Summary
אנחנו שפותחה. ומתארות פרוטוקול מבוסס על הרעיון ספינינג רטוב, לבנייה של מבוססי ג'לטין biomaterials בשימוש של יישום הנדסת רקמות.
Abstract
מאמר זה מציג שיטה זולה כדי לבדות ג'לטין, כמו פולימר טבעי, לתוך סיבי monofilament או צורות אחרות המתאימות. דרך ספינינג בשיטה רטובה, ג'לטין סיבים המיוצרים על ידי ההבלטה חלקה במדיום קרישה מתאים. כדי להגדיל את השטח פונקציונלי של סיבים אלה ג'לטין והיכולת שלהם לחקות את התכונות של רקמות, ג'לטין שאפשר לעצב לטופס צינור בהתייחסות לרעיון הזה. נבדק על ידי בדיקות במבחנה ויוו, הצינורות ג'לטין מדגימים פוטנציאל גדול עבור יישום בהנדסת רקמות. מתנהג כחומר מילוי מתאים הפער, ג'לטין צינורות יכול לשמש כתחליף הרקמה באזור הפגוע (למשל, במערכת העצבים או לב וכלי דם), כמו גם לקדם התחדשות על-ידי מתן תחליף ישירה של תאי גזע, המעגלים העצביים. פרוטוקול זה מספק הליך מפורט ליצירת biomaterial מבוסס פולימר טבעי, וצפויה יישומה באופן משמעותי לטובת פיתוח correlative פולימרים טבעיים, המסייעים לממש אסטרטגיות התחדשות רקמות.
Introduction
הפיתוח האחרון התחדשות רקמות כוללת את היישום של הנדסת רקמות, אשר מייצג את אתגר עבור השיפור של אסטרטגיות טיפוליות חדשות בטיפולים רפואיים. לדוגמה, הפוטנציאל מוגבל של מערכת העצבים התחדשות, הבאים מפציעה או מחלה, מהווה בעיה בריאותית משמעותית ברחבי העולם. בשל המורכבות של התהליכים הקשורים pathophysiological עם מערכת העצבים, השימוש בשתל מסורתי או היישום של ייצוב ניתוח הוכח להציע הטבות בתוצאות פונקציונלי, אבל אין שום ראיה חזקה עבור ההשפעות של קיבוע עמוד שדרה ניתוח1,2. ברקמות האזור הפגוע איבד והוחלף האסטרוציטים המושרה hypertrophically3, בסופו של דבר ויוצרים הצלקת גליה צפופה4,5. מטריצה זו משמש כמחסום כי רחובות ההתאוששות של העצב לתפקד6,7 , לכן, במידה רבה מעכבת התחדשות. לכן, חומר מילוי מתאים הפער צפוי למנוע האובדן של רקמת ולהפחית את היווצרות של רקמת צלקת-הקשורים על ידי שמירה על השלמות של האזור הפגוע, כמו גם על-ידי מתן החלפה ישירה של תאים עצביים, המעגלים כדי לקדם התחדשות האקסון.
Biomaterials פולימריים היה מועדף כמו פיגומים לתרפיה התחדשות רקמות, בהתבסס על התקנון של התקדמות ההתנהגות ואת הרקמה תא או האקסון וכלה בתמיכה מטריצה חוץ-תאית טבעיים (ECM). התבנית סיבים נחשבת בדרך כלל אבן בניין לחומרים שונים, בשל מבנה חד-ממדי8. הסיבים יכול להיות מושגת בדרך כלל על-ידי ההבלטה להמיס או רטוב ספינינג שיטה; עם זאת, גודל גדול והעלות של הציוד וכל הקושי לבצע בשיטות אלה הם מאתגרים. בנוסף, רוב העבודה הקשורים סיבי פולימר התמקדו חומרים סינתטיים או ללא הפרדות צבע. פולימרים טבעיים כמקור biomaterial מציעים מאפיינים הביו טוב יותר עבור גוף האדם. בכל זאת, כדי להשיג את היישור של סיבי פולימר טבעי הוא יחסית קשה יותר של פולימר סינתטי מקורות9. ומכאן, ההמרה של פולימר טבעי כמו מקור עשיר לחלבון לתוך סיבי biomaterial הוא לאסטרטגיה חשובה – לא רק הסיבים biomaterial יכול להיות ישירות מבודד מן חומר הגלם, וכך להימנע של טרנספורמציה מיותרים כדי מונומרים, אבל סיבי חלבון יש גם מראה טוב של מאפיינים חיוביים10.
בהקשר זה, אנו מתארים שיטה זולה עיבוד עבור ייצור סיבי פולימר טבעי דרך התפיסה הבסיסית של ספינינג רטוב, זה יכול להיות מיושם על המשקל מעבדה עבור הנדסת רקמות. ספינינג רטוב מבוצעת על ידי ההבלטה קרישה של פתרון פולימרי לתוך nonsolvent פולימר מתאימים. פתרון מתאים, צמיגה מסטול לתוך בינוני קרישת הדם גורמת מולקולות הפולימר להתמוסס. שלב המעבר, חוטים לאבד את המסיסות שלהם ואז הם זירז בצורה של שלב11פולימר מוצק. בהתייחס לתפיסה זו, אנו מורחב ואז ההתפתחות של הג'לטין לתוך הטופס שפופרת של תהליך היציקה, אשר נחשב ראוי ליישום התחדשות רקמות. בנוסף, ביסודה, אנו גם לפתח כל צורה של חומר מסיבי ג'לטין (למשל, צינור ג'לטין מסתכמת מסיבי ג'לטין מספר), לשני היישומים הרצויים.
ג'לטין, פולימר טבעי מתכלה, נוצר מ קולגן שפגע בסימני, הידרוליזה, כולל כל מדינה הסליל semicrystalline, אמורפי או משולשת של קולגן12. ידוע הזה קולגן הוא החלבון מבניים חיוני של כל רקמות החיבור של חולייתנים, חסרי חוליות13,14, אשר דומה למבנה חלבון של ECM העיקרי שגורם עצב צמיחה, במקביל, מחליף את כמות גדולה של גליקוזאמינוגליקן מופרש במהלך פגיעות בעמוד השדרה. לכן, השימוש של ג'לטין כמקור יהיה בחירה מצוינת עבור כל רכב רפואי. מלבד היותו מקור זול, ג'לטין הוא גם מתכלה, cytocompatible ומוכח קלינית להיות זמני פגם מילוי15. התפתחה צורת צינור, בדיקות במבחנה ויוו המתוארים כאן מדגימים כי ג'לטין יש הביו מעולה התאמתם רקמות בעתיד יישומי הנדסה. בתרבית עם תאי גזע אנושי אדיפוז, ג'לטין צינורות לשפר תאית התמיינות לתוך ובתאים עצביים באמצעות צביעת nestin חיובי כסמן תאי העצבים. יתר על כן, ג'לטין מספקות הפער חומר, המיוצר על ידי השיטה נוסדה במחקר זה, כמו צפוי להיות לניהול ובטוחה וכדי נהנים מאוד רקמות מהנדסים לפיתוח correlative פולימרים טבעיים עבור השיפור של רקמות אסטרטגיות התחדשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
רקמות השומן התקבלו ניתוחים אורתופדיים כמו המאושר על ידי המוסדיים סקירה הלוח של Tri-שירות כללי החולים, טייפה, טייוואן, R.O.C. הליכים הכוללים נושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת אכפת לי חיה-National מרכז רפואי ההגנה, טייוואן (R.O.C).
1. להרטיב ספינינג תהליך
-
פתרון הכנה
- להמיס 5 גר' אבקת ג'לטין ב- 100 מ של מים מזוקק פעמיים כדי לקבל 5% (w/v) פתרון ריכוז.
- מערבבים את התערובת לאט ב 60-70 ° C בלילה כדי להשיג פיזור הומוגנית לחלוטין ללא בועות.
-
רטוב ספינינג
- מערך סיבים
הערה: תיאור סכמטי של השיטה מוצג איור 1א'. הגדרת ספינינג מצויד עם מכונת משאבת סחרור (ראה טבלה של חומרים) זה מספק מהירות דיוק גבוהה ושולטת מסירה חלקה של הזרם.- מתחברים מזרק 26 G x 1/2 אינץ ' (0.45 מ מ x 12 מ"מ) כמו מזרק פתרון ברור ויניל אבובים.
- הכן 100 מ של 99.5% פתרון אצטון בכוס הספל כדי לשמש את האמבטיה קרישת הדם.
- להפעיל את המכונה משאבת סחרור 21 סל"ד (3.25 mL/min) ולתת לעמוד למשך מספר שניות בפתרון אצטון לפני גלגול זה הפתרון ג'לטין.
- להוציא את הסיבים ג'לטין מהפתרון אצטון, לטבול אותם לתוך 2.5% (w/v) של polycaprolactone/דיכלורומתאן (PCL/DCM) פתרון עם 1:20 (w/w).
- תן הג'לטין סיבי בפתרון PCL/DCM יבש למשך הלילה, מתחת למכסה המנוע בטמפרטורת החדר.
- היווצרות שפופרת
הערה: תיאור סכמטי של השיטה מוצג באיור 1ב'.- להשתמש קטטר ורידי היקפיים של 24 G x 3/4 אינץ ' (0.7 מ"מ x 19 מ"מ) שפופרת עובש.
- לטעון את הצנתר בתוך תמיסת ג'לטין והחזק אותו שם למשך 3 s.
- לטעון את הצנתר בתוך תמיסת אצטון והחזק למשך 1 דקות.
- לטעון את הצנתר שוב לתוך הפתרון ג'לטין והחזק אותו שם למשך 3 s.
- חזור על x 20 זה הליך חלופי.
- להוציא את הקטטר מהפתרון אצטון ולתת את הצינור עי יבש בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- בעדינות להוציא ברכבת התחתית ג'לטין הצנתר על-ידי שימוש עוצר דימום ולהעביר בזהירות את הצינור הג'לטין לתוך כוס פיפטה פסטר עם טבילת 2.5% (w/v) של הפתרון PCL/DCM.
- תן את פסטר פיפטה שמכילה שהג'לטין שפופרת ואת PCL/DCM פתרון יבש לילה, מתחת למכסה המנוע בטמפרטורת החדר.
- מערך סיבים
2. מורפולוגיה של הצינור ג'לטין
- לטעון את חתיכת צינור ג'לטין מיובשים על גדם פחמן.
- שים המדגם לתוך המכונה coater לרעוד. להוציא יון (ראה טבלה של חומרים) המעיל המדגם בזהב 60 s; לאחר מכן, להתבונן מורפולוגיה שלה על-ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (ראה טבלה של חומרים).
3. תרבות של תאי גזע אנושי אדיפוז
- מקם את רקמות השומן (המתקבל אוראלי רקמת שומן על ידי ניתוח הקליני) לתוך צלחת פטרי המכילות 10 מ"ל של העברת פתרון המורכב 0.1 M באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 0.1% גלוקוז.
- חתוך את הרקמות לחתיכות קטנות (פחות מ- 1 מ מ2) עם להב סכין.
- העברת הרקמות לתוך צינור פלסטיק 15 מ"ל צנטריפוגה ב 500 x g למשך 5 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע, דגירה שהגופה צינור פלסטיק המכיל 10 מ"ל הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM, בהיקף של 4 מ מגלוטמין פירובט נתרן 1 מ מ, 15 מ ג/ליטר פנול אדום) עם 0.1% collagenase ב 37 מעלות צלזיוס, באווירה humidified המכיל 95% אוויר ו-5% CO2, עבור יום אחד.
- Centrifuge צינור פלסטיק ב x 500 g למשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע בקפידה (אל תיגע המשקע), להשעות את המשקע בעדינות על-ידי הוספת 10 מ"ל של DMEM המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS) ואז ומשהים 1 יום ב 37 ° C , באווירה humidified המכיל 95% אוויר ו-5% CO2.
- Centrifuge צינור פלסטיק ב x 500 g למשך 5 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע בקפידה; לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של תאי גזע בינוני (המורכב של תקין ללא סרום בינוני (K-SFM), 5% FBS N-acetyl-L-ציסטאין, חומצה אסקורבית-2-פוספט, סטרפטומיצין, שהוא גוסס) להשעות את המשקע, להעביר אותו לתוך בקבוקון תרבות T25 המכיל 4 מיליליטר גזע בינוני תא, ומשהים 3 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס, באווירה humidified המכיל 95% אוויר ו-5% CO2.
- למחוק את תגובת שיקוע, להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), דגירה זה ב 37 מעלות צלזיוס, באווירה humidified המכיל אוויר 95% ו- 5% CO2 3.5 דקות, כדי לנתק את התאים מתחתית הבקבוק תרבות.
- להוסיף 1 מ"ל של FBS, להשהות את התערובת, להעביר אותו צינור microcentrifuge.
- Centrifuge את המתלים ב 500 x g למשך 3.5 דקות להשעות את המשקע עם 1 מ"ל של תאי גזע בינוני, להעביר אותו הבקבוקון תרבות המכיל 5 מ של תאי גזע בינוני; לאחר מכן, לשמור את זה 37 ° C באווירה humidified המכיל 95% אוויר ו-5% CO2.
- לשמר את תת-תרבות על-ידי שינוי המדיום תאי גזע כל 3 ימים.
4. טיפוח של תאים על המרקע ג'לטין
- לעקר את הצינור ג'לטין עם אור UV עבור 2 h; . ואז, לטבול אותו ב- 75% (v/v) אתנול, לשטוף אותה 2 x עם תאי גזע בינוני להסיר האתנול שיורית.
-
לאסוף תאי גזע אדיפוז אנושי (hASCs) הבקבוקון תרבות.
- הסר בינוני את הבקבוק תרבות.
- להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified המכיל 95% אוויר ו-5% CO2 3.5 דקות, כדי לנתק hASCs מתחתית הבקבוק תרבות.
- להוסיף 1 מ"ל של FBS, להשהות את התערובת, להעביר אותו צינור microcentrifuge.
- Centrifuge את הצינור microcentrifuge ב x 500 g למשך 3.5 דקות; לאחר מכן, למחוק את תגובת שיקוע בקפידה, להשעות את המשקע עם 1 מ"ל של תאי גזע בינוני.
- למקם את הצינור הג'לטין לתוך צלחת 6-ובכן המכיל 3 מ"ל של תאי גזע בינוני, זרע 4 x 104 של hASCs אל הצינור; דגירה אותם 2 שבועות ב 37 מעלות צלזיוס, באווירה humidified המכיל 95% אוויר ו-5% CO2.
- לשנות המדיום תאי גזע כל 3 ימים כדי לספק מספיק תזונה צמיחת תאים.
5. Immunocytochemistry
- הסר את תאי גזע בינוני ולשטוף היטב עם PBS.
- לתקן את הצינור עם תאים עם 0.1% חומצה אצטית סינתטית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את x 2 טוב עם PBS.
- הוספה של חומרים פעילי שטח (NP-40, 0.05%) תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את x 3 טוב עם PBS.
- להוסיף 2% עז נורמלית בסרום, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- Decant הפתרון הוספת נוגדן ראשוני nestin (סמן תא עצבי קדמון), דגירה בין לילה ב 4 º C.
- לשטוף את x 3 טוב עם PBS.
- הוספת נוגדנים משניים חמור אנטי-mouse-fluorescein isothiocyanate (FITC) ולשמור את הדגימה בחושך כבר שעתיים.
- לשטוף את x 3 טוב עם PBS.
- להוסיף 1 מ"ל של Hoechst 33342 כתם הגרעינים, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף היטב בעדינות, התבוננו בו תחת מיקרוסקופ זריחה.
6. בבדיקת התאימות Vivo
הערה: חולדות עם משקל בין 201-225 גרם נבדקו בהצלחה באמצעות פרוטוקול זה.
-
הרדמה
- זירוז ולשמור על הרדמה; רצוי, עזים ומתנגד של עכברוש (בן שבוע 8 ספראג Dawley חולדה, נקבה) באמצעות זריקה תוך שרירית של tiletamine ו- zolazepam (25 מ ג / ק ג + 25 מ"ג / ק"ג, בהתאמה), חריגות השירותים הווטרינריים (5 מ"ג/ק"ג). לבצע מבחן גירוי לכאב בהקשת האצבעות של החולדה כדי לאשר את ההרדמה.
-
עיקור וסירוס של האתר כירורגית
- לגלח לנקות את העור של שטח הטרפז של עכברוש (על גבו של הצוואר), לנגב את זה עם povidone-היוד להכין את התנאי אספטי של העור (100 מ"ג/מ"ל).
- מכסים את העכברוש עם וילונות כירורגי סטרילי כדי לצמצם העברת חיידקים וזיהום עוקבות של האתר כירורגית.
-
השרשה של הצינור ג'לטין
- חותכים בעדינות את העור של עכבר שטח הטרפז עם מספריים כירורגיים.
- ליצור פצע של 2 ס מ ומניחים את הצינור ג'לטין ישירות על השכבה בין fascia השריר.
-
ניתוח postimplantation
- לסגור את הפצע עם תפר ניילון, לנגב את זה עם povidone יוד פתרון (100 מ"ג/מ"ל).
- זירוז העכברוש באמצעות זריקה תוך שרירית של ketoprofen (2.5 מ"ג/ק"ג), צפאזולין (15 מ"ג/ק"ג).
- שמור את החולדה בתנאים aseptic במשך 7 ימים.
-
המתת חסד
- עכברוש הוא מורדמים באמצעות חנק2 CO לפי הנחיות AVMA המתת חסד. לאשר את מותו של עכבר על ידי צביטה הבוהן וזנב, ואחריו החזה לגעת כדי להבטיח את פעימות הלב.
- לחתוך את החולדה בעדינות עם סכין אזמל, להסיר את הרקמה מושתל, לצלם תמונות להשגחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה, פיתחנו בהצלחה את הג'לטין לתוך סיבי (איור 2א) ואת צינורות (איור 2ב, ג) דרך מושג ספינינג רטוב ידידותי למשתמש. חומרים אלה מבוססי ג'לטין יכול להיות מנוצל כמו כל כלי רפואי, בהתאם הצורה שלהם. בהתחשב בכך כי השטח פונקציונלי ואת מסגרת של חומרים כאלה מתאימים יותר עבור התחדשות רקמות, בדקנו את הביו צינור ג'לטין על-ידי ביצוע בדיקות במבחנה ויוו.
כדי לקבל מבט כולל על הצינור ג'לטין, ראשית, ערכנו תצפיות מורפולוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (איור 3). תוצאות הבדיקה הראו כי פני השטח של הצינור ג'לטין איננה חלקה מאוד (איור 3א), הקוטר הפנימי שלה היה יותר מ-200 מיקרומטר (איור 3ב), את עוביו היה כ 20 מיקרומטר (איור 3ג').
לאחר מכן, immunocytochemistry בוצעה כדי לבדוק את התאימות של הצינור ג'לטין במבחנה (איור 4). בתחילה, הצינור ג'לטין, נדגרה עם תאי גזע אנושי אדיפוז 2 שבועות, הוכתם nestin כסמן תאי העצבים (איור 4א). תחת המיקרוסקופ פלורסצנטיות, ההכתמה הראה את חיובי nestin מכתים סמן (צבע ירוק) יחד עם חבורה של גרעינים שזוהו (צבע כחול), אשר הציע כי התאים יכולים לחדור לדבוק היטב הצינור ג'לטין, להבדיל לתוך עצבית ובתאים (איור 4B). יתר על כן, המבחן הביו ויוו של הצינור ג'לטין הראו התוצאות מקביל. הצינור ג'לטין הוכנס לתוך השכבה fascia באזור הטרפז של עכברוש במשך 7 ימים. התוצאה מדגים כי ההשתלה של הצינור הג'לטין לתוך השכבה fascia המצוין שלה הביו נהדר, הראה שום סימן. של אדמומיות, נפיחות, או אחרים דלקת סימפטומים של הרקמה המקומית, ובטיחות, היה מוקף מפותח רקמות החיבור (איור 5A, B).
איור 1 : בסכמה רטובה ספינינג ההתקנה. (א) ג'לטין סיבים. (B) ג'לטין צינור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : בהיר הצגת תמונות מבוססי ג'לטין חומר שהושג דרך רטובה ספינינג שיטה. (א) ג'לטין סיבים. (B) ג'לטין צינור. (ג) ג'לטין צינור בפתרון PBS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : מורפולוגיה של הרכבת התחתית ג'לטין, שנצפה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. (א) A view שטחית של פני השטח של הצינור ג'לטין (סולם בר = 50 מיקרומטר). נוף מישור משופע (B) (סולם בר = מיקרומטר 200). תצוגה אנכיות (C) (סולם בר = מיקרומטר 25). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : התבוננות צמיחת תאי גזע אדיפוז אנושי (חסידי גור) ברכבת התחתית ג'לטין. (א) תמונה תצוגה מוארת של ג'לטין שפופרת-hASCs. (B) מתחת למיקרוסקופ פלורסצנטיות, ההכתמה הראה חיובי nestin מכתים סמן יחד עם חבורה של גרעינים מוכתם Hoechst 33342.The ג'לטין צינור בתנאי סביבה אופטימלית עבור hASCs לדבוק ולגדול בתוך הצינור (סולם בר = מיקרומטר 200; צבע כחול = גרעינים; צבע ירוק = nestin). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: In vivo הביו מבחן של הצינור ג'לטין. (א) ההשתלה של הצינור הג'לטין לתוך השכבה fascia. התבוננות (B) של הסביבה רקמות מקומיות מושתל עם הצינור ג'לטין (שטח המלבן האדום) לאחר 7 ימים. אין אדמומיות, נפיחות או תסמינים אחרים דלקת נצפו ולאחר הצינור מוקף על ידי רקמות החיבור מפותח 7 ימים לאחר ההשתלה. . זה מעיד על הביו מעולה של הצינור ג'לטין עם הסביבה רקמות מקומיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצגנו את התפתחות biomaterials מבוססי ג'לטין על-ידי שימוש פשוט רטוב ספינינג טכניקה שניתן להחיל במחקר של פולימרים טבעיים עבור התחדשות רקמות. עבודה זו הפגין את האפשרות של ייצור ג'לטין כמקור חלבון נהדר ללא התוספת של מקורות אחרים, במטרה לייעל את המאפיינים של ג'לטין עצמה. התפתחות biomaterials מבוססי ג'לטין בוצע לחלוטין בטמפרטורת החדר (22-26 מעלות צלזיוס). הכנה פתרון עדין הוא שלב קריטי בתוך הפרוטוקול, כמו שמירה על ריכוז של פתרון מדויק, זע את הפתרון בצורה חלקה מאוד להימנע בועות. הופעת בועות הפתרון, במיוחד כאשר נטען לתוך המזרק, תשפיע על הצורה של ג'לטין במדיום קרישת הדם.
Biomaterials מבוססי ג'לטין התקבלו שלב המעבר של הפתרון ג'לטין במדיום קרישה מתאים גורם את desolvation של מולקולות הפולימר, ארגונייט שוקע הפתרון הג'לטין לתוך שלב11פולימר מוצק. על ידי העסקת הרעיון הבסיסי הזה של רטובה ספינינג שיטה, אנחנו מנוצל את הצורה של הג'לטין לתוך צינור טופס כדי להגביר את הפונקציונליות של פני השטח שלו וכדי לחקות את התכונות של רקמות אנוש דרך תהליך דפוס. במקרה זה, הזמנים נאותה כדי לטעון, החזק ולאחר חזור על השלבים נחוצים לבנות טופס צינור המדויק. ב פרוטוקול זה, ההומוגניות של צורת צינור במהלך התהליך שלא ניתן לשלוט, שוקלת באופן אסינכרוני של שלב המעבר מלמטה למעלה לחלק של הצינור. בנוסף, שיטות משומר, סטריליזציה חומר זה מוגבלות בגלל תכולת החלבון שלה.
התוצאות הנוכחי בחן על ידי בדיקות במבחנה ויוו, הוכיח כי הצינורות ג'לטין שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה מוצג של הביו מעולה ויש הישימות פוטנציאל גדול בהנדסת רקמות. הקוטר הפנימי של הצינורות ג'לטין שהושגו במחקר זה היה יותר מ-200 מיקרומטר (איור 3ב), אשר מאפשר את התאים לעבור בקלות לדבוק פני השטח הפנימי של הצינורות16. בנוסף, עובי ואת במתינות asperous פני השטח של הצינור מספק תבנית נכונה עבור התא מצורף (איור 3א, ג). באופן עקבי, התוצאות immunocytochemistry הראו כי התאים שחדר, דבקה הג'לטין שפופרת-במיוחד עצבי תאי גזע, כפי שנמדדו באמצעות צביעה חיובית של תאים עצביים עם סמן nestin (איור 4B ). כמו דה מרקר nestin נמצא באזור של הקונוסים צמיחה בשלבים של האקסון סיומת, צביעה חיובית של nestin היא מעידה על צמיחה חרוט17. בסופו של דבר, שילוב ג'לטין חיובי-hASCs זה ייושם בטיפול של התחדשות מערכת העצבים. חוט השדרה מורכב של קבוצות של נוירון אקסונים, חבילות של סיבי עצב לאורך החוליות בעמוד השדרה. לפיכך, הצינור ג'לטין עשוי לא רק לספק חומר מילוי המתאים הפער אלא גם מדריך סיבי עצב צמיחה והתחדשות דרך הצינורית. יתר על כן, הביו מעולה שנצפה על ידי ההשתלה של צינור הג'לטין לתוך fascia שכבה לא להפגין יותר מזיקים, דלקת השפעה על הרקמות מקומי, ועל הצינור היה מוקף רקמות החיבור מפותח (איור 5 A, B).
לסיכום, הצלחנו לפתח פרוטוקול פשוט ושימושי להקמת biomaterials מבוססי ג'לטין עם סביבת הביו ותא מעולה שיכול לשמש ברקמת פרוספקט הנדסה יישומים, כגון עצבני מערכת התחדשות, החלפת כלי דם, דלקת בדרכי השתן שיקום, ובשנת מחדש של חלקי איברים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על ידי מהנדסים רקמות לפיתוח correlative פולימרים טבעיים ללא כל תוספת פולימר סינתטי. הפרוטוקול ניתן להרחיב בקלות על והוא יכול לשמש כדי להתאים אישית את העיצוב של biomaterials ספציפיים. בעתיד, פרוטוקול זה ניתן להתאים כדי לייצר חלבון מבוססת biomaterials בקנה מידה המוני, ובכך מסייעת להבין התחדשות רקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי משרד הלאומי הביטחון (MAB-105-070; MAB-106-077; MAB-107-032; MAB-107-065), משרד המדע והטכנולוגיה (רוב 107-2320-B016-016), בית חולים כללי Tri-שירות, הלאומית ההגנה המרכז הרפואי, טייוואן (TSGH-C106-046; TSGH-C106-115; TSGH-C107-041), בית החולים הכללי נג-חסין ואת שיתוף הפעולה של המרכז הרפואי של הביטחון הלאומי (CH-NDMC-107-8).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution preparation: | |||
| Gelatin type B (porcine) | Ferak | Art. -Nr. 10733 | 500 g vial |
| Wet spinning process: | |||
| Peristaltic pump | Gilson | Model M312 | Minipuls*3 |
| Plastic tube connector | World Precision Instruments | 14011 | 1 box |
| Syringe | Sterican | 5A06258541 | 26Gx1/2"(0.45 x 12mm) |
| Acetone | Ferak | Art. -Nr. 00010 | 2.5 L vial |
| Polycaprolactone CAPA 6500 | Perstorp | 24980-41-4 | - |
| Dichloromethane | Scharlau | CL03421000 | 1 L vial |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | - |
| Hemostat | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Peripheral venous catheter (Introcan Certo) | B. Braun | 1B03258241 | 24Gx3/4"(0.7 x 19mm) |
| Morphology of the gelatin tube: | |||
| Ion sputter coater machine | Hitachi | e1010 | - |
| Scanning electron microscopy | Hitachi | S-3000N | - |
| Cultivation of cells on the gelatin tube: | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 488625 | 100 mL vial |
| Fetal bovine serum | Gibco | 923119 | 500 mL vial |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 31600-034 | Powder |
| Keratinocyte-SFM medium | Gibco | 10744-019 | 500 mL vial |
| T25 culture flask | TPP | 90025 | VENT type |
| 6-well plate | Falcon | 1209938 | - |
| Immunocytochemistry: | |||
| Phospate-buffered saline | Gibco | 654471 | 500 mL vial |
| Acetic acid glacial | Ferak | Art. -Nr. 00697 | 500 mL vial |
| NP-40 surfactant (Tergitol solution) | Sigma | 056K0151 | 500 mL vial |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000-20 | 20 mL vial, concentrate |
| Nestin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-23927 | - |
| Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-2099 | - |
| Hoechst 33342 | Anaspec | AS-83218 | 5 mL vial |
| In vivo biocompatibility test: | |||
| Tiletamine+zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Xylazine | Bayer korea | KR03227 | 10 mL vial |
| Ketoprofen | Astar | 1406232 | 2 mL vial |
| Povidone-iodine solution | Everstar | HA161202 | 4 L barrel |
| Cefazolin | China Chemical & Pharmaceutical | 18P909 | 1 g vial |
| Scalpel blade | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
| Surgical scissor | Shinetec instruments | ST-B021 | - |
References
- Bagnall, A. M., Jones, L., Duffy, S., Riemsima, R. P. Spinal fixation surgery for acute traumatic spinal cord injury. Cochrane Database of Systematic Reviews. 1, 004725 (2008).
- Fehlings, M. G., Perrin, R. G. The role and timing of early decompression for cervical spinal cord injury: update with a review of recent clinical evidence. Injury. 36, Suppl 2 13-26 (2005).
- Yang, L., Jones, N. R., Stoodley, M. A., Blumbergs, P. C., Brown, C. J. Excitotoxic model of post-traumatic syringomyelia in the rat. Spine. 26, 1842-1849 (2001).
- Rolls, A., et al. Two faces of chondroitin sulfate proteoglycan in spinal cord repair: a role in microglia/macrophage activation. PLoS Medicine. 5, 1262-1277 (2008).
- Properzi, F., Asher, R. A., Fawcett, J. W. Chondroitin sulphate proteoglycans in the central nervous system: changes and synthesis after injury. Biochemical Society Transactions. 31, 335-336 (2003).
- Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Research Bulletin. 49, 377-391 (1999).
- Yang, Z., Mo, L., Duan, H., Li, X. Effects of chitosan/collagen substrates on the behavior of rat neural stem cells. Science China Life Sciences. 53, 215-222 (2010).
- Chawla, K. K. Fibrous Materials. , Cambridge University Press. London, UK. (1998).
- Pickering, K. L., Aruan Efendy, M. G. A review of recent developments in natural fibre composites and their mechanical performance. Composites Part A-Applied Science and Manufacturing. 83, 98-112 (2016).
- Lundgren, H. P. Synthetic fibers made from proteins. Advances in Protein Chemistry. 5, 305-351 (1954).
- Radishevskii, M. B., Serkov, A. T. Coagulation mechanism in wet spinning of fibres. Fibre Chemistry. 37, 266-271 (2005).
- Yannas, I. V.
- Baer, E., Cassidy, J. J., Hiltner, A. Hierarchical structure of collagen composite Systems: lessons from biology. Pure and Applied Chemistry. 6, 961-973 (2009).
- Harrington, W. F., Von Hippel, P. H. The structure of collagen and gelatin. Advances in Protein Chemistry. 16, 1-138 (1961).
- Veis, A. The Macromolecular Chemistry of Gelatin. , Academic Press. New York, NY. (1994).
- Freyman, T. M., Yannas, I. V., Gibson, L. J. Cellular materials as porous scaffolds for tissue engineering. Progress in Materials Science. 46, 273-282 (2001).
- Michalczyk, K., Ziman, M. Nestin structure and predicted function in cellular cytoskeletal organization. Histology and Histopathology. 20, 665-671 (2005).
