Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Identificatie van Orexin en endocannabinoïde receptoren bij volwassen zebravis met behulp van immunoperoxidasekleuring en immunofluorescentie methoden

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59308
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 1
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Summary

Hier gepresenteerd zijn protocollen voor immunohistochemische karakterisering en lokalisatie van orexin peptide, orexin receptoren, en endocannabinoïde receptoren in de darm en hersenen van normale en dieet-geïnduceerde obesitas (DIO) Adult zebravis modellen met behulp van immunoperixidase en dubbele immunofluorescentie methodes.

Abstract

Immunohistochemistry (IHC) is een zeer gevoelige en specifieke techniek betrokken bij de opsporing van doel-antigenen in weefselsecties met gelabelde antilichamen. Het is een multistep proces waarbij de optimalisering van elke stap cruciaal is om het optimale specifieke signaal te verkrijgen. Via IHC kunnen de distributie en lokalisatie van specifieke biomarkers worden gedetecteerd, waarbij informatie over evolutionaire instandhouding wordt onthuld. Bovendien staat IHC in voor het begrijpen van expressie-en distributie veranderingen van biomerkers in pathologische omstandigheden, zoals obesitas. IHC, hoofdzakelijk de immunofluorescentie techniek, kan gebruikt worden bij volwassen zebravis om de organisatie en distributie van door de moleculen bewaarde stoffen te detecteren, maar een standaard IHC-protocol is niet estasblished. Orexin en endocannabinoïde zijn twee sterk behouden systemen die betrokken zijn bij de controle van voedselinname en obesitas pathologie. Gemeld hier zijn protocollen die worden gebruikt om informatie te verkrijgen over orexin peptide (OXA), orexin receptor (OX-2R), en cannabinoïde receptor (CB1R) lokalisatie en distributie in de darm en de hersenen van de normale en dieet-geïnduceerde zwaarlijvige (DIO) volwassen zebravis modellen. Ook beschreven zijn methoden voor immunoperoxidasekleuring en dubbele immunofluorescentie, alsmede de voorbereiding van reagentia, fixatie, paraffine-inbedding, en cryoprotection van zebravis weefsel en de voorbereiding voor een endogene activiteit-blokkerende stap en achtergrond counterstaining. De volledige set van parameters is verkregen uit eerdere IHC experimenten, waardoor we hebben laten zien hoe immunofluorescentie kan helpen met het begrijpen van OXs, OX-2R, en CB1R distributie, lokalisatie, en het behoud van expressie in volwassen zebravis Weefsels. De resulterende beelden met zeer specifieke signaalintensiteit leidden tot de bevestiging dat zebravis geschikte dierlijke modellen voor immunohistochemische studies van distributie, localisatie, en evolutief behoud van specifieke biomarkers in fysiologische en pathologische omstandigheden. De hier gepresenteerde protocollen worden aanbevolen voor IHC experimenten bij volwassen zebravis.

Introduction

Immunohistochemistry (IHC) is een goed gevestigde klassieke techniek die wordt gebruikt om cellulaire of weefsel componenten (antigenen) te identificeren door antigeen-antilichaam interactie1,2. Het kan worden gebruikt om de lokalisatie en distributie van target biomoleculen te identificeren in een tissue. IHC gebruikt immunologische en chemische reacties om antigenen op te sporen in weefselsecties3. De belangrijkste tellers die voor de visualisatie van antigeen-antilichaam interactie worden gebruikt omvatten fluorescente kleurstoffen (immunofluorescentie) en enzym-substraat kleuren Reacties (immunoperoxidasekleuring), allebei geconjugeerd aan antilichamen4. Het gebruiken van microscopische observatie is mogelijk om de localisatie van geëtiketteerd weefsel te bepalen, dat ongeveer aan localisatie van het doel antigeen in het weefsel beantwoordt.

Twee methodes bestaan voor fluorescente of chromogene reacties om proteïne te ontdekken: de directe opsporingsmethode, waarin het specifieke primaire antilichaam direct wordt geëtiketteerde; en de indirecte opsporingsmethode, waarin het primaire antilichaam ongeconjugeerd is terwijl het secundaire antilichaam het etiket5,6,7draagt. De indirecte methode heeft sommige voordelen, die hoofdzakelijk zijn signaal versterking is. Bovendien, in tegenstelling tot andere moleculaire en cellulaire technieken, met immunofluorescentie, is het mogelijk om de distributie, de localisatie, en de coexpressie van twee of meer proteïnen te visualiseren die differentieel binnen cellen en weefsels worden uitgedrukt7. De keuze van de gebruikte detectiemethode is afhankelijk van experimentele Details.

Tot op heden, wordt IHC wijd gebruikt in fundamenteel onderzoek als krachtig en essentieel hulpmiddel om de distributie en de localisatie van biomarkers en het algemene profileren van verschillende proteïnen in biologisch weefsel van mens aan ongewervelden te begrijpen8, 9 , 10 , 11. de techniek helpt een kaart van eiwituitdrukking in een groot aantal normale en veranderde dierlijke organen en verschillende weefseltypes tonen, die mogelijke beneden-of omhoog-regulering van uitdrukking tonen die door fysiologische en pathologische veranderingen wordt veroorzaakt. IHC is een zeer gevoelige techniek die nauwkeurigheid en de juiste keuze van methoden vereist om optimale resultaten te verkrijgen12. Eerst en vooral, kunnen vele verschillende factoren zoals bevestiging, dwars-reactiviteit, antigeen herwinning, en gevoeligheid van antilichamen tot valse positieve en valse negatieve signalen13leiden. De selectie van de antilichamen is één van de belangrijkste stappen in IHC en hangt van de antigeenspecificiteit en zijn affiniteit af aan de proteïne en de soorten onder onderzoek7.

Onlangs, hebben wij de IHC techniek geoptimaliseerd om leden van orexin/hypocretine en endocannabinoïde systemen in volwassen zebravis weefsel te ontdekken. We hebben vooral gericht op fixatie, weefsel inbedding met behulp van twee verschillende benaderingen, secties en montage (die van invloed kunnen zijn resolutie en detail tijdens microscopische analyse), en het blokkeren (om valse positieven te voorkomen en te verminderen achtergrond)14. Andere belangrijke kenmerken zijn de antilichamenspecificiteit en selectiviteit en reproduceerbaarheid van individuele IHC protocollen. De sleutel tot het verstrekken van antilichaam specificiteit is het gebruik van negatieve controles (met inbegrip van geen primaire antilichamen of weefsel waarvan bekend is dat niet de doelstelling eiwitten uitdrukken), alsmede positieve controles (met inbegrip van weefsel dat bekend is om de doel-eiwitten uit te drukken)15 . De selectie van antilichamen voor IHC wordt gemaakt op basis van hun soort-specificiteit (de waarschijnlijkheid waarmee zij met het antigeen van belang reageren) en de antigeen-antilichaam bindende opsporingssystemen die4,5,6 worden gebruikt ,7. In het geval van immunoperoxidasekleuring, wordt de kleur van de reactie bepaald door selectie van neerslaan chromogeen, gewoonlijk diaminobenzidine (bruin)16. Enerzijds, gebruikt immunofluorescence antilichamen die met een fluorophor worden vervoegd om eiwituitdrukking in bevroren weefselsecties te visualiseren en maakt voor gemakkelijke analyse van veelvoudige proteïnen met betrekking tot het chromogene opsporingssysteem mogelijk 5 , 7.

In de immunoperoxidasekleuring techniek, het secundaire antilichaam is geconjugeerd aan biotine, een linker molecuul in staat van aanwerving van een chromogene reporter molecule [avidin-Biotine complex (ABC)], wat leidt tot versterking van de kleuring signaal. Met de ABC reporter methode, reageert het enzym peroxidase met 3, 3 '-diaminobenzidine (schar), producerend een intens bruin-gekleurde kleuring waar het enzym aan het secundaire antilichaam bindt, dat dan met een gewone lichte Microscoop kan worden geanalyseerd. ABC die, wegens de hoge affiniteit van avidin voor Biotine bevlekt, veroorzaakt een snelle en optimale reactie, met weinig secundaire antilichamen verbonden aan de plaats van de primaire antilichaam reactiviteit. Deze chromogene detectiemethode zorgt voor de densitometric analyse van het signaal, het verstrekken van semi-kwantitatieve gegevens op basis van de correlatie van bruine signaalniveaus met eiwitexpressie niveaus18.

Met immunofluorescentie technieken, gelijktijdige opsporing van veelvoudige proteïnen is mogelijk toe te schrijven aan de capaciteit van verschillende fluorochromes om licht bij unieke golflengten uit te stoten, maar is belangrijk om fluorochromes zorgvuldig te kiezen om spectrale overlapping te minimaliseren 5. Bovendien minimaliseert het gebruik van primaire antilichamen in verschillende gastheer soorten problemen met betrekking tot cross-reactiviteit. In dit geval, erkent elk soort-specifiek secundair antilichaam slechts één type van primair antilichaam. Fluorescerende verslaggevers zijn kleine organische moleculen, waaronder commerciële derivaten, zoals Alexa Fluor kleurstoffen.

Vele dierlijke modellen worden gebruikt om bepaalde fysiologische en pathologische voorwaarden te begrijpen. Tot op heden is vastgesteld dat veel metabole routes worden bewaard in de loop van de evolutie. Daarom kan IHC studies in modelorganismen zoals zebravis inzicht verschaffen in het ontstaan en het onderhoud van pathologische en niet-pathologische omstandigheden17. Het is een doel van dit rapport om IHC-protocollen te illustreren die kunnen worden uitgevoerd op volwassen zebravis weefsel en worden gebruikt om gedetailleerde beelden te verkrijgen van de distributie en lokalisatie van OXA, OX-2R en CB1R op perifere en centrale niveaus. Ook gemeld zijn protocollen voor de toepassing van twee grote IHC indirecte methoden in perifere en centrale weefsels van volwassen zebravis. Beschreven is de indirecte methode, die voor signaal versterking in gevallen toestaat waar een secundair antilichaam aan een fluorescente kleurstof (immunofluorescentie methode) of enzym Reporter (immunoperoxidasekleuring methode) wordt vervoegd. Zowel chromogene als fluorescente opsporingsmethodes bezitten voordelen en nadelen. Gerapporteerd in dit protocol is het gebruik van IHC, hoofdzakelijk immunofluorescentie, in volwassen zebravis, een dierlijk model dat wijd wordt gebruikt om systemen te bestuderen die evolutief behouden over verschillende fysiologische en pathologische voorwaarden zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. immunoperoxidasekleuring Protocol

Nota: zebravis werd verkregen door Prof. Omid Safari (Ministerie van visserij, Faculteit van natuurlijke rijkdommen en milieu, Ferdowsi Universiteit van Mashhad, Mashhad, Iran)10.

  1. Weefsel dissectie
    1. Offer de zebravis door onderdompeling in ijswater (5 delen ijs/1 deel water, 4 °C); laat ze tot beëindiging van alle verkeer om de dood te waarborgen door hypoxie.
    2. Verwijder snel de darm en de hersenen met de volgende dissectie methode:
      1. Droog de vis op een papieren handdoek en plaats het sagittally op een ontleden mat, het blokkeren van de buik deel van het oog socket en vlezige deel van de staart.
      2. Voor de darm: Snijd de huid en verwijder voorzichtig de huid en de onderliggende spier van de zijkant van de vis tot de inwendige organen zichtbaar zijn. Verwijder de darm uit het lichaam holte stretching het uit.
      3. Voor de hersenen: Verwijder het hoofd met een scheermesje. Verwijder het zachte weefsel van de buikkant van de schedel met een tang. Open de schedel en verwijder het bot van de buikkant van de hersenen. Verwijder de huid en schedel botten uit de dorsale kant van de hersenen. Verwijder de hersenen.
  2. Weefsel fixatie
    1. Bevestig het ontleden van weefsels door onderdompeling in verse 4% paraformaldeyde (de) in fosfaatbuffer (PB, pH 7,4, 4 °C) voor 3 h bij kamertemperatuur (RT).
      1. Bereid 0,1 M PB voor door 1,755 g van NaH2po4H2o en 4,575 g van na2HPO4 in 450 ml gedestilleerd water (DH2o) op te lossen, en aan een pH van 7,4 met de noodzakelijke hoeveelheid NaOH 1N aan te passen.
      2. Bereid 4% van het geleidende Gestel in 100 mL van 0,1 M PB (pH 7,4) met beroering op een warmte plaat. Wanneer een temperatuur van 60 °C wordt bereikt, voeg 2-4 druppels NaOH 1N toe om een duidelijke oplossing te verkrijgen. Linkse 4% bij RT en controle van de pH. Stel de pH in op 7,4.
        Opmerking: weefsel fixatie voor meer dan 4 – 6 h kan leiden tot overfixatie, die maskers antigenen, het beperken van antilichaam-epitope binding. Tijd van fixatie is afhankelijk van weefsel grootte.
  3. Weefsel inbedding
    1. Spoel de weefsels 5x voor 5 min elk, door onderdompeling in 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Dehydrateer de weefsels door verdere onderdompeling in alcohol 70% (6 min), 80% (6 min), 95% (5 min), 95% (5 min), 100% (1 min), en 100% (1 min).
    3. Verduidelijk de weefsels door onderdompeling in 100% alcohol: xyleen (1:1) voor 10 min, dan 2x in xyleen voor 5 min elk.
    4. Infiltreren de weefsels met paraffine (56 °C) tweemaal voor 1 h elk door directe onderdompeling in paraffine.
    5. Embed de weefsels in paraffineblokken bij kamertemperatuur (RT) en op te slaan op RT tot de afdeling.
  4. Weefsel snijden
    1. Snijd weefsels in coronale of sagittale secties met 8 µm dikte met een microtome, en verzamel de secties in afwisselende reeks op zelfklevende glas dia's op het water en verwarmd bij 38 °C.
    2. Droog de dia's met secties bij 37 °C 's nachts.
  5. Deparaffinization en rehydratatie van weefselsecties
    1. Dewax de secties door onderdompeling in xyleen voor 5 min gevolgd door onderdompeling in xyleen voor 3 min.
    2. Rehydrateer de secties door volgende dia's onderdompeling in alcohol 100% II (1 min), 100% I (1 min), 95% (1 min), 75% (1 min), 50% (1 min), plaats dan de dia's in dH2O (5 min).
      Nota: volledig dewax de secties alvorens de reactie te beginnen. Als de secties nog sporen van paraffine hebben, voer een extra onderdompeling in xyleen 5 minuten of meer uit.
  6. Het herwinning van het antigeen
    1. Behandel de secties met citraat buffer (0,01 M, pH 6,0) door de dia's in de oplossing te onderdompelen en in een microgolfoven voor 5 min bij maximale macht te verwarmen.
    2. Laat de secties afkoelen.
    3. Herhaal de cyclus van 5 min in de magnetron op maximaal vermogen om het antigeen ophalen te voltooien.
      1. Bereid citraat buffer (0,01 M, pH 6,0) door het oplossen van 2,10 g citroenzuur in 100 mL dH2o en 5,882 g van natrium citraat in 200 ml DH2o. meng natrium citraat (0,01 m) met citroenzuur (0,01 m) met een 1:4-ratio door volume en pas de pH aan 6 met behulp van HCl 0.1 N.
  7. Het blokkeren van endogene peroxidase
    1. Afbakenen van het weefsel gebied op de dia's met een solvent-resistente pen.
    2. Spoel de secties 3 keer, 5 min elk, met tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) (0,1 M, pH 7,3).
      1. Bereid 0,1 M TBS voor door 12,1 g van trizma basis en 9 g van NaCl in 950 mL van dH2O op te lossen en aan pH 7,3 met HCl 0.1 n aan te passen.
    3. Blokkeer de endogene peroxidase activiteit door dia's onderdompeling in een oplossing van 0,75% H2O2 voor 5 min bij RT.
      1. Bereid de 0,75% H2o2 oplossing voor om 5 ml 30% h2o2 in 195 ml DH2o op te lossen.
        Opmerking: ndogenous enzymen kunnen reageren met IHC reagentia en valse positieve resultaten opleveren. Bovendien, zeer vasculaire weefsels Express veel endogene peroxidase, wat kan leiden tot intense niet-specifieke kleuring en achtergrondniveaus. De behandeling met 0,75% H2O2 dooft endogene peroxidase en vermindert beduidend de niet-specifieke achtergrond.
  8. Blokkering van niet-specifieke Bindi ng sites en weefsel permeabilization
    1. Incubeer het weefselsecties met de TBS/0.4% Triton (TBS-T) blokkering buffer, met de primaire antiserum (NRS), voor 30 min op RT te blokkeren niet-specifieke bindende sites.
      1. Bereid 0,4% Triton voor door 0,4 mL van Triton X-100 in 100 mL van TBS op te lossen.
      2. Bereid de blokkerende buffer TBS-T oplossing door het oplossen van 1% normaal serum in TBS met 0,4% Triton X-100 (1 mL van het normale serum + 8,2 mL van TBS + 0,8 mL van 0,48 Triton X-100).
        Nota: Selecteer de soorten van het dierlijke serum afhankelijk van de gastheer van het secundaire antilichaam (b.v., wanneer het gebruiken van een geit anti-konijn secundair antilichaam, gebruik normaal geit serum).
  9. De incubatie van het weefsel met primair antilichaam
    1. Incubeer de secties 's nachts in een vochtige doos bij RT met primaire antilichamen verdund in TBS-T. Vlek de secties met het volgende primaire antilichaam:
      1. Het antilichaam van de geit tegen OS-2R verdunde 1:200, die de C-terminal van de proteïne erkent.
      2. Het antilichaam van de geit tegen OS-verdunde 1:200 [orexin-A (C-19)], wat de C-terminal van de proteïne erkent.
        Opmerking: Zorg ervoor dat het primaire antilichaam reageert met de Biomolecuul van belang. Bepaal met welke epitope van de biomolecule het primaire antilichaam reageert door de gen groepering te gebruiken. Bijvoorbeeld, de OS-een epitope is in kaart gebracht tussen de AA 50 – 100 van de menselijke OX-A (O43612) terwijl de OX-2R epitope is in kaart gebracht in de buurt van de laatste 50 AA op de C-terminal van de mens.
  10. De incubatie van het weefsel met secundair antilichaam
    1. Spoel de secties 3x voor 5 min elk, met 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Incubeer de secties voor 1,5 h bij RT met biotinylated secundair antilichaam en konijn anti-geit immunoglobuline (H + L) geconjugeerd met biotine, dan verdund 1:100 in TBS-T.
      Nota: test en vind de verschillende verdunningen van zowel primaire als secundaire antilichamen om de optimale verdunning te vinden die vermindering van de achtergrond toestaat.
  11. Peroxidase reactie
    1. Spoel de secties 3x voor 5 min elk, met 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Incubeer de secties met avidin-Biotine complex (ABC) voor 1 uur.
      1. Bereid ABC-oplossing toevoegen van twee druppels van component A, gevolgd door twee druppels van component B in 5 mL van TBS.
    3. Spoel de secties 3x voor 5 min elk, met 0,1 M TBS (pH 7,3).
    4. Behandel de secties met het chromogeen substraat 3, 3 '-diaminobenzidine-4 (schar).
      1. Bereid de oplossing van de schar toe toevoegend één daling (ongeveer 30 µ L) van schar chromogeen concentraat aan 1 mL van het oplosmiddel van de schar, en mengeling goed vóór gebruik.
        Opmerking: bereid ABC-oplossing ten minste 30 minuten voor gebruik en houd het complex bij 4 ° c tot het gebruik voor een stabiele avidin/Biotine binding mogelijk te maken. Bereid de verse DAB werkoplossing, van toepassing op het weefselsecties, en ontwikkelen tot de kleur passend is. Wanneer de chromogene-reactie de epitope-sites converteert naar een bruine kleur en de intensiteit van het signaal geschikt is voor Imaging, gaat u verder met de volgende stap. Timing van de schar ontwikkeling kan variëren van een paar seconden tot 10 min. Voor OX-A en OX-2R 1, 2 min is genoeg. Handvat schar met zorg, want het is kankerverwekkend.
  12. Weefsel dehydratatie en montage
    1. Spoel alle secties 3x voor 5 min elk, met 0,1 M TBS (pH 7,3) om de schar reactie te stoppen.
    2. Dehydrateer de secties door volgende dia's onderdompeling in alcohol 50% (2 min), 75% (2 min), 95% (2 min), 100% I (2 min), 100% II (2 min).
    3. Verduidelijk de plakjes door onderdompeling 2x in xyleen 10 min elk.
    4. Monteer de secties met DPX (dibutylftalaat ftalaten xyleen) Mounty voor de histologie, het toevoegen van twee druppels van de montage van media om dia's en topping langzaam met-dekglaasjes.
      Opmerking: sinds de onderdompeling van weefsel in toenemende concentraties van alcohol tijdens uitdroging resulteert in alcohol penetratie van weefsel en vervanging van water met alcohol, bepalen een precieze uitdroging tijd en niet meer dan uitdrogen van de weefsels. Voer de onderdompeling in xyleen na uitdroging om het weefsel te verduidelijken en overtollige of resterende alcohol te verwijderen.
  13. Besturingselementen
    1. Herhaal secties 1.1 – 1.12, weglatend het primaire antilichaam en/of vervangend het primaire antilichaam of het secundaire antilichaam IgG door TBS (negatieve controles).
    2. Herhaal secties 1.1 – 1.12 pre-absorberend elk primair antilichaam met een overmaat van het relatieve peptide (100 mg van peptide/1 mL verdunde antiserum).
    3. Herhaal secties 1.1 – 1.12 met behulp van verschillende weefsels als positieve controle (bijv. muis weefsel).
      Opmerking: bereid alle buffers vers, kort voor aanvang. Verwijder zorgvuldig de overtollige vloeistof bij elke stap met een pipet of filtreerpapier rond de secties, altijd het houden van de secties nat.
  14. Beeld verwerving en analyse
    1. Het verwerven van digitale beelden onder constante licht verlichting en op dezelfde magnification met behulp van een Microscoop uitgerust met een digitale camera.
    2. Voer een semi-kwantitatieve analyse van de kleurintensiteit met behulp van imaging software (Zie tabel van materialen).
      1. Open de opgenomen beelden, in. LIF of. TIFF bestandsformaat, voor het evalueren van indices van OX-A of OX2-R positiviteit.
      2. Selecteer de knop onder meten en klik op Manual Counting. Tel het aantal gekleurd cel profielen rechtstreeks van het scherm door het plaatsen van een merk op positieve cellen door te klikken op de muis.
      3. Selecteer een regio van belang (ROI) gebied (3 x 103 μm2) om de immunosignal dichtheid (optische dichtheid, OD) te kwantificeren.
      4. Bepaal de pixel met de hoogste intensiteit (hoog positief) en minste intensiteit (negatief) binnen de geanalyseerde afbeelding om de nul toe te wijzen als de waarde van de achtergrond (dat wil zeggen, een deel van weefsel verstoken van gekleurd cellen).
      5. Beoordeel de OD door te werken aan een logaritmische schaal van absorptie. In digitale beeldanalyse, de schar pixel intensiteit varieert van de donkerste (0 waarde) tot lichtste (255 waarde) schaduw.
      6. Bepaal OD door het uitzetten van een histogram van de volgende: Log10(255/i), waar "I" is de waarde van de pixel intensiteit gegeven door het programma en bepaald door aftrekken van de achtergrond.
        Nota: de permanente en stabiele immunoperoxidasekleuring reactie kan op elk ogenblik onder een helder-gebied Microscoop worden geanalyseerd. Voer het tellen van gelabelde cellen uit op een andere sectie om dubbele telling van dezelfde cel uit aangrenzende secties te voorkomen.

2. immunofluorescentie Protocol

  1. Weefsel dissectie
    1. De dieren te offeren en te ontleden zoals beschreven in punt 1,1.
  2. Weefsel fixatie
    1. Bevestig de darm en de hersenen door onderdompeling voor 3 uur in 4% van het gedenkpunt bij 4 °C.
      1. Prepareer PB en 4% als in punt 1.2.1.
        Opmerking: de tijd van fixatie is afhankelijk van de weefsel grootte. Weefsel fixatie voor meer dan 4 – 6 h kan leiden tot overfixatie, die maskers antigenen en grenzen antilichaam-epitope binding.
  3. Weefsel inbedding
    1. Spoel de weefsels 3x voor 5 min elk, met 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Breng voor de cryoprotection de weefsels over naar 20% sacharose in PB (0,1 M, pH 7,4) en houd een overnachting bij 4 °C. Breng de weefsels vervolgens over naar 30% sacharose in 0,1 M PB (pH 7,4) en houd voor een extra nacht bij 4 °C.
    3. Embed de weefsels in een blok van optimale snij temperatuur (okt) compound. Om dit te doen, bereiden een kleine dewar's van vloeibare stikstof, neem aluminiumfolie, en snijd het in tweeën om een pan te maken. De pan met de weefsels gevuld met de LGO compound moet worden ondergedompeld in de vloeibare stikstof tot de LGO compound wordt gekoeld. De bevroren weefsels kunnen worden opgeslagen bij-80 °C tot de snede.
  4. Weefsel snijden
    1. Breng de bevroren weefsel blokken over naar een cryostat bij-20 °C en snijd in coronale of sagittale delen van 10 μm.
    2. Verzamel de weefsels in afwisselende seriële secties op zelfklevende glazen dia's geschikt voor Immunohistochemistry en bewaar ze bij-20 °C tot het gebruik.
      Opmerking: Sla dia's op tussen-20 °C en 4 °C in een donkere schuifbalk of een dia-boek.
  5. Blokkering van niet-specifieke bindings sites en weefsel permeabilizzation
    1. Het weefsel gebied op de glijbaan afbakenen met een solventbestendige pen.
    2. Spoel de secties 3x voor 5 min elk, met 0,1 M PB (pH 7,4).
    3. Incubeer de secties met 1% normaal ezel serum opgelost in de permeabilization buffer PB-Triton X-100 0,3% (PB-T) voor 30 min bij RT om het celmembraan te permeabilize en de niet-specifieke bindende plaatsen te blokkeren.
      1. Bereid Triton X-100 0,3% oplossend 0,3 mL van Triton X-100 in 100 mL van 0,1 M PB (pH 7,4) voor.
      2. Bereid de blokkerende oplossing voor het oplossen van 1% normaal ezel serum in PB die 0,3% Tritonx-100 bevat.
        Nota: de dierlijke soorten van het serum dat in de permeabilization wordt gebruikt en blokkerende buffers zijn afhankelijk van de gastheer van het secundaire antilichaam.
  6. Incubatie met mix van primaire antilichamen
    1. Spoel de secties 3x voor 5 min elk, met 0,1 M PB (pH 7,4).
      1. Incubeer de secties 's nachts in een vochtige doos bij RT met een mix van primaire antistoffen verdund in PB-T. De volgende mengelingen van primaire antilichamen kunnen worden gebruikt: het antilichaam van de geit tegen OS-2R verdund 1:100/het antilichaam van het konijn tegen CB1R verdunde 1:100, of het antilichaam van de geit tegen OS-A verdund 1:100/het antilichaam van het konijn tegen CB1R verdunde 1:100.
  7. Incubatie met mengeling van secundaire antilichamen
    1. Spoel de secties 3x voor 5 min elk, met 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Incubeer de secties voor 2 h bij RT met 1) een mengeling van ezel anti-konijn Alexa Fluor 488-geconjugeerd secundair antilichaam en ezel anti-geit Alexa Fluor 594-geconjugeerd secundair antilichaam verdund 1:100 in PB-T; of 2) een mengeling van ezel anti-geit Alexa Fluor 488-geconjugeerd secundair antilichaam en ezel anti-konijn Alexa Fluor 594-geconjugeerd secundair antilichaam verdund 1:100 in PB-T.
      Nota: Gebruik secundaire antilichamen die in de zelfde dierlijke gastheer worden ontwikkeld. Het normale serum moet tot de zelfde soort van het secundaire antilichaam behoren (b.v., gebruik secundaire antilichamen die in ezel en een ezel normaal serum worden ontwikkeld). Verdun de primaire en secundaire antilichamen met blokkerende buffer met het wasmiddel om de cel permeabilization te verhogen en de achtergrond te verminderen.
  8. Weefsel montage
    1. Spoel de secties 3x voor 5 min elk, met 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Eosine de secties met kern kleurstof DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) bereid oplossend 1,5 µ L van DAPI (1 mg/mL) in 3 mL PB.
    3. Dekglaasje dia's met montage medium (Zie de lijst van materialen). Deze waterige montage medium stabiliseert het weefselmonster en vlekken voor gebruik op lange termijn. De fluorescente steekproeven kunnen in Dark bij 4 °C worden opgeslagen. Gebruik een antifed montage medium om de levensduur van fluorofores te verlengen.
      Opmerking: Kies een goede montage medium. Een van de belangrijkste parameters van de montage agenten is de brekingsindex (nD), die moet rond de 1,5, de brekingsindex van glas. Het hier gebruikte bevestigingsmiddel kan vooral met specimen worden gebruikt dat voor enzym en lipide bepalingen wordt voorbereid (d.w.z., specimen dat niet met een oplopende reeks alcohol moet worden uitgedroogd).
  9. Besturingselementen
    1. Herhaal secties 2.1 – 2.8, weglatend het primaire of secundaire antilichaam, of in de specifieke stap de primaire of secundaire antisera met PB (negatieve controle) vervangen.
    2. Herhaal secties 2.1 – 2.8, pre-absorberend elk primair antilichaam met een overmaat van het relatieve peptide (100 mg van peptide/1 mL verdunde antiserum).
    3. Herhaal secties 2.1 – 2.8 op schijfjes muis hersenen (positieve controle).
      Opmerking: bereid alle buffers vers, kort voor aanvang. Verwijder de overmaat van vloeistof zorgvuldig bij elke stap met een pipet of filtreerpapier rond de secties, altijd het houden van de sectie vochtig.
  10. Beeldacquisitie
    1. Gebruik een confocale Microscoop uitgerust met een x-y-z gemotoriseerde fase, digitale camera, en acquisitie en beeldanalyse software zoals NIS-Elements C te observeren en analyseren van de immunostained secties. Verwerven van digitale beelden met behulp van de 5-20-40x doelstellingen.
    2. Neem de beelden van elke sectie op een lage vergroting (10x of 20x doelstelling) in elk van de beschikbare kanalen om een lage vergroting montage samen te stellen, die een overzicht van de hele regio te vergemakkelijken de lokalisatie en documentatie van OX-2R/CB1R anatomische co-expressie. Normaliseren van de fluorescentie beelden tot maximaal contrast en overlay voor de analyse.
    3. Verzamel seriële Z-stacks van beelden in het gebied van belang. Verwerf de beelden door middel van zes focale vlakken (Z-Step) met focale stappen van 1 – 1,8 µm ter dekking van het weefsel volume waarin OX-2R/CB1R coexpression wordt gevisualiseerd als gele puncta. Om deze collectie te doen voor elk kanaal (rood, groen, blauw) afzonderlijk, met behulp van een Z-gemotoriseerde Microscoop.
    4. Gebruik een Imaging dewindion software om beelden te deconvolve door toepassing van tien iteraties en vouw de seriële Z vlakken beelden in een enkele maximale projectie beeld.
    5. Pas de handtekeningen aan voor licht en contrast met Adobe Photoshop 6,01 (Adobe Systems, San Jose, CA).
      Nota: Voer de dewinding stap tijdens observatie uit om de achtergrond verder te verminderen. Beperk de glijbaan blootstelling aan licht om te voorkomen dat fotobleken.
  11. Beeldanalyse
    1. Voer kwantitatieve analyse uit van OX-2R/CB1R-coexpressie op afwisselend 10 μm dikke secties (n = 5 dier per groep) door alle regio van belang van elk dier te bedekken.
    2. Kwantificeren van de OX-2R/CB1R-coexpressie als het aantal gele positieve puncta met een semiautomated systeem van beeldanalyse. Imagines software kan zorgen voor een hoger niveau van detail, met kwantitatieve gegevens over de regio's van overlap tussen verschillende fluorescente sondes.
    3. Kwantificeer de puncta met behulp van drempel gereedschappen voor signaalintensiteit in de twee kanalen. Open het bestand. Liff,. TIFF of. jpg en selecteer afbeelding – drempel. Selecteer automatische instelling of handmatige methode en reguleren drempel totdat alle gekleurd puncta zijn geselecteerd. Analyseer de verdeling van de pixel intensiteiten in een gebied van de afbeelding die geen immunolabelled objecten bevat om de achtergrond drempel te verkrijgen. Bepaal deze achtergrond individueel voor elke afbeelding. De achtergrond drempel wordt vervolgens verwijderd door de basislijn van pixel intensiteiten in te stellen op de achtergrondwaarde.
    4. Selecteer Analyseer-meet en kies de te meten parameters (puncta intensiteit-minimum, maximum en gemiddelde waarden; aantal/dichtheid van de immunolabelled puncta).
    5. Tel de gele puncta langs het volume van het weefsel in 4 Z-stacks voor elke sectie, met behulp van de stacks direct boven of onder de beste focus vliegtuig. De out-of-focus regio's uitsluiten van de analyse.
      Opmerking: Voer het tellen van gelabelde cellen uit op een andere sectie om dubbele telling van dezelfde cellen te voorkomen in aangrenzende secties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representatieve gegevens voor de immunoperoxidasekleuring kleuring worden weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2. Immunohistochemische analyse van OX-A en OX-2R distributie in de darm van volwassen zebravis toonde verschillende lokalisatie sites van OX-A en OX-2R en hun toename in expressie in de intestinale cellen van DIO zebravis. Een intense bruine kleuring voor OX-A werd waargenomen in de cellen van de mediale en voorste darm (Figuur 1a, een1). De immunoexpression van OX-A gaf duidelijke signalen in de verschillende darm compartements, afnemend van de voorste naar de mediale darm (Figuur 1b, B1). De negatieve controle werd gebruikt als referentie voor de achtergrond en om de specificiteit van OX te bevestigen-een signaal (Figuur 1e). De langdurige blootstelling aan de chromogeen schar resulteerde in de toename van de achtergrond intensiteit (figuur 1d). Vergelijkbare resultaten werden waargenomen voor OX-2R immunoexpression in de darm van DIO en controle dieet zebravis (Figuur 2). Een verhoogde OS-een signaal in DIO Adult zebravis ging gepaard met de overexpressie van OX-2R in andere intestinale compartements (Figuur 2b, B1).

Met behulp van immunofluorescentie, werden de gegevens verkregen door immunoperoxidasekleuring analyse bevestigd, ten grondslag liggen aan de toename van OX-A en OX-2R expressie in de darm van volwassen DIO zebravis met betrekking tot de controle (Figuur 3). Bovendien, met behulp van dubbele immunofluorescentie, was het mogelijk om informatie te verkrijgen over de expressie van de endocannabinoïde receptor CB1R en de co-lokalisatie met OX-A of OX-2R in de darm en de hersenen van de controle dieet en DIO Adult zebravis. Het voordeel van immunofluorescentie is dat het een meer gedetailleerd signaal met minder verstrekte informatie over weefsel morfologie oplevert, in vergelijking met immunoperoxidasekleuring techniek. Met behulp van de immunofluorescentie methode, hebben we eerder bepaald anatomische interacties tussen OX-2R en CB1R in zowel de gut en Brain10.

De nauwkeurige analyse van immunefluorescentie beelden toonde de toename van OX-2R/CB1R co-lokalisatie in de darm van DIO Adult zebravis ten opzichte van de controle dieet zebravis (Figuur 3b, C). Een soortgelijke situatie werd waargenomen in verschillende hersengebieden, zoals de dorsale telencephalon, hypothalamus (laterale, buik, en dorsale zones), optische Tectum, torus lateraal, en diffuse kern van de inferieure kwab (Figuur 4). De negatieve (figuur 5a, B) en positieve (muis hersenen) (figuur 5c) controles werden gebruikt als verwijzingen voor de achtergrond en om de specificiteit van CB1R en Ox-2R signalen te bevestigen.

Bovendien, door dubbele immunokleuring met OX-A/CB1R, werd waargenomen in de orexinergic neuronen van de hypothalamus dat er een toename van de co-lokalisatie begeleid door een toename van OX-een fluorescerende signaal (Figuur 6). Deze resultaten laten zien hoe dubbele immunofluorescentie kan helpen bij het identificeren fysiologisch behouden eiwitexpressie, co-lokalisatie van target eiwitten, en hun distributie en/of expressie veranderingen in verschillende pathologische omstandigheden.

Figure 1
Figuur 1: Orexin immunolocalization in de darmen van DIO VS controle dieet volwassen zebravis. (A) Ox-een immunoreactivity in de cellen van de mediale darm van de controle dieet zebravis. (A1) OS-een immunoreactivity in de cellen van de mediale darm van DIO zebravis. (B) Ox-een immunoreactivity in de cellen van de voorste darm van de controle dieet zebravis. (B1) OX-een immunoreactivity in de cellen van de voorste darm van DIO zebravis. (A1, B1) Een toename van OX-een positieve cellen in verschillende weefsel compartement van de mediale en voorste darm van DIO zebravis. (C) Ox-een immunoreactivity in de cellen van de voorste DARM van Dio zebravis. (D) immunoperoxidasekleuring reactie voor Ox-a na een langdurige blootstelling aan DAB. Enegatieve controle. De staaf van de schaal: 50 µm (A, A1, B, b1); 100 µm (C, D, E). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Orexin 2 receptor immunolocalization in de darm van Dio VS controle dieet volwassen zebravis. (A) Ox-2R immunoreactivity in de cellen van de mediale darm van de controle dieet zebravis. (A1) OX-2R immunoreactivity in de cellen van de mediale darm van DIO zebravis. (B) Ox-2R immunoreactivity in de cellen van de voorste darm van de controle dieet zebravis. (B1) OX-2R immunoreactivity in de cellen van de voorste darm van DIO zebravis. (A1, B1) Een toename van OX-2R positieve cellen in verschillende weefsel compartement van de mediale en voorste darm van DIO zebravis. Schaal Bar: 50 µm. Please Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Distributie van Ox-a (groen)/CB1R (rood) en Ox-2R (rood)/CB1R (groen) en hun co-lokalisatie met Ox-2R/CB1R (geel) in de darmen van Dio VS. controle dieet volwassen zebravis. (A) Ox-A/CB1R co-expressie in de darm van de controle dieet volwassen zebravis. (B) Ox-2R/CB1R co-expressie binnen de darm van de controle dieet zebravis. (C) Ox-2R/CB1R co-expressie in de DARM van Dio Adult zebravis. Een toename van OX-2R/CB1R co-lokalisatie (gele stippen) in de darm van DIO zebravis. Schaal Bar: 25 µm. gelieve Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Distributie van Ox-2R (rood) en CB1R (groen) en hun co-lokalisatie met Ox-2R/CB1R (geel) in de hersenen coronale secties van Dio vs. controle dieet volwassen zebravis. (A) Ox-2R/CB1R co-expressie in de telencephalon van het controle dieet zebravis. (A1) OS-2R/CB1R mede-uitdrukking in telencephalon van DIO zebravis. (B) Ox-2R/CB1R co-expressie binnen de laterale, buik-en dorsale zone van de hypothalamus, optische Tectum, torus lateraal, diffuse kern van de inferieure kwab van controle dieet zebravis (B1) Ox-2R/CB1R co-expressie binnen de laterale, buik, en dorsale zones van de hypothalamus, optische Tectum, torus lateraal, en diffuse kern van de inferieure kwab van DIO zebravis. (C) hogere vergroting van de optische Tectum waaruit de co-expressie van Ox-2R/CB1R (geel) in de controle dieet zebravis. (C1) Hogere vergroting van de optische Tectum met de co-expressie van OX-2R/CB1R (geel) in de DIO zebravis. (D) een bijzonder van de optische Tectum waaruit de verdeling en mede-expressie van Ox-2R/CB1R (geel) in de Dio zebravis. DAPI (blauw) werd gebruikt om kernen te eosine. CP: centrale achterste thalamus kern; DD: dorsaal; Gelijkstroom: Centraal; DL: lateraal; DM: mediale; DP: posterior deel van de dorsale telencephalon; HD: dorsale zone van de periventriculaire hypothalamus; HV: de streek van de buik van periventriculaire hypothalamus; LH: lateraal deel van de hypothalamus; PGl: lateraal en PGm: mediale preglomerular kernen; PGZ: periventriculaire grijze zone van de optische Tectum; TeO: optische Tectum; TL: torus longitudinalis; VD: dorsale deel van de buik telencephalon. De staaf van de schaal: 50 µm (A, A1, c, c1); 250 µm (B en B1); 25 µm (D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Ox-2R en CB1R eiwitexpressie en specificiteit in volwassen hersenen van zebravis en muis Hippocampus. (A) negatieve controle van Ox-2R door pre-absorptie met het relatieve peptide. (B) negatieve controle van CB1R door pre-absorptie met het relatieve peptide. (C) positieve controle van Ox-2R/CB1R in de hippocampus van de muis. PGZ: periventriculaire grijze zone van de optische Tectum; TeO: optische Tectum. De staaf van de schaal: 100 µm (A, B); 250 µm (C). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: distributie van Ox-a (groen) en CB1R (rood) en hun co-lokalisatie met Ox-a/CB1R (geel) in de hypothalamic coronale secties van Dio vs. controle dieet volwassen zebravis. (A) Ox-a/CB1R co-expressie in de hypothalamus van de controle dieet zebravis (een1) hogere vergroting met de Ox-a/CB1R co-expressie binnen de laterale hypothalamus. Detail van OX-A/CB1R co-expressie waaruit een vermeende aangrenzende lokalisatie van OX-A/CB1R of co-lokalisatie en overlapping van OX-A/CB1R in dezelfde cellen. (B) Ox-a/CB1R co-expressie in de hypothalamus van Dio zebravis (b1) hogere vergroting met de verhoogde Ox-a/CB1R co-expressie binnen de laterale hypothalamus. Detail van OX-A/CB1R co-expressie waaruit een vermeende aangrenzende lokalisatie van OX-A/CB1R of co-lokalisatie en overlapping van OX-A/CB1R in dezelfde cellen. LH: lateraal deel van de hypothalamus. De staaf van de schaal: 50 µm (A, B); 25 µm (A1, B1). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Monstervoorbereiding

De voorbereiding van de steekproef is de eerste kritieke stap in IHC. Een betrouwbare protocol zorgt voor het onderhoud van de cel morfologie, weefsel architectuur, en antigenicity. Deze stap vereist juiste weefsel inzameling, bevestiging, en sectioning22,23. Het doel van fixatie is het behoud van weefsel en het verminderen van de werking van weefsel enzymen of micro-organismen. In het bijzonder, de fixatie stap behoudt cellulaire componenten en biomoleculen, voorkomt autolyse en verschuiving van cel bestanddelen (zoals antigenen en enzymen), stabiliseert cellulaire materialen tegen aversieve effecten van de volgende procedures, en vergemakkelijkt immunokleuring4,7,24.

Alvorens te sectioneren, wordt het weefsel voorbereid en door paraffine inbedding (immunoperoxidasekleuring methode) of gecryopreserveerde (het bevriezen in cryomedia, in veelvoudige immunofluorescentie methodes) bewaard. De conserveringsmethode wordt geassocieerd met het type fixatie7. Na fixatie en bewaring, worden de weefsels in plakjes gesneden door een microtome als ingebed in paraffine, of door een cryostat indien ingebed in een cryomedia. Weefsels worden meestal gesneden op een dikte bereik van 8-10 μm en gemonteerd op dia's. Voor immunoperoxidasekleuring het bevlekken, kan het monster extra stappen vereisen om de epitopes voor antilichamen band te ontmaskeren, met inbegrip van deparaffinization en antigeen teruggewonnen25,26. Het moet in gedachten worden gehouden dat overfixatie kan epitope maskeren veroorzaken, terwijl de onderfixatie kan weinig tot geen positief signaal met zware rand vlekken veroorzaken.

Blokkering en achtergrond reductie

In de immunoperoxidasekleuring methode, de hoge affiniteit van avidin voor Biotine is waarschijnlijk verantwoordelijk voor de snelle productie van achtergrond vlekken. Bovendien, aangezien de avidin-Biotine-reactie onomkeerbaar is, kan de achtergrond niet worden verwijderd18,27. Tijdens IHC, kan de hoge achtergrond ook door niet-specifieke band aan endogene weefsel tanden worden geproduceerd. Hydrofobe en Ionische interacties (zoals die geproduceerd door collageen en andere bindweefsel zoals epitheel en adipocyten), evenals endogene enzymactiviteit, zijn belangrijke oorzaken van achtergrond vlekken. Endogene biotine of enzymen en hydrofobe binding moet worden geminimaliseerd voorafgaand aan antilichaam kleuring, die kan worden bereikt door de toevoeging van een wasmiddel, zoals Triton X-100, in de blokkerende buffers28.

Het gebruik van 0.3%-0,4% Triton X-100 in de blokkerende buffers staat ook voor volledige permeabilization van de antilichamen in weefselsecties toe. Bovendien, hoewel antilichamen zijn bij voorkeur specifiek voor een epitope, gedeeltelijke binding aan sites op niet-specifieke eiwitten is mogelijk, wat leidt tot hoge achtergrond vlekken29. De niet-specifieke bindingen kunnen het signaal van het doel antigeen30maskeren. Ter vermindering van niet-specifieke achtergrondkleuring, monsters moeten worden uitgebroed met een buffer die blokkeert niet-specifieke reactieve sites. Gemeenschappelijke blokkerende buffers zijn normaal serum of boviene serum albumine30. De soort van het blokkerende serum zou hetzelfde moeten zijn als de gastheer van het secundaire antilichaam. Het wordt aanbevolen om de beste incubatietijd te bepalen. De concentratie van het normale serum in de blokkerende buffer is een andere belangrijke bepaling31. Bovendien, om de achtergrondkleuring te elimineren, is het essentieel om de optimale verdunning van de primaire en secundaire antilichamen te gebruiken. Zo moet de incubatietijd zorgvuldig worden gekozen, in aanvulling op de temperatuur (dat wil zeggen, verhoging van de tijd als het uitvoeren van bij 4 ° c, daling van de tijd als bij RT) en detectie systeem.

Antilichaam keuze

De selectie van antilichamen voor IHC kleuring is belangrijk en kan van invloed zijn experimentele uitkomst32. Om ervoor te zorgen dat het antilichaam gepast zal antwoorden, moet de epitope die door het wordt erkend worden overwogen. Begrijpend de doel proteïne en zijn functie, weefsel en subcellulaire localisatie, en of het post-translationele wijzigingen ondergaat kan helpen om de keus van antilichaam te bepalen. Een andere belangrijke stap is het testen van verschillende concentraties van primair/secundair antilichaam om de achtergrond en aspecificity op een minimumniveau te houden dat met een specifiek signaal compatibel is. Voorts is het belangrijk om soorten reactiviteit te controleren om primaire en secundaire antilichamen verenigbaarheid en het vermogen van het primaire antilichaam te bevestigen om het antigeen doel in zijn inheemse conformatie te erkennen. Een andere belangrijke stap voor primaire antilichamen keus is de groepering van het gen. Dit zorgt ervoor dat het primaire antilichaam met de biomolecule van belang reageert en verstrekt informatie waarover epitope door het antilichaam in een specifiek dierlijk model wordt erkend. De groepering van het gen verstrekt ook de mogelijkheid om antilichamen te kiezen geschikt om epitopes te erkennen die evolutief behouden zijn.

Besturingselementen

Om de specificiteit van de antilichamen te verduidelijken, een belangrijk aspect is de prestaties van de controles, die het mogelijk maakt de opsporing van specifieke vlekken. De controles omvatten: i) een weefsel dat wordt gekend om het antigeen als positieve controle uit te drukken; II) een weefsel dat bekend is om het antigeen als een negatieve controle uit te drukken; III) de weglating van het primaire antilichaam of de absorptie van het primaire antilichaam met een specifieke peptide om te bevestigen dat het secundaire antilichaam niet crossreact met andere weefsel componenten14,33.

In IHC technieken, kunnen verschillende stappen problemen veroorzaken voorafgaand aan het bereiken van de uiteindelijke kleuring. Sterke achtergrondkleuring en niet-specifieke doel antigeen kleuring kan worden veroorzaakt door endogene biotine of primaire/secundaire antilichaam cross-reactiviteit en slechte enzymactiviteit of primaire antilichaam potentie, respectievelijk. Achtergrondkleuring en niet-specifieke binding kan worden voorkomen door het blokkeren van de endogene enzymen voorafgaand aan de incubatie met de primaire antilichaam. Het gebruik van normaal serum is de beste manier om niet-specifieke interacties te blokkeren30. De keuze van de blokkerings buffer is afhankelijk van de gebruikte detectiemethode. Bovendien, een weefsel waarvan bekend is dat het gebrek aan de expressie van het doel antigeen als negatieve controle kan fungeren als de verwijzing naar de hoeveelheid van de achtergrondkleuring34te bepalen. De afzetting van chromogene of fluorescerend signaal in de negatieve controle bevestigt de aanwezigheid van niet-specifieke kleuring. Bovendien, onvoldoende blokkerings tijd blokkeert leidt tot een hoge achtergrond, terwijl overmatig blokkeren leidt tot een laag signaal35.

In immunoperoxidasekleuring kleuring, de aanwezigheid van endogene peroxidase in het weefsel is een andere oorzaak van bruine achtergrond depositie. De behandeling met H2O2 Prior de incubatie met het primaire antilichaam blokkeert endogene peroxidase36,37. Integendeel, in immunofluorescentie, fixatie speelt een belangrijke rol in de generatie van autofluorescentie. Om te voorkomen dat autofluorescentie, de beste fixatie methode, tijd van fixatie, en de bereiding van weefsels moeten zorgvuldig worden gekozen. Een andere kritieke stap van IHC is bevestiging van het primaire antilichaam. Een antilichaam wordt als geldig beschouwd als het een verenigbaar en specifiek het bevlekken patroon in een bepaald weefsel of cel/subcellulaire componenten veroorzaakt en als de pre-absorptie van het primaire antilichaam met een specifieke peptide kleuring38niet opbrengt. In immunofluorescentie, toont de niet-specifieke band gelijkaardige fluorescente intensiteit onder drie kleuren fluorescentie Detectors, terwijl het signaal veranderlijk is aangezien de verschillende fluorescente geconjugeerde secundaire antilichamen worden gebruikt. Deze aspecten van IHC weefsel voorbereiding en antilichaam het bevlekken moeten worden gericht om het bevlekken kwesties te overwinnen.

IHC, hoewel een relatief eenvoudige techniek, presenteert een aantal beperkingen en zijn afhankelijk van vele factoren39. Een van de cruciale punten is formaline fixatie, die kan veranderen de expressie van post-Translation gemodificeerde eiwitten. Aan de andere kant, formaline-vaste paraffine-embedded weefsels kunnen worden opgeslagen voor de lange termijn bij kamertemperatuur, terwijl bevroren weefsels kunnen alleen worden opgeslagen voor maximaal een jaar bij-80 ° c. Bovendien kunnen bevroren weefsels worden beschadigd door de vorming van ijs kristallen, die van invloed kunnen zijn op de subcellulaire details veranderen IHC kleuring40,41. Met betrekking tot onze studies, het moeilijkste aspect was het vinden van specifieke primaire antilichamen tegen zebravis moleculen. Hoewel zebravis zijn erkend als een geldig diermodel met een zeer geconserveerde mate van structuur, zijn zeer weinig antilichamen ontwikkeld die specifieke eiwitten en andere moleculen kunnen herkennen in zebravis. Om deze beperkingen te overwinnen, is het belangrijk om antilichamenspecificiteit door westelijke het bevlekken analyse en gen groepering te valideren.

De groeiende interesse in IHC methods heeft geleid tot de ontwikkeling van zeer specifieke immunokleuring die onderzoek kunnen helpen42. IHC wordt met toenemende frequentie gebruikt om de aanwezigheid van specifieke moleculaire markers en hun veranderingen in verschillende pathologieën te identificeren. De twee benaderingen die hier worden geïllustreerd, immunoperoxidasekleuring en immunofluorescentie, hebben respectieve voordelen en nadelen43. Paraffine-embedded weefsel, gebruikt in de immunoperoxidasekleuring techniek, kan zorgen voor een hoge resolutie van cellen en weefsels en onthullen details over de verdeling en de hoeveelheid doelwit eiwitten44,45. Echter, paraffine-embedded weefsels zijn niet geschikt voor immunofluorescentie, omdat paraffine kan maskeren de antigenicity en leiden tot niet-specifieke fluorescentie46. Aan de andere kant, cryosection van het vaste weefsel behoudt endogene antigenicity en leiden tot een daling van de niet-specifieke fluorescentie. Zelfs als de technische kwaliteit van de cryosecties veel lager is dan die van paraffine-ingebed weefsel, kunnen ze geldige resultaten opleveren met behulp van de IHC Technique47.

Bovendien, terwijl paraffine inbedding beter behoudt morfologische Details, cryopreservatie beter conserven enzym en antigeen expressie, wat leidt tot meer gedetailleerde immunokleuring. De immunofluorescentie techniek maakt het ook mogelijk de hedendaagse detectie van twee of drie verschillende biomoleculen, onthullende mogelijke interacties, zoals geïllustreerd in onze eerdere werk voor orexin en endocannabinoïde Systems10. Onder de technieken die worden gebruikt om de distributie en het niveau van specifieke biomoleculen te detecteren, maakt IHC niet alleen de bepaling van specifieke morfologische expressie en distributie van moleculen en eiwitten mogelijk, maar ook de mogelijkheid om kwantitatieve Analyse.

Met behulp van immunofluorescentie kunnen ook de codistributie en coexpressie van biomoleculen verder worden begrepen, alsmede mogelijke interacties en hun veranderingen in gevallen van verschillende pathologieën48. Confocale microscopie, gedurende de laatste 20 jaar, is vaak gebruikt om de cellulaire en subcellulaire distributie van tal van eiwitten in de hersenen van zoogdieren te bestuderen. Fluorescentie microscopie maakt het ook mogelijk de visualisatie (met behulp van fluorophores of fluorescent kleurstoffen) van specific structuren van belang, zoals eiwitten, organellen, en andere biologische materie; dergelijke signalen kunnen in zowel vaste als levende biologische systemen aan beeld specific subcellulaire structuren49worden gebruikt. De potentiële modulator functie van biomoleculen in specifieke cel compartimenten kan worden verkend via de visualisatie van hun expressie patronen, terwijl de rol van eiwit signalering in de weefsels kan worden blootgelegd via de neuroanatomische verdeling van metabolische enzym uitdrukking of receptoren.

De gepresenteerde technische werk introduceert IHC benaderingen, voornamelijk immunofluorescentie, aan het bestuderen van twee sterk behouden systemen, orexin en endocannabinoïde, in een volwassen zebravis model. In het bijzonder, kunnen de immunofluorescentie methodes worden gebruikt om de distributie, het relatieve bedrag, en de anatomische interactie van specifieke proteïnen in doelweefsels te bepalen. Cryopreservatie van de met een vaste tissues gerepareerde weefsels bewaart zeer gevoelige eiwitten die gevoelig zijn voor snelle achteruitgang. Bovendien wordt cryopreservatie gedacht om antigeen en antigenicity beter te bewaren, en het staat voor het bestuderen van post-Translation gemodificeerde proteïnen en DNA toe.

Zelfs als bevroren weefsels (in vergelijking met paraffine-embedded secties) zijn dikker, die belemmert de mogelijkheid om weefsel morfologie observeren in detail, confocale microscopie zorgt voor sample visualisatie in groot detail en verbetert de beeldvorming mogelijkheden. Bovendien kan immunofluorescentie worden gebruikt voor kwantitatieve analyse van de kleurintensiteit, en densitometric analyse van het signaal levert kwantitatieve gegevens. Dit zorgt voor het bepalen van correlaties van fluorochrom signaalniveaus met eiwitexpressie niveaus door te kijken naar gebieden van co-lokalisatie. Dit werk beschrijft en illustreert protocollen die kunnen worden gebruikt om het evolutionaire behoud van belangrijke eiwitten in de volwassen zebravis te bestuderen. Het gebruik van IHC, hoofdzakelijk immunofluorescentie, bij volwassen zebravis kan helpen het nut van dit diermodel te benadrukken bij het bestuderen van de morfologische expressie en de verdeling van sterk behouden biomoleculen, evenals het openbaren van mogelijke veranderingen in verschillende pathologische omstandigheden correleren met menselijke pathofysiologie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door Fondi ricerca di Ateneo (FRA) 2015-2016, Universiteit van Sannio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216, 49-67 (1998).
  2. Haines, D. M., West, K. H. Immunohistochemistry: forging the links between immunology and pathology. Veterinary Immunology and Immunopathology. , 151-156 (2005).
  3. Onul, A., et al. Application of immunohistochemical staining to detect antigen destruction as a measure of tissue damage. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (9), 683-693 (2012).
  4. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  5. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells, II: improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  6. Coons, A. H., Leduc, E. H., Connolly, J. M. Studies on antibody production, I: a method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit. The Journal of Experimental Medicine. 102 (1), 49-60 (1955).
  7. Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
  8. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 2 (Suppl 2), S307-S309 (2012).
  9. Al-Hussinee, L., et al. Immunohistochemistry and pathology of multiple Great Lakes fish from mortality events associated with viral hemorrhagic septicemia virus type IVb. Diseases of Aquatic Organisms. 93 (2), 117-127 (2011).
  10. Imperatore, R., et al. Overlapping Distribution of Orexin and Endocannabinoid Receptors and Their Functional Interaction in the Brain of Adult Zebrafish. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 62 (2018).
  11. Concas, A., et al. Immunochemical Localization of GABAA Receptor Subunits in the Freshwater Polyp Hydra vulgaris. Neurochemical Research. 41 (11), 2914-2922 (2016).
  12. Mania, M., et al. Expression and distribution of leptin and its receptors in the digestive tract of DIO (diet-induced obese) zebrafish. Annals of Anatomy. , 37-47 (2017).
  13. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  14. Holmseth, S., et al. Specificity controls for immunocytochemistry: the antigen preadsorption test can lead to inaccurate assessment of antibody specificity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 60 (3), 174-187 (2012).
  15. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (1), 6-12 (2011).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  18. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  19. Cristino, L., et al. Obesity-driven synaptic remodeling affects endocannabinoid control of orexinergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), E2229-E2238 (2013).
  20. Imperatore, R., et al. Genetic deletion of monoacylglycerol lipase leads to impaired cannabinoid receptor CBR signaling and anxiety-like behavior. Journal of Neurochemistry. 135 (4), 799-813 (2015).
  21. Laperchia, C., et al. The excitatory/inhibitory input to orexin/hypocretin neuron soma undergoes day/night reorganization. Brain Structure and Function. 222 (8), 3847-3859 (2017).
  22. Eltoum, I., Fredenburgh, J., Grizzle, W. E. Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. Journal of Histotechnology. 24 (3), 201-210 (2001).
  23. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. Public Library of Science One. 6 (8), e23780 (2011).
  24. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70 (1), 12-19 (2014).
  25. Dupre, M. P., Courtade-Saidi, M. Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology. Annales de Pathologie. 32 (6), 433-437 (2012).
  26. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of Immunohistochemistry for Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections Based on the Antigen Retrieval Technique: From Experiments to Hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39, 741-748 (2006).
  27. Giorno, R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diagnostic Immunology. 2 (3), 161-166 (1984).
  28. Ramos-Vara, J. A., Saeteele, J. Immunohistochemistry. Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., Kaser, M. R. , CRC Press. Boca Raton, FL. 273-314 (2007).
  29. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  30. Buchwalow, I., Somoloiva, V., Boecker, W., Tiemann, M. Nonspecific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Scientific Reports. 1, 28 (2011).
  31. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  32. Kalyuzhny, A. E. The dark side of the immunohistochemical moon: industry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (12), 1099-1101 (2009).
  33. Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Endocrinology. 155 (3), 676-687 (2014).
  34. Ivell, R., Teerds, K., Hoffman, G. E. Proper application of antibodies for immunohistochemical detection: antibody crimes and how to prevent them. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
  35. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Progress in Retinal and Eye Research. 48, 181-202 (2015).
  36. Boi, G., Scalia, C. R., Gendusa, R., Ronchi, S., Cattoretti, G. Disaccharides Protect Antigens from Drying-Induced Damage in Routinely Processed Tissue Sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (1), 18-31 (2016).
  37. Curran, R. C., Gregory, J. Demonstration of immunoglobulin in cryostat and paraffin sections of human tonsil by immunofluorescence and immunoperoxidase techniques. Effects of processing on immunohistochemical performance of tissues and on the use of proteolytic enzymes to unmask antigens in sections. Journal of Clinical Pathology. 31 (10), 974-983 (1978).
  38. O'Hurley, G., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8 (4), 783-798 (2014).
  39. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomarker Insights. 5, 9-20 (2010).
  40. Mayersbach, H. V. Principles and limitations of immunohistochemical methods. Journal of Royal Microscopical Society. 87 (2), 295-308 (1967).
  41. Shi, S. R., Liu, C., Taylor, C. R. Standardization of immunohistochemistry for formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen-retrieval technique: from experiments to hypothesis. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (2), 105-109 (2007).
  42. Dixon, A. R., et al. Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry. Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).
  43. Mölne, J., Breimer, M. E., Svalander, C. T. Immunoperoxidase versus immunofluorescence in the assessment of human renal biopsies. American Journal of Kidney Diseases. 45 (4), 674-683 (2005).
  44. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  45. Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies. International Journal of Genomics. , 1926304 (2017).
  46. Xie, R., et al. Factors influencing the degradation of archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 59 (4), 356-365 (2011).
  47. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  48. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17 (12), 14067-14090 (2012).
  49. Marks, K. M., Nolan, G. P. Chemical labeling strategies for cell biology. Nature Methods. 3 (8), 591-596 (2006).

Tags

Biochemie kwestie 148 Immunohistochemistry immunoperoxidasekleuring orexin receptor endocannabinoïde receptor zebravis hersenen zebravis darm
Identificatie van Orexin en endocannabinoïde receptoren bij volwassen zebravis met behulp van immunoperoxidasekleuring en immunofluorescentie methoden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Imperatore, R., D'Angelo, L., De… More

Imperatore, R., D'Angelo, L., De Girolamo, P., Cristino, L., Paolucci, M. Identification of Orexin and Endocannabinoid Receptors in Adult Zebrafish Using Immunoperoxidase and Immunofluorescence Methods. J. Vis. Exp. (148), e59308, doi:10.3791/59308 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter