微电极阵列接口微流体研究神经元通信和轴向信号传播

Summary

该协议旨在说明如何将体外微电极阵列与微流体器件结合起来, 研究神经元培养中的动作电位传递。数据分析, 即传播动作电位的检测和表征, 是使用一种新的先进的、但方便用户和免费提供的计算工具进行的。

Abstract

微电极阵列 (mea) 在体外研究神经元功能方面得到了广泛的应用。这些装置允许同时进行非侵入性记录--长期刺激电生理活动。然而, 当试图了解神经元电路中的通信和信号传播时, 来自每个微电极周围所有来源的信号的传感特性可能会变得不利。在神经元网络中, 多个神经元可以同时激活, 并可以产生重叠的动作电位, 使其难以识别和跟踪信号传播。考虑到这一局限性, 我们建立了一个体外设置, 重点评估电生理通信, 它能够分离和放大具有较高空间和时间分辨率的轴突信号。通过微流体器件和多边环境协定的接口, 我们能够通过轴突和微电极的控制对齐来划分神经元培养。这种设置允许在几个星期的时间里记录具有高信噪比的尖峰传播。结合专门的数据分析算法, 详细地量化了通信相关的几个属性, 如传播速度、传导故障、烧成速率、前品位尖峰和编码机制。

该协议演示了如何在底集成的多边环境协定上创建分隔的神经元培养设置, 如何在此设置中培养神经元, 以及如何成功地记录、分析和解释此类实验的结果。在这里, 我们展示了建立的设置如何简化了对神经元通信和轴突信号传播的理解。这些平台为具有工程和可控神经元网络拓扑的新的体外模型铺平了道路。它们可以在同质神经元培养的背景下使用, 也可以与共培养配置一起使用, 例如, 对感觉神经元和其他细胞类型之间的通信进行监测和评估。这种设置提供了非常有趣的条件来研究, 例如, 神经发育, 神经元电路, 信息编码, 神经退行性变和神经再生的方法。

Introduction

了解神经元回路中的电通信是揭示正常功能的一个基本步骤, 也是解决功能障碍的治疗策略的一个基本步骤。神经元集成、计算和中继沿薄轴突传播的动作电位 (ap)。传统的电生理技术 (如膜片钳) 是研究神经元活动的强大技术, 但通常仅限于较大的细胞结构, 如 soma 或树突。成像技术为研究空间分辨率高的轴突信号提供了一种替代方法, 但在技术上很难执行, 也不允许进行长期测量¹。在此背景下, 微电极阵列 (mea) 和微流体技术的结合可以在揭示神经元的基本特性方面做出强有力的贡献, 从而在体外神经元网络中产生活性和信号传输^2,(三)有什么问题吗？

mea 技术依赖于神经元培养的细胞外记录。这种电生理方法的主要优点是能够在多个站点以非侵入性方式支持长期、同时刺激和记录^.mea 由嵌入在玻璃晶片基板中的生物相容性、高导电性和耐腐蚀微电极制成。它们与传统的细胞培养生物涂层兼容, 通过促进细胞粘附, 显著提高了基材和细胞之间的密封电阻^3,4。此外, 它们在设计上用途广泛, 在微电极尺寸、几何形状和密度方面可能有所不同。总体而言, mea 作为常规细胞培养血管发挥作用, 其优点是允许同时进行活体成像和电生理记录/刺激。

mea 技术的应用有助于研究神经网络^的重要特征5。然而, 有一些固有的特点限制了多边环境协定在神经元电路中研究通信和 ap 传播的性能。mea 允许从单个细胞甚至子细胞结构 (如轴突) 进行记录, 但与体细胞信号相比, 轴突信号的信噪比 (snr)^非常低。此外, 从每个微电极周围的所有来源感知细胞外场电位的特性阻碍了在神经元电路中跟踪信号传播。

然而, 最近的研究表明, 通过在狭窄的微通道内排列微电极, 可以使轴突生长到其中, 从而实现更好的记录条件。此配置显著增加了信噪比, 因此可以很容易地检测到传播轴突信号^{的 7、8、9、10、11}、¹²、 ^13岁将微流体器件与 mea 技术结合起来的策略创造了一个适合放大轴突信号^{11 的}电隔离微环境。此外, 沿微槽存在多个传感微电极是检测和表征轴突信号传播的基础。

这种具有高度可控神经元网络拓扑的体外平台可以适应许多研究问题¹⁴。这些平台适合在神经元培养的背景下使用, 但可以扩展到工程共培养配置, 在那里可以监测和评估神经元与其他细胞类型之间的通信。因此, 这种设置提供了非常有趣的条件, 以探索一些与神经元有关的研究, 如神经发育, 神经元电路, 信息编码, 神经退行性变和神经再生。此外, 它与新出现的人类诱导多能干细胞模型 15^、16结合起来, 可以为开发影响神经系统的人类疾病的潜在疗法开辟新的途径。

我们的实验室正在使用这个将微电极与微流体 (μef) 结合起来的平台来了解细胞和网络水平的神经元过程及其在生理和病理神经系统中的含义。鉴于这种平台在神经科学领域的价值, 本协议的目的是演示如何在俯冲集成的多边环境协定上创建条块分割的神经元培养, 如何在此平台上培养神经元, 以及如何成功记录,分析和解释这些实验的结果。该方案必将丰富神经细胞培养研究的实验工具箱。

Protocol

所有涉及动物的程序都是根据欧洲联盟 (欧盟) 第201/63 /eu 号指令进行的 (2013年将其转用于葡萄牙立法)。试验议定书 (0421/000/201入) 得到了葡萄牙动物福利和实验官方管理局 (Direção-Geral de Alimentação e devagaria-dgav) 和东道机构的伦理委员会的批准。

1. 文化媒体的准备和其他解决方案

注: 在使用当天, 请准备好涂层溶液。未使用的涂层解决方案和培养基可存储在-20°c 或 4°c, 详情如下。

1. 制备 0.05% (v/v) 聚 (乙烯胺) (pei) 工作溶液的10毫升。
   1. 在无菌水中溶解纯化的 pei (见材料表), 制备20% 的 pei 库存溶液, 使其达到0.25%。
   2. 在8毫升无菌蒸馏水中稀释2毫升 0.25% (w/v) pei 库存溶液。混合好, 使用好。未使用的溶液可存储在4°c。
2. 制备5μgl 层压蛋白溶液的1毫升。
   1. 在995μl 基部介质中稀释 1 mgml 层压蛋白库存溶液 5μl (见材料表)。混合好, 使用好。未使用的溶液可在-20°C 冻结保存1-2周。
3. 准备1升的 hepes 缓冲汉克的平衡盐溶液 (h-hbss)。
   1. 在超纯水中溶解11.9 克 hepes 粉制备 1m hepes 溶液。调整 ph 值为7.2。
   2. 在800毫升的超纯水中溶解 5.33 mm 氯化钾、0.44 mm 磷酸钾一式辛酸、138 mm 氯化钠、0.3 mm 磷酸钠二基和 5.6 mm 葡萄糖, 制备 h-hbss 溶液 (不含钙和镁)。
   3. 加入15毫升 hpes 溶液15毫升 (最终浓度为 15 mm)。
   4. 使用 1 n hcl 或 1 n naoh 将 ph 值调整到低于所需 ph 7.4 的0.2-0.3 单位。加入超纯水, 以弥补最终的溶液体积。
      注意在过滤过程中 ph 值会上升。
   5. 使用0.22μm 孔隙率聚聚 (醚磺酸) (pes) 膜过滤消毒。
4. 制备含有10% 热灭活胎儿牛血清 (hfbs) 的 h-hbss 10 毫升。
   1. 在 h-hbss 9 毫升中稀释1毫升的 hfbs。混合好, 使用好。未使用的溶液可在4°c 下储存3-4周。
5. 制备 1.5 mg/ml 胰蛋白酶溶液的5毫升。
   1. 在使用前, 在5-hbss 中溶解7.5 毫克的胰蛋白酶。使用0.22μm 孔隙率 pes 膜过滤消毒。
6. 制备50毫升的补充介质。
   1. 在一个50毫升锥形管中, 混合48.5 毫升的基部培养基 (见材料表)、2% (v/v) b-27 补充剂、0.5万 mL l-谷氨酰胺和 1% penicillin strep (10, 000 u/ml 青霉素和 10, 000μgml 链霉素)。补充介质可在4°c 下储存3-4周。

2. 微流体和 mea 器件制备

注: 在细胞播种前一天执行步骤 2.1-2.11。

1. 清洁微流体设备, 使用乙烯基胶带去除制造和其他碎片。轻轻地将磁带按在设备上, 以到达设备的所有区域。
2. 空气等离子体清洗 mea 3分钟 (0.3 毫巴), 以清洁表面, 使其更具亲水性。
3. 将微流体装置短暂浸入70% 乙醇中, 使其在层流罩内风干。
4. 将每个 mea 放入无菌的90毫米 petri 培养皿中, 并通过15分钟的紫外线 (uv) 光照射对其进行灭菌。
5. 在37°c 条件下, 用 500μl 0.05% (v/v) 的 pei 溶液孵育 mea 中心表面积, 以至少1小时的速度涂上。
   注: 如其他17所述, 与使用聚赖氨酸涂层相比, mea 的 pei 涂层的细胞聚集较少。
6. 从 mea 表面吸入 pei 涂层溶液, 并用1毫升无菌蒸馏水清洗 mea 4x。清洗步骤时, 请注意不要触摸 mea 表面, 因为这会损坏电极。
7. 在层流罩内的立体显微镜引导下, 将 mea 芯片居中, 并在 mea 的中心区域添加1毫升的无菌水。
8. 将微流体装置放置在 mea 表面的顶部。
9. 小心地将微流体器件的微槽与 mea 的微电极网格对齐。
10. 正确对齐时, 请小心地吸气多余的水, 而不接触 mea 或微流体设备。
11. 在37°c 下隔夜培育μef 以干燥并允许完全连接。为了便于连接, 轻轻地将微流体装置按在 mea 上。
    注: 在细胞播种当天执行步骤2.12。
12. 一旦μef 完全干燥, 将含有 150μml-l-lol 层压蛋白的微流体井加载, 并在37°c 孵育至少 2小时, 然后在细胞播种前孵育。
    注: 当使用层压蛋白溶液加载μef 时, 请确保溶液填充微槽。使用真空去除微槽中可能存在的任何气泡。

3. 前额皮质解剖

1. 准备解剖区域, 以便去除胚胎。
   1. 用70% 乙醇对工作表面和手术器械进行消毒。
      注: 虽然此解剖不是无菌的程序, 消毒有助于减少污染的机会。
   2. 使用干净的一次性尿布来限制解剖区域, 并布置用于胚胎去除的手术器械。
   3. 准备4个90毫米的 petri 培养皿, 里面装满了冷的 h-hbss, 放在解剖区附近有冰的托盘上。
2. 用二氧化碳 (co₂) 吸入使 e-18 时间怀孕的 wistar 大鼠安乐死。
3. 手术完成后, 将动物从二氧化碳_室取出, 并通过二次安乐死方法确认死亡, 如失血过多。
4. 将动物腹侧放在一次性尿布上, 用70% 乙醇喷洒下腹部, 并在钳子和剪刀的帮助下腹部, 通过皮肤切割 u 形以暴露子宫。
5. 通过切断任何结缔组织, 小心地将胚胎从子宫中取出, 并将其放入一个带冷 h-hbss 的培养皿中。
6. 将每个胚胎从胚胎囊中取出, 并借助钳子和剪刀将胚胎斩首。
7. 将胚胎的头部转移到充满冷 h-hbss 的第二个培养皿中。
8. 对每个胚胎重复步骤 3.6-3.7。
9. 解剖前额叶皮层。
   1. 将胚胎的头部转移到第三个培养皿中。
   2. 用一对钳子来暴露大脑。
   3. 从腔中取出大脑, 用冷的 h-hbss 覆盖它。
   4. 如果存在, 请卸下并丢弃嗅觉灯泡。解剖前额叶皮层, 切除脑膜。
   5. 将前额叶皮层的碎片转移到第四培养皿中, 其中充满了冷的 h-hbss。
   6. 重复每个胚胎 3.9.1-3.9.5 的步骤。

4. 皮质神经元在μef 上的分离与培养

注: 经过15分钟的紫外线灭菌后, 在层流罩内进行了以下操作。工作表面积以及放置在引擎盖内的所有材料应事先用70% 的乙醇消毒。

1. 如步骤1.5 所述, 将先前加权的胰蛋白酶溶解在 h-hbss 的5毫升中, 并对溶液进行过滤。
2. 收集以前在总共5毫升的 h-hbss 中解剖的皮层片段。将它们转移到无菌的15毫升锥形管。
3. 在含有皮质碎片的试管中加入2.3 毫升新鲜制备的 1.5 mg/ml 胰蛋白酶溶液。
4. 将悬浮液混合在37°c 下孵育 15分钟 (每5分钟短暂搅拌一次)。
5. 停止组织消化, 洗掉胰蛋白酶。
   1. 丢弃含有胰蛋白酶的上清液。添加含有 10% hfbs 的 5-hbss, 以激活剩余的胰蛋白酶;轻轻地搅拌。
   2. 让皮层碎片沉淀下来, 然后丢弃上清液。
   3. 加入5毫升的 h-hbss, 去除 hifbs 残留物。让皮层碎片沉淀下来, 丢弃上清液。
   4. 用5毫升的 h-hbss 再次清洗皮层碎片。
   5. 让皮层碎片沉淀下来, 丢弃上清液。加入5毫升的补充神经元培养基。
6. 通过缓慢向上和向下移液10-15 次, 机械地分离带有5毫升血清学移液器的皮层碎片。如有必要, 使用小口径移液器重复此过程, 直到细胞悬浮液变得均匀。
7. 通过过滤40μm 细胞过滤器中的细胞悬浮液来丢弃剩余的未离解组织。
8. 计算活细胞并确定细胞密度。
   1. 在微管中, 将20μl 的 0.4% (w/v) 色氨酸蓝添加到20μl 细胞悬浮液中。将溶液混合均匀, 并将10μl 转移到 neubauer 计数室。
   2. 计算活细胞并确定活细胞的细胞密度。
9. 将细胞密度调整到 3.6 x 10^{7 细胞}(如果需要, 离心机细胞悬浮液)。
10. 在细胞播种前, 从所有的微子井中去除层压蛋白涂层。将补充介质的移液器50μl 连接到μf 轴索隔间的每一口井。
11. 种子5μl 细胞悬浮液在μef 的体细胞室。在37°c 下孵化 1小时, 以允许细胞附着在基板上。
12. 用加热的补充介质轻轻填充每口井的μef。将μef 转移到提供 5% co2 的37°c 加湿器孵化器.
    注: 为避免快速培养介质蒸发, 请在培养皿中放置一个充满水的打开的微管, 并携带μef。
13. 在规定的时间内保持文化, 每第二至第三天更换50% 的培养基。
    注: 实验结束后, 微流体可以通过在水中浸泡一夜来脱离多边环境协定。如果需要, 借助钳子轻轻剥去微流体。用1% 的商用酶洗涤剂 (见材料表) 隔夜孵育即可清洁多边环境协定。

5. 记录自发的神经活动

注: mea 上的胚胎皮质神经元培养物通常在体外 (div) 中表现出自发活动 (div), 但需要 2-3周 (14-21 div) 才能成熟并表现出稳定的活性。由实验者根据研究的目标决定何时开始电生理测量。在该协议中, 通过使用商业记录系统 (有关硬件详细信息, 请参阅材料表), 并添加加热模块, 演示来自μef 的神经元活动记录。对于执行录制, 我们使用了免费提供的软件 (有关软件详细信息, 请参阅材料表)。

1. 打开 mea 记录系统和温度控制器, 使前置放大器的加热基板达到37°c。
   注: 对于长期录音 (每次 gt;30 分钟), 也应该有一个保持二氧化碳_气氛的系统。
2. 将μf 放在前置放大器 (头级) 上。
   注: 确保 mea 芯片与左上角边缘的参考编号正确对齐。我们使用的 mea 芯片是旋转对称的, 但这种对齐方式与电极和硬件 id 的引脚布局的正确方向相匹配。
3. 关闭并锁上前置放大器盖。
4. 若要记录, 请打开记录软件, 并定义记录参数和记录数据流的路径 (有关如何设置记录方案的详细信息, 请参阅软件手册)。
   注: 采样率为 20 khz 的采集通常足以满足大多数应用的需要。如果在尖峰计时中需要更精确的精度, 则建议使用更高的采样频率。如果只打算记录峰值, 请将高通滤波器设置为 300 hz, 这将衰减信号的低频分量。如果同时记录原始数据和筛选数据, 这将显著增加数据文件大小。始终可以对原始数据进行脱机筛选。为了减少数据文件的大小, 人们还可以限制要记录的微电极 (例如, 只有微槽内的微电极)。
5. 单击"启动 daq"开始数据采集。检查显示屏是否显示正在运行的活动痕迹并开始录制。
   注: 与微槽相对应的微电极的噪音水平通常稍高。如果噪声水平过高 (峰值振幅和 gt;50 μv) 或几个微电极不稳定, 则可能是由于阻碍良好引脚垫接触的污垢造成的。这个问题通常是通过温和清洗 mea 接触垫和前置放大器引脚使用棉签湿70% 乙醇。
6. 在分析软件中打开记录的文件 (参见材料表), 以快速浏览数据。

6. 数据分析

注: 以下步骤演示如何使用在 aguiar 实验室开发的计算工具μspikehunter 软件 (根据电子邮件要求免费提供), 以分析使用μef 记录的数据。图形用户界面 (图 2) 用于加载数据、识别传播尖峰波、确定其方向 (前品位或逆行) 以及估计传播速度。μspikehunter 与使用 mea2100 系列系统获得的记录生成的 hdf5 文件兼容, 可与60、120和256电极多边环境协定配合使用。使用多通道实验器获得的录音可以使用免费提供的软件轻松转换为 hdf5 文件 (见材料表)。

1. 单击 "浏览"选择录制文件。然后, 单击 "文件信息" 按钮以列出采样率、记录持续时间以及记录的数据流列表 (例如,原始数据、筛选数据)。
   注: 对于真正的传播速度估计, 建议选择原始数据流进行分析。
2. 选择微电极 (与微槽相关的单行或柱) 进行分析, 并将尖峰检测阈值 (正或负相位) 设置为信号噪声标准偏差 (sd) 的6倍。单击 "读取数据"以应用事件检测器并获取标识的传播序列。
   注: 如果满足条件, 检测到的传播序列列表将填充分析面板。然后, 用户可以查看传播序列的多个分析工具并与之交互, 包括电压跟踪、微电极间的相关性、单序列传播速度、测速仪和音频播放工具。虽然可以获得任何一对微电极的传播速度估计, 也可以作为所有对的估计平均值, 但如果选择最远的对, 这种估计就更可靠。
3. 对感兴趣的微电极集重复上一步。每次单击 "保存所有事件" 可将所有已识别的传播序列的峰值 (在每个微电极上) 的时间和振幅保存到 csv 文件中。
4. 将 csv 文件导入到数据分析环境中, 以进一步分析区域性的活动模式 (例如,触发速率、峰值间间隔)。

Results

使用这里描述的协议, 在μef 上播种的 e-18 大鼠皮质神经元能够在这些培养条件下发展并保持健康一个多月。一旦培养了 3至5天, 皮质神经元就会通过微沟槽向μef 的轴突室生长轴突 (图 1)。经过15天的培养, 在μef 上培养的皮质神经元有望表现出稳定的活性水平, 并有望沿微沟槽传播动作电位。与传统的多边环境协定记录 18^、19一样, 较老的文化 (和 gt;14 div) 往往以爆裂活动^为主。

录音和数据分析

利用μsp钉 hunter (图 2) 进行的...

Discussion

这里介绍的协议演示了如何组装一个μef, 由一个微流体器件和一个具有标准商业可用设计的 mea 组成, 以及如何分析记录的数据。

在设计实验时, 研究人员必须考虑到体外模型受到 mea 固定网格的限制, 这限制了微槽的排列。特定微流体或 mea 设计的使用将取决于特定的实验需要, 但一般来说, 相同的步骤应适用于不同的μf 配置。

在μef 装配之前要做出的一个关键决定是, 用户是否打算在未来的实验中重复使用组装的μef。在两个表面上使用氧等离子体进行处理可以将微流体器件与 mea²⁰共价地结合。然而, 这种密封往往使 mea 芯片无法用于进一步的实验, 因为分离微流体器件不可逆转地损坏钝化层。为了避免这个问题, 研究小组倾向于重用安装的μef, 尽管可能存在缺点 (例如,以前实验产生的碎片)。通过仔细遵循本协议中概述的步骤, 从实验到实验, 可以安全地连接和分离微流体设备, 而不会损坏 mea。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27 补充物 （50X）	Thermo Fisher Scientific	LTI17504-044
支链聚（乙烯亚胺）（PEI），25 kDa	Sigma-Aldrich	408727	使用 2.5 kDa 截止膜在 4° 下透析 3 天，纯化支链 PEI;C 与 5 mM HCl 溶液（每天更新）。冷冻干燥纯化的 PEI。
细胞过滤器 （40 µm）	Falcon	352340
锥形微管 （1.5 ml）	VWR	211-0015
一次性尿布，60x40 厘米	Bastos Viegas SA	455-019
镊子 Dumont #5，直线	精细科学工具	91150-20
镊子 Dumont #5/45	精细科学工具	11251-35
镊子 Dumont #7，弯曲	精细科学工具	91197-00
灭活胎牛血清优质	Biowest	S181BH-500ML
层粘连蛋白来自Engelbreth-Holm-Swarm	Sigma-Aldrich	L2020-1MG	通过将粉末溶解在相应体积的非补充培养基中，制备 1 mg/mL 的层粘连蛋白储备液。将层粘连蛋白溶液储存在 -20 °C;C 以小等分试样 （20 µL） 以避免重复冻融循环。
L-谷氨酰胺 200 mM	Thermo Fisher Scientific	LTID25030-024
Neubauer 改进的计数室（血细胞计数器）	Marienfeld	630010
Neurobasal 培养基 （1X）	Thermo Fisher Scientific	21103-049	用于神经元培养
PDMS 微流控设备的基础培养基	不适用	不适用	由两个细胞接种室组成，由 20 个 450 &mu 的微槽相互连接;m 长度和时间;10 μm 高度 & 次;14 μm 宽度尺寸并由 86 µ 分隔;m （总间隔为 100 μm） 的
青霉素-链霉素 （P/S） 溶液 （100X）	Biowest	L0022-100
PES 针式过滤装置 （Ø 30 mm），0.22 µM	Frilabo	1730012
聚丙烯锥形管，15 ml	Thermo Fisher Scientific	07-200-886
聚丙烯锥形管，50 ml	Thermo Fisher Scientific	05-539-13
聚苯乙烯一次性血清移液管，10 ml	Thermo Fisher Scientific	1367811D
聚苯乙烯一次性血清移液管，5 ml	Thermo Fisher Scientific	1367811D
标准再生纤维素膜 （2 kDa）	Spectrum labs	132107
标准手术剪刀	精细科学工具	91401-14
基底集成平面 MEA（256 个微电极）	多通道系统	256MEA100/30iR-ITO	252 氮化钛 （TiN） 记录电极和 4 个内部参比电极，组织在 16 x 16 方形网格中。每个记录电极为 30 µm 直径，间隔 100 &μ;m。
注射器鲁尔锁尖端，10 ml	Terumo Europe	5100-X00V0
注射器鲁尔锁尖端，50 ml	Terumo Europe	8300006682
Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	用于 MEA 清洗的酶活性粉末洗涤剂
组织培养板，35 mm	StemCell Technologies	27150
组织培养板，90 mm	Frilabo	900095
台盼蓝溶液 （0.4%）	Sigma-Aldrich	T8154
胰蛋白酶 （1：250）	Thermo Fisher Scientific	27250018
乙烯基胶带 471	3M	B40071909