MEA）联合使用。使用多通道记录系统获得的记录可通过免费软件轻松转换为 HDF5 格式（见材料表）。
- 点击 浏览 以选择记录文件。然后，点击文件信息按钮，查看采样率、记录时长以及所记录数据流的列表（例如，原始数据、滤波后数据）。
注意：为获得准确的传播速度估算，建议选择原始数据流进行分析。 - 选择用于分析的微电极（与微沟槽相关的单行或单列），并将脉冲检测阈值（正相或负相）设置为信号噪声标准差（SD）的6倍。点击 读取数据 以应用事件检测器，并获取识别出的传播序列。
注意：若满足条件，检测到的传播序列列表将显示在分析面板中。用户可查看并使用多种分析工具对传播序列进行分析，包括电压轨迹、微电极间互相关、单个序列的传播速度、时空图（kymograph）以及音频回放工具。尽管传播速度估算可针对任意一对微电极进行，或取所有电极对估算值的平均值，但选择距离最远的一对电极时，估算结果更为可靠。 - 对感兴趣的微电极组重复上述步骤。每次点击 保存所有事件，将所有识别出的传播序列中各微电极上的脉冲时间与幅度保存至CSV文件。
- 将CSV文件导入数据分析环境，进一步分析培养物的活动模式（例如，放电频率、脉冲间间隔）。
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结果
采用此处所述方案，接种在 µEF 上的 E-18 大鼠皮层神经元可在这些培养条件下存活并保持健康超过一个月。培养 3 至 5 天后，皮层神经元即可通过微沟槽生长轴突，延伸至 µEF 的轴突区（图 1）。培养 15 天后，预期在 µEF 上培养的皮层神经元表现出稳定的电活动水平，并沿微沟槽传播动作电位。较老的培养物（>14 DIV）往往以爆发式放电活动为主，类似于传统的 MEA 记录结果18,19。
记录与数据分析
使用 µSpikeHunter 进行原始数据分析（图2
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讨论
本文所示方案介绍了如何组装一个微电场（µEF）系统，该系统由采用标准商用设计的微流控装置和微电极阵列（MEA）组成，以及如何分析所记录的数据。
在设计实验时，研究人员必须考虑到这一点 体外 该模型受限于MEA的固定网格，从而限制了微沟槽的排列方式。特定微流控或MEA设计的选择取决于具体的实验需求，但通常而言，相同的操作步骤适用于不同的µEF构型。
在进行µEF组装之前，一个关键的决策是确定用户是否计划在未来的实验中重复使用已组装的µEF。可通过在两个表面进行氧气等离子体处理，以共价键合的方式将微流控装置与MEA20连接。然而，这种封合方式通常会导致MEA芯片无法用于后续实验，因为拆卸微流控装置会不可逆地损坏钝化层。为避免这一问题，研究团队倾向于重复使用已安装的µEF，尽管可能存在一些缺点（例如，来自先前实验的残留物）。通过严格遵循本方案中所述的从一个实验到下一个实验的操作步骤，可以在不损坏MEA的前提下安全地安装和拆卸微流控装置。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由欧洲区域发展基金（FEDER）通过“竞争力与国际化运营计划”（COMPETE 2020）、葡萄牙2020计划，以及葡萄牙科学技术基金会（FCT）/科学、技术和高等教育部通过项目PTDC/CTM-NAN/3146/2014（POCI-01-0145-FEDER-016623）资助。José C Mateus 获FCT（PD/BD/135491/2018）资助。Paulo Aguiar 获“科学计划”（Programa Ciência）—人力资源潜力运营计划（POPH）—科研岗位促进项目、欧洲社会基金（ESF）和科技教育部（MCTES）以及FCT研究员计划（Investigador FCT）、POPH和欧洲社会基金资助。微流控器件在葡萄牙INESC微系统与纳米技术研究所，在João Pedro Conde和Virginia Chu的指导下制备完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| B-27 添加剂（50X） | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| 支化聚乙烯亚胺（PEI），25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | 使用截留分子量为2.5 kDa的透析膜，在4°C条件下对5 mM HCl溶液（每日更换）透析纯化支化PEI，持续3天。将纯化后的PEI进行冻干处理。 |
| 细胞筛（40 µm） | Falcon | 352340 | |
| 锥形微量离心管（1.5 ml） | VWR | 211-0015 | |
| 一次性尿布，60×40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| 杜蒙特#5直头镊子 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| 杜蒙特#5/45镊子 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 杜蒙特#7弯头镊子 | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| 热灭活优质胎牛血清 | Biowest | S181BH-500ML | |
| Engelbreth-Holm-Swarm来源层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | 通过将粉末溶解于适量无添加培养基中，配制浓度为1 mg/mL的层粘连蛋白储备液。将层粘连蛋白溶液分装成小份（20 µL），于-20 °C保存，以避免反复冻融。 |
| L-谷氨酰胺 200 mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| 改进型Neubauer计数板（血细胞计数器） | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal 培养基（1X） | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | 用于神经元培养的基础培养基 |
| PDMS微流控装置 | 不适用 | 不适用 | 由两个细胞接种室组成，通过20条微沟槽相互连接，微沟槽尺寸为450 μm长 × 10 μm高 × 14 μm宽，两室之间间隔86 µm（总间距为100 μm）。 |
| 青霉素-链霉素（P/S）溶液（100X） | Biowest | L0022-100 | |
| PES针筒式滤器单元（Ø 30 mm），0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| 聚丙烯锥形管，15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 聚丙烯锥形管，50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 聚苯乙烯一次性移液管，10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 聚苯乙烯一次性移液管，5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 标准再生纤维素膜（2 kDa） | Spectrum labs | 132107 | |
| 标准外科剪刀 | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| 基底集成平面微电极阵列（MEA，256个微电极） | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 包含252个氮化钛（TiN）记录电极和4个内部参考电极，排列成16×16的方形网格。每个记录电极直径为30 µm，电极间距为100 µm。 |
| 鲁尔锁式针筒头，10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| 鲁尔锁式针筒头，50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | 一种含酶活性的粉状清洁剂，用于MEA的清洗 |
| 组织培养皿，35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| 组织培养皿，90 mm | Frilabo | 900095 | |
| 台盼蓝溶液（0.4%） | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 胰蛋白酶（1:250） | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| 乙烯基胶带 471 | 3M | B40071909 |
参考文献
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