Summary
Bu protokol, daha önce birden fazla hafta boyunca in vitro nöral atalardan farklılaşmış insan kök hücre türetilmiş nöronlar resucan ve kültür için ayrıntılı bir prosedür açıklar. Prosedür, ışık mikroskobu ve yüksek içerikli tarama ile uyumlu bir formatta nöritler, sinapslar ve geç ifade nöronal belirteçlerin görüntüleme tabanlı tahlilleri kolaylaştırır.
Abstract
İnsan pluripotent kök hücre türetilmiş nöral progenitor hücrelerinden (NCD) iki boyutlu kültürde ayırt edilen nöronlar, hastalık mekanizmalarını keşfetmek ve bileşimi sorgulamak için yüksek içerikli tarama (HCS) yapmak için güçlü bir model sistemi temsil eder. veya gen mutasyonu fenotiplerini tanımlar. Ancak, insan hücreleri ile fonksiyonel NPC geçiş, olgun nöron birkaç hafta gerektirir. Sinapslar genellikle monolayer kültürde 3 haftalık farklılaşmadan sonra oluşmaya başlar ve birkaç nörona özgü proteinler, örneğin daha sonra ifade eden pan-nöronal belirteç NeuN veya 5/6 serebral kortikal nöron belirteci CTIP2, yaklaşık 4-5 hafta sonrası farklılaşma. Bu uzun farklılaşma süresi, küçük hacimli, çok kuyulu HCS platformlar için kullanılan en uygun kültür koşullarıyla uyumsuz olabilir. Pek çok zorluk arasında, en az hücre kümeleme ile iyi yapışılmış, düzgün dağılmış hücrelere duyulan ihtiyaç ve uzun vadeli canlılık ve fonksiyonel sinaps olgunlaşmasını teşvik eden kültür prosedürleri yer almaktadır. Bir yaklaşım büyük hacimli biçimde nöronlar ayırt etmek, daha sonra HCS uyumlu multi-wells daha sonraki bir zaman noktasında onları replate etmektir. Bu replating yaklaşımı kullanırken bazı temel zorluklar, dendritik ve aksonal ağın stresli bozulması nedeniyle, tekrarlanabilirlik ve hücre canlılığı ile ilgilidir. Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) türetilmiş nöronların büyük hacimli formatta 4-8 hafta farklılaşmasından sonra, 384-iyi mikrotiter'e aktarılması için ayrıntılı ve güvenilir bir prosedür gösteriyoruz. plakaları ve mükemmel hücre hayatta kalma ile daha 1-3 hafta için onları kültür. İnsan nöronların bu rekaplama sadece replating iki hafta içinde sinaps montaj ve olgunlaşma çalışma sağlar, ama aynı zamanda neurite rejenerasyon ve büyüme konisi özellikleri çalışmaları sağlar. 384 kuyulu bir platform kullanarak neuritogenez ve sinaptogenez için ölçeklenebilir tahlil örnekleri salıyoruz.
Introduction
İnsan pluripotent kök hücre (hiPSC) türetilmiş nöronlar giderek temel araştırma, ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp alanlarında ilgili. İş akışları ve prosedürleri kendi kültür ve bakım optimize etmek ve belirli nöronal alt tiplerefarklılaşma verimliliğini artırmak için, hızla 1,2gelişmektedir. İnsan kök hücre kaynaklı nöronların, ilaç keşfi ve hedef doğrulamada yüksek içerikli analizlere uygun model sistemleri olarak yarar ve maliyet etkinliğini artırmak için, olgun, fonksiyonel oluşturmak için gereken kültürlenme süresini azaltmak yararlıdır nöronlar, maksimum sağlamlık korurken, tekrarlanabilirlik, ve fenotip alaka. 3 boyutlu organoid kültürler nörogelişim araştırmasında atılımlar itici olmasına rağmen3, 2 boyutlu monolayer kültürler ilerler en az doku kalınlığı nedeniyle otomatik görüntüleme tabanlı uygulamalar ile özellikle uyumludur.
Ancak görüntüleme tabanlı tarama yöntemlerinin insan nörolojik ve nörogelişimsel hastalık modellerine uyarlaması büyük bir sorunla karşı karşıyadır. İnsan sinir sisteminin in vivo olarak olgunlaştığı uzun zaman dilimi, doğal gen ekspresyonu programlarını barındırmak ve nöronal olgunlaşmayı sağlamak için kültürde uzun süre yitirir.
Uzun nöronal farklılaşma programının pratik bir sonucu, hiPSC türetilmiş monolayer kültürlerin bakımı yeterli sinaps olgunluğu elde etmek için haftalarca sürdürülmelidir. Bu süre zarfında, farklılaşmamış kalan nöral atalar bölünmeye devam eder. Bu hızlı bir şekilde kültür büyümek ve canlı postmitotik nöronlar korumak için gerekli besin içeriği gasp edebilirsiniz. Şiddetle nöral progenitor hücreleri bölen (NPCs) da büyüme substrat için nöronlar ile rekabet edebilir. Bu, bu tür kültürleri, görüntüleme tabanlı tahliller için uygun olmayan bir durum olan kötü yapışma sorunlarına maruz kılabilir. Ayrıca, birçok araştırmacı küçük kültür hacmi, nöronal farklılaşma geç aşamalarında gözlemlemek için yeterince uzun farklılaşmış nöronların sağlıklı popülasyonları korumak daha büyük zorluk bulabilirsiniz. Başka bir deyişle, yüksek içerik tarama (HCS) yaklaşımları kullanarak sinaps olgunlaşma tahlilleri insan kaynaklı nöronlar için çok zor olabilir.
Bu sorunların bazılarını atlatmak için, daha önce farklılaştırılmış hiPSC türetilmiş nöronların yeniden sulandırılması ve rekaplama bir prosedür kullanılmıştır. İlk olarak, tam kararlı nöronların bir popülasyonda neurite büyüme (ya da daha doğrusu, nöral rejenerasyon) çalışma sağlar. İkinci olarak, daha önce farklılaşmış nöronların büyük hacimli formattan (10 cm veya daha büyük) küçük hacimli biçimlere (HCS uyumlu 96 veya 384 kuyulu mikrotiter plakalar gibi) yeniden kaplaması, toplam kültürlendirme süresinde önemli bir azalma sağlar. küçük hacimli durum. Bu in vitro sonraki haftalarda sinaps montaj ve olgunlaşma çalışmasını kolaylaştırır.
Ancak, zaten uzun nöritler ve karmaşık bir bağlantı ağı kurmuş olgun nöronların rekaplama çeşitli zorluklar sunar, biri hücre ölümü bazen yüksek ve değişken oranıdır. Burada, mükemmel hücre sağkalım ve tekrarlanabilirlik ile sonuçlanan bir rekaplama prosedürü açıklar. Genellikle nöronlar, triturasyon öncesinde hücreleri substrattan ayırmak için kısa kuluçka dönemleri için (genellikle ~3-10 dk) proteolitik enzimlere maruz kalırlar. Bu kısa proteoziz süresi alışılmış olarak, nöronal olmayan hücreler ve farklılaşmamış atalar4,5,6dahil olmak üzere birçok bölen hücre türünü yeniden sulandırmak ve geçirmek için kullanılır. Ancak, uzun, birbirine bağlı nöronlar taşıyan farklı nöronlar için, sadece substrat hücreleri ayırmak için değil, aynı zamanda hasarı en aza indirirken bireysel hücreleri izole etmek için dendritik ve aksonal ağ bozmak için gereklidir. Nitekim, nöronların kalın bir örgü genellikle tek bir levha olarak substrat ayırmak eğilimindedir, yerine bireysel hücreler olarak. Bakım nöritlerin kalın ağ gevşetmek için alınmazsa, nöronlar sadece geri dönüşümsüz hasar lı hale gelir, ama bunların çoğu kümeleri kaldırmak için kullanılan filtre geçmek için başarısız, zayıf hücre verimi ile sonuçlanan. Aşağıda bu zorluklara karşı yaygın olarak kullanılan proteaz kuluçka prosedürü basit bir değişiklik açıklar.
Aşağıda açıklanan protokolde nöronlar 40-45 dakika boyunca proteolitik enzim (örn. Accutase) gibi hafif bir proteaz ile kuluçkaya yatırılır. Enzim ikiekledikten sonra ilk 5-10 dakika boyunca, nöronal ağ bir levha olarak substrat kapalı kaldırır. Proteaz ile kuluçka nazik triturasyon ve filtreleme ile devam etmeden önce ek bir 30-40 dakika için ilerler. Bu ekstra kuluçka süresi, malzemenin sindiriminin hücreler arası ağı rahatlatmasını sağlamaya yardımcı olur ve böylece sonraki triturasyonun tek tek hücrelerin askıya alınmasını sağlar. Bu işlem hücre ölümünü en aza indirirken rekaplama üzerine hücre dağılımının tekdüzeliğini en üst düzeye çıkarır. Bu rekaplama yöntemini çeşitli farklılaşma protokolleri7,8 ve hiPSC'lerin çeşitli hatlarından oluşturulan hiPSC kaynaklı nöronal kültürlere başarıyla uyguladık. Prosedür, kök hücre kaynaklı nöronların çoğu veya tüm hatları ile kullanım için nominal uygundur. Biz uzun bir proteaz kuluçka süresi kesinlikle küçük biçimli plakalar (örneğin, 35 mm çapında) kültürlerin replating için gerekli olmadığını gözlemledik; ancak, burada da gösterdiğimiz gibi, büyük çaplı plakalardan (örn. 10 cm çapında veya daha büyük) rekaplama yaparken, muhtemelen bu plakalarda bulunan nöritler çok uzun süreçleri uzatabildikleri ve yoğun bir şekilde birbirine bağlı bir dizi oluşturabildikleri için önemli bir fayda sağlar.
Burada bu yöntemi göstermek ve kısaca erken neuritogenez ve dendritler ve aksonlar boyunca pre-ve postsinaptik proteinlerin kümelenmesi içeren sinaps olgunlaşma sı için tahlillerde uygulama göstermek, daha sonra takip sinaptik sitelerde kolokalizasyon. Örnekler, bu protokolün hücre canlılığını ve tekrarlanabilirliğini korumada sunduğu avantajları vurgular. İlk olarak, araştırmacılar insan neuritogenesis erken adımları çalışma için izin verir. Deneysel ayarı kemirgen kortikal veya hipokampal nöronların yaygın olarak kullanılan birincil kültürlere benzer, burada hücreler geç fetal veya erken postnatal beyinden çıkarılır, nazik proteaz tedavisi sonrası triturasyon tarafından ayrıştırılır, ve izin nöritler başlatmak veya yordam9,10kesildi nöritler yeniden. Bu tür kemirgen primer nöronlar benzer, hiPSC kaynaklı nöronlar oluşturmak veya replating sonra birkaç saat içinde kendi nöritler yeniden başlar, daha az yüksek spatiotemporal görüntüleme için optimal bir ortamda büyüme konileri ve nörit morfolojisi görüntüleme sağlayan farklılaşmamış hücreleri çevreleyen. Nöronların ilk olarak bir ata popülasyonundan ayırt etmeye başladıklarında görülen değişken gecikmeler ve farklı büyüme oranlarına göre nötrit büyümenin daha senkronize olduğunu gözlemledik. Buna ek olarak, replating genellikle daha sonra nöral gelişim de görünen nöronal alt tip belirteçleri ifade nöronların tahlilleri sağlar, kortikal tabaka gibi 5/6 transkripsiyon faktörü CTIP2 (Tavuk ovalbumin upstream organizatörü transkripsiyon faktör-etkileşen protein 2), veya pan-nöronal marker NeuN11. Replating yaklaşımının özellikle yararlı bir özelliği sinaptogenezin HCS ile uyumlu bir zaman dilimi içinde ilerler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Replating Öncesi Farklılaşma Dönemi
- 10 cm yemekleri üzerinde nöronlar ayırt, seçim bir protokol kullanarak7,8 nöronlar süreçleri ile kalın bir ağ oluşturmuş ve MAP2 veya TuJ1 gibi sadece erken nöronal belirteçleri ifade kadar, ama aynı zamanda NeuN gibi geç belirteçleri.
-
Nöronal farklılaşma işlemi sırasında her 4 günde bir tercih edilen ortamın yarısını değiştirin.
NOT: Daha kapsamlı veya sık orta değişiklikler temel trofik faktörleri seyreltmek ve olgunlaşma olumsuz olabilir.- iPSC türetilmiş WT126 nöronlar için, aşağıdaki diferansiyasyon sonrası kültür ortamıkullanın: 5 mL 100x N2 takviyesi, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 μg/mL laminin, 200 μM askorbik asit, 1 μM dibutiryl-cAMP ve 500 mL Dulbecco'nun modifiye Kartal'ın modifiye Kartal'ın orta sı için 10 mL SM1 besin karışımı F-12 (DMEM/F12). Yavaş yavaş, yarım ortam değişiklikleri kullanarak, nöral bazal orta ile değiştirin (Malzeme Tablosu) ve aynı takviyeleri.
- iPSC türetilmiş CVB WT nöronlar için aşağıdaki diferansiyasyon sonrası kültürortamını kullanın:500 mL nöral bazal A orta (Malzeme Tablosu) ve 500 mL DMEM/F12 orta 2 μg/mL laminin, 10 mL glutamin takviyesi (MalzemeTablosu), 0.75 mg/mL sodyum bikarbonat, 5 mL minimum esansiyel orta (MEM) esansiyel olmayan amino asitler, 0.2 mM askorbik asit, 10 ng/mL BDNF, 20 mL 50x B27 ve 10 mL 100x N2 takviyesi.
2. Kaplama Multiwells
- Rekaplamadan bir gün önce, poli-L-ornitin (PLO) ile kat. Bir stok çözeltisi (10 mg/mL) yapmak için steril suda FKÖ çözün. Bu stoku -20 °C'de saklayın. PKÖ'yü 1:100 suyla sulandırın ve kaplama camı 50 g/mL ve kaplama camı 1:1.000 oranı (10 g/mL) elde edin.
- Kaplamayı doğrudan hedef plakalara uygulayın. Plaka boyutuna uygun kaplama hacmini kullanın (örneğin, 24 kuyulu bir plaka için kuyu başına 500 μL FKÖ çözeltisi uygulayın).
- Tabakların oda sıcaklığında bir gecede karanlıkta oturmasına izin verin.
- Kaplamalı plakaları rekaplama gününde alın ve steril bir biyogüvenlik kabinine aktarın.
- FKÖ çözeltisini aspire edin ve steril suyla iki kez durulayın.
- Seyreltik laminin (1.15 mg/mL) fosfat tamponlu salin (PBS) 1:400 seyreltme.
NOT: 4 °C'de laminin çözülmesi ve laminin ve düzensiz kaplamanın agregasını önlemek için pbs'ye hızlı cayma. - Steril su aspire ve daha önce PLO ile kaplanmış kuyulara 500 μL laminin kaplama uygulayın.
- Plakaları en az 4-6 saat boyunca 37 °C'lik bir kuluçka makinesine yerleştirin. Tutarlı kuluçka süreleri kullanın.
3. Replating Diferansiye Nöronlar
- PBS ile farklılaştırılmış nöronların durulayın plaka bir kez yavaşça. PBS'yi, bozulmaması için doğrudan hücrelere değil, plaka duvarından hafifçe aşağı dağıtın.
- PBS'yi nazikçe aspire edin, hücrelere doğrudan dokunmaktan kaçınmak için dikkatli olun ama araştırmacıya doğru devrerken yemeğin kenarından aspire edin.
- 10 cm'lik plaka başına en az1 mL proteolitik enzim (Malzeme Tablosu) uygulayın ve hücreleri kuvöze döndürün. Doku kültür odası düşük nem nedeniyle yüksek buharlaşma oranı sergiliyorsa biraz daha yüksek hacimler ekleyin.
- 40-45 dk proteolitik enzim içeren inkübasyon hücreleri plakadan ayırmak ve nöronal ağ daki diğer nöronlardan ayırmak için.
NOT: Bu adımda zamanlama çok önemlidir. Proteazçok erken söndürme rekaplama sonra artan hücre ölümüne yol açabilir. Proteolitik enzim üreticisi, 37 °C'nin çok altındaki sıcaklıkların, geçiş yapan hücre hatları için daha uzun kuluçka süreleri ile kullanılmasını önerir (örn. bir gecede 4 °C).) Ancak, 4 °C'deki nöronların kullanımından kaçınılmalıdır, çünkü genellikle soğuk maruziyetten sonra yetersiz sağkalım gösterirler. Üretici ayrıca 37 °C'de enzimle 60 dk kuluçka nın enzimin enziminin enziminin aktivasyonuna yol açtığını belirtir. Ancak, yazarların deneyimlerine göre, 37 °C'de hiPSC kaynaklı nöronal kültürlerin 40-45 dk kuluçka ya da rekaplama üzerine verimli dissociation ve mükemmel nöronal sağkalım için yeterlidir. - Kuluçka süresi boyunca bir faz-kontrast mikroskop üzerinde nöronlar kontrol edin ve proteaz tedavisi nin devam etmesine izin nöral ağ tamamen plaka dan ayırır ve kısa bir süre altında plaka sallayarak üzerine küçük levhalar halinde parçalanmaya başlar Mikroskop.
- Sindirimi durdurmak için 10 cm plakada 1 mL proteaz başına 5 mL taze DMEM media kullanarak proteaz aktivitesini söndürün. Serolojik pipetler kullanarak ağı bozmak için hücreleri plakaya karşı 5-8 kez hafifçe triturate. Farklılaştırılmış nöronlar kırılgan olduğu için, triturating yaparken çok fazla basınç uygulamamaya dikkat edin. P1000 ucu kullanmayın, çünkü sonu çok keskin ve dardır ve böylece nöronlara zarar verebilir veya zarar verebilir.
- 100 μm çapında örgü ile bir hücre süzgeci aracılığıyla hücrelerle solüsyon uygulayın taze bir 50 mL konik tüp damla damla içine.
- Hücreler filtrelendikten sonra 5 mL taze DMEM ortamı yla süzgeçi durula.
- Tezgah üstü santrifüjdeki spin hücreleri 1.000 x g'de 5 dk.
- Konik tüpü biyogüvenlik kabinesine geri döndürün ve ortamın çoğunu aspire ederek hücrelerin nemi korumasını sağlamak için yaklaşık 250 l'lik bir ortam bırakarak.
- 2 mL taze DMEM ortamlarında hücreleri nazikçe yeniden askıya alın. Peleti tüpün yan tarafına sürtünmeyin. Bunun yerine, yavaşça konik 2-3 kez ters ve onları çıkarmak için 5 mL serolojik pipet sonundan hücreleri geçmek.
- Bir hemositometre kenarına resuspended nöronlar 10 μL uygulayın.
- Bu resuspension adımı sırasında hücre canlılığını değerlendirmek için hücre damlacıklarına 8-10 μL trypan mavisi ekleyin. Bu karışımın 10 μL'sini hemositometreye veya diğer otomatik hücre sayaçlarına uygulayın. Faz parlak ve trypan mavi boya hariç bu hücreleri uygun olarak değerlendirin.
- Canlı hücre/mL miktarını belirleyin ve konik tüpün içeriğini istenilen hücre yoğunluğuna göre seyreltmeye hazırlayın.
- 384 kuyulu bir plaka için kuyu başına plaka ~10.000 hücre; plaka ~ 150,000-200,000 hücreleri iyi başına 24-iyi plaka için.
- Uygun seyreltme elde etmek için resuspended hücrelerin konik tüp taze DMEM ekleyin ve b27 ve / veya BDNF gibi ek uygun takviyeleri eklemek, belirli hücre hattının gereksinimlerine bağlı olarak.
- Konik tüpü 2-3 kez karıştırmak için hafifçe yatırın.
- 24 kuyulu plakadan veya 16 kanallı pipet kullanarak 384 kuyulu çok kuyulu plakadan aspire laminin kaplamave PBS ile bir kez durulayın.
- 24 kuyulu plaka için P1000 veya 384 kuyulu plakalar için 16 kanallı pipet kullanarak PBS'yi aspire edin.
- Kümelenmeyi önlemek için sekiz lik bir hareketle her kuyuya hücre çözeltisi uygulayın. Kaplama tekdüzeliği, otomatik sıvı işleme cihazları kullanılarak da optimize edilebilir.
NOT: Rekaplama sonrası 2-4 gün başlayan ortama laminin eklenmesi de hücrelerin homojen dağılımını korumaya yardımcı olur. - Her kuyu için 3.19 ve 3.20 adımlarını tekrarlayın.
- Plakayı 37 °C ve %5 CO 2'de ayarlanan kuvöze geri döndürün.
- 2 gün sonra, bölüm 1.2'de açıklanan diferansiyasyon sonrası kültür ortamını kullanarak her 4 günde bir ortamın yarısını değiştirmeye başlayın. İstenilen olgunlaşma süresinden sonra 37 °C'de %3.7 formaldehit kullanarak kültürleri düzeltin ve hücreleri deneysel gereksinimlere göre lekeleyin.
4. Hücre Canlılık Tahlilleri Post-replating
- Stok çözeltisini kısa bir süre girdapladıktan sonra erken hücre ölümü muhabirini (VivaFix: kuyu başına 500 μL kültür ortamı başına 50 μL stok çözeltisinin 0,5 μL'lik kısmını) ekleyin.
- Görüntü canlı ve ölü hücreler cam alt multiwells kültürlü, 20 dakika sonra, herhangi bir yıkama adımı olmadan, boya floresan sadece bir kez hücrelerin içinde beri, ya da düzeltmek ve 4 ile co-leke 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve / veya diğer antikorlar görüntüleme den önce konfokal mikroskop kullanarak.
5. İmmünoboyama
- PBS'de %3,7 formaldehit artı 37 °C'de 20 dk için 120 mM sakaroz ile kültürleri düzeltin.
- Durulama ve% 0.2 Triton X-100 ile 5 dakika oda sıcaklığında, ve sonra% 2 sığır serum albumin (BSA) ile 30 dakika için blok.
- Tavşan anti-MAP2 antikor 1:1.000, fare anti-β3 tubulin (TuJ1) antikor 1:2.000, tavuk anti-NeuN antikor (1:100) ve sıçan anti-CTIP2 antikor (1:500) veya anti-PSD95 ile oda sıcaklığında 1 saat durulama ve kuluçka olmadan BSA aspire ( 01:200), tavşan anti-sinapsin 1 (01:200) ve tavuk anti-MAP2 sinaptik boyama için antikor.
- PBS ile durula ve Alexa Fluor konjuge sekonder antikorlar artı DAPI ile 37 °C'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.
- Son olarak, görüntülemeden önce PBS ile iki kez yıkayın.
6. Kalsiyum görüntüleme
- AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (Salk Biyolojik Çalışmalar Enstitüsü, GT3 Çekirdek Tesisi) ile kültürlü hücreleri enfekte 10 gün post-replating ve görüntü de spontan kalsiyum geçici değerlendirmek için 3-4 hafta post-replating.
7. Görüntü edinimi ve Analizi
NOT: Satın alma sistemi hakkında ayrıntılı bilgi için lütfen Calabrese ve ark.12bakın.
- Manuel veya otomatik görüntü edinimi için bir görüntüleme modülü ve morfometrik ölçümler için CellProfiler13gibi bir görüntü analizi yazılım modülü kullanın.
- TuJ1 pozitif nöritlerin ve MAP2 pozitif dendritlerinin ortalama uzunluğunu, aynı alan daki nöron sayısına (DAPI + MAP2 veya TuJ1 pozitif hücreler) bölünerek görüş alanı başına toplam uzunluğu ölçerek hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Birden fazla hafta için farklılaşmış olan hiPSCs türetilmiş nöronların rekaplama çeşitli avantajlar sunuyor. Ancak, uzun, birbirine bağlı dendritler ve aksonlara sahip farklılaştırılmış nöronların ayrılması ve dizginlettürülmeleri (Şekil1A)geri dönüşümsüz olarak hasar görmüş nöronların yüksek bir fraksiyonuna neden olabilir.
Protokol bölümünde açıklandığı gibi, nöronları substrattan ayırmak için proteolitik enzimle kuluçka kullandık. Tipik olarak, nöritlerin kalın örgü leri nedeniyle (Şekil1A), hücreler genellikle kuyuda süzülmeye başlayan tek bir sintial benzeri tabaka olarak tek bir anda ayrışma eğilimindedirler (Şekil 1C). Bu oldukça hızlı bir şekilde olur ve belki de neden en laboratuvarları tercih onların proteolitik enzim ile kuluçka sadece 5 dakika sonra hücreleri toplamak eğilimindedir, ve hemen triturasyon ile hücre levha yıkmak için (yukarı ve aşağı pipetleme). Ancak, Bu mekanik manipülasyon nöronlar için yüksek strese neden gibi görünüyor. Stres derecesinin nöronal ağın kapsadığı alanla orantılı olabileceğine inanıyoruz, çünkü yetersiz proteaz inkübasyonundan kaynaklanan belirgin hasarın 35 mm veya daha küçük plakalardan 10 cm veya daha büyük plakalar için daha büyük olduğunu görüyoruz. Böylece, sezgilere aykırı olarak, enzimatik kuluçka süresini 40-45 dk'ya uzatmanın hücre ayrıştırma sırasında hücre ölümünü azalttığını bulduk (Şekil1C) ve saatler içinde süreçleri yayan canlı, sağlıklı hücrelerin daha verimli bir şekilde kurtarılmasına izin verir gün sonrası rekaplama (Şekil 1B). Muhtemelen, hafif bir proteolitik enzim ile genişletilmiş kuluçka süresi güçlü birbirlerine hücreleri ve süreçlerini yapıştırmak proteinlerin kısmi sindirim sağlar ve hücre dışı matris. Bu, aşırı güçlü triturasyona gerek kalmadan tek tek hücreleri ayırmak için yeniden uzaklaştırma işleminin verimli bir şekilde çalışmasını sağlar.
Uzatılmış enzim kuluçka prosedürünün etkinliğini ölçmek için, triturasyondan hemen sonra trypan mavisi (Şekil1C) kullanılarak ve daha sonra 1, 3 ve 7 gün sonra erken bir hücre kullanarak askıya alınan hücrelerin canlılığını değerlendirdik. ölüm işareti (Şekil 2). Triturasyondan hemen sonra, trypan mavisi boyama, proteolitik enzimile 45 dk'lık bir kuluçkaya kıyasla 5 dk'lık bir kuluçkadan sonra önemli ölçüde daha fazla hücre ölümü olduğunu göstermiştir (Şekil1C). Bu gözlemi göstermek için kullandığımız iki iPSC hattı, farklı protokoller kullanılarak nöral progenitor aşamasından nöronlara farklılaştırılmış ve rekaplama prosedürüne çok farklı bir duyarlılık göstermiştir. WT126 hattından kültürler "rozet seçim yöntemi" kullanılarak NCD'lere ayrılmıştır7 hızlı bir ayırt etme yöntemi ile CVB WT24 hattından farklılaşan kültürlerden daha fazla hasara duyarlıydı8 . Bununla birlikte, her iki hat için de uzatılmış enzim kuluçka prosedürü kullanılarak hemen hücre ölüm derecesi yaklaşık yarıya indi.
Replating sonra, kültürler genişletilmiş enzim kuluçka prosedürü kullanarak sonraki günlerde hücre canlılığı yaklaşık iki katına gösterdi, OLARAK DAPI-pozitif hücrelerin yoğunluğu tarafından belirlenir (Şekil2B, solda grafik). Buna ek olarak, genişletilmiş enzim kuluçka ölü veya ölmekte olan hücrelerin daha düşük bir yoğunluk tabir boya-dışlama canlılık kiti kullanılarak tespit sonuçlandı (Şekil2B, sağda grafik). 24 saat sonrası rekaplama dan sonra canlılık tayini kullanılarak tespit edilen ölü hücrelerin fraksiyonu triturasyondan hemen sonra trypan mavisi kullanılarak görülenden daha yüksekti. Bu muhtemelen bu ilk 24 saat üzerinde ölü ve ölmekte olan hücrelerin birikimini yansıtır, canlılık tsay daha hassas trypan mavi tsay daha hücre ölümü algılar mümkündür rağmen. Ölü hücreler rekaplama sonrası 1-7 gün boyunca saptamaya devam etti (Şekil 2B). Her iki deney grubu için de ilk kaplama yoğunluğu (5 dk ve 45 dk) aynıydı ve triturasyon sonrası hücre süspansiyonunun hemositometre canlı hücre sayılarına dayanıyordu. Daha da önemlisi, rekaplama sonrası her zaman noktalarında, canlı, sağlıklı hücrelerin sayısı 5 dk kuluçka ile karşılaştırıldığında 45 dk enzim kuluçka sonrasında yaklaşık iki katına çıkarıldı. Bu gözlemler her adımda hücre morfolojisini izlemek için faz kontrast mikroskobu kullanılarak nitel olarak doğrulandı: rekaplamadan önce, rekaplama sırasında ve rekaplama sonrası (Şekil 1 ve Şekil2).
Onlar birkaç hafta için ayırt edilmiştir sonra hiPSC türetilmiş nöronların replating avantajlarından biri hücrelerin çoğu atası aşamasında çıktı ve replating sırasında bir nöronal fenotip kararlı olmasıdır. Nöronal farklılaşmanın nöral atalardan geçiş evresi birkaç gün içinde gerçekleşir ve beta-III tubulin (antikor TuJ1 tarafından saptanır) veya MAP2 gibi erken evre nöronal belirteçleri yavaş yavaş ifade eden daha fazla sayıda hücre bulunur. Gen ekspresyonu birkaç hafta içinde gelişir ve sonunda NeuN gibi geç evre pan-nöronal belirteçlerin veya CTIP2 gibi kortikal nöronlar için hücre tipi spesifik belirteçlerin ekspresyonuna neden olur. Bu nedenle, daha önce diferansiye hiPSC türetilmiş nöronların rekaplama bir erken ve geçici nöronal olayları çalışma sağlar, neurite inisiyasyon gibi, nöronların tanımlanmış alt tiplerinde. Şekil 3, daha büyük bir kültür çanasında 4 haftalık ön farklılaşmadan sonra yenilmi yapılan kültürlerde erken nöronal belirteçlerin hemen varlığını göstermektedir. NeuN ve CTIP2 ifade eden nöronların rekaplama sonrası birkaç gün içinde kolayca tanımlanadığını unutmayın (Şekil 3). Nöronal farklılaşmanın özellikleri ve zamanlaması hiPSC çizgileri arasında farklılık gösterebilir. WT 126 hattı ve burada tanımladığımız CVB WT24 hatları için, hücrelerin sırasıyla %85 ± %12 'si (n = 2) ve 52 ± %11 (n = 5) βIII-tubulin marker TuJ1 için immünoreaktiviteyi genişletilmiş proteaz inkübasyon prosedürünü kullanarak rekaplamadan 4 gün sonra ifade ettiler. Her iki hat için, hücrelerin% 30-40, ve nöronların% 80-90 da tabaka 5/6 neokortikal marker CTIP2 ifade. Geliştirilmiş canlılığa ek olarak, genişletilmiş proteaz protokolü de Orta gelişmiş neurite outgrowth (nöron başına ortalama nötrit uzunluğu), Şekil 4gösterildiği gibi . Her iki total neurit uzunluğu (antikor Tuj1 kullanılarak ölçülür, hangi lekeler hem aksonları ve dendritler; Şekil 4 B, sol grafik) ve dendrit büyüme (MAP2 kullanılarak ölçülen, hangi lekeler sadece dendritler; Şekil 4 B, merkez grafiği) genişletilmiş proteaz kuluçka prosedürü kullanırken tercih edildi. Şekil 2'deki DAPI pozitif (DAPI (+)) hücre sayılarının grafiği, Şekil4'teki hücre sayısı grafiğiyle aynı görüntü örneklerine dayandığını, ancak Şekil 2'de Fiji yazılımı nın yardımcı olduğu otomatik olmayan bir yöntem kullanılarak sayısallaştırıldığını, Şekil 4'te ise otomatik görüntü analizi yazılım platformu CellProfiler kullanılarak ölçüldü. Bu iki görüntü analizi yaklaşımı da benzer sonuçlar vermiştir.
Replating sadece neurite büyüme çalışma için yararlıdır, ama aynı zamanda sinaps veya nöronların diğer daha sonra görünen biyolojik özellikleri çalışma. Nitekim, sadece bir hafta post-replating sonra biz birçok presinaptik ve postsinaptik proteinler için belirteçleri bir punctate desen nöronal dendritler dekorasyon gözlemlemek (Şekil5A). 4 hafta sonra da fonksiyonel sinapsoluşumunun bir göstergesi olan kolokalizasyonlarını tespit etmeye başlarız (Şekil 5A). Ayrıca, spontan depolarizasyon ve sinaptically tahrik akımları elektriksel aktivite kalsiyum görüntüleme (Şekil5B) veya multielectrode dizileri (MEAs) kullanılarak tespit edilebilir.
Şekil 1 : Hücre ayrışması için proteolitik enzim ile daha uzun kuluçka sonrası nöronal canlılığın üstün korunması. (A) NPC kaynaklı nöronların faz kontrast görüntüsü 3 hafta boyunca farklılaşmıştır. Sol görüntüdeki kutulu bölge sağda büyütülür. Bu aşamada nöronlar kalın bir örgü oluşturan uzun süreçler var. Ölçek çubukları = 80 μm (solda); 35 μm (sağda). (B) HiPSC'den türetilmiş nöronların 1 ve 5 gün sonra rekaplamadan sonraki görüntüleri seçilir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) Sol: hücreler proteaz tedavisini başlattıktan sonra birkaç dakika içinde tek bir yaprak olarak ayrılırlar. Ölçek çubuğu = 200 μm. Sağ: triturasyon hücreleri replating önce hemositometre sayılır sonra. Grafikler, 5 dakika veya 45 dk inkübasyondan sonra iki farklı hat için proteolitik enzim ile uygun olmayan, trypan-mavi pozitif hücrelerin niceliğini gösterir CVB WT24 (*** p < 0.0003, eşleşmemiş t-testi) ve WT 126 (*** p < 0.0001, eşleşmemiş t-testi). Değerler, 4 ayrı çoğaltmanın ± S.E.M ortalamasını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 : Rekaplama sonrası birkaç gün sonra nöronal canlılık. (A) 5 dk ve 45 dk proteaz kuluçka kullanarak 1 ve 3 gün post-rekaplamag WT126 NPC kaynaklı nöronların görüntüleri. Ölmekte olan hücreler hassas erken hücre ölümü muhabiri ile etiketlenir. Karşılık gelen parlak alan görüntüleri solda gösterilir. Bazı hücresel enkaz (mavi ok) genellikle rekaplama sonra tespit edilir, özellikle 5 dk grubunda. Ölçek çubukları = 150 μm. (B) CVB WT24 NPC'den türetilmiş kültürlerin görüntüleri 5 dk ve 45 dk proteaz kuluçka kullanarak rekaplama sonrası 1, 3 ve 7 gün sonra. Ölmekte olan hücreler hassas erken hücre ölümü muhabiri (kırmızı) ile etiketlenir. Yaşayan ve ölmekte olan hücrelerin tüm çekirdekleri DAPI (siyan) ile etiketlenir. Birleştirilmiş beyaz sinyal DAPI ve VivaFix pozitif (+) hücreleri temsil eder. Birkaç hücre VivaFix boyama görüntülemek ama DAPI boyama eksikliği (sağdaki kombine görüntüde kırmızı hücreler); Bunlar muhtemelen saatlerce ölü olan hücrelerdir. Ölçek çubukları: 25 μm. Sağ grafik, proteolitik enzimle farklı kuluçka süresinden sonra ölü hücrelerin fraksiyonunun (VivaFix/DAPI) niceliğini gösterir (5 dk vs 45 dk: * p < 0.05 1 d ve *** p < 0.001, 3 d; iki yönlü ANOVA, ardından çok karşılaştırmalı Bonferroni sonrası hok testi). Sol grafik, 5 dk vs 45 dk için genel hücre yoğunluğu (# DAPI(+) hücrelerindeki değişiklikleri gösterir: *** p < tüm zaman noktaları için 0,0001; iki yönlü ANOVA, ardından çok karşılaştırmalı Bonferroni post hoc testi). Tüm değerler ortalama ± S.E.M 3 çoğaltmaolarak gösterilir ve durum başına en az 1.500 hücre puanlandırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3 : Rekaplamadan hemen sonra geç evre nöronal belirteçlerin saptanabilir ekspresyonu. CVB WT24 hiPSC türetilmiş hücrelerin kültürleri, 4 hafta boyunca NPC aşamasından farklılaştırılmış olan 10 cm'lik bir çanaktan 45 dakika proteaz kuluçka dan 45 dakika sonra görüntülenmiştir. Gösterilen örnekler pan-nöronal belirteçleri TuJ1, MAP2 veya NeuN için boyanmış; veya derin tabaka kortikal piramidal nöron belirteci CTIP2. Geniş nöritlerin varlığına ve TuJ1 ve MAP2'nin sağlam ifadesine dikkat edin. Özellikle nöronların önemli bir kısmının geç evre belirteçleri NeuN ve CTIP2 ifade ettiğini unutmayın. Ölçek çubuğu = 16 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4 : Rekaplama sırasında daha kısa ve uzun enzim kuluçkalarını takiben zamanla neurite ve dendrit büyümesi. (A) Replated CVB WT24 hiPSC türetilmiş nöronlar hızla nöritler uzatmak, antikor Tuj1 kullanılarak tespit olarak. Genişletilmiş proteaz kuluçka süresi nin neuritogenezi teşvik ettiğini unutmayın. Ölçek çubuğu = 25 μm. (B) 5 dk veya 45 dk proteaz kullanarak 1, 3 ve 7 gün sonrası rekaplama nın neurit ve dendrite uzunluğunun niceliği. Toplam nötrit uzunluğu TuJ1 (βIII-tubulin) boyama dan ölçüldü; dendritspesifik boyama genel hücre yoğunluğu (sağ grafik) için düzeltilen MAP2 boyama snf'den ölçüldü. Tüm değerler 3 çoğaltmanın ortalaması ± S.E.M olarak gösterilir. Neurite uzunluğu 5 dk vs 45 dk: * p < 0.05 1 gün ve 7 gün, ** p < 0.01 3 gün; dendrite uzunluğu 5 dk vs 45 dk: ** p < 0.01 1 gün ve 3 gün, önemli değil (ns) 7 gün; # DAPI(+) 5 dk vs 45 dk: *** p < 0.0001 tüm zaman noktaları için; iki yönlü ANOVA, çok karşılaştırmalı Bonferroni sonrası hoc testi izledi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5 : Rekaplama sonrası diferansiye hiPSC kaynaklı nöronlarda sinaptogenez ve spontan kalsiyum geçicidir. (A) Sol: genişletilmiş proteaz kuluçka protokolü kullanılarak 4 hafta sonra rekaplama, presinaptik marker sinapsin 1 MAP2 pozitif dendritler boyunca punctate kümelerinde tespit edilebilir. Ölçek çubukları = 5 μm. Sağ: preminaptic ve postsinaptik kümeler (sarı ok), potansiyel olarak aktif sinapsların bir göstergesi arasında kolocalizasyon gösteren seçilen dendritik bölge. Ölçek çubukları = 1.5 μm. (B) Sol: AAV8-syn-jGCaMP7f-WPRE ile enfekte hiPSC türetilmiş nöronlar ağ aktivitesi tarafından yönlendirilen spontan kalsiyum geçicilerini izlemek için kullanıldı. Brightfield görüntüsü, zaman atlamalı serideki tek bir zaman noktasında GCaMP7 floresanının psödorenk görüntülemesinin bitişiğinde gösterilir. Ölçek çubuğu = 25 μm. Renkli sayılar, sağdaki izlerde gösterildiği gibi, GCaMP7 floresansının zaman içinde ölçüldüğü 4 seçili hücreyi gösterir. Her renkli iz bir hücreye karşılık gelir. Yıldız işareti, soldaki görüntünün karşılık verdiği canlı kayıt sırasındaki zamanı işaret eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6 : Yüksek içerik taraması ve/veya farklılaşma ve neurite outgrowth veya MEA kayıtları nın ayrıntılı çalışmaları için kültür hiPSC'lerine replating prosedürlerinin iş akışı. Daha geniş bir formatta 4 veya daha fazla hafta boyunca yetiştirilen nöronların farklılaştırılmış kültüründen başlayarak (örn. 10 cm'lik bir kültür çanağı), nöronlar 40-45 dakika proteaz ile kuluçkaya yatırılır, ayrıştırmak ve yeniden askıya almak için hafifçe trituted. Hücreler daha sonra HCS ile uyumlu çok kuyulara, görüntüleme büyüme konileri (sarı ok) veya diğer yapılarla uyumlu yüzeylere veya çok elektrotlu dizi kayıtları için uygun çok kuyulara dağıtılır. Ölçek çubukları = 27 μm, 5 μm, 2,5 μm, 130 μm (soldan sağa). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yüksek içerik tarama platformları ile uyumlu bir şekilde canlılık, farklılaşma başarısı ve hücre altı görüntülemeyi optimize eden insan nöronal kültürlerinin yeniden süspansiyonu ve yeniden kaplaması için doğrudan ileri ye doğru bir prosedür gösterdik. ve uyuşturucu keşfi ile ilgili diğer tahliller. Şekil 6 genel iş akışını ve bu tür uygulamaların örneklerini göstermektedir.
Burada kortikal nöron kaderine yönelik hiPSC kaynaklı nöronlara odaklanmış olsak da, bu yöntemin insan embriyonik kök hücre kaynaklı nöronlar ve diğer doğru yönlendirilmiş kök hücre kaynaklı nöronlar için eşit derecede uygulanabilir olmasını bekliyoruz. nöronal fenotipleri14,15,16,17,18. Ayrıca, bu genişletilmiş proteaz prosedürünün, örneğin FACS sıralama veya primer nöronların tek hücreli analizleri gibi, yerleşik bir nörit örgüse sahip hücrelerin yeniden askıya alınmasını gerektiren diğer durumlar için yararlı olabileceğini varsayıyoruz19 , 20. yıl.
Replating hiPSC türetilmiş nöronlar birçok önemli biyolojik olayların hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için uygun bir model sistemi sağlar. Örneğin, bu prosedür insan nötrit büyüme ve büyüme konisi özellikleri ayrıntılı çalışmalar kolaylaştırabilir, ve geniş bilgi tabanı ile bulguların karşılaştırılması diğer türler, hem omurgalı ve omurgasız çalışma onlarca yıl inşa. Replating prosedürünün, hücre altı yapısı ve fonksiyonunun optik değerlendirilmesi için uygun olan daha büyük büyüme konilerioluşturmak için koşulları optimize etmeyi kolaylaştırdığını görüyoruz (Şekil 6). Buna karşılık, hiPSCs gelen nöronların ilk farklılaşması sırasında gözlenen büyüme konileri daha tipik küçük ve kompakt olma eğilimindedir, ve bu tür kültürlerde non-nöronal hücrelerin yoğun dizi zor hem de substrat koşullarını ayarlamak için yapar büyüme konisi yayılmasını teşvik ve karmaşık doku ortamında bireysel büyüme konileri görüntü. Böylece, taze bir çanak üzerine replating nöronlar hangi iyi görüntüleme koşulları altında büyüme konileri görüntülemek için bir "temiz kayrak" sağlar.
Replating, HCS'ye uygun hücre kültür platformlarını kullanırken özellikle avantajlıdır, çünkü kültürlerin küçük hacimlerde yetiştirildiği toplam süreyi büyük ölçüde azaltır. 96, 384 veya 1536-iyi çok kuyuların (sırasıyla yaklaşık 100, 50 ve 5 mikrolitre çalışma hacmi) bireysel kuyuların küçük çalışma hacimleri genellikle buharlaşma ve besin tükenmesini karşıkoymak için sık (yani, günlük) medya değişiklikleri gerektirir. Sık sık yapılan medya değişiklikleri, sadece reaktifler ve işçilik açısından değil, koşullu ortamı sulandırarak ve hücrelerin mekanik türbülans nedeniyle substrattan kopma şansını artırarak kültürlerin canlılığını tehlikeye atabilir. HiPSCs Replating de çok elektrot dizileri kullanarak fizyolojik aktivite nin kaydedilmesi kolaylaştırabilir21,22, dinamik nöronal fenotiplerin tahlilleri kültürlerin canlı görüntüleme23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, ulusal kooperatif yeniden programlanmış hücre araştırma gruplarının (NCRCRG) akıl hastalığını incelemek için bir bileşenidir ve NIH grant U19MH1 2015-0644 tarafından desteklenmiştir. İlk çalışmalar da NIH hibe NS070297 tarafından desteklendi. Biz Dr Carol Marchetto ve Fred Gage, Salk Enstitüsü, nöral ata hücrelerinin WT 126 hattı sağlamak için teşekkür ederim, ve Dr Eugene Yeo ve Lawrence Goldstein, UC San Diego nöral ata hücrelerinin CVB WT24 hattı sağlamak için. Biz Yararlı tartışmalar için Dr Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Tıp Discovery Enstitüsü, laboratuvarda Deborah Pre teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media |
| Dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50x) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 mL to 1 L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µL to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5 mL to 1 L N2B27 media |
| N2 (100x) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5 mL to 500 mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10 mL to 1 L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10 cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1,000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100 mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 mL of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| Rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| Chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| Chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| Rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| Mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| Rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).
- Langdon, S. P. Cancer Cell Culture. , Humana Press. New York, NY. (2010).
- Picot, J. Human Cell Culture Protocols. 107, Springer Science & Business Media. Berlin, Germany. (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K.
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
