Summary
Dit protocol heeft tot doel om aan te tonen hoe te in vitro micro-elektrode-arrays combineren met microfluidic apparaten voor het bestuderen van de actiepotentiaal transmissie in neuronale culturen. Data-analyse, namelijk de opsporing en karakterisering van teeltmateriaal van de actie potentieel, is uitgevoerd met behulp van een nieuwe geavanceerde, nog gebruikersvriendelijk en vrij beschikbaar zijn, computationele gereedschap.
Abstract
Micro-elektrode matrices (MEA's) worden veel gebruikt om neuronale functie in vitrote studeren. Deze apparaten kunnen gelijktijdige niet-invasieve opname/stimulatie van elektrofysiologische activiteit voor lange periodes. Echter kan de eigenschap van sensing signalen van alle bronnen rond elke micro-elektrode ongunstige worden, wanneer het proberen te begrijpen van de communicatie en signaal doorgeven in neuronale schakelingen. In een neuronale netwerk, verschillende neuronen kunnen gelijktijdig worden geactiveerd en overlappende actie potentieel, waardoor het moeilijk te discrimineren en bijhouden van het doorgeven van het signaal kunnen genereren. Gezien deze beperking, hebben we een in vitro opstelling gericht op de beoordeling van elektrofysiologische mededeling, die in staat te isoleren en versterken van axonale signalen met hoge ruimtelijke en temporele resolutie is opgericht. Door interfacing microfluidic apparaten en multilaterale milieu-akkoorden, kunnen we gecompartimenteerd neuronale culturen met een goed gecontroleerde aanpassing van de axonen en microelectrodes. Deze setup kunt opnames van spike vermeerdering met een hoge signaal-/ ruisverhouding in de loop van enkele weken. Gecombineerd met gespecialiseerde data analyse algoritmen, het biedt gedetailleerde kwantificering van verscheidene communicatie gerelateerde eigenschappen zoals propagatie snelheid geleiding mislukking, vuren tarief, anterograde spikes, en mechanismen te coderen.
Dit protocol laat zien hoe maak je een verzuilde neuronale cultuur setup over substraat-geïntegreerd MEAs, hoe cultuur neuronen in deze setup, en hoe succesvol opnemen, analyseren en interpreteren van de resultaten van dergelijke experimenten. Hier, laten we zien hoe de gevestigde setup vereenvoudigt het begrip van neuronale communicatie en axonale signaal doorgeven. Deze platformen de weg vrijmaken voor nieuwe in vitro modellen met gemanipuleerde en controleerbare neuronale netwerk topografieën. Ze kunnen worden gebruikt in het kader van homogene neuronale culturen, of met co cultuur configuraties waar, bijvoorbeeld, communicatie tussen de sensorische neuronen en andere celtypes wordt gecontroleerd en beoordeeld. Deze instelling biedt zeer interessante voorwaarden om te studeren, bijvoorbeeld, neurologische, neuronale circuits, codering, neurodegeneratie en neuroregeneration benaderingen informatie.
Introduction
Inzicht elektrische communicatie in neuronale circuit is een fundamentele stap te onthullen van de normale functie, opstellen van therapeutische strategieën om aan te pakken van de disfunctie. Neuronen integreren, berekenen en Relais actie potentials (APs) die langs hun dunne axonen propageren. Traditionele elektrofysiologische technieken (bijvoorbeeld patch klem) krachtige technieken te bestuderen van neuronale activiteit zijn maar zijn vaak beperkt tot de grotere cellulaire structuren, zoals het soma of de dendrites. Imaging technieken bieden een alternatief om te bestuderen van axonale signalen met hoge ruimtelijke resolutie, maar ze zijn technisch moeilijk te voeren en op lange termijn metingen1niet toegestaan. In dit verband kan de combinatie van micro-elektrode arrays (MEA's) en microfluidics maken een krachtige bijdrage in het vrijgeven van de fundamentele eigenschappen van neuron´s activiteit en signaal transmissie binnen neuronale netwerken in vitro2 , 3.
MEA technologie is gebaseerd op extracellulaire opnames van neuronale culturen. De belangrijkste voordelen van deze elektrofysiologische methodologie zijn de mogelijkheid om op lange termijn, gelijktijdige stimulatie en opname op meerdere plaatsen en in een niet-invasieve manier3te ondersteunen. MEA's zijn gemaakt van biocompatibel, hoge geleidend en corrosiebestendige microelectrodes ingebed in een glas wafer substraat. Ze zijn compatibel met conventionele cel cultuur bio-coatings, die door het bevorderen van cel adhesie aanzienlijk verhogen van de verzegeling weerstand tussen de ondergrond en cellen3,-4. Bovendien, ze zijn veelzijdig in design en kunnen variëren in grootte van de microelectrodes, de meetkunde en de dichtheid. Globaal, multilaterale milieuovereenkomsten werken als conventionele cel kweekvat met het voordeel van het toestaan van gelijktijdige live-imaging en elektrofysiologische opnames/stimulatie.
Het gebruik van MEA technologie heeft bijgedragen aan de studie van belangrijke kenmerken van neurale netwerken5. Echter, er zijn inherente functies die de prestaties van multilaterale milieu-akkoorden voor het bestuderen van de mededeling en APs vermeerdering in een neuronale circuit beperken. MEA's inschakelen opnames van afzonderlijke cellen en zelfs subcellular structuren zoals axonen, maar in vergelijking met somal signalen, axonale signalen hebben een zeer lage signaal-ruisverhouding (SNR)6. Bovendien belemmert het kenmerk van extracellulaire veld potentieel uit alle bronnen rond elke micro-elektrode sensing het volgen van signaal doorgeven in een neuronale circuit.
Recente studies hebben echter aangetoond dat betere opname omstandigheden kunnen worden bereikt door het hebben van de microelectrodes uitgelijnd binnen smalle microchannels waarin axonen kunnen groeien. Deze configuratie biedt dat een aanzienlijke toename van de SNR zodanig dat teeltmateriaal van axonale signalen kan gemakkelijk worden gedetecteerd7,8,9,10,11,,12, 13. De strategie van het Bondgenootschap microfluidic apparaten met MEA-technologie creëert een elektrisch geïsoleerde communicatie geschikt voor het versterken van axonale signalen11. Bovendien is de aanwezigheid van meerdere sensing microelectrodes langs een microgroove is fundamenteel voor de detectie en karakterisatie van axonale signaal doorgeven.
Dergelijke platforms in vitro met zeer controleerbaar neuronale netwerk topografieën kunnen worden aangepast aan vele onderzoek vragen14. Deze platforms zijn geschikt om te worden gebruikt in het kader van neuronale culturen maar ingenieur co cultuur configuraties, waar de communicatie tussen de neuronen en andere celtypes kan worden gecontroleerd en beoordeeld kunnen worden uitgebreid. Deze opstelling biedt dus zeer interessante voorwaarden om te verkennen van een aantal neurale-gerelateerde studies zoals neurologische, neuronale circuits, codering van informatie, neurodegeneratie en neuroregeneration. Bovendien kan de combinatie met opkomende modellen van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen15,16 nieuwe wegen openen in de ontwikkeling van mogelijke therapieën voor ziekten bij de mens dat invloed op het zenuwstelsel.
Ons lab is het gebruik van dit platform combineren microelectrodes met microfluidics (µEF) te begrijpen van de neuronale processen op cellulair en netwerk niveau en hun betrokkenheid bij de fysio- en pathologische zenuwstelsel. Gezien de waarde van dergelijke platform op het gebied van de neurowetenschappen, het doel van dit protocol is om aan te tonen hoe maak je een verzuilde neuronale cultuur over substraat-geïntegreerd MEAs, hoe cultuur neuronen in dit platform en hoe succesvol opnemen, analyseren en interpreteren van de resultaten van dergelijke experimenten. Dit protocol zal zeker de experimentele toolbox voor neuronale culturen in de studie van de mededeling van de neurale verrijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren werden uitgevoerd volgens de Europese Unie (EU) richtlijn 2010/63/EU (omgezet naar de Portugese wetgeving door Decreto-Lei 113/2013). Het experimentele protocol (0421/000/000/2017) werd goedgekeurd door de ethische commissie van de beide de Portugese overheid over dierenbescherming en experimenten (e in de Alimentação van Direção-Geral de Veterinária - DGAV) en van de ontvangende instelling.
1. bereiding van de voedingsbodems en andere oplossingen
Opmerking: Vers de coating oplossingen voor te bereiden op de dag van het gebruik ervan. De ongebruikte coating oplossingen en cultuur media kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C of 4 ° C zoals hieronder beschreven.
- 10 mL van een 0,05% (v/v) Poly(ethylene imine) (PEI) werkende oplossing voor te bereiden.
- 20 mL van de stockoplossing van 0,25% (m/v) PEI bereiden door ontbinding van gezuiverde PEI (Zie Tabel van materialen) in steriel water.
- Verdun 2 mL van de stockoplossing van het PEI 0,25% (m/v) in 8 mL steriel gedistilleerd water. Meng goed en gebruiken. Ongebruikte oplossing kan worden achtergelaten bij 4 ° C.
- Bereiden 1 mL van een 5 µg/mL laminin oplossing.
- Verdun 5 µL van 1 mg/mL laminin voorraadoplossing in 995 µL van basaal medium (Zie Tabel van materialen). Meng goed en gebruiken. Ongebruikte oplossing kan worden opgeslagen bevroren bij-20 ° C tot 1-2 weken.
- Bereiden 1 L HEPES-buffer Henks evenwichtige zoutoplossing (H-HBSS).
- Bereiden 1 M HEPES-oplossing door het oplossen van 11.9 g HEPES poeder in 50 mL ultrazuiver water. Breng de pH op 7,2.
- H-HBSS-oplossing (zonder calcium en magnesium) voor te bereiden door ontbinding 5,33 mM kaliumchloride, 0,44 mM kalium fosfaat monobasisch, 138 mM natriumchloride, 0.3 mM natriumfosfaat dibasische en 5,6 mM glucose in 800 mL ultrazuiver water.
- Voeg toe 15 mL 1 M HEPES-oplossing (eindconcentratie van 15 mM).
- Breng pH op 0,2-0,3 eenheden onder de gewenste pH 7.4 met 1 N HCl of 1 N NaOH. Voeg ultrazuiver water te halen van het volume van de definitieve oplossing.
Opmerking pH heeft de neiging te stijgen tijdens de filtratie. - Steriliseren door filtratie met behulp van een 0,22 µm porositeit poly(ether sulfone) (PES) membraan.
- Bereiden van 10 mL van de H-HBSS bevattende 10 gewichtspercenten warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (hiFBS).
- 1 mL van hiFBS in H-HBSS 9 mL verdund. Meng goed en gebruiken. Ongebruikte oplossing kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor 3-4 weken.
- Bereid 5 mL van 1,5 mg/mL trypsine-oplossing.
- Onmiddellijk vóór gebruik, los op 7,5 mg trypsine in 5 mL H-HBSS. Steriliseren door filtratie met behulp van een 0,22 µm porositeit PES membraan.
- 50 mL aangevuld voedingsbodem voor te bereiden.
- In een conische buis van 50 mL, meng 48.5 mL van basaal medium (Zie Tabel van materialen), 2% (v/v) B-27 supplement, 0.5 mM L-glutamine en 1% Pen/Strep (10.000 U/mL penicilline en 10.000 µg Mo/mL streptomycine). Aangevuld medium kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor 3-4 weken.
2. Microfluidic en de bereiding van MEA apparaten
Opmerking: Stappen 2.1-2.11 op de dag vóór het zaaien van de cel.
- Schone microfluidic apparaten om fabricage en ander vuil met behulp van vinyl tape te verwijderen. Druk zachtjes op de tape tegen het apparaat te bereiken alle gebieden van het apparaat.
- Lucht plasma-schoon de MEA gedurende 3 minuten (0.3 mbar) te reinigen van het oppervlak en maken het meer hydrofiele.
- Kort microfluidic apparaten in 70% ethanol dompelen en laten drogen in een laminaire flow-kap.
- Plaats elke MEA in een steriele 90 mm petrischaal en steriliseren hen in 15 min van blootstelling aan ultraviolet (UV) licht.
- Coat de MEA centrale oppervlakte door aan het broeden met 500 µL van 0,05% (v/v) PEI-oplossing voor ten minste 1 uur bij 37 ° C.
Opmerking: Zoals beschreven door anderen17, PEI coating van MEA's resulteert in minder cel clustering dan het gebruik van poly(lysine) coating. - De PEI coating oplossing van het oppervlak van MEA gecombineerd en wassen van multilaterale milieuovereenkomsten 4 x met steriele 1 mL gedestilleerd water. Wees voorzichtig om niet aanraken het MEA oppervlak tijdens het wassen stappen als dit schade aan de elektroden veroorzaken kan.
- Geleid door een stereomicroscoop binnen in een laminar flow hood, centreren de MEA-chip en voeg 1 mL steriel water aan het centrale gebied van MEA.
- Plaats het apparaat van de microfluidic op de top van de MEA oppervlak.
- Zorgvuldig de microgrooves van microfluidic apparaat met de micro-elektrode-raster van de MEA uitlijnen
- Wanneer correct uitgelijnd, moet u zorgvuldig het overtollige water zonder te raken de MEA of het microfluidic-apparaat gecombineerd.
- Incubeer de µEFs 's nachts bij 37 ° C te drogen en volledige bijlage. Ter vergemakkelijking van de bijlage, druk zachtjes op het apparaat van de microfluidic tegen de MEA.
Opmerking: Voer stap 2.12 op de dag van cel zaaien. - Zodra de µEFs zijn volledig opgedroogd, laad de putten van de microfluidic met 150 µL van 5 µg/mL laminin coating oplossing en Incubeer bij 37 ° C gedurende ten minste 2 uur vóór het zaaien van de cel.
Opmerking: Bij het laden van µEF met laminin oplossing, zorg ervoor dat de oplossing de microgrooves vult. Gebruik een vacuüm te verwijderen elke luchtbel die kan voorkomen in de microgrooves.
3. de prefrontale Cortex dissectie
- Het gebied van de dissectie voorbereiden embryo verwijdering.
- Desinfecteer het plateau en de chirurgische instrumenten met 70% ethanol.
Opmerking: Hoewel dit dissectie geen steriele procedure is, desinfectie helpt bij het verminderen van de kans op besmetting. - Gebruik een schone wegwerp luier te beperken tot het gebied van de dissectie en lay-out de chirurgische instrumenten voor het verwijderen van het embryo.
- Bereiden van 4 90 mm petrischalen gevuld met koude H-HBSS en plaats ze op een dienblad met ijs in de buurt van de dissectie-gebied.
- Desinfecteer het plateau en de chirurgische instrumenten met 70% ethanol.
- Een E-18 tijd-zwangere Wistar rat euthanaseren kooldioxide (CO2) inademing.
- Na afronding van de procedure, het dier uit de CO2 -kamer verwijderen en bevestig dood door een secundaire methode voor euthanasie, zoals exsanguination.
- Plaats van de dierlijke ventrale zijde omhoog op de wegwerp luier, spray de onderbuik met 70% ethanol en, met de hulp van de Tang en schaar, maak een U-vormige snijden door de huid te bloot van de baarmoeder.
- Zorgvuldig verwijderen van de embryo's uit de baarmoeder door het snijden van weg bindweefsel en plaats ze in een van de petrischaaltjes met koude H-HBSS.
- Verwijder elk embryo uit haar embryonale WRA en, met de hulp van de Tang en schaar, decapitate het embryo.
- Het hoofd van de embryo´s overbrengen in een tweede petrischaal gevuld met koude H-HBSS.
- Herhaal stap 3.6-3.7 voor elk embryo.
- Het ontleden van de prefrontale cortex.
- Een hoofd embryo´s overdragen aan een derde petrischaal.
- Met een paar pincet waarmee werkmapberekeningen van de hersenen.
- De hersenen van de holte verwijderen en bedek het met koude H-HBSS.
- Indien aanwezig verwijderen en gooi de bulbus bollen. Ontleden van de prefrontale cortex en verwijderen van de hersenvliezen.
- De prefrontale cortex fragmenten overbrengen in een vierde petrischaal gevuld met koude H-HBSS.
- Herhaal de stappen 3.9.1 - 3.9.5 voor elk embryo.
4. corticale neuronen dissociatie en cultuur op µEF
Opmerking: De volgende procedures werden uitgevoerd binnen een laminaire flow hood na een 15 min fietsen van UV-sterilisatie. Werken van zowel oppervlakte als alle materialen geplaatst binnen de kap moet eerder worden ontsmet met 70% ethanol.
- Zoals beschreven in stap 1.5, los van de eerder gewogen trypsine in H-HBSS 5 mL en filtreer de oplossing.
- De stukken van de cortex eerder ontleed in een totaal van 5 mL H-HBSS verzamelen. Overbrengen naar een conische buis van steriele 15 mL.
- 2.3 mL vers bereide 1,5 mg/mL trypsine oplossing aan de buis met de cortex-fragmenten toevoegen.
- Meng de schorsing en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten (kort doorroeren elke 5 min).
- Stop weefsel spijsvertering en trypsine wassen.
- Verwijder het supernatant met de trypsine. Voeg 5 mL van H-HBSS met 10% hiFBS voor inactivering van de resterende trypsine; zachtjes doorroeren.
- Laat cortex fragmenten settelen en vervolgens Verwijder het supernatant.
- Voeg 5 mL van H-HBSS te verwijderen van de residuen van hiFBS. Laat cortex fragmenten settelen en verwijder het supernatant.
- Wassen opnieuw de cortex fragmenten met 5 mL H-HBSS.
- Laat cortex fragmenten settelen en verwijder het supernatant. Voeg 5 mL van aangevuld neuronale medium.
- Mechanisch distantiëren cortex fragmenten met een serologische 5 mL-pipet langzaam op en neer waarbij eveneens voor 10 - 15 keer. Indien nodig, herhaal de procedure met behulp van een klein kaliber precisiepipet totdat de celsuspensie homogene geworden.
- Gooi de resterende ongedissocieerde weefsels door het filteren van de cel schorsing trog een 40 µm cel zeef.
- Levensvatbare cellen tellen en bepalen van de celdichtheid.
- Voeg in een microtube, 20 µL van 0,4% (m/v) Trypan blauw aan een 20 µL celsuspensie. Meng goed aan homogenaat de oplossing en 10 µL overbrengen in een Neubauer tellen kamer.
- Levensvatbare cellen tellen en bepalen van de celdichtheid van levensvatbare cellen.
- Aanpassen van de celdichtheid naar 3.6 x 107 cellen/mL (indien nodig, centrifugeer celsuspensie).
- Onmiddellijk vóór cel zaaien, laminin coating uit alle putjes van de µEF te verwijderen. Pipeteer 50 µL van aangevuld medium aan elk putje van de µEF axonale compartiment.
- Zaad 5 µL celsuspensie in het µEF somal compartiment. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur, zodat de cellen gehechtheid aan het substraat.
- Voorzichtig vullen elk goed voor µEF met verwarmde aangevuld medium. De µEF overbrengen in een luchtbevochtiger incubator bij 37 ° C bij 5% CO2geleverd.
Opmerking: Om te voorkomen dat de snelle kweekmedium verdamping, plaats een geopende microtube gevuld met water binnen de petrischaal met de uitvoering van de µEF. - Onderhouden culturen voor de vereiste periode door vervanging van 50% van het kweekmedium elke tweede naar de derde dag van cultuur.
Opmerking: Na de experimenten, de microfluidics kan worden losgekoppeld van multilaterale milieu-akkoorden door de µEF in water's nachts onder te dompelen. Indien nodig, zachtjes schil de microfluidics met behulp van een pincet. MEA's kunnen worden gereinigd door overnight incubatie met een commerciële enzymatische wasmiddel 1% (v/v) (Zie Tabel van materialen).
5. opname van de spontane Neuronale activiteit
Opmerking: Embryonale corticale neuron culturen op multilaterale milieuovereenkomsten vertonen meestal spontane activiteit zodra 7 dagen in vitro (DIV), maar neem 2-3 weken (14-21 DIV) om te rijpen en vertonen stabiele activiteit. Het is aan de experimentator beslissen wanneer u wilt beginnen met het elektrofysiologische metingen op basis van de doelstellingen van de studie. In dit protocol, de opname van neuronale activiteit van µEF wordt aangetoond met behulp van een commerciële opname-systeem (Zie Tabel van materialen voor hardwaredetails), met een module verwarming opgenomen. Voor het uitvoeren van opnames, hebben we een vrij beschikbare software gebruikt (Zie Tabel van materialen voor software details).
- Zet op de MEA opname systeem en de temperatuur controller en laat de verwarmde grondplaat van de voorversterker tot 37 ° C.
Opmerking: voor langdurige opnames (> 30 min per keer) één moeten ook een systeem dat een CO2 -sfeer handhaaft. - Plaats de µEF op de voorversterker (headstage).
Opmerking: Zorg ervoor dat de chip MEA correct is afgestemd op het nummer in de bovenste linkerrand. De MEA-chip die we gebruiken is rotatie symmetrisch, maar deze uitlijning overeenkomt met de correcte oriëntatie van de pin-layout van de elektroden en de hardware-id's. - Sluit en klink van de deksel van de voorversterker.
- Registreren, open de opnamesoftware en definiëren van de opnameparameters en het pad van de gegevensstreams van de opgenomen (Zie de softwarehandleiding voor details op hoe te opstelling een opname-regeling).
Opmerking: Een overname met een sampling rate van 20 kHz is over het algemeen genoeg voor de meeste toepassingen. Een hogere bemonsteringsfrequentie is het raadzaam indien meer precisie is nodig in spike tijdsinstellingen. Als men wil alleen record spikes, ingesteld een hoogdoorlaat filter bij 300 Hz, die de lagere frequentie componenten van het signaal zal verzachten. Als rauw en gefilterde gegevens tegelijk opgenomen worden, zal hierdoor de bestandsgrootte van gegevens aanzienlijk toenemen. Het is altijd mogelijk om te doen off line filteren van de ruwe gegevens. Ter vermindering van de gegevens kunt bestandsgrootte een microelectrodes waaruit naar record (bijvoorbeeld enige microelectrodes binnen microgrooves) ook beperken. - Klik op Start DAQ om te starten van data-acquisitie. Controleer als het display lopende sporen van activiteit en opname starten.
Opmerking: Het geluidsniveau is meestal iets hoger in de microelectrodes die overeenkomt met de microgrooves. Als het geluidsniveau te hoog is (piek-tot-piek amplitude > 50 µV) of wankele in verschillende microelectrodes, dit kan worden veroorzaakt door vuil belemmeren een goed contact van de speld-Stootkussen. Dit probleem wordt meestal opgelost door voorzichtig schoonmaken van de MEA contact pads en de pinnen van de voorversterker met behulp van een wattenstaafje bevochtigd met 70% ethanol. - Open het opgenomen bestand in de software van de analyse (Zie Tabel van materialen) om de gegevens snel te verkennen.
6. de gegevensanalyse
Opmerking: De volgende stappen laten zien hoe de µSpikeHunter-software, een computationele tool ontwikkeld bij de Aguiar lab (vrij beschikbaar op e-mail verzoek aan pauloaguiar@ineb.up.pt), voor het analyseren van de gegevens opgenomen met µEF te gebruiken. Een grafische gebruikersinterface (Figuur 2) wordt gebruikt om te laden van de gegevens, het identificeren van teeltmateriaal spike golven, bepalen hun richting (anterograde of retrograde) en de raming van de propagatie snelheden. µSpikeHunter is compatibel met HDF5 bestanden gegenereerd op basis van de opnamen die zijn verkregen met behulp van de MEA2100-familie systemen, die kunnen worden gebruikt in combinatie met 60 - 120- en 256-elektrode multilaterale milieuovereenkomsten. De opnamen die zijn verkregen met behulp van de multi-kanaals experimentator gemakkelijk kunnen worden geconverteerd naar HDF5 bestanden met behulp van vrij beschikbare software (Zie Tabel van materialen).
- Klik op Bladeren om het opnamebestand te selecteren. Klik vervolgens op de knop Bestandsinfo als u wilt weergeven van de samplefrequentie, de duur van de opname, evenals een lijst van de opgenomen gegevensstreams (bijvoorbeeld onbewerkte gegevens, gefilterde gegevens).
Opmerking: Voor ware propagatie snelheid schattingen, is het aanbevolen om te selecteren van de stroom van de ruwe gegevens voor de analyse. - Selecteer microelectrodes (één rij of kolom microgroove is gekoppeld) voor analyse en de drempelwaarde van de spike-detectie (positieve of negatieve fase) vastgesteldop 6 x de standaarddeviatie (SD) van de signaal-ruisverhouding. Klik op Gegevens lezen om te passen de gebeurtenis detector en verkrijgen van de geïdentificeerde propagatie sequenties.
Opmerking: Als de criteria wordt voldaan, dan zal een lijst van gedetecteerde propagatie sequenties hettoezichtpanel analyse bevolken. De gebruiker kan vervolgens bekijken en interactie met verschillende analysehulpmiddelen voor de volgorde van de voortplanting, met inbegrip van sporen van spanning, tussen micro-elektrode Kruis-correlaties, single-sequence propagatie snelheden, een Kymograaf en een audio afspelen tool. Hoewel de propagatie snelheid schatting kan worden verkregen voor elk paar van microelectrodes of als het gemiddelde van de ramingen voor alle paren, is deze schatting meer betrouwbaar als het verste paar is geselecteerd. - Herhaal de vorige stap voor de micro-elektrode sets van belang. Elke keer klikt u op Alle gebeurtenissen opslaan als u wilt opslaan van de tijd en amplitude van de spikes (op elk van de microelectrodes) voor alle geïdentificeerde propagatie sequenties naar een CSV-bestand.
- Importeer de CSV-bestanden naar data analyse omgevingen voor verdere analyse van de patronen van activiteit van de cultuur (bijvoorbeeld vuren tarief, Inter spike intervallen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met het protocol beschreven hier, kunnen E-18 rat corticale neuronen ontpit op µEF ontwikkelen en blijven gezond in deze kweekomstandigheden voor meer dan een maand. Zo snel als 3 tot 5 dagen in cultuur, groeien corticale neuronen hun axonen via microgrooves naar de axonale compartiment van µEF (Figuur 1). Na 15 dagen in cultuur, corticale neuronen gekweekt op µEF worden verwacht om regelmatige niveaus van activiteit tentoon te stellen en verspreiding van de actie potentieel langs de microgrooves naar verwachting. Oudere culturen (> 14 DIV) hebben de neiging te worden gedomineerd door het barsten van de activiteit zoals conventionele MEA opnames18,19.
Opnames en data analyse
Ruwe data analyse met µSpikeHunter (Figuur 2) toegestaan de opsporing en winning van teeltmateriaal van spike golven langs sets van 4 microelectrodes (in microgrooves). Figuur 3 wordt een van deze gebeurtenissen weergegeven. µSpikeHunter toegestaan voor de schatting van propagatie snelheden, gebaseerd op de cross-correlatie tussen de spanning golfvormen van geselecteerde paren microelectrodes (mits een vertraging) en de bijbehorende bekend tussen elektrode afstand.
De uitgepakte gegevens werd verder geanalyseerd met behulp van aangepaste ontworpen code in MATLAB. Een representatieve raster plot van het teeltmateriaal spike golven langs 11 (van 16) microgrooves wordt getoond in figuur 4a. De momentane vuren tarief voor een hoge en een lage-activiteit-microgroove wordt weergegeven in figuur 4b.
µEF opnamen vertonen verschillende niveaus van activiteit per micro-elektrode. Vaak zijn de verschillende microelectrodes in het somal compartiment 'stille'. Echter, de meeste microelectrodes binnen microgrooves neiging om actief te zijn (figuur 5a). Het is goed beschreven dat de microgrooves als signaal versterkers8 functioneren. De amplitude van een opgenomen signaal hangt niet alleen op de grootte van de stromingen van de bron, maar ook op de soortelijke weerstand van de omliggende media. De weerstand langs een microgroove is bijzonder hoog is, dat verhoogt de amplitude van de gemeten signalen in vergelijking met die van de microelectrodes in het somal compartiment (Figuur 5b).
Figuur 1 . Embryonale rat corticale neuronen gekweekt op µEF. (a) foto van µEF. Schaal bar: 1 cm. (b) representatieve foto van corticale neuronen gekweekt in het µEF voor 5 dagen, tonen verschillende axonen overschrijding van de microgrooves en het bereiken van de axonale compartiment (pijlen). Schaal bar: 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Screen capture van de belangrijkste grafische gebruikersinterface van µSpikeHunter. De gebruiker kan de gegevens opgenomen met µEF laden, identificeren van teeltmateriaal spike golven, bepalen hun richting (anterograde of retrograde) en de raming van de propagatie snelheden. Een Kymograaf-tool kan de gebruiker handmatig schatten de propagatie snelheid op basis van een lijn op de Kymograaf. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Anterograde teeltmateriaal spike Golf gevoeld door 4 microelectrodes (E8-E11) binnen een microgroove. Elke trace vertegenwoordigt één micro-elektrode raw opname voor 3 ms. na analyse met µSpikeHunter, de cross-correlatie tussen de verste microelectrodes (E8 en E11) toegestaan de berekening van de snelheid van een vermeerdering van 0.52 m/s. Klik hier om in te Bekijk een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Informatie barrage via de microgrooves. (a) vertegenwoordiger raster perceel van 2 minuten van de spontane activiteit opgenomen langs 11 microgrooves. Elke stip vertegenwoordigt een teeltmateriaal spike Golf (eenheid) voelde door 4 microelectrodes en geïdentificeerd door middel van de analyse met µSpikeHunter. Een hoge en een lage-activiteit-microgroove worden benadrukt in geel en rood, respectievelijk. (b) de evolutie van het tarief van de momentane afvuren (net als in het tarief-codering) voor de twee gemarkeerde microgrooves langs 10 minuten. Enige teeltmateriaal eenheden werden beschouwd voor de berekening van het percentage afvuren. Opmerking de synchronisatie van de activiteit, ondanks de verschillende vuren tarief niveaus. De momentane vuren tarief werd berekend de spike gebeurtenissen met een Gaussiaans kernel met een standaarddeviatie van 100 ms. convolving Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Kwaliteit van extracellulaire opnamen in µEF. (a) in het venster tijd (1 seconde) van een opname van de µEF (rat corticale neuronen bij de 15 dagen in vitro) met een sampling rate van 20 kHz en een high-pass-filter op 300 Hz. elektrode rijen 1-7 correspondeert met de somal compartiment en rijen 8-11 tot en met de microgrooves. (b) doos en friemeltje plot van het volledige scala van spike amplitudes uitgepakt (spikes gedetecteerd met behulp van de methode van een drempel, met negatieve fase alleen, vastgesteldop 6 x standaarddeviatie) van de opgegeven rijen (totale opnametijd van 10 minuten). De spikes amplitudes zijn aanzienlijk groter in de microelectrodes binnen microgrooves (rijen 8-11; 16 microgrooves), in vergelijking met de microelectrodes van het somal compartiment (rijen 1-7; 16 actieve microelectrodes). One-way ANOVA, Dunn is meerdere vergelijkingstests, ***p < 0,0001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol ziet hoe te monteren van een µEF, samengesteld uit een microfluidic-apparaat en een MEA met standaard verkrijgbare designs, en hoe om de opgenomen gegevens te analyseren.
Bij het ontwerpen van een experiment, moeten onderzoekers rekening houden dat de in vitro -model wordt beperkt door de MEA vast raster, die microgroove regelingen bedwingt. Het gebruik van een bepaalde microfluidic of MEA ontwerp zal afhangen van de specifieke experimentele behoeften, maar in het algemeen, dezelfde procedure stappen gelden voor configuraties van de verschillende µEF.
Een kritisch besluit moet worden ingediend voordat µEF vergadering is of de gebruiker van plan is om de verzamelde µEF in de toekomst opnieuw te experimenten. Behandeling met zuurstof plasma op beide oppervlakken kan worden gedaan om de binding covalent microfluidic apparaten aan MEAs20. Echter maakt dit afdichten vaak de MEA-chips onbruikbaar voor verdere experimenten, zoals de passivering laag loskoppelen van het apparaat microfluidic onherroepelijk schade. Om dit probleem te omzeilen, neiging onderzoeksgroepen om hergebruik van de gemonteerde µEF, ondanks de mogelijke nadelen (bijvoorbeeld puin uit eerdere experimenten). Door nauwgezet te volgen van de stappen in dit protocol, van experiment om te experimenteren, men kan veilig hechten en microfluidic apparaten loskoppelen zonder beschadiging van de MEA.
Het gebruik van µEF maakt het isolement van een aantal axonen binnen de microgrooves. De tijd die nodig is voor een redelijk aantal axonen te steken van de microgrooves hangt sterk af van de cel zaaien procedure, namelijk geplaatste celdichtheid. De dichtheid opgegeven in dit protocol, neuronen gebruiken om over te steken van de hele microgroove binnen 3 tot 5 DIV.
Afhankelijk van de omgeving van de cultuur (dat wil zeggen, incubator en luchtvochtigheid), kan het vereist zijn ter vervanging van media elke 2 tot 3 dagen voor cultuur. Bij de verlenging van media, verwijder het medium van µEF putten met behoud van de media binnen de belangrijkste kanalen. Vervolgens voorzichtig media toevoegen aan de putten van de µEF zodat het langzaam doorheen kan stromen de belangrijkste kanalen voor het opvullen van de putjes met definitieve media volume. Naar aanleiding van deze aanbevelingen zijn we in staat om deze culturen in gezonde omstandigheden voor ten minste een maand.
Een belangrijk voordeel van dit platform is de mogelijkheid om te isoleren, meten en bijhouden van axonale signalen. Hoewel de µEF opname eenvoudig is, de grote hoeveelheid gegevens die kunnen worden gegenereerd is zeer lastig te behandelen en vereist goede kennis van data-analyse. De analysesoftware hier gebruikt, µSpikeHunter21, is een geavanceerde maar toch intuïtieve computationele instrument, waarmee voor de gedetailleerde kwantificering van verschillende daarmee samenhangende maatregelen (bijvoorbeeld teeltmateriaal evenementen, propagatie snelheid etc.) in een paar stappen. Hoewel data-analyse niet de focus van dit protocol is, kan de inlichtingen hier al de winning van relevante gegevens uit de opname van een µEF. Het is echter belangrijk op te merken dat de betrouwbare isolatie van een enkele axon per microgroove praktisch niet haalbaar blijft. Zeer complexe spike golfvormen (als gevolg van meerdere axonen passeren van de microgroove) kunnen ontstaan en dus invloed op de spike tijdsinstellingen en berekeningen van de snelheid van de voortplanting. Deze beperking kan worden verzwakt door gebruik te maken van zeer smalle microgrooves (hieronder 5 µm)13 en/of via spike sorteren technieken21, die helpen bij het onderscheiden van verschillende signaalbronnen.
Hoewel in vitro culturen kunnen niet de volledige in-vivo -complexiteit recapituleren, kunnen hun combinatie met µEF goed gecontroleerde onderop onderzoek benaderingen. We hopen dat dit protocol zal helpen zowel beginners als bedreven MEA gebruikers tot de oprichting van nieuwe en betrouwbare modellen voor het bestuderen van elektrofysiologische communicatie in neuronale circuits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door FEDER - Fundo Europeu de Desenvolvimento regionale fondsen door middel van de COMPETE 2020 - Operacional-programma voor concurrentievermogen en internationalisering (POCI), Portugal-2020, en door Portugezen financiert door FCT - Fundação para Ciência l a g e een Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior in het kader van het project PDTC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus werd gesteund door FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar werd gesteund door Programa Ciência - Programa Operacional Potencial Humano (POPH) - bevordering van wetenschappelijke werkgelegenheid, ESF en MCTES en programma Investigador FCT, POPH en Fundo sociale Europeu. De apparaten van de microfluidic werden vervaardigd op INESC - Microsystems en nanotechnologieën, Portugal, onder toezicht van João Pedro Conde en Virginia Chu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M.
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W.
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
