Summary
Здесь мы представляем воспроизводимый метод для разработки модели ортотопическая мышиных плоскоклеточный рак головы и шеи. Опухолей продемонстрировать клинически значимых Гистопатологические особенности заболевания, в том числе некроза, бедных дифференциации, узловой метастазов и иммунных инфильтрации. Опухоль подшипник мышей развивать клинически значимых симптомов, включая дисфагии, перемещение челюсти и потеря веса.
Abstract
Голова и шея плоскоклеточный рак (HNSCC) является изнурительным и смертельной болезни с высокой распространенностью повторения и неэффективности лечения. Разработать более терапевтические стратегии, важно понимание опухоли microenvironmental факторов, влияющих на сопротивление лечения. Основным препятствием для понимания механизмов болезни и повышение терапии был недостаток мышиных клеточных линий, которые напоминают агрессивным и метастатического характера человека HNSCCs. Кроме того большинство мышиных моделях используют подкожных имплантаций опухолей, которые не имеют важные физиологические особенности области головы и шеи, включая высокую плотность сосудистой, обширные лимфатический сосудистую и резидентов флоры слизистых оболочек. Целью данного исследования является развивать и характеризуют модель ортотопическая HNSCC. Мы используем две генетически различных мышиных клеточных линий и установленным опухоли слизистой мышей. Мы оптимизируем методы пищеварения на основе коллагеназы опухоли для оптимального восстановления единичных клеток от установленных опухоли. Представленные здесь данные показывают, что мышей весьма васкуляризированной опухоли, метастазы в регионарных лимфатических узлах. Одноклеточных многопараметрических массового cytometry анализ показывает наличие различных иммунных населения с миелоидных клеток, представляющих большинство всех иммунных клеток. Модели, предлагаемые в настоящем исследовании имеет применение в биологии рака, опухоли иммунологии и предклинической разработки Роман терапии. Сходство ортотопическая модели клинические особенности течения заболеваний человека будет служить инструментом для расширения перевода и улучшения результатов лечения пациентов.
Introduction
HNSCC является пятым наиболее распространенных злокачественных во всем мире, с более чем 600 000 больных диагностируется ежегодно1. Несмотря на агрессивное лечение с участием химиотерапии и лучевой терапии (RT) общий показатель выживаемости (ОС) для HNSCC пациентов без инфекции вируса папилломы человека (ВПЧ) остается ниже 50% после 5 лет2. Это в значительной степени объясняется весьма сложным опухоли микроокружения как опухоли могут быть получены из нескольких различных анатомических сайтов в регионе головы и шеи, включая слизистой оболочки рта, язык, слово рот, полости носа, ротовой полости, глотки, ротоглотки и гортаноглотки. Кроме того головы и шеи регион весьма васкуляризированной и содержит почти половина всех лимфатических узлов в тело3. Большинство исследований, изучения биология опухоли головы и шеи полагаются на модели опухоли в регионе фланге. Такие модели могут предложить проницательность в опухоль внутренние механизмы, но отсутствие родной микроокружения головы и шеи может существенно повлиять трансляционная потенциал таких выводов. Один метод, который был использован для устных опухолей является воздействие канцерогенов 9,10-диметил-1,2-benzanthracene (DMBA)4. Однако, этот метод связан с длительным процессом, индуцирует опухоли в хомяков и крыс, но не в мышей, и результирующая опухоли не обладают многие из Гистологические особенности дифференцированного SCCs5,6. Введение carcinogen4-nitroquinoline 1-оксида (4-NQO), производная водорастворимый хинолона, привели к мыши устных опухолей при применении устно, но также страдают от долгое время экспозиции (16 недель) и ограниченного принять ставку в пределах и между сериями мышей,8,,7,9. Для того, чтобы развивать клинически значимые модели, несколько групп используются генетически модифицированные модели с участием манипуляции драйвер онкогенов или генов супрессоров опухолей, в том числе TP53, TGFB, КАРСТ, HRA и SMAD410. Эти модели может предложить понимание опухоли с известных драйверов генов, но не повторить сложные неоднородность человеческого HNSCCs.
В этой работе мы продемонстрировать возможность выполнения прививкой intramucosal клеток плоскоклеточный рак у мышей. Привитых клетки развиться в агрессивные опухоли в течение 1 недели после инъекции. Подобно человеческого HNSCCs, опухоли метастазы в регионарных лимфатических узлах. Мы характеризуют гистологические и клинических особенностей заболевания и обеспечить понимание иммунной микроокружения опухоли. Мы предлагаем, что эта ортотопическая модель HNSCC имеет применение в биологии рака, опухоли иммунологии и доклинические исследования. Механизмов иммунной уклонение, опухолевой прогрессии, лечение сопротивления и метастазов представляют области клинического значения, которые могут быть рассмотрены с использованием предлагаемой модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные процедуры выполнялись в соответствии с утвержденным институциональных животных ухода и использования Комитет (IACUC) протокол из университета Колорадо Денвер (протокол # 00250).
1. опухолевые клетки культуры
Примечание: B4B8 и LY2 клеточных линий были использованы для создания ортотопическая HNSCC опухоли: B4B8 опухолевые клетки были получены от канцероген трансформированных слизистой кератиноциты (от мышей BALB/C)11. LY2 опухолевые клетки были получены из лимфатических узлов метастазы спонтанно Преобразованный BALB/C кератиноцитов линия (Пэм 212)12,13. Обе линии клетки были любезно предоставлены доктор Надараджах, Vigneswaran (UTHealth, Хьюстон, Техас, США).
- Использование Дульбекко изменение орла средних (DMEM) F/12 с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% антимикробной реагент для обслуживания линии клеток. Поддержание этих клеточных линий в стерильных инкубатора при 37 ° C и 5% CO2. Клетки должны использоваться для прививок до более 15 ходов.
- Пластина 2 х 106 -4 x 106 клеток в колбах культуры клеток2 175 см.
Примечание: Клетки обеспечивают менее чем 90% притока, чтобы избежать вызывая реакции стресса. - Когда клетки являются 70% притока (~ 48 ч), удалите фляга из инкубатора и вымыть клетки 3 x с холодной фосфат амортизированное saline (PBS).
- Отсоедините клетки из колбы с помощью трипсин 0.25%, достаточно для покрытия поверхности пластины.
- Чтобы сделать это, отказаться от 4 мл трипсина в колбе2 175 см, содержащие 70% вырожденная клеток. Инкубируйте клетки с трипсином для 3-4 минут в инкубатор культуры клеток при 37 ° C и 5% CO2.
- Визуализируйте клетки под микроскопом для обеспечения мобильный отряд.
- Добавьте 12 мл СМИ DMEM F/12, содержащий FBS для нейтрализации активности трипсина.
- Аспирационная суспензию клеток и поместите его в 50 мл Конические трубки.
- Встряхнуть трубка, содержащая клетки путем переворачивать его 3 x-4 x.
- При необходимости смешать с 10 мкл Трипановый синий в пробки microcentrifuge Алиготе 10 мкл суспензии клеток и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева. Определить жизнеспособность клеток путем вычитания числа Трипановый сине положительных клеток от общего числа клеток и делим на общее количество клеток.
- Центрифуга суспензию клеток на 300 x g 5 мин при 4 ° C.
- Ресуспензируйте клеток в сыворотке крови свободных и без антибиотика DMEM на соответствующий объем, так что 1 x 10-6 клетки присутствуют в 50 мкл средств массовой информации.
Примечание: Основываясь на агрессивность линии в естественных условиях клетки (определяется эмпирически), 1 x 106 клеток на месте инъекции на мышь было сочтено уместным для B4B8 и LY2 клеток. - Место во флаконе, содержащего суспензию клеток на льду.
- Место предварительно размороженные базальной мембраны матрицы на льду.
Примечание: Матрица базальной мембраны был разморожен на ночь при 4 ° C.
2. ячейки инъекции в мышей
- Приготовить смесь 1:1 матрицы мембраны клеток: подвал (по 50 мкл).
- Добавление ячейки затем постепенно Пипетка матрице базальной мембраны. Избегайте введения пузырьков воздуха. Убедитесь, что смесь производится непосредственно перед инъекцией животных. Добавление матрицы базальной мембраны клеток для длительного периода времени может привести к ячейке, поселившись в матрице смесь, которая затрудняет тщательно встряхните смесь. Это приведет к значительной изменчивостью размера опухоли между мышей.
- Осторожно перемешать. Убедитесь, что выполняются все действия с участием матрицы на льду. Базальной мембраны матрица будет полимеризоваться при комнатной температуре.
- Подготовьте шприцы для прививки.
- Нагрузка 0,5 мл-шприцы (23 G) с 100 мкл раствора матрицы мембраны клеток/подвале.
- Храните шприцы на льду во избежание базальной мембраны матрица полимеризации.
- Анестезировать мышей, поместив их в камере с изофлюрановая и кислорода (2,5%).
- Убедитесь, что мышей глубоко под наркозом перед выполнением инъекций (путем обеспечения отсутствия реакции на щепотку мыс).
- Вставьте иглу в регионе щечной вправо или влево. Это осуществляется через имеющиеся открытое пространство по бокам рта.
- Убедитесь, что язык мыши не находится в пути.
Примечание: Это легко засунуть язык, который приведет к язык опухоли. При необходимости переместите язык на противоположной стороне. - Держите шприц параллельно щечной области внутри полости.
- Когда будете готовы придать, отступить шприц и медленно вставьте шприц углом 10°.
- Придать 100 мкл суспензии матрицы мембраны клеток/подвале в течение 5 s.
- Возьмите шприц в место для дополнительных 5 s для обеспечения всех материал закачивается.
Примечание: Для управления nontumor подшипник мышей инъекционные смеси сыворотки свободных СМИ и матрицы (как описано выше) без опухолевых клеток. - Осторожно снять шприц.
- Продолжите процедуру выше остальных мышей.
- Разрешить за 1 неделю до тех пор, пока опухоли начинают появляться грубо (3 50 – 200 мм для B4B8 и LY2 клетки).
3. Мониторинг мышь
- Выполните первое измерение при помощи штангенциркуля на 1 неделю после инъекции клеток опухоли. Чтобы вычислить объем опухоли, используя внешние суппортов, определяют наибольший продольный диаметр (длина) и наибольший поперечный диаметр (ширина) и использовать измененные эллипсоидальной формула14,15.
- Продолжать выполнять регулярные суппорта измерений для тома опухоли (1 x x-2 в неделю на регулярной основе).
- Измерения веса животных для оценки последствий роста опухоли на кормление.
4. заготовка опухоли
- Когда достигается экспериментальной конечной точки, усыпить животных, с использованием надлежащих мер (например, CO2 удушья, обезглавливание или шейки матки дислокации).
Примечание: В этом исследовании, конечной точки было достигнуто если мышей стала устаревшей (с потерей веса > 15% от их первоначального веса, отсутствие ухода, кахексия) или если размер опухоли достигло 1000 мм3. -
Начните, рассекает животного, создавая длинный разрез через по средней линии в области шеи.
- Использование тупой щипцы захватить кожи и острые ножницы, чтобы вырезать кожу.
- Вставьте ножницами аккуратно под кожей, охватывающих опухоли и создавать воздушные карманы, нажав ножницы через и в кожу.
- Как только кожа достаточно отсоединяется от опухоли, определить крылом лимфатические узлы (DLNs) и акцизных их избежать опухолевой ткани проклятый наличием лимфатических узлов.
Примечание: Большие опухоли может достигать и/или покрытия DLN. В зависимости от типа выполняемой пробирного изоляции нетронутыми лимфатических узлов необходимо, чтобы избежать утечки иммунных клеток в опухоли, которая приведет к искажению результатов анализа. - Вырежьте через границы опухоли до тех пор, пока весь объем отсоединяется.
5. опухоль, обработки нисходящие приложения
- По течению гистологическое обследование место опухоли в формалина 10% при комнатной температуре. Чтобы избежать overfixation, замените формалин 70% этиловом спирте. Для анализа потока цитометрии процесс опухоли, как описано ниже.
Примечание: Ткани могут храниться в формалин за 72 ч до overfixation может стать проблематичным для некоторых видов окрашивания. - Вырезать опухоль на 1 – 2 мм-размера куски с помощью стерильных лезвие бритвы или острыми ножницами.
- Место частей вырежьте опухоли в 50 мл Конические трубки с коллагеназы III (4250 единиц на сэмпл), DNase I (0,1 мг на сэмпл) и ингибитор трипсина (1 мг на сэмпл).
- Инкубируйте при 37 ° C за 30 мин при встряхивании каждые 10 мин.
Примечание: Образцы могут быть размещены в закрывающейся мешок, стерилизованное с 90% этанола и помещены в инкубатор культуры клеток. - После 30 мин добавьте 20 мл Хэнка сбалансированного солевого раствора (HBSS) и спина на 300 x g за 5 мин.
Примечание: HBSS состоит из хлорид калия, хлорид натрия, бикарбонат натрия, натрия фосфат двухосновной, монокальций фосфат натрия и глюкозы. - Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 2 – 3 мл буфера lysis эритроцитов (РБК). Пипетка строго.
Примечание: Буфер lysis РБК состоит из аммония хлорид, натрия бикарбонат и динатриевой. - Проинкубируйте 2 мин при комнатной температуре.
Примечание: Длительный инкубационный могут быть токсичными для других клеточных популяций. - Добавьте 20 мл HBSS для нейтрализации эффекта буфера lysis.
- Центрифуга на 300 x g 5 минут и удалить супернатант.
- Ресуспензируйте гранулы в 10 мл HBSS.
- Передать решение через 70 мкм нейлон фиксатор и центрифуги на 300 x g для 5 минут удалить супернатант.
- Повторите шаги 5,8 – 5,10 и передайте суспензию клеток через 40 мкм нейлон фиксатор, чтобы убедиться, что любые дополнительные мусор удаляется из подвеска.
6. ячейки окрашивание и сбора данных
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл HBSS.
- Подсчет количества ячеек, используя Горяева или счетчик автоматизированных клеток, как описано в шаге 1.7
-
Определите количество ячейке и соответствующей концентрации для окрашивания.
Примечание: идеальной клетки концентрация для потока цитометрии пятнать это 1-2 миллионов клеток. Например если окрашивание производится в 96-луночных тарелку и есть 10 миллионов клеток, Ресуспензируйте образца в 1 мл и пластины 100 мкл на 1 миллион клеток в колодец. -
Добавьте блок ФК (CD16/CD32) в концентрации 1: 100 для предотвращения привязки nonantigen специфических иммуноглобулинов в FcγIII и FcγII рецепторов. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга и Ресуспензируйте Пелле клеток в 100 мкл потока цитометрии ячейки пятнать буфера (состоит из солевой раствор, содержащий 5% FBS, ЭДТА 2% и 1% HEPES).
-
Выполняйте клеточной поверхности, окрашивание согласно предоставленных поставщиком инструкции (Добавление каждое антитело на соответствующие разрежения). Инкубируйте 60 мин при комнатной температуре.
- Центрифуга и Ресуспензируйте Пелле клеток в 100 мкл HBSS. Повторите 2 x, чтобы избавиться от избыточных антитела.
-
Запуск образцов на соответствующие проточный цитометр.
- Если анализ внутриклеточных маркеров (например, foxp3), выполняют клетки permeabilization и окрашивание согласно инструкциям поставщика.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В пробирке оценки LY2 и B4B8 пролиферации клеток показали, что обе линии клетки имеют аналогичные удвоение раз (21 h и 23 h, соответственно). In vivo, обе линии клетки сформировали единый, видимым и ощутимым массы в течение 1 недели прививка (рис. 1A). В мышах с учетом LY2 опухоли челюсть было смещено 3 недели из-за опухоли бремя (рис. 1A). Контроль мышей, которые не получили опухолевые клетки не развиваются опухоли как ожидалось. LY2 опухоли росла более высокими темпами по сравнению с B4B8 опухоли. Объем средняя опухоли на 21 день в LY2 опухоли подшипник мышей было 632 ± 10 мм3 по сравнению с 162 ± 4 мм3 в B4B8 опухоли (рис. 1B). Мышей, экспонируется челюсть перемещения быстро разработал потеря веса за счет дисфагия (рис. 1 c). Мышей, экспонирование значительный вес потеря определяется как > 15% от их первоначального веса и/или имеющие объем опухоли > 1 см3 были умерщвлены в течение 1 дня отмечалось наблюдения. Медиана выживаемости мышей LY2 составила 22,5 дней, по сравнению с 52,0 дней в B4B8 опухоль подшипник мышей (рис. 1 d).
Магнитно-резонансная томография (МРТ) опухоли подшипник мышей показало четко разграниченные опухоли, расширяя во внутренний слой слизистой оболочки (рис. 2A). Опухоли не сделал вторгнуться в язык или другие близлежащие органы (вилочковой железы, пищевода, бронхов), как показано с гистологическим оценки. Гетерогенность сигнала на изображения МРТ был представитель присутствия васкуляризированной hyperintense регионах (обозначаются знаком V) и некротические hypointense (обозначается с N) (рис. 2A). Брутто морфологического исследования показали расширенного DLNs (рис. 2B). Мы далее оценивать объем опухоли с компьютерная томография (КТ) для определения надежности измерений суппорта. Опухоли были определены с использованием цифровых изображений и коммуникации в медицине (DICOM) изображения анализ программного обеспечения16. Оценка объема опухоли LY2 суппортов и КТ показал отличную корреляцию между двумя методами (R2 = 0.8493; Рисунок 2 c). Это означает, что рост опухоли является главным образом экзофитный и суппорт измерение является надежным методом для оценки роста опухоли. Гистологическое обследование показало, что все LY2 опухоль подшипник мышей разработаны слабо дифференцированной плоскоклеточный рак (Рисунок 2D). Девять из девяти LY2 опухоли подшипник мышей разработаны метастазов в лимфатические узлы первого и второго эшелона. Узловой метастазы были главным образом подкапсулярный (с семь из девяти мышей) и внутри пазухи (с пяти из девяти мышей), с двумя из девяти мышей, демонстрируя Внутрикапсульный вторжения. В отличие от мышей, принимая B4B8 опухоли, умеренно развитые продифференцировано плоскоклеточный рак (Рисунок 2E) и не метастазировать в региональном или отдаленные места, включая DLNs. некроз оценивали на основании ранее установленных три класса Масштаб: 0 = нет видимых некроз, 1 = скудную, 2 = умеренный и 3 = тяжелая17. Все мыши опухоль подшипник LY2 гистологически подтвердил некроз с большинством (семь из десяти) демонстрирует умеренной до тяжелой некроза (Рисунок 2F). В B4B8 опухолей было отмечено никаких признаков некроза.
Мы сосредоточились на LY2 опухоли модель для дальнейшей характеризации микроокружения опухоли иммунной. Опухоли были собраны на 3 недели после прививки опухолевых и переваривается с помощью коллагеназы III, после окрашивания поверхности клетки и внутриклеточных маркеров для потока/масса цитометрии (рис. 3A). Образцы были обработаны, с помощью массового цитометр, в университете Колорадо Денвер потока цитометрии общих ресурсов. Gating и анализ данных проводились с помощью потока цитометрии коммерческого программного обеспечения. Полученные данные показали присутствие многочисленных иммунных клеток населения в различной степени. Всего иммунных клеток (CD45+) представлял 7,3% общего опухоли (рис. 3B). В абсолютных цифрах, мы наблюдали, в среднем, 26 CD45+ клетки (SD = 0,81) на миллиграмм опухолевой ткани (рис. 3B). Миелоидных клеток (CD11b+) представлены 37,8% всех CD45+ клеток (рис. 3 c). Миелоидные клетки были в основном состоит из макрофагов (F4 / 80 +, 63,0%), а затем клетки миелоидного производные супрессор (MDSCs) (Gr1 +, 8.51%) и нейтрофилов (Ly6G +, 5,87%). Общая Т-клетки составила 15,9% CD45 с уровнем CD4-клеток+ + T клетки, включающий большинство всех Т-клеток (79.4%), из которых 53,4% были регулирования T клетки (Tregs) (CD4+FoxP3+) (рис. 3D). Естественных киллеров (NK) составила 1,75% всех CD45+ клеток. Эти данные выделите присутствие различных иммунных проникает в LY2 ортотопическая HNSCC опухолей, которые могут играть определенную роль в посредничестве прогрессии опухоли и иммунной уклонение.
Рисунок 1: мониторинг мышей, принимая ортотопическая опухоли HNSCC. (A) представитель изображения опухоли подшипник мышей. Привитых щечной опухоль развивается в течение 1 недели прививка. На 3 недели наблюдается смещение челюсти. (B) темпы роста опухоли в B4B8 и LY2 мышей опухоли подшипник как определяется суппорта измерений. (C) изменения веса тела мышей, принимая B4B8 или LY2 опухоли. (D) выживание B4B8 и LY2 опухоли подшипник мышей. Бары представляют Среднеквадратичная ошибка среднего (SEM) 7 – 10 мышей на группу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: изображений и гистологические особенности мышиных опухолей HNSCC. (A) представитель корональных изображение Мистер LY2 опухоль подшипник мыши. Анатомический сайты помечены. Области hyperintensity сигнала представляют васкуляризированной регионов (обозначается V). Регионах сигнала hypointensity представляют собой области, некротические (обозначения N). (B) представитель брутто изображение расчлененных опухоли содержащих региона. Белые стрелки указывают на увеличенных лимфоузлов слива (DLNs). (C) соотношение объема опухоли по оценке суппорта измерения против компьютерная томография (КТ)-на основе оценки. Склон, коэффициент корреляции (R2) и линии наилучшего отображаются. (D) представитель гематоксилином и эозином (H & E) изображение LY2 опухоли. (E) представитель H & E изображение B4B8 опухоли. (F) количественное определение некроза опухоли LY2, основанный на H & E четыре класса балльной системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: анализ базовых внутриопухолевых иммунитета населения с использованием цитометрии на время полета (CyTOF). Опухоли были обработаны в одну ячейку подвеска с помощью ферментативного пищеварения на основе коллагеназы и, затем, окрашенных с клеток поверхности и внутриклеточных маркеров. (A) масса цитометрии была выполнена с использованием платформы CyTOF. (B) абсолютные и относительные количественной оценки общего числа иммунных клеток (CD45+). (C) количественная оценка миелоидного иммунной субпопуляций. (D) количественная оценка лимфоидных иммунной субпопуляций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Тщательный анализ и характеристика микроокружения опухоли представляют важной стратегией для понимания механизмов развития опухоли, прогрессии, и метастазов и для разработки эффективной терапии. Рак головы и шеи является сложное заболевание, которое может быть взято из нескольких анатомических сайтов в области головы и шеи. Основным препятствием для понимания механизмов болезни и повышение терапии был недостаток мышиных мыши клеточных линий, которые напоминают агрессивным и метастатического характера человека HNSCCs. Кроме того многочисленные мышиных моделях используют подкожной имплантации опухолей, которые не имеют важные физиологические особенности области головы и шеи, включая высокую плотность сосудистой, обширные лимфатический сосудистую и резидентов флоры слизистых оболочек.
В этом исследовании мы характеризуется ортотопическая модель мышиных HNSCC. Мы выбрали слизистой как сайт опухоли прививка для целого ряда причин, включая легкий доступ в регион без необходимости для руководства изображения, возможность оценить рост опухоли, при помощи штангенциркуля, наличие опухоли в пределах слизистой флоры, присутствие окружающие лимфатические и легкость, воспроизводимости. Хотя инъекции клеток в слизистой прямой, позиционирование иглы и глубина проникновения имеют решающее значение для предотвращения проколов через кожу и убедитесь, что клетки не вводят подкожно. Мы рекомендуем вставки иглы внутри устно, хотя это совершенно параллельно в регионе Щечной и наклон на угол не более 10 °, когда будете готовы придать.
Линии клетки, которые мы использовали были мышиных клеточных линий, позволяя их имплантации в иммунокомпетентных мышей штамма, что они были получены от. Есть более 39 HNSCC линий клеток человека, которые были изучены в литературе, но не могут быть использованы при наличии родной микроокружения18. Последние события позволили для разработки моделей гуманизированные мыши, которые интегрируют человека кости-костного мозга производные химер NOD scid гамма мышей (также известный как ГЯП мышей), позволяя развитие иммунной системы человека, которые могут взаимодействовать с человека опухоли в иммунодефицитных мыши модель19. Однако такие модели являются дорогостоящими, требуют кропотливого разведения методов и не повторить все компоненты микроокружения опухоли, включая эндотелиальных клеток, фибробластов и лимфатические. Мышиных мыши модели, которую мы заняты в этом исследовании пилки критические компоненты человеческого HNSCCs, включая присутствие различных иммунных инфильтратов. Для обеспечения максимальной поиска жизнеспособных одной клетки из опухоли, необходимо использование ферментов для переваривания. Ферменты пищеварения на основе коллагеназы может быть суровым на клетки и оптимизации концентрации и тип коллагеназы могут быть необходимы для типов различных опухолей. Мы сравнили пять ферменты пищеварения прежде чем определить, что коллагеназы III, который был использован в этом исследовании, является оптимальный метод для переваривания плоскоклеточный клеток опухоли.
Опухоль модели, используемые в данном исследовании являются особенно полезными для изучения механизмов иммунной уклонение HNSCC и доклинической оценке различных терапий. Ранее мы показали, B4B8 и LY2 опухоли являются радиационно и тугоплавких анти PD-L1 ингибитором иммунной контрольно-пропускного пункта20. Это согласуется с большинством человеческого HNSCCs. Последние клинические исследования показали, что меньше, чем 15% больных HNSCC реагируют на анти PD-1/PD-L1 терапии21,,2223,24,25. Кроме того хорошо известно, что HNSCCs являются радиационно26,27. Ориентация пути ответственных за радиостойкость в HNSCC является важным шагом для улучшения лечения ответ. Наземный ориентир Боннер et al. исследования показали значительное преимущество в общей выживаемости с добавлением cetuximab RT, по сравнению с RT только в больных местнораспространенным HNSCC28. Последние данные показывают, что ингибирование EphB4-Эфрины-B2 сигнализации в ортотопическая HNSCCs можно улучшить ответ на RT или cetuximab-RT путем поощрения апоптоз опухолевых и сдерживает распространение опухоли29,30. Кроме того сочетая RT с рациональной иммунной терапии можно дополнить противоопухолевого иммунного ответа и укрепления местной опухоли управления и контроля отдаленных метастазов31. Недавно мы продемонстрировали, что ориентация Tregs в сочетании с блокады иммунной контрольно-пропускной пункт и RT приводит к ликвидации опухоли и иммунологической памяти32. Будущие исследования, используя ортотопическая модели HNSCC будет лучше информировать дизайн клинических испытаний и улучшить понимание механизмов иммунной уклонение опухоли и лечение сопротивления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Нет
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase III | Worthington Biochemical Corp. | LS004183 | |
| DNase I | Worthington Biochemical Corp. | LS006328 | |
| Fc Block (CD16/32) | BD Biosciences | 553141 | Clone 2.4G2 |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14175079 | no calcium, no magnesium, no pheno red |
| Helois mass cytometer | Fluidigm | NA | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB-40234B | |
| MRI Scanner | Bruker | NA | 7.4 Tesla |
| RBC lysis buffer | BioLegend | 420301 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington Biochemical Corp. | LS002830 |
References
- Chaturvedi, A. K., et al. Worldwide trends in incidence rates for oral cavity and oropharyngeal cancers. Journal of Clinical Oncology. 31 (36), 4550-4559 (2013).
- Ang, K. K., Sturgis, E. M. Human papillomavirus as a marker of the natural history and response to therapy of head and neck squamous cell carcinoma. Seminars in Radiation Oncology. 22 (2), 128-142 (2012).
- Amin, M. B., et al. The Eighth Edition AJCC Cancer Staging Manual: Continuing to build a bridge from a population-based to a more "personalized" approach to cancer staging. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (2), 93-99 (2017).
- Salley, J. J. Experimental carcinogenesis in the cheek pouch of the Syrian hamster. Journal of Dental Research. 33 (2), 253-262 (1954).
- Morris, A. L. Factors influencing experimental carcinogensis in the hamster cheek pouch. Journal of Dental Research. 40, 3-15 (1961).
- MacDonald, D. G. Comparison of epithelial dysplasia in hamster cheek pouch carcinogenesis and human oral mucosa. Journal of Oral Pathology & Medicine. 10 (3), 186-191 (1981).
- Hawkins, B. L., et al. 4NQO carcinogenesis: a mouse model of oral cavity squamous cell carcinoma. Head & Neck. 16 (5), 424-432 (1994).
- Tang, X. H., Knudsen, B., Bemis, D., Tickoo, S., Gudas, L. J. Oral cavity and esophageal carcinogenesis modeled in carcinogen-treated mice. Clinical Cancer Research. 10 (1 Pt 1), 301-313 (2004).
- Vered, M., Yarom, N., Dayan, D. 4NQO oral carcinogenesis: animal models, molecular markers and future expectations. Oral Oncology. 41 (4), 337-339 (2005).
- Bornstein, S., et al. Smad4 loss in mice causes spontaneous head and neck cancer with increased genomic instability and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 119 (11), 3408-3419 (2009).
- Thomas, G. R., Chen, Z., Oechsli, M. N., Hendler, F. J., Van Waes, C. Decreased expression of CD80 is a marker for increased tumorigenicity in a new murine model of oral squamous-cell carcinoma. International Journal of Cancer. 82 (3), 377-384 (1999).
- Yuspa, S. H., Hawley-Nelson, P., Koehler, B., Stanley, J. R. A survey of transformation markers in differentiating epidermal cell lines in culture. Cancer Research. 40 (12), 4694-4703 (1980).
- Chen, Z., Smith, C. W., Kiel, D., Van Waes, C. Metastatic variants derived following in vivo tumor progression of an in vitro transformed squamous cell carcinoma line acquire a differential growth advantage requiring tumor-host interaction. Clinical & Experimental Metastasis. 15 (5), 527-537 (1997).
- Euhus, D. M., Hudd, C., LaRegina, M. C., Johnson, F. E.
- Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).
- Yushkevich, P. A., et al. User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability. NeuroImage. 31 (3), 1116-1128 (2006).
- Dutta, S., et al. The relationship between tumour necrosis, tumour proliferation, local and systemic inflammation, microvessel density and survival in patients undergoing potentially curative resection of oesophageal adenocarcinoma. Britisch Journal of Cancer. 106 (4), 702-710 (2012).
- Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research. 12 (4), 571-582 (2014).
- Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual Review of Pathology. 12, 187-215 (2017).
- Oweida, A., et al. Ionizing radiation sensitizes tumors to PD-L1 immune checkpoint blockade in orthotopic murine head and neck squamous cell carcinoma. OncoImmunology. 6 (10), e1356153 (2017).
- Ferris, R., et al. Further evaluations of nivolumab (nivo) versus investigator’s choice (IC) chemotherapy for recurrent or metastatic (R/M) squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN): CheckMate 141. Journal of Clinical Oncology. 34, (2016).
- Ferris, R. L., et al. Nivolumab for Recurrent Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck. The New England Journal of Medicine. 375 (19), 1856-1867 (2016).
- Harrington, K. J., et al. Nivolumab versus standard, single-agent therapy of investigator's choice in recurrent or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck (CheckMate 141): health-related quality-of-life results from a randomised, phase 3 trial. The Lancet Oncology. 18 (8), 1104-1115 (2017).
- Kiyota, N., et al. A randomized, open-label, Phase III clinical trial of nivolumab vs. therapy of investigator's choice in recurrent squamous cell carcinoma of the head and neck: A subanalysis of Asian patients versus the global population in checkmate 141. Oral Oncology. 73, 138-146 (2017).
- Ling, D. C., Bakkenist, C. J., Ferris, R. L., Clump, D. A. Role of Immunotherapy in Head and Neck Cancer. Seminars in Radiation Oncology. 28 (1), 12-16 (2018).
- Perri, F., et al. Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications. Head & Neck. 37 (5), 763-770 (2015).
- Yamamoto, V. N., Thylur, D. S., Bauschard, M., Schmale, I., Sinha, U. K. Overcoming radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 63, 44-51 (2016).
- Bonner, J. A., et al. Radiotherapy plus cetuximab for locoregionally advanced head and neck cancer: 5-year survival data from a phase 3 randomised trial, and relation between cetuximab-induced rash and survival. The Lancet Oncology. 11 (1), 21-28 (2010).
- Bhatia, S., et al. Inhibition of EphB4-Ephrin-B2 Signaling Enhances Response to Cetuximab-Radiation Therapy in Head and Neck Cancers. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4539-4550 (2018).
- Bhatia, S., et al. Enhancing radiosensitization in EphB4 receptor-expressing Head and Neck Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 6, 38792 (2016).
- Tang, C., et al. Combining radiation and immunotherapy: a new systemic therapy for solid tumors? Cancer Immunology Research. 2 (9), 831-838 (2014).
- Oweida, A., et al. Resistance to radiotherapy and PD-L1 blockade is mediated by TIM-3 upregulation and regulatory T-cell infiltration. Clinical Cancer Research. , (2018).
