Summary
Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un test per transposase-accessibile della cromatina (ATAC-seq) la sequenziazione su linfociti CD4 + umani. Il protocollo è stato modificato per ridurre al minimo la contaminazione letture di DNA mitocondriale dal 50% al 3% attraverso l'introduzione di un nuovo buffer di lisi.
Abstract
ATAC-seq è diventata una metodologia ampiamente usata nello studio dell'epigenetica a causa del suo approccio rapido e semplice alla mappatura del genoma accessibile della cromatina. In questa carta presentiamo un protocollo ATAC-seq migliorato che riduce la contaminazione letture di DNA mitocondriale. Mentre precedente ATAC-seq protocolli hanno lottato con una media di 50% contaminando il DNA mitocondriale si legge, il buffer di lisi ottimizzato introdotto in questo protocollo riduce la contaminazione di DNA mitocondriale a una media del 3%. Questo protocollo di ATAC-seq migliorata consente una riduzione del 50% nei pressi del costo di sequenziamento. Dimostriamo come queste librerie di ATAC-seq di alta qualità possono essere preparate da linfociti CD4 + attivati, fornendo istruzioni dettagliate da CD4 + isolamento dei linfociti da sangue intero attraverso l'analisi dei dati. Questo protocollo di ATAC-seq migliorata è stata convalidata in una vasta gamma di tipi di cellule e sarà di immediata utilità per i ricercatori che studiano l'accessibilità della cromatina.
Introduction
Il dosaggio per transposase-accessibile della cromatina sequenziamento (ATAC-seq) è rapidamente diventato il principale metodo per interrogare architettura della cromatina. ATAC-seq può identificare regioni di cromatina accessibile attraverso il processo di tagmentation, la frammentazione e la codifica di DNA con lo stesso enzima, per produrre le librerie con cui sequenziamento può determinare l'accessibilità cromatinica attraverso un intero genoma. Questo processo di tagmentation è mediato dalla transposase Tn5 iperattivo, che taglia solo regioni aperte della cromatina a causa di composti sterico. Come taglia, la transposase Tn5 inserisce anche schede di sequenziamento che consentono la costruzione della libreria rapida mediante PCR e sequenziamento di nuova generazione di cromatina accessibile genoma1,2.
ATAC-seq è diventato il metodo preferito per determinare aree di accessibilità della cromatina a causa del protocollo relativamente semplice e veloce, la qualità e la gamma di informazioni che possono essere determinati dai suoi risultati e la piccola quantità di materiale necessario di partenza. Rispetto a dnasi-seq3 (che misura anche l'accessibilità della cromatina genoma), MNase-seq4 (che determina posizioni nucleosoma nelle regioni del genoma aperto), e la formaldeide-mediata FAIRE-seq5, ATAC-seq è più veloce, più economico e più riproducibili1. È anche più sensibile, lavorando con materiale di minor come 500 nuclei, rispetto ai 50 milioni nuclei richiesti per dnasi-seq3di partenza. ATAC-seq ha anche la capacità di fornire ulteriori informazioni sull'architettura di cromatina rispetto ad altri metodi, comprese le regioni di legame del fattore di trascrizione, nucleosoma posizionamento e cromatina aperta regioni1. Efficace, unicellulare ATAC-seq protocolli sono stati convalidati, fornendo informazioni sull'architettura della cromatina al livello unicellulare6,7.
ATAC-seq è stato utilizzato per caratterizzare l'architettura della cromatina attraverso un ampio spettro di tipi di ricerca e cellule, tra cui piante8, esseri umani9e molti altri organismi. E ' stato anche critico nell'identificazione di regolazione epigenetica di malattia stati7. Tuttavia, il protocollo più diffuso di ATAC-seq include il grave inconveniente di letture di sequenziamento di contaminazione da DNA mitocondriale. In alcuni set di dati, questo livello di contaminazione può essere alto come il 60% di sequenziamento risultati1. C'è uno sforzo concertato nel campo per ridurre queste letture mitocondriale contaminanti al fine di consentire l'applicazione più efficiente di ATAC-seq7,10,11. Qui presentiamo un protocollo ATAC-seq migliorato che riduce il tasso di contaminazione di DNA mitocondriale ad appena il 3%, permettendo la riduzione del 50% circa nel sequenziamento costi10. Ciò è reso possibile da un processo semplificato di isolamento di linfociti CD4 + e l'attivazione e un buffer di lisi migliorata che è fondamentale per minimizzare la contaminazione del DNA mitocondriale.
Questo protocollo modifiedATAC-seq è stato convalidato con una vasta gamma di cellule primarie, tra cui primario del sangue periferico umano cellule mononucleari (PBMCs)10, monociti umani primari e le cellule dendritiche (inedite) del mouse. È anche stato utilizzato con successo per interrogare le linee cellulari di melanoma in uno schermo regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) cluster di non-codificazione elements11. Inoltre, il pacchetto di analisi dei dati descritto in questo protocollo e forniti su GitHub fornisce ai ricercatori nuovi ed esperti con strumenti per analizzare i dati ATAC-seq. ATAC-seq è il dosaggio più efficace per eseguire il mapping all'accessibilità cromatinica attraverso un intero genoma, e modifiche al protocollo esistente che vengono introdotti qui permetterà ai ricercatori di produrre dati di alta qualità con bassa contaminazione di DNA mitocondriale, riducendo i costi di sequenziamento e migliorando la velocità di ATAC-seq.
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Protocol
Questo protocollo migliorato fornisce istruzioni dettagliate per eseguire ATAC-seq di linfociti CD4 +, da materiale di partenza di sangue intero attraverso l'analisi dei dati (Figura 1).
1. isolamento di CD4 + cellule di T dal sangue intero
Nota: Il materiale di partenza per questo protocollo è 15 mL di sangue intero fresco raccolti utilizzando le procedure standard, permettendo l'origine della materia prima di essere selezionato basato su requisiti di ricerca. Scala il protocollo come necessario. Pre-riscaldare il tampone fosfato salino (PBS) + 2% siero fetale del vitello (FCS) a temperatura ambiente (TA) e regolare la centrifuga per RT prima di iniziare la procedura di arricchimento delle cellule T CD4 +.
- Aggiungere 750 µ l di CD4 + T cell arricchimento umano cocktail a 15 mL di sangue intero in una provetta conica da 50 mL e mescolare delicatamente per inversione. Incubare a temperatura ambiente per 20 min. Al termine dell'incubazione, aggiungere 15 mL di PBS + 2% FCS alla provetta e mescolare delicatamente per inversione.
- Preparare un tubo conico di fresca 50 mL con 15 mL di media densità. Strato con cura il campione di sangue diluito sulla parte superiore del mezzo densità, essere sicuri di non disturbare l'interfaccia di densità medio/sangue che si forma. Centrifugare per 20 min 1.200 x g e RT con accelerazione impostata su 1 e il freno discendente OFF.
Nota: È fondamentale per impostare l'accelerazione su 1 e discendente freno disinserito sulla centrifuga per evitare perturbazioni dello strato delle cellule nel mezzo di densità. - Raccogliere le cellule di T di CD4 + arricchite dall'interfaccia densità medio/plasma utilizzando una pipetta di trasferimento gambo stretto. Trasferire le cellule prelevate da un tubo conico di fresca 50 mL. Centrifugare le cellule di T di CD4 + raccolte per 8 min a 423 x g e RT.
Nota: Assicurati di tornare l'accelerazione centrifuga freno 9 e discendente su ON per passaggio 1.3 e tutti i passaggi seguenti. - Scartare il surnatante e lavare il pellet cellulare due volte con 50 mL di PBS + 2% FCS, centrifugazione per 8 min a 423 x g e RT. scartare il sopranatante finale lavare e sospendere il pellet cellulare lavato in 2 mL di PBS + 2% FCS.
- Contare le celle utilizzando un emocitometro. Per continuare con ATAC-seq, procedere al punto 2.3. Per congelare le cellule per la successiva elaborazione, passare al punto 1.6.
- Aggiungere 1 mL di medium di congelamento fresco (90% FCS + 10% dimetilsolfossido) per 1 milione di cellule. Aliquotare 1 mL di celle di congelamento criogenici sicuro tubi di medie. Inserire le provette a-80 ° C durante la notte in un contenitore di congelamento lento. Il giorno successivo, trasferimento tubi a azoto liquido per stoccaggio a lungo termine.
Nota: 1 milione di cellule T CD4 + saranno isolati per 2 mL di volume originale di sangue intero. Congelare le 500.000 cellule in aliquote di 1 mL di medium di congelamento. Fare mezzo congelamento fresco ad ogni utilizzo.
2. attivare e purificare le cellule di T di CD4 +
Nota: Questo protocollo rapido per l'attivazione e purificare le cellule T CD4 + solo richiede 48h e risultati nel 95% vitali, attiva le cellule T CD4 +. Raffreddare la centrifuga a 4 ° C prima di iniziare il protocollo.
- Scongelare 1 flacone (500.000) di cellule T CD4 + in bagnomaria a 37 ° C fino a quando il ghiaccio si è sciolto solo. Trasferire delicatamente le cellule a una provetta conica da 15 mL contenente 9 mL di pre-riscaldato media di Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), completati con 10% FCS, appresso RPMI completo.
Nota: Non lasciare che le cellule scongelare completamente per evitare l'esposizione a DMSO. - Centrifuga per 6 min a 1500 x g e a 4 ° C. Scartare il surnatante e delicatamente sospendere il pellet in 2 mL di RPMI completo. Ripetere lo spin down, scartare il surnatante e sospendere delicatamente le cellule in 0,5 mL di RPMI completo.
- Contare le celle utilizzando un emocitometro. Regolare la densità della sospensione delle cellule con RPMI completo ai 50.000 cellule in 200 µ l per pozzetto di una piastra di fondo tondo 96 pozzetti di targa.
Nota: Da un tubo di congelati di cellule T CD4 + di 500K, pozzetti della piastra 10 di 50.000 cellule T CD4 + in 200 µ l per pozzetto. -
Preparare biglie magnetiche coniugate con gli anticorpi di anti-CD3 e anti-CD28 T-attivatore di umani.
- Aliquotare e 12,5 µ l della umana T-attivatore CD3/CD28 perline per ATAC-seq campione in una provetta da 1,5 mL. Lavare le perline con 1 mL di 1X PBS e posizionare il tubo su un magnete per 1 min.
- Con attenzione rimuovere e scartare il supernatante chiaro, rimuovere la provetta dal magnete e sospendere le perline in 13 µ l completa RPMI al campione di ATAC-seq.
Nota: Calcolare la quantità di perline necessarie dipenda dal numero di campioni di ATAC-seq in fase di elaborazione. Questo protocollo richiede 12,5 µ l di CD3/CD28 perline per 500.000 cellule, che costituisce un esempio di ATAC-seq.
- Attivare le cellule T CD4 +. Raccogliere 500.000 cellule in 2,1 mL di terreno RPMI completo in una provetta conica da 15 mL e aggiungere 12,5 µ l della pre-lavati perle di T-attivatore umani. Mescolare delicatamente capovolgendo la provetta.
- Trasferire delicatamente le cellule con Perline a una sterile serbatoio e piastra 200 µ l di cellule con perline per pozzetto della piastra a 96 pozzetti fondo tondo usando una pipetta multicanale. Incubare per 48 h a 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Post incubazione, centrifugare la piastra a 96 pozzetti per 8 min a 423 x g e RT. rimuovere 100 µ l di terreno per pozzetto dalla piastra a 96 pozzetti, raccogliendola in una provetta conica prima di scartare per evitare la perdita della perla. Risospendere il pellet cellulare nei restanti 100 µ l e raccogliere tutto in una provetta da 1,5 mL.
Nota: 10 pozzi delle cellule di T attivate saranno raccolti in un volume di 1 mL. - Eseguire CD4 + isolamento. Aggiungere 50 µ l di pre-lavato CD4 coniugato perline a 500.000 cellule in 1 mL di RPMI completo. Combinare le perline e le cellule mediante pipetta. Incubare per 20 min a 4 ° C in frigorifero. Agitano perline e miscela delle cellule ogni 6 min.
Nota: Questo protocollo deve essere utilizzato per un campione di 500.000 cellule. Regolare come necessario per due o più campioni di 500.000. - Quando l'incubazione è completa, è necessario posizionare il tubo sul magnete per 2 min. rimuovere e gettare il supernatante quando chiaro. Lavare le cellule associato a perlina di rimozione del tubo dal magnete, sospendendo le cellule associato a perlina in 1 mL di PBS + 2% FCS, sostituire il tubo sul magnete per 1 min e scartando il sovranatante chiaro. Ripetere questo processo per un totale di 3 lavaggi.
Nota: Fare attenzione a non eliminare tutti i branelli durante i lavaggi. - Dopo il lavaggio finale, posizionare il tubo sul magnete per 1 min. rimuovere e gettare il supernatante e mettere la pallina sul ghiaccio. Passare alla sezione 3 (ATAC-seq).
3. ATAC-seq
Nota: In questo passaggio, i nuclei sono isolati da cellule T CD4 + attivate per ATAC-segg. Il buffer di lisi utilizzato in questo protocollo è stato migliorato per essere più delicato sui nuclei, con conseguente digestione più efficiente e ottenere risultati di qualità superiore. Tutte le fasi di centrifugazione nella sezione 3 sono eseguite con una centrifuga ad angolo fisso mantenuta a 4 ° C. Raffreddare la centrifuga prima di iniziare il protocollo.
- Eseguire l'isolamento di nuclei. Risospendere le cellule con buffer di lisi freddo (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 millimetri di NaCl, 3 millimetri di MgCl2, 0.03% polisorbato 20) e perline. Centrifugare immediatamente a 500 x g per 10 min a 4 ° C. Rimuovere e scartare il surnatante.
- Eseguire la reazione di transposase. Sospendere il pellet di nuclei isolati con 50 µ l di miscela di Tn5 transposase (tabella 1). Incubare in un termociclatore per 30 min a 37 ° C con un coperchio di 40 ° C, mantenimento a 4 ° C al termine.
- Dopo thermocycling, immediatamente eseguire un lancio di centrifuga da banco rapido verso il basso e posizionare il tubo sul magnete per 1 min rimuovere le perline dal prodotto.
- Trasferire il surnatante chiaro dal tubo sul magnete a una colonna di purificazione del DNA. Lavare la colonna una volta con 250 µ l di tampone PB e due volte con 750 µ l di tampone PE. Eluire il campione in 10 µ l di tampone di eluizione. Passare direttamente al punto 3.5.
Nota: Questo passaggio amplifica i frammenti di DNA con gli adattatori dei, qui indicati come la biblioteca di ATAC-seq. Al fine di multiplex diverse librerie di ATAC-seq per essere eseguito su una sola corsia NGS, utilizzare non indicizzata Primer 1 per tutti i campioni e un diverso 2 Primer indicizzata per singoli campioni (tabella 2). Gli iniettori sono utilizzati a concentrazioni di 1,25 µM di lavoro. - Impostare l'iniziale reazione di amplificazione di PCR in un tubo PCR privo di nucleasi, combinando i componenti nell'ordine e nel volume specificato nel tabella 3. Inserire il tubo PCR nel termociclatore ed eseguire il programma di amplificazione di PCR con ciclismo condizioni come specificato nella tabella 4.
-
Monitorare la reazione di qPCR. Impostare la reazione di qPCR in una provetta PCR privo di nucleasi, combinando i componenti nell'ordine e nella quantità specificata nella tabella 5. Posto nella macchina di qPCR e ciclo come specificato nella tabella 6.
- Per determinare che il numero ottimale di amplificazione ulteriore cicli per la reazione di 45 µ l restante, crea una stampa con numero di ciclo sull'asse x e relativa fluorescenza (RFU) sull'asse y. Il numero ottimale di cicli di amplificazione supplementare è un terzo il numero di cicli che ci vuole per la reazione di qPCR raggiungere altopiano.
Nota: La reazione di monitoraggio di qPCR permette per la determinazione del numero ottimo di cicli PCR desiderata ottenere amplificazione frammento biblioteca ottimale riducendo al minimo contenuto di GC e dimensione bias.
- Per determinare che il numero ottimale di amplificazione ulteriore cicli per la reazione di 45 µ l restante, crea una stampa con numero di ciclo sull'asse x e relativa fluorescenza (RFU) sull'asse y. Il numero ottimale di cicli di amplificazione supplementare è un terzo il numero di cicli che ci vuole per la reazione di qPCR raggiungere altopiano.
- Completare l'amplificazione di PCR finale dei restanti 45 µ l di reazione di PCR. Collocare la provetta PCR con la reazione di amplificazione da passo 3.5 indietro nel termociclatore ed eseguire il programma come descritto nella tabella 7.
Nota: Per i campioni trattati come descritto in questo protocollo, il numero ottimo di cicli di amplificazione di PCR è stato determinato per essere 12. - Dopo aver completato l'amplificazione, purificare le librerie utilizzando un kit di pulizia PCR seguendo il protocollo del produttore, medicati in 25 µ l di tampone di eluizione.
Nota: Librerie di amplificato possono essere conservate a 4 ° C per 48 h o congelate a-20 ° C per la conservazione a lungo termine.
4. ATAC-seq biblioteca qualità analisi
Nota: È importante convalidare la qualità e la quantità di ATAC-seq librerie prima di sequenziamento di nuova generazione. La qualità e la quantità delle librerie dovrebbero essere valutati usando i kit disponibili in commercio (Vedi Tabella materiali).
- Valutare la qualità e la quantità delle librerie ATAC-seq utilizzando una piattaforma basata su microfluidica per dimensionamento, quantificazione e controllo di qualità del DNA. Vedere la Figura 2 per risultati di valutazione di qualità rappresentative.
Nota: La concentrazione delle librerie ATAC-seq deve essere > 1 ng / µ l per ottenere risultati di sequenziamento di qualità. In media, 30 nM a 25 µ l è stata ottenuta.
5. sequenziamento e analisi dei dati
Nota: Questa pipeline di analisi consente agli utenti di controllare la qualità di letture mapping di procedura, regolare le coordinate per il disegno sperimentale e chiamare picchi per analisi a valle. Di seguito sono le linee di comandi e la spiegazione di esecuzione. Il pacchetto di analisi dei dati è disponibile presso (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).
- Sequenza le librerie preparate su un sequencer di prossima generazione per una profondità di lettura media di 42 milioni di letture per campione.
- Stimare la qualità di sequenziamento letture controllando i file generati da FastQC12 pacchetto software utilizzando il comando:
fastqc -o < output_directory >< fastq_file > - Trim, le basi di letture di Trimmomatic13 software, se necessario, come determinato dal controllo di qualità FastQC, utilizzando il comando (per coppia-ended):
java-jar < percorso file jar trimmomatic > PE < input1 >< input2 >< accoppiati output1 >< spaiato output1 >< accoppiati output2 >< spaiato output2 > HEADCROP: < ritagliare basi > - Allineare il software14 Bowtie2 letture al genoma umano di riferimento (hg38):
bowtie2 - x < genoma di riferimento > -1 < coppia di ingressi 1 >< coppia di ingressi 2 > -S < file di output SAM >
Nota: L'argomento - x è per il nome di base dell'indice per il genoma di riferimento, e -S è per l'output del formato di SAM. - Verifica thequality di letture mappate utilizzando Samtools15 flagstat pacchetto:
samtools flagstat < file BAM > - Ordinare il file mappato letture e rimuovere i duplicati utilizzando Picard16 tool:
java-jar picard.jar SortSam INPUT = < nome file di input SAM > OUTPUT = < nome del file di output ordinato BAM > SORT_ORDER = coordinate "e" java-jar picard.jar MarkDuplicates INPUT = < file ordinato BAM > OUTPUT = < file di output BAM senza duplicati > REMOVE_DUPLICATES = TRUE - File indice BAM, tagliare le letture di cromosoma inutilizzati e spostare le coordinate per la ragione sperimentale di ATAC-seq17:
java-jar picard.jar BuildBamIndex INPUT = < file BAM >
samtools idxstats < file Input BAM > | cut -f 1 | grep - v chrY | grep - v chrM | grep - v chrUn | xargs samtools Mostra -b < file Input BAM >>< Output assettato file BAM >
bedtools bamtobed -i < Input assettato file BAM >>< Output assettato file letto >
awk ' iniziare {OFS = "\t"}; {Se ($6 = = "+") print $1, $2 + 4, $3 + 4, $4, $5, $6; else print $1, $2-5, 3-5 $, $4, $5, $6}' < Input assettato file letto >< parzialmente rasato spostato file letto > - Eliminare le letture che sono spostate al coordinamento negativo:
awk '{if ($2 > 0) print $1 "\t" $2 "\t" $3 "\t" $4 "\t" $5 "\t" $6}' < Input BED file >< file di Output non negativo coordinamento letto >. - Consente di convertire il file letto file BAM per l'analisi di18 DiffBind seguente:
bedtools bedtobam -i < file Input letto > -g < riferimento genoma >< file di Output BAM > - Eseguire la chiamata di picco di DiffBind18 pacchetto software:
macs2 callpeak -t < file Input BAM > -f BAM -g hs - nomodel - nolambda - tenere-dup tutti-- chiamata-sommità - outdir < percorso della directory di Output > - n < nome Output > -B - q 0.01 - bdg - MAIUSC -100 - extsize 200
Nota: Dopo il filtraggio, si aspettano una mediana di 37 milioni di letture per campione. Contaminazione da DNA mitocondriale spazieranno da 0,30% – 5,39% (1,96% in media). Ci sarà un basso tasso di moltiplicare mappate letture (6,7%-56%, 19% in media) e una percentuale relativamente alta di utilizzabile nucleare legge (60%-92%, 79% in media).
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Representative Results
A partire da 15 mL di sangue intero fresco, questo protocollo genera una media di 1 milione di cellule T CD4 +. Questi possono essere congelati per la successiva elaborazione o utilizzati immediatamente. Vitalità delle cellule T CD4 +, fresche o scongelate, era costantemente > 95%. Questo metodo di isolamento delle cellule T CD4 + consente flessibilità nel tempo di materiale e raccolta di origine. Questo protocollo di ATAC-seq migliorato produce una raccolta finale di più maggior di 1 ng / µ l per il sequenziamento. Controllo di qualità effettuato utilizzando sistemi commercialmente disponibili dovrebbe dimostrare frammenti di DNA tra 200 e 1.000 bp (Figura 2). L'ordinamento deve essere eseguita solo con le librerie di alta qualità.
Tutte le librerie sono state sequenziate per una profondità media di maggiore di 40 milioni di leggere per campione. Mentre protocolli ATAC-seq comunemente utilizzati sono stati sfidati da contaminanti sequenziamento letture da DNA mitocondriale che può variare da 50-60% del totale sequenziamento letture1 questo protocollo migliorato Elimina il problema. Seguendo questo protocollo preparate le librerie contengono in media solo 3% mitocondriale letture (Figura 3A). L'alta percentuale di letture utilizzabile è sufficientemente costante attraverso replicati biologici (Figura 3B). Il protocollo è stato in grado di fornire risultati altamente riproducibili attraverso tecniche replicati (Figura 4A, B) saranno replicati biologici (Figura 4, D). Inoltre, il protocollo per attivazione a cellula T CD4 + presentato prende 48h anziché una settimana o più e provoca l'attivazione coerenza ed efficace, come dimostrato dai risultati riproducibili sequenziamento (Figura 4A, B). Predetto ATAC-seq picchi vengono chiamati con precisione tramite la pipeline di analisi (Figura 4E). Analisi dei risultati di sequenziamento identificato Cancella modifiche nello stato della cromatina durante l'attivazione delle cellule T umane. Le regioni differenzialmente accessibili della cromatina aperta sono state identificate tra sei campioni prima e dopo 48 h di attivazione (Figura 5).
Figura 1: Panoramica sperimentale del protocollo modificato ATAC-seq. (A) esempio di acquisizione e l'elaborazione, da 15 mL di sangue intero paziente attraverso CD4 + T cell isolamento, placcatura e l'attivazione delle cellule T e isolamento di nuclei con il buffer di lisi migliorata. (B) La transposase reazione e l'amplificazione di PCR della libreria di sequenziamento. (C) analisi qualità, sequenziamento e analisi dei dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: librerie ATAC-seq rappresentante di alta qualità da una piattaforma basata su microfluidica per dimensionamento, quantificazione e controllo di qualità del DNA. (A) immagine di gel elettronico dei campioni B1 e D1 con la fascia tra 200 e 1.000 paia di basi. (B e C) Risultato di traccia elettroferogramma di campioni B1 (B) e D1 (C), con picchi tra 200 e 1.000 paia di basi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: è diminuito di contaminazione da DNA mitocondriale con i risultati di protocollo ATAC-seq migliorati in un aumento di letture di sequenziamento del DNA utilizzabile. (A) confronto tra utilizzabile legge (viola), duplicato legge (verde) e letture mitocondriale (rosso) da CD4 + T cell ATAC-seq profilatura nella letteratura. (B) confronto tra utilizzabile legge (viola), duplicato legge (verde), legge mitocondriale (rosso) e letture non mappate (blu) di CD4 + T cell ATAC-seq profilatura da più individui sani (n = 22). Questa figura è stata modificata da Cheng et al.10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: migliorato l'accuratezza e riproducibilità protocollo ATAC-seq. A dispersione trame di accessibilità della cromatina (segnale ATAC-seq, x e y) per due replicare gli esperimenti di non stimolate (A; 36.486 Th picchi) o attivato (B; 52.154 Thstim picchi) cellule T dimostra riproducibilità tecnica. L'accessibilità della cromatina per cellule di T attivate dagli individui IGTB1191 (asse y) e IGTB1190 (asse x) (C) e istogramma delle correlazioni tra ogni paia degli individui per le cime di Thstim 52.154 (D) dimostra riproducibilità tra gli individui. (E) ATAC-seq picchi chiamato con il nostro protocollo di ATAC-seq migliorata al cromosoma 19 Q13.12. Questa figura è stata modificata da Cheng et al.10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: risultati rappresentante ATAC-seq delle modifiche nello stato di cromatina dopo l'attivazione di CD4 + T-cell. (A) sperimentale Panoramica (a sinistra) e nomenclatura (a destra). (B) regioni differenzialmente accessibile della cromatina aperta (colonne) in sei campioni (righe) prima (in alto, Th) e dopo (in basso, Thstim) attivazione di 48 h di cellule T CD4 + primarie. Questa figura è stata modificata da Cheng et al.10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 2 x TD Buffer | 25 Μ l |
| Tn5 enzima | 5 Μ l |
| Acqua gratuita nucleasi | 20 Μ l |
| Volume totale | 50 Μ l |
Tabella 1: Componenti di reazione transposase passo 3.2.
| Ad1_noMX: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG |
| AD2.1_TAAGGCGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCGCCTTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.2_CGTACTAG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.3_AGGCAGAA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.4_TCCTGAGC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.5_GGACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.6_TAGGCATG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATGCCTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.7_CTCTCTAC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.8_CAGAGAGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTCTCTGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.9_GCTACGCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCGTAGCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.10_CGAGGCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGCCTCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.11_AAGAGGCA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCCTCTTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.12_GTAGAGGA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCTCTACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.13_GTCGTGAT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCACGACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.14_ACCACTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAGTGGTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.15_TGGATCTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.16_CCGTTTGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACAAACGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.17_TGCTGGGT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACCCAGCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.18_GAGGGGTT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAACCCCTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.19_AGGTTGGG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCCAACCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.20_GTGTGGTG CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACCACACGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.21_TGGGTTTC CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAAACCCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.22_TGGTCACA CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTGACCAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.23_TTGACCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGGTCAAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
| AD2.24_CCACTCCT CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTGGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT |
Tabella 2: ATAC-seq oligos disegni utilizzati per PCR.
| Acqua gratuita nucleasi | 11,9 Μ l |
| 100 µM personalizzato Nextera Primer 1 (tabella 2) | 0,6 Μ l |
| NEBNext ad alta fedeltà 2 x PCR Master Mix | 25 Μ l |
| ATAC-Seq biblioteca | 10 Μ l |
| 25 µM personalizzato Nextera Primer 2 (tabella 2) | 2,5 Μ l |
| Volume totale | 50 Μ l |
Tabella 3: Miscela di reazione PCR iniziale passo 3.5.
| PASSAGGIO DI CICLO | TEMPERATURA | TEMPO | CICLI |
| Estensione | 72 ° C | 5 min | 1 |
| Denaturazione iniziale | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturazione | 98 ° C | 10 s | 10 |
| Ricottura | 63 ° C | 30 s | |
| Estensione | 72 ° C | 1 min | |
| Tenere premuto | 4 ° C | Infinity | 1 |
Tabella 4: Programma in bicicletta per l'amplificazione 3.5 passo iniziale PCR.
| Aliquota di reazione di PCR | 5 Μ l |
| Cocktail PCR dalla tabella 3 con 0,6 x Syber verde | 10 Μ l |
Tabella 5: Mix di reazione qPCR passo 3.6.
| PASSAGGIO DI CICLO | TEMPERATURA | TEMPO | CICLI |
| Denaturazione iniziale | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturazione | 98 ° C | 10 s | 20 |
| Ricottura | 63 ° C | 30 s | |
| Estensione | 72 ° C | 1 min | |
| Tenere premuto | 4 ° C | Infinity | 1 |
Tabella 6: Programma bike al passo 3.6 qPCR.
| PASSAGGIO DI CICLO | TEMPERATURA | TEMPO | CICLI |
| Denaturazione iniziale | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Denaturazione | 98 ° C | 10 s | Come determinato |
| Ricottura | 63 ° C | 30 s | |
| Estensione | 72 ° C | 1 min | |
| Tenere premuto | 4 ° C | Infinity | 1 |
Tabella 7: Il programma ciclismo passo 3.7 PCR per l'amplificazione di PCR finale.
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Discussion
Il protocollo modificato di ATAC-seq presentato in questo articolo fornisce risultati riproducibili con contaminazione minima di DNA mitocondriale. Il protocollo è stato usato per con successo caratterizzano l'architettura della cromatina di umano primario PBMCs10, monociti umani, le cellule dendritiche (inedite) del mouse, e linee cellulari di melanoma coltivate11. Anticipiamo la lisi migliorata condizione ha il potenziale di lavorare per altri tipi di cellule pure. È anche previsto che questo protocollo di isolamento di nuclei saranno compatibile con nuclei singoli protocolli ATAC-seq, riducendo al minimo la contaminazione da DNA mitocondriale per migliorare i risultati del sequenziamento.
Un ulteriore vantaggio di questo protocollo modificato è la capacità di congelare lotti di cellule T CD4 + isolate da PBMCs in momenti diversi a seconda della disponibilità dei campioni dei pazienti. Come ATAC-seq potranno quindi essere eseguite contemporaneamente su tutti i campioni, potenziali bias di effetto di batch nella transposase reazione e il sequenziamento è ridotto al minimo10. È fondamentale che quello mezzo di congelamento essere fatta fresca con ogni uso, al fine di mantenere la redditività alta che si ottiene con questo protocollo di congelamento-scongelamento. Attuabilità delle cellule T CD4 + isolate dovrebbe rimanere superiore al 90% al fine di evitare la digestione non specifico nel transposase reazione1.
Siete pregati di notare che l'ulteriore ottimizzazione può essere richiesto per poter utilizzare questo protocollo con quantitativi e i tipi di cella variabile. Poiché il rapporto di transposase-a-nuclei Tn5 è stato ottimizzato per 500.000 nuclei nel presente protocollo, se eseguendo ATAC-seq con un diverso numero di nuclei, la quantità di Tn5 transposase dovrebbe essere adeguata di conseguenza. Sovra-lisi dei nuclei a causa di un eccesso di Tn5 può portare a un'elevato background da cromatina chiusa e bassa complessità delle librerie di sequenziamento, mentre sotto-Lisi non possono fornire una completa PCR amplificato library1. Per evitare queste complicazioni, si consiglia di eseguire i nuclei attenti conteggio e ottimizzare il rapporto Tn5 come necessario. Per migliorare ulteriormente la qualità dei dati, si consiglia di ottimizzare cicli di amplificazione di PCR di qPCR monitoraggio. Se la libreria finale subisce troppi cicli di amplificazione, ci può essere pregiudizi introdotto nel sequenziamento dati2. Si consiglia di eseguire il controllo di qualità adeguata delle librerie ATAC-seq prima del sequenziamento di nuova generazione al fine di risparmiare tempo e denaro.
Come abbiamo dimostrato, un buffer di lisi modificate è la chiave per la riduzione della contaminazione da DNA mitocondriale ed è efficace su una vasta gamma di tipi di cellule. Altri protocolli hanno affrontato la questione della contaminazione mitocondriale con alternativa lysis buffer7,19 o dal processo intensivo di un CRISPR-mediata mitocondriale del DNA lo svuotamento20. Il nostro protocollo di ATAC-seq alternativo contribuisce agli sforzi volti a ridurre la contaminazione da DNA mitocondriale di sequenziamento letture con un tampone di lisi migliorata e conservazione della semplicità di ATAC-seq che rende una tecnica così accessibile. Insieme a sequenza di singola cellula e RNA-seq, ATAC-seq è un potente strumento per esplorare regolazione epigenetica. Questo ha migliorato il protocollo ATAC-seq e pacchetto di analisi di dati vi aiuterà a ridurre i costi di sequenziamento e produrre risultati di qualità superiore.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Atsede Siba per il supporto tecnico. C.s.c. è supportato da NIH grant 1R61DA047032.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS, Sterile | Gibco | 10010023 | Can use other comparable products. |
| 5810/5810 R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets | Eppendorf | 22625501 | Can use other comparable products. |
| 96 Well Round Bottom Plate | Thermo Scientific | 163320 | Can use other comparable products. |
| Agilent 4200 Tape Station System | Agilent | G2991AA | Suggested for quality assessment. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Can use other comparable products. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Can use other comparable products. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Critical Component |
| Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Critical Component |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Critical Component |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Can use other comparable products. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 50674626 | Suggested for quality assessment. |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade | Sigma | M2393 | Can use other comparable products. |
| MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer) | Qiagen | 28004 | Critical Component |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Can use other comparable products. |
| NaCl, Molecular Biology Grade | Sigma | S3014 | Can use other comparable products. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Critical Component |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
| Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Can use other comparable products. |
| Polysorbate 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Can use other comparable products. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Critical Component |
| Precision Water Bath | Thermo Scientific | TSGP02 | Can use other comparable products. |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | Critical Component |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Suggested for quality assessment. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Suggested for quality assessment. |
| Rosette Sep Human CD4+ Density Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Critical Component |
| Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15022 | Critical Component |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Can use other comparable products. |
| Sterile Resevoir | Thermo Scientific | 8096-11 | Can use other comparable products. |
| T100 Thermocycler with Heated Lid | BioRad | 1861096 | Can use other comparable products. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Can use other comparable products. |
References
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).
- Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis. Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Rosenberg, A. B., et al. Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science. 360 (6385), 176-182 (2018).
- Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
- Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).
- Lara-Astiaso, D., et al. Chromatin state dynamics during blood formation. Science. 345 (6199), 943-949 (2014).
- Gate, R. E., et al. Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans. Nature Genetics. , (2018).
- Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
- Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2018).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Broad Institute. Picard Tools. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2018).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from: http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf (2018).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Wu, J., et al. The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos. Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).
