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Biochemistry

Identification des récepteurs d'orexine et d'endocannabinoïdes chez le poisson zèbre adulte à l'aide de méthodes d'immunoperoxidase et d'immunofluorescence

Published: June 25, 2019 doi: 10.3791/59308
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 2, 1
1Department of Sciences and Technologies (DST), University of Sannio, 2Endocannabinoid Research Group, Institute of Biomolecular Chemistry, 3Department of Veterinary Medicine and Animal Productions, University of Naples Federico II

Summary

Présentés ici sont des protocoles pour la caractérisation immunohistochimique et la localisation du peptide d'orexine, des récepteurs d'orexin, et des récepteurs endocannabinoïdes dans l'intestin et les cerveaux des modèles normaux et induits par l'obésité de régime (DIO) de poissons zèbres adultes utilisant immunoperixidase et les méthodes d'immunofluorescence double.

Abstract

L'immunohistochimie (IHC) est une technique très sensible et spécifique impliquée dans la détection d'antigènes cibles dans les sections tissulaires avec des anticorps étiquetés. Il s'agit d'un processus en plusieurs étapes dans lequel l'optimisation de chaque étape est cruciale pour obtenir le signal spécifique optimal. Grâce au CSI, la distribution et la localisation de biomarqueurs spécifiques peuvent être détectées, révélant des informations sur la conservation évolutive. En outre, le CSI permet de comprendre les changements d'expression et de distribution des biomarqueurs dans des conditions pathologiques, comme l'obésité. IHC, principalement la technique d'immunofluorescence, peut être utilisé chez les poissons zèbres adultes pour détecter l'organisation et la distribution des molécules phylogénétiquement conservées, mais un protocole Standard IHC n'est pas estasblished. L'orexine et l'endocannabinoïde sont deux systèmes hautement conservés impliqués dans le contrôle de l'apport alimentaire et de la pathologie de l'obésité. Les protocoles utilisés ici sont utilisés pour obtenir des informations sur le peptide orexin (OXA), le récepteur de l'orexine (OX-2R) et la localisation et la distribution des récepteurs cannabinoïdes (CB1R) dans l'intestin et le cerveau des modèles de poissons zèbres adultes obèses normaux et induits par l'alimentation (DIO). Sont également décrits des méthodes pour l'immunoperoxidase et la double immunofluorescence, aussi bien que la préparation des réactifs, de fixation, de paraffin-embedding, et de cryoprotection du tissu de poisson zèbre et la préparation pour une étape et arrière-plan endogènes de blocage d'activité contre-staining. L'ensemble complet des paramètres est obtenu à partir d'expériences précédentes du CSI, grâce auxquelles nous avons montré comment l'immunofluorescence peut aider à comprendre les OX, l'OX-2R et la distribution, la localisation et la conservation de l'expression chez les poissons zèbres adultes. Tissus. Les images résultantes avec une intensité de signal très spécifique ont conduit à la confirmation que le poisson zèbre sont des modèles animaux appropriés pour les études immunohistochimiques de la distribution, de la localisation et de la conservation évolutive de biomarqueurs spécifiques dans conditions physiologiques et pathologiques. Les protocoles présentés ici sont recommandés pour les expériences du CSI chez les poissons zèbres adultes.

Introduction

L'immunohistochimie (IHC) est une technique classique bien établie utilisée pour identifier les composants cellulaires ou tissulaires (antigènes) par interaction antigène-anticorps1,2. Il peut être utilisé pour identifier la localisation et la distribution des biomolécules cibles dans un tissu. Le CSI utilise des réactions immunologiques et chimiques pour détecter les antigènes dans les sections tissulaires3. Les principaux marqueurs utilisés pour la visualisation des interactions antigène-anticorps comprennent les colorants fluorescents (immunofluorescence) et les réactions de couleur enzyme-substrat (immunoperoxidase), tous deux conjugués aux anticorps4. L'utilisation de l'observation microscopique est possible pour déterminer la localisation des tissus étiquetés, ce qui correspond approximativement à la localisation de l'antigène cible dans le tissu.

Deux méthodes existent pour les réactions fluorescentes ou chromogéniques pour détecter les protéines : la méthode de détection directe, dans laquelle l'anticorps primaire spécifique est directement étiqueté; et la méthode de détection indirecte, dans laquelle l'anticorps primaire est non conjugué tandis que l'anticorps secondaire porte l'étiquette5,6,7. La méthode indirecte présente certains avantages, qui sont principalement son amplification du signal. En outre, contrairement à d'autres techniques moléculaires et cellulaires, avec l'immunofluorescence, il est possible de visualiser la distribution, la localisation et la coexpression de deux protéines ou plus exprimées différemment dans les cellules et les tissus7. Le choix de la méthode de détection utilisée dépend des détails expérimentaux.

À ce jour, iHC est largement utilisé dans la recherche fondamentale comme un outil puissant et essentiel pour comprendre la distribution et la localisation des biomarqueurs et le profilage général des différentes protéines dans les tissus biologiques de l'homme aux invertébrés8, 9 (en) , 10 Ans et plus , 11. La technique aide à afficher une carte de l'expression des protéines dans un grand nombre d'organes animaux normaux et altérés et de différents types de tissus, montrant la possibilité de descendre ou de modifier l'expression induite par des changements physiologiques et pathologiques. IHC est une technique très sensible qui nécessite une précision et le bon choix de méthodes pour obtenir des résultats optimaux12. Tout d'abord, de nombreux facteurs différents tels que la fixation, la réactivité croisée, la récupération d'antigènes et la sensibilité des anticorps peuvent conduire à de faux signaux positifs et faux négatifs13. La sélection des anticorps est l'une des étapes les plus importantes du CSI et dépend de la spécificité de l'antigène et de son affinité avec les protéines et les espèces à l'étude7.

Récemment, nous avons optimisé la technique du CSI pour détecter les membres de l'orexine/hypocrétine et des systèmes endocannabinoïdes dans le tissu adulte de poisson zèbre. Nous nous sommes concentrés principalement sur la fixation, l'intégration tissulaire à l'aide de deux approches différentes, la section et le montage (qui peuvent affecter la résolution et le détail lors de l'analyse microscopique), et le blocage (pour prévenir les faux positifs et réduire le fond)14. D'autres caractéristiques importantes sont la spécificité et la sélectivité des anticorps et la reproductibilité des protocoles individuels du Ci-Ph. La clé pour fournir la spécificité d'anticorps est l'utilisation des contrôles négatifs (y compris aucun anticorps primaire ou tissu qui est connu pour ne pas exprimer les protéines cibles) aussi bien que des contrôles positifs (y compris le tissu qui est connu pour exprimer les protéines cibles)15 . La sélection des anticorps pour iHC est faite en fonction de leur spécificité de l'espèce (la probabilité avec laquelle ils réagissent avec l'antigène d'intérêt) et des systèmes de détection de liaison antigène-anticorps qui sont utilisés4,5,6 ,7. Dans le cas de l'immunoperoxidase, la couleur de la réaction est déterminée par la sélection du chromogène précipitant, habituellement diaminobenzidine (brun)16. D'autre part, immunofluorescence utilise des anticorps conjugués avec un fluorophor pour visualiser l'expression des protéines dans les sections de tissus congelés et permet une analyse facile de protéines multiples en ce qui concerne le système de détection chromogénique 5 Annonces , 7.

Dans la technique d'immunoperoxidase, l'anticorps secondaire est conjugué à la biotine, une molécule de liaison capable de recruter une molécule journaliste chromogénique [complexe d'avidin-biotine (ABC)], conduisant à l'amplification du signal de coloration. Avec la méthode de journaliste d'ABC, l'enzyme peroxidase réagit avec 3,3'-diaminobenzidine (DAB), produisant une coloration intensément brune où l'enzyme se lie à l'anticorps secondaire, qui peut alors être analysée avec un microscope léger ordinaire. La coloration d'ABC, due à la forte affinité de l'avidine pour la biotine, produit une réaction rapide et optimale, avec peu d'anticorps secondaires attachés au site de la réactivité primaire d'anticorps. Cette méthode de détection chromogénique permet l'analyse densitométrique du signal, fournissant des données semi-quantitatives basées sur la corrélation des niveaux de signal brun avec les niveaux d'expression protéique18.

Avec les techniques d'immunofluorescence, la détection simultanée de protéines multiples est possible en raison de la capacité de différents fluorochromes à émettre de la lumière à des longueurs d'onde uniques, mais il est important de choisir les fluorochromes avec soin pour minimiser les chevauchements spectrals 5. En outre, l'utilisation d'anticorps primaires chez différentes espèces hôtes minimise les difficultés liées à la réactivité croisée. Dans ce cas, chaque anticorps secondaire spécifique à une espèce ne reconnaît qu'un seul type d'anticorps primaires. Les reporters fluorescents sont de petites molécules organiques, y compris des dérivés commerciaux, comme les colorants Alexa Fluor.

De nombreux modèles animaux sont utilisés pour comprendre des conditions physiologiques et pathologiques particulières. À ce jour, il est établi que de nombreuses voies métaboliques sont conservées au cours de l'évolution. Par conséquent, les études du CIS dans des organismes modèles tels que le poisson zèbre peuvent fournir un aperçu de la genèse et du maintien des conditions pathologiques et non pathologiques17. C'est un but de ce rapport pour illustrer des protocoles d'IHC qui peuvent être exécutés sur le tissu adulte de poisson zèbre et employés pour obtenir des images détaillées de la distribution et de la localisation d'OXA, d'OX-2R, et de CB1R aux niveaux périphériques et centraux. On signale également des protocoles pour l'application de deux principales méthodes indirectes du CIS dans les tissus périphériques et centraux du poisson zèbre adulte. La méthode indirecte, qui permet l'amplification du signal dans les cas où un anticorps secondaire est conjugué à un colorant fluorescent (méthode d'immunofluorescence) ou à un reporter enzymatique (méthode d'immunoperoxidase). Les méthodes de détection chromogéniques et fluorescentes possèdent des avantages et des inconvénients. Rapporté dans ce protocole est l'utilisation de IHC, principalement l'immunofluorescence, chez le poisson zèbre adulte, un modèle animal largement utilisé pour étudier les systèmes qui sont évolutifs conservés à travers différentes conditions physiologiques et pathologiques.

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Protocol

1. Protocole d'immunoperoxidase

REMARQUE: Le poisson zèbre a été obtenu par le professeur Omid Safari (Département des pêches, Faculté des ressources naturelles et de l'environnement, Université Ferdowsi de Mashhad, Mashhad, Iran)10.

  1. Dissection tissulaire
    1. Sacrifier le poisson zèbre par submersion dans l'eau glacée (5 parties de glace/1 partie d'eau, 4 oC); les laisser jusqu'à la cessation de tout mouvement pour assurer la mort par hypoxie.
    2. Enlevez rapidement l'intestin et le cerveau avec la méthode de dissection suivante :
      1. Séchez le poisson sur un essuie-tout et placez-le sagittalement sur un tapis de dissection, bloquant la partie ventrale de la douille de l'œil et la partie charnue de la queue.
      2. Pour l'intestin: couper la peau et enlever soigneusement la peau et le muscle sous-jacent du côté du poisson jusqu'à ce que les organes internes sont visibles. Retirez l'intestin de la cavité du corps qui l'étire.
      3. Pour le cerveau : retirez la tête avec une lame de rasoir. Enlever les tissus mous du côté ventral du crâne avec des forceps. Ouvrez le crâne et retirez l'os du côté ventral du cerveau. Enlever la peau et les os du crâne du côté dorsal du cerveau. Enlevez le cerveau.
  2. Fixation des tissus
    1. Fixer les tissus disséquants par immersion dans du paraformaldeyde frais de 4 % (PFA) dans un tampon de phosphate (PB, pH 7,4, 4 oC) pendant 3 h à température ambiante (RT).
      1. Préparer 0,1 M PB en dissolvant 1,755 g de NaH2PO4H2O et 4,575 g de Na2HPO4 dans 450 mL d'eau distillée (dH2O), et ajuster à un pH de 7,4 avec la quantité nécessaire de NaOH 1N.
      2. Préparer 4% PFA dissoudre 4 g de PFA dans 100 ml de 0,1 M PB (pH 7,4) par agitation sur une plaque chauffante. Lorsqu'une température de 60 oC est atteinte, ajouter 2-4 gouttes de NaOH 1N pour obtenir une solution claire. Gauche PFA 4% à RT et contrôler le pH . Ajuster le pH à 7,4.
        REMARQUE : La fixation des tissus pendant plus de 4 à 6 h peut conduire à une surfixation, qui masque les antigènes, limitant la liaison anticorps-épitophe. Le temps de fixation dépend de la taille des tissus.
  3. Incorporation de tissu
    1. Rincer les tissus 5x pendant 5 min chacun, par immersion en 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Déshydrater les tissus par immersion subséquente dans l'alcool 70 % (6 min), 80 % (6 min), 95 % (5 min), 95 % (5 min), 100 % (1 min) et 100 % (1 min).
    3. Clarifier les tissus par immersion dans 100% alcool:xylène (1:1) pendant 10 min, puis 2x en xylène pendant 5 min chacun.
    4. Infiltrer les tissus avec de la cire de paraffine (56 oC) deux fois pendant 1 h chacun par immersion directe dans la paraffine.
    5. Intégrer les tissus dans des blocs de paraffine à température ambiante (RT) et les conserver à RT jusqu'à la section.
  4. Coupe de tissu
    1. Couper les tissus en sections coronales ou sagittales d'une épaisseur de 8 m avec un microtome, et recueillir les sections en série alternée sur des lames de verre adhésif sur l'eau et réchauffées à 38 oC.
    2. Séchez les toboggans avec des sections à 37 oC pendant la nuit.
  5. Déparaffinisation et réhydratation des sections tissulaires
    1. Décire les sections par immersion en xylène pendant 5 min suivie d'une immersion en xylène pendant 3 min.
    2. Réhydratez les sections par immersion subséquente dans l'alcool 100% II (1 min), 100% I (1 min), 95% (1 min), 75% (1 min), 50% (1 min), puis placez les lames en dH2O (5 min).
      REMARQUE : Décire complètement les sections avant de commencer la réaction. Si les sections ont encore des traces de paraffine, effectuez une immersion supplémentaire en xylène pendant 5 minutes ou plus.
  6. Récupération d'antigène
    1. Traiter les sections avec un tampon de citrate (0,01 M, pH 6,0) en plongeant les glissières dans la solution et en chauffant dans un four à micro-ondes pendant 5 min à puissance maximale.
    2. Laissez refroidir les sections.
    3. Répéter le cycle de 5 min au micro-ondes à puissance maximale pour compléter la récupération d'antigène.
      1. Préparer le tampon de citrate (0,01 M, pH 6,0) en dissolvant 2,10 g d'acide citrique en 100 ml de dH2O et 5,882 g de citrate de sodium dans 200 mL de dH2O. Mélanger le citrate de sodium (0,01 M) avec de l'acide citrique (0,01 M) à un ratio de 1:4 en volume et ajuster le pH 6 en utilisant HCl 0.1N.
  7. Blocage de la peroxidase endogène
    1. Délimiter la zone tissulaire sur les lames à l'égard d'un stylo résistant aux solvants.
    2. Rincer les sections 3 fois, 5 min chacune, avec une solution saline tris tamponnée (TBS) (0,1 M, pH 7,3).
      1. Préparer 0,1 M TBS en dissolvant 12,1 g de base de trizma et 9 g de NaCl en 950 ml de dH2O et ajuster au pH 7,3 avec HCl 0,1N.
    3. Bloquez l'activité endogène de peroxidase par des diapositives immersion dans une solution de 0,75% H2O2 pour 5 min à RT.
      1. Préparer la solution H2O2 de 0,75 % dissolvant 5 mL de 30 % H2O2 dans 195 mL de dH2O.
        REMARQUE : les enzymes ndogenous peuvent réagir avec des réactifs iHC et donner de faux résultats positifs. En outre, les tissus fortement vascularisés expriment beaucoup de peroxidase endogène, qui peut mener à la coloration non spécifique intense et aux niveaux de fond. Le traitement avec 0.75% H2O2 étanches peroïdase endogène et réduit de manière significative le fond non spécifique.
  8. Blocage de bindi bindi ng sites et perméabilisation des tissus
    1. Incuber les sections tissulaires avec le tampon de blocage Triton (TBS-T) du SCT/0,4 %, contenant l'antisérum primaire (SNR), pendant 30 min à RT pour bloquer les sites de liaison non spécifiques.
      1. Préparer 0,4 % de Triton en dissolvant 0,4 mL de Triton X-100 dans 100 mL de SCT.
      2. Préparer la solution tampon de blocage TBS-T en dissolvant 1 % de sérum normal dans le SCT contenant 0,4 % de Triton X-100 (1 ml de sérum normal, 8,2 mL de SCT et 0,8 mL de 0,48 Triton X-100).
        REMARQUE : Sélectionnez l'espèce du sérum animal en fonction de l'hôte de l'anticorps secondaire (p. ex., lorsque vous utilisez un anticorps secondaire anti-lapin de chèvre, utilisez un sérum de chèvre normal).
  9. Incubation de tissus avec anticorps primaires
    1. Incuber les sections pendant la nuit dans une boîte humide à RT avec des anticorps primaires dilués dans TBS-T. Tainer les sections avec l'anticorps primaire suivant :
      1. Anticorps de chèvre contre OX-2R dilué 1:200, qui reconnaît le C-terminal de la protéine.
      2. Anticorps de chèvre contre OX-A dilué 1:200 [orexin-A (C-19)], qui reconnaît le C-terminal de la protéine.
        REMARQUE : Assurez-vous que l'anticorps primaire réagit avec la biomolécule d'intérêt. Définir avec quel épitoe de la biomolécule l'anticorps primaire réagit en utilisant l'alignement des gènes. Par exemple, l'épitope OX-A a été cartographié entre les aa 50-100 de l'ox-A humain (O43612) tandis que l'épitope OX-2R a été cartographié près des 50 derniers aa au terminal C de l'homme.
  10. Incubation de tissus avec anticorps secondaire
    1. Rincer les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Incuber les sections pendant 1,5 h à RT avec des anticorps secondaires biotinylated et l'immunoglobuline anti-chèvre de lapin (H-L) conjugués à la biotine, puis diluer 1:100 dans TBS-T.
      REMARQUE : Testez et trouvez les différentes dilutions des anticorps primaires et secondaires pour trouver la dilution optimale qui permet la réduction de l'arrière-plan.
  11. Réaction de Peroxidase
    1. Rincer les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Incuber les sections avec avidin-biotine complexe (ABC) pour 1 h.
      1. Préparer la solution ABC en ajoutant deux gouttes de composant A suivies de deux gouttes de composant B dans 5 ml de SCT.
    3. Rincer les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M TBS (pH 7,3).
    4. Traiter les sections avec le substrat chromogène 3,3'-diaminobenzidine-4 (DAB).
      1. Préparer la solution DAB en ajoutant une goutte (environ 30 l) de concentré de chromogène DAB à 1 ml de diluant DAB, et mélanger bien avant utilisation.
        REMARQUE : Préparer la solution ABC au moins 30 min avant l'utilisation et maintenir le complexe à 4 oC jusqu'à ce qu'il soit utilisé pour permettre une liaison stable à l'avidine/biotine. Préparer la solution de travail DAB fraîche, appliquer sur les sections de tissu, et se développer jusqu'à ce que la couleur est appropriée. Lorsque la réaction chromogénique convertit les sites de l'épitographe en une couleur brune et que l'intensité du signal est appropriée pour l'imagerie, passez à l'étape suivante. Le moment du développement de DAB peut varier de quelques secondes à 10 min. Pour OX-A et OX-2R 1, 2 min suffit. Manipulez le DAB avec soin, car il est cancérogène.
  12. Déhydratation et montage des tissus
    1. Rincer toutes les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M TBS (pH 7.3) pour arrêter la réaction DAB.
    2. Déshydrater les sections par immersion subséquente dans l'alcool 50% (2 min), 75% (2 min), 95% (2 min), 100% I (2 min), 100% II (2 min).
    3. Clarifier les tranches par immersion 2x en xylène 10 min chacune.
    4. Montez les sections avec DPX (dibutyl phtalate xylène) monture pour l'histologie, en ajoutant deux gouttes de supports de montage à des diapositives et en garniture lentement avec des couvertures.
      REMARQUE : Puisque l'immersion des tissus dans des concentrations croissantes d'alcool pendant la déshydratation entraîne la pénétration de l'alcool des tissus et le remplacement de l'eau par de l'alcool, déterminez un temps de déshydratation précis et ne déshydratez pas trop les tissus. Effectuer l'immersion en xylène après déshydratation pour clarifier le tissu et enlever tout excès ou l'alcool restant.
  13. Contrôles
    1. Répétez les sections 1.1-1.12, en omettant l'anticorps primaire et/ou en remplaçant l'anticorps primaire ou l'anticorps secondaire IgG par le SCT (contrôles négatifs).
    2. Répétez les sections 1,1 à 1,12 préabsorbant chaque anticorps primaire avec un excès du peptide relatif (100 mg de peptide/1 mL d'antisérum dilué).
    3. Répétez les sections 1.1-1.12 en utilisant différents tissus comme contrôle positif (p. ex., tissu de souris).
      REMARQUE : Préparer tous les tampons frais, peu de temps avant de commencer. Retirez soigneusement l'excès de liquide à chaque étape avec une pipette ou un papier filtre autour des sections, en gardant toujours les sections humides.
  14. Acquisition et analyse d'images
    1. Acquérir des images numériques sous éclairage lumineux constant et au même grossissement à l'aide d'un microscope équipé d'un appareil photo numérique.
    2. Effectuer une analyse semi-quantitative de l'intensité des taches à l'aide d'un logiciel d'imagerie (voir Tableau des matériaux).
      1. Ouvrez les images capturées, en format fichier .lif ou .tiff, pour évaluer les indices de positivité OX-A ou OX2-R.
      2. Sélectionnez le bouton sous Mesure et cliquez sur Manuel Counting. Comptez le nombre de profils de cellules tachées directement à partir de l'écran en plaçant une marque sur les cellules positives en cliquant sur la souris.
      3. Sélectionnez une zone d'intérêt (ROI) (3 x 103 m2) pour quantifier la densité immunosignal (densité optique, OD).
      4. Déterminer le pixel ayant la plus forte intensité (haute intensité positive) et la moins forte intensité (négative) à l'intérieur de l'image analysée pour attribuer le zéro comme valeur de l'arrière-plan (c.-à-d. une partie du tissu dépourvu de cellules tachées).
      5. Évaluer l'OD en travaillant sur une échelle logarithmique d'absorption. Dans l'analyse d'image numérique, l'intensité du pixel DAB varie de l'ombre la plus sombre (valeur 0) à la plus légère (255 valeur).
      6. Déterminer l'OD en traçant un histogramme de ce qui suit : log10(255/I), où « I » est la valeur d'intensité de pixel donnée par le programme et déterminée en soustrayant l'arrière-plan.
        REMARQUE : La réaction permanente et stable d'immunoperoxidase peut être analysée sous un microscope lumineux-champ à tout moment. Effectuer le comptage des cellules étiquetées sur une section alternative afin d'éviter le double comptage de la même cellule à partir de sections adjacentes.

2. Protocole d'immunofluorescence

  1. Dissection tissulaire
    1. Sacrifiez et disséquez les animaux tels que décrits à la section 1.1.
  2. Fixation des tissus
    1. Fixer l'intestin et le cerveau par immersion pendant 3 h dans 4% de PFA à 4 oC.
      1. Préparer pb et 4% PFA comme dans la section 1.2.1.
        REMARQUE : Le moment de la fixation dépend de la taille des tissus. La fixation des tissus pendant plus de 4 à 6 h peut conduire à une surfixation, qui masque les antigènes et limite la liaison anticorps-épitopées.
  3. Incorporation de tissu
    1. Rincer les tissus 3x pendant 5 min chacun, avec 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Pour la cryoprotection, transférer les tissus à 20% de saccharose en PB (0,1 M, pH 7,4) et garder toute la nuit à 4 oC. Ensuite, transférer les tissus à 30% de saccharose en 0,1 M PB (pH 7,4) et garder pour une nuit supplémentaire à 4 oC.
    3. Intégrer les tissus dans un bloc de température de coupe optimale (OCT). Pour ce faire, préparez un petit dewar d'azote liquide, prenez du papier d'aluminium et coupez-le en deux pour créer une casserole. La casserole contenant les tissus remplis du composé OCT doit être trempée dans l'azote liquide jusqu'à ce que le composé OCT soit refroidi. Les tissus congelés peuvent être stockés à -80 oC jusqu'à la section.
  4. Coupe de tissu
    1. Transférer les blocs de tissus congelés dans un cryostat à -20 oC et les couper en sections coronales ou sagittales de 10 m.
    2. Recueillir les tissus dans d'autres sections de série sur des lames de verre adhésif s'approprier l'immunohistochimie et les stocker à -20 oC jusqu'à l'utilisation.
      REMARQUE : Conservez les diapositives entre -20 et 4 oC dans une boîte à diapositives ou un livre de diapositives foncés.
  5. Blocage des sites de liaison non spécifiques et perméabilizzation tissulaire
    1. Délimiter la zone tissulaire sur la glissière à l'égard d'un stylo résistant aux solvants.
    2. Rincer les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M PB (pH 7,4).
    3. Incuber les sections avec 1% de sérum d'âne normal dissous dans le tampon de perméabilisation PB-Triton X-100 0,3% (PB-T) pendant 30 minutes à RT pour perméabilize la membrane cellulaire et bloquer les sites de liaison non spécifiques.
      1. Préparer Triton X-100 0,3% dissolvant 0,3 mL de Triton X-100 en 100 ml de 0,1 M PB (pH 7,4).
      2. Préparer la solution de blocage dissolvant 1% sérum d'âne normal dans PB contenant 0,3% TritonX-100.
        REMARQUE : Les espèces animales du sérum utilisées dans la perméabilisation et les tampons de blocage dépendent de l'hôte de l'anticorps secondaire.
  6. Incubation avec mélange d'anticorps primaires
    1. Rincer les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M PB (pH 7,4).
      1. Incuber les sections pendant la nuit dans une boîte humide à RT avec un mélange d'anticorps primaires dilués dans PB-T. Les mélanges suivants d'anticorps primaires peuvent être utilisés : anticorps de chèvre contre OX-2R dilué 1:100/rabbit anticorps contre CB1R dilué 1:100, ou anticorps de chèvre contre OX-A dilué 1:100/rabbit anticorps contre CB1R dilué 1:100.
  7. Incubation avec mélange d'anticorps secondaires
    1. Rincer les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Incuber les sections pour 2 h à RT avec 1) un mélange d'âne anti-lapin Alexa Fluor 488-conjugué anticorps secondaires et âne anti-chèvre Alexa Fluor 594-conjugué anticorps secondaires dilués 1:100 en PB-T; ou 2) un mélange d'âne anti-chèvre Alexa Fluor 488-conjugué anticorps secondaires et âne anti-lapin Alexa Fluor 594-conjugué anticorps secondaires dilués 1:100 en PB-T.
      REMARQUE : Utilisez des anticorps secondaires développés dans le même hôte animal. Le sérum normal doit appartenir à la même espèce de l'anticorps secondaire (p. ex., utiliser des anticorps secondaires développés dans un âne et un sérum normal d'âne). Diluer les anticorps primaires et secondaires avec un tampon de blocage contenant le détergent pour augmenter la perméabilisation cellulaire et réduire l'arrière-plan.
  8. Montage de tissu
    1. Rincer les sections 3x pendant 5 min chacune, avec 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Counterstain les sections avec d'un colorant nucléaire DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) préparé la dissolution de 1,5 'L de DAPI (1 mg/mL) en 3 ml de PB.
    3. Glissades de couverture avec support de montage (voir Tableau des matériaux). Ce milieu de montage aqueux stabilise l'échantillon de tissu et les taches pour une utilisation à long terme. Les échantillons fluorescents peuvent être stockés dans l'obscurité à 4 oC. Pour prolonger la vie des fluorofores, utilisez un support de montage antialimenté.
      REMARQUE : Choisissez un bon support de montage. L'un des paramètres les plus importants des agents de montage est l'indice de réfraction (nD), qui devrait être d'environ 1,5, l'indice de réfraction du verre. Le support de montage utilisé ici peut être utilisé en particulier avec des échantillons préparés pour les déterminations des enzymes et des lipides (c.-à-d., spécimen qui ne doit pas être déshydraté avec une série ascendante d'alcool).
  9. Contrôles
    1. Répétez les sections 2.1-2.8, en omettant l'anticorps primaire ou secondaire, ou en remplaçant dans l'étape spécifique l'antisera primaire ou secondaire par PB (contrôle négatif).
    2. Répétez les sections 2,1 à 2,8, préabsorbant chaque anticorps primaire avec un excès du peptide relatif (100 mg de peptide/1 mL d'antisérum dilué).
    3. Répétez les sections 2.1-2.8 sur les tranches de cerveau de souris (contrôle positif).
      REMARQUE : Préparez tous les tampons frais, peu de temps avant de commencer. Enlever soigneusement l'excès de liquide à chaque étape avec une pipette ou un papier filtre autour des sections, en gardant toujours la section humide.
  10. Acquisition d'images
    1. Utilisez un microscope confocal équipé d'un stade motorisé x-y-z, d'un appareil photo numérique et d'un logiciel d'acquisition et d'analyse d'images comme NIS-Elements C pour observer et analyser les sections immunostained. Acquérir des images numériques en utilisant les objectifs 5-20-40x.
    2. Prenez les images de chaque section à faible grossissement (objectif 10x ou 20x) dans chacun des canaux disponibles pour composer un montage de grossissement faible, fournissant un aperçu de l'ensemble de la région pour faciliter la localisation et la documentation de OX-2R/CB1R co-expression anatomique. Normalisez les images de fluorescence au maximum de contraste et de superpose avant l'analyse.
    3. Recueillir des piles Z série d'images dans toute la zone d'intérêt. Acquérir les images à travers six plans focaux (Z-step) avec des étapes focales de 1 à 1,8 m pour couvrir le volume tissulaire dans lequel la coexpression OX-2R/CB1R est visualisée comme une ponctua jaune. Pour faire cette collection pour chaque canal (rouge, vert, bleu) séparément, à l'aide d'un microscope motorisé Z.
    4. Utilisez un logiciel de déconvolution d'imagerie pour décongestionner les images par l'application de dix itérations et effondrer les images de plans en série Z en une seule image de projection maximale.
    5. Ajuster les micrographes pour la lumière et le contraste en utilisant Adobe Photoshop 6.01 (Adobe Systems, San Jose, CA).
      REMARQUE : Effectuez l'étape de déconvolution pendant l'observation pour diminuer davantage l'arrière-plan. Limitez l'exposition à la la diapositive à la lumière pour éviter le photoblanchiment.
  11. Analyse d'image
    1. Effectuer une analyse quantitative de la coexpression OX-2R/CB1R sur des sections alternées de 10 m d'épaisseur (n ' 5 animaux par groupe) en couvrant toute la région d'intérêt de chaque animal.
    2. Quantifier la coexpression OX-2R/CB1R en tant que nombre de ponctuas positifs jaunes avec un système semi-automatisé d'analyse d'image. Le logiciel Imagins peut fournir un niveau de détail plus élevé, avec des données quantitatives concernant les régions de chevauchement entre les différentes sondes fluorescentes.
    3. Quantifier la poncte en utilisant des outils de seuil pour l'intensité du signal dans les deux canaux. Ouvrez le fichier d'images .liff, .tiff ou .jpg et sélectionnez Image-Seuil. Sélectionnez Réglage Automatique ou Méthode Manuelle et régulez Le Seuil jusqu'à ce que toutes les ponctuas tachées soient sélectionnées. Analyser la distribution des intensités de pixels dans une zone de l'image qui ne contient pas d'objets immuno-étiquetés pour obtenir le seuil d'arrière-plan. Déterminez ce fond individuellement pour chaque image. Le programme supprime ensuite le seuil d'arrière-plan en définissant la ligne de base des intensités de pixels à la valeur de fond.
    4. Sélectionnez Analyze-Measure et choisissez les paramètres à mesurer (intensité de puncta-minimum, valeurs maximales et moyennes; nombre/densité de la puncte immunoétiquetée).
    5. Comptez la poncte jaune le long du volume du tissu en 4 z-piles pour chaque section, en utilisant les piles immédiatement au-dessus ou en dessous du meilleur plan de mise au point. Exclure les régions floues de l'analyse.
      REMARQUE : Effectuez le comptage des cellules étiquetées sur la section alternative pour éviter le double comptage des mêmes cellules des sections adjacentes.

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Representative Results

Les données représentatives de la coloration immunoperoxidase sont présentées à la figure 1 et à la figure 2. L'analyse immunohistochimique de la distribution d'OX-A et d'OX-2R dans l'intestin du poisson zèbre adulte a montré différents sites de localisation d'OX-A et d'OX-2R et leurs augmentations d'expression dans les cellules intestinales du poisson zèbre dio. Une coloration brune intense pour l'OX-A a été observée dans les cellules de l'intestin médial et antérieur (Figure 1A, A1). L'immunoexpression d'OX-A a donné des signaux clairs dans les différents compartements intestinaux, diminuant de l'antérieur vers l'intestin médial (Figure 1B, B1). Le contrôle négatif a été utilisé comme référence pour l'arrière-plan et pour confirmer la spécificité du signal OX-A (figure 1E). L'exposition prolongée au dAB chromogène a entraîné l'augmentation de l'intensité de fond (Figure 1D). Des résultats similaires ont été observés pour l'immunoexpression OX-2R dans l'intestin de DIO et le poisson zèbre de régime de contrôle (figure 2). Un signal accru d'OX-A chez le poisson zèbre adulte de DIO s'est accompagné de la surexpression de l'OX-2R dans d'autres compartements intestinaux (Figure 2B, B1).

À l'aide de l'immunofluorescence, les données obtenues par l'analyse de l'immunoperoxidase ont été confirmées, sous-jacentes à l'augmentation de l'expression ox-A et OX-2R dans l'intestin du poisson zèbre DIO adulte en ce qui concerne le contrôle (figure 3). En outre, en utilisant la double immunofluorescence, il a été possible d'obtenir des informations sur l'expression du récepteur endocannabinoïde CB1R et sa co-localisation avec OX-A ou OX-2R dans l'intestin et le cerveau de l'alimentation de contrôle et dio poisson zèbre adulte. L'avantage de l'immunofluorescence est qu'elle donne un signal plus détaillé avec moins d'informations fournies sur la morphologie des tissus, par rapport à la technique de l'immunoperoxidase. En utilisant la méthode d'immunofluorescence, nous avons précédemment déterminé les interactions anatomiques entre OX-2R et CB1R dans l'intestin et le cerveau10.

L'analyse précise des images immunofluorescentes a montré l'augmentation de la co-localisation OX-2R/CB1R dans l'intestin du poisson zèbre adulte DIO par rapport au poisson zèbre de régime témoin (Figure 3B, C). Une situation similaire a été observée dans différentes régions du cerveau, telles que le ténècéphale dorsal, l'hypothalamus (zones latérales, ventrales et dorsales), le tectum optique, le torus lateralis et le noyau diffus du lobe inférieur (figure4). Les contrôles négatifs (figure 5A,B) et positifs (cerveau de souris) (figure5C)ont été utilisés comme références pour l'arrière-plan et pour confirmer la spécificité des signaux CB1R et OX-2R.

De plus, en se dotant d'une double immunostaining avec OX-A/CB1R, on a observé dans les neurones orexinergiques de l'hypothalamus qu'il y avait une augmentation de la co-localisation accompagnée d'une augmentation du signal fluorescent OX-A (figure 6). Ces résultats montrent comment la double immunofluorescence peut aider à identifier l'expression physiologiquement conservée des protéines, la co-localisation des protéines cibles, et leur distribution et/ou leurs changements d'expression dans différentes conditions pathologiques.

Figure 1
Figure 1 : Immunolocalisation d'orexin e dans les intestins de DIO contre. contrôle du poisson zèbre adulte de régime. (A) L'immunoréactivité d'OX-A dans les cellules du intestin médial du poisson zèbre témoin de régime. (A1) Ox-A immunoreactivité dans les cellules de l'intestin médial du poisson zèbre DIO. (B) Ox-A immunoreactivité dans les cellules de l'intestin antérieur du poisson zèbre de régime témoin. (B1) Ox-A immunoreactivité dans les cellules de l'intestin antérieur du poisson zèbre DIO. (A1, B1) Une augmentation des cellules positives d'OX-A dans le copartement différent de tissu de l'intestin médial et antérieur du poisson zèbre de DIO. (C) OX-A immunoreactivité dans les cellules de l'intestin antérieur du poisson zèbre DIO. (D) réaction immunoperoxidase pour OX-A après une exposition prolongée au DAB. (E) Contrôle négatif. Barre d'échelle : 50 m (A, A1, B, B1); 100 m (C, D, E). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Immunolocalisation de récepteur d'Orexin 2 dans l'intestin de DIO contre. contrôle zèbre adulte de régime. (A) OX-2R immunoreactivité dans les cellules de l'intestin médial du poisson zèbre de régime témoin. (A1) Ox-2R immunoréactivité dans les cellules de l'intestin médial du poisson zèbre DIO. (B) OX-2R immunoréactivité dans les cellules de l'intestin antérieur du poisson zèbre de régime témoin. (B1) Ox-2R immunoréactivité dans les cellules de l'intestin antérieur du poisson zèbre DIO. (A1, B1) Une augmentation des cellules positives d'OX-2R dans le copartement différent de tissu de l'intestin médial et antérieur du poisson zèbre de DIO. Barre d'échelle : 50 m. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Répartition de l'OX-A (vert)/CB1R (rouge) et de l'OX-2R (rouge)/CB1R (vert) et de leur co-localisation avec OX-2R/CB1R (jaune) dans les intestins de DIO vs. control diet adult zebrafish. (A) CO-expression OX-A/CB1R dans l'intestin du poisson zèbre adulte de régime témoin. (B) OX-2R/CB1R co-expression dans l'intestin du poisson zèbre régime témoin. (C) CO-expression OX-2R/CB1R dans l'intestin du poisson zèbre adulte DIO. Une augmentation de la co-localisation OX-2R/CB1R (points jaunes) dans l'intestin du poisson zèbre DIO. Barre d'échelle : 25 m. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Distribution d'OX-2R (rouge) et de CB1R (vert) et de leur co-localisation avec OX-2R/CB1R (jaune) dans les sections coronales du cerveau de DIO vs contrôle du poisson zèbre adulte. (A) CO-expression OX-2R/CB1R dans le telencephalon du poisson zèbre de régime témoin. (A1) CO-expression d'OX-2R/CB1R dans le telencephalon du poisson zèbre de DIO. (B) CO-expression OX-2R/CB1R dans la zone latérale, ventrale et dorsal de l'hypothalamus, du tectum optique, du torus lateralis, du noyau diffus du lobe inférieur du poisson zèbre (B1) OX-2R/CB1R co-expression dans le latéral, ventral, et zones dorsales de l'hypothalamus, tectum optique, torus lateralis, et noyau diffus du lobe inférieur du poisson zèbre de DIO. (C) Grossissement plus élevé du tectum optique montrant la co-expression de l'OX-2R/CB1R (jaune) dans le poisson zèbre de régime témoin. (C1) Grossissement plus élevé du tectum optique montrant la co-expression de l'OX-2R/CB1R (jaune) dans le poisson zèbre DIO. (D) Un particulier du tectum optique montrant la distribution et la co-expression d'OX-2R/CB1R (jaune) dans le poisson zèbre DIO. DAPI (bleu) a été utilisé pour contrer les noyaux. CP : noyau thalamique postérieur central ; Dd: dorsal; Dc: central; Dl: latéral; Dm: médial; Dp: partie postérieure du ténicéphale dorsal; Hd : zone dorsal de l'hypothalamus périventriculaire ; Hv : zone ventrale de l'hypothalamus périventriculaire ; LH : partie latérale de l'hypothalamus ; PGl: latéral et PGm: noyaux préglomerulaires médial; PGZ : zone grise périventriculaire du tectum optique ; TeO: tectum optique; TL: torus longitudinalis; Vd: partie dorsal du ténaucéphale ventrale. Barre d'échelle : 50 m (A,A1, C, C 1); 250 m (Bet B 1); 25 m (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Expression et spécificité des protéines OX-2R et CB1R dans le cerveau adulte du poisson zèbre et de l'hippocampe de souris. (A) Contrôle négatif de l'OX-2R par préabsorption avec le peptide relatif. (B) Contrôle négatif du CB1R par préabsorption avec le peptide relatif. (C) Contrôle positif de l'OX-2R/CB1R dans l'hippocampe de la souris. PGZ : zone grise périventriculaire du tectum optique ; TeO: tectum optique. Barre d'échelle : 100 m (A, B); 250 m (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Répartition de l'OX-A (vert) et cb1R (rouge) et de leur co-localisation avec OX-A/CB1R (jaune) dans les sections coronales hypothalamiques de DIO vs contrôle du poisson zèbre adulte. (A) CO-expression OX-A/CB1R dans l'hypothalamus du poisson zèbre de régime témoin (A1) grossissement plus élevé montrant la co-expression d'OX-A/CB1R dans l'hypothalamus latéral. Détail de la co-expression OX-A/CB1R montrant une localisation adjacente présumée d'OX-A/CB1R ou de co-localisation et chevauchement d'OX-A/CB1R dans les mêmes cellules. (B) CO-expression OX-A/CB1R dans l'hypothalamus du poisson zèbre DIO (B1) Grossissement plus élevé montrant l'augmentation de la co-expression OX-A/CB1R dans l'hypothalamus latéral. Détail de la co-expression OX-A/CB1R montrant une localisation adjacente présumée d'OX-A/CB1R ou de co-localisation et chevauchement d'OX-A/CB1R dans les mêmes cellules. LH : partie latérale de l'hypothalamus. Barre d'échelle : 50 m (A, B); 25 m (A1, B1). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Préparation de l'échantillon

La préparation d'échantillons est la première étape critique du CSI. Un protocole fiable permet le maintien de la morphologie cellulaire, de l'architecture tissulaire et de l'antigénicité. Cette étape nécessite la collecte correcte de tissu, la fixation, et la section22,23. Le but de la fixation est de préserver les tissus et de réduire l'action des enzymes tissulaires ou des micro-organismes. En particulier, l'étape de fixation préserve les composants cellulaires et les biomolécules, empêche l'autolyse et le déplacement des constituants cellulaires (tels que les antigènes et les enzymes), stabilise les matériaux cellulaires contre les effets aversifs des procédures suivantes, et facilite l'immunostaining4,7,24.

Avant la section, le tissu est préparé et conservé par l'incorporation de paraffine (méthode d'immunoperoxidase) ou cryoconservé (congélation dans le cryomédia, dans les méthodes multiples d'immunofluorescence). La méthode de conservation est associée au type de fixation7. Après fixation et conservation, les tissus sont tranchés par un microtome s'ils sont incorporés dans la paraffine, ou par un cryostat s'ils sont incorporés dans un cryomédia. Les tissus sont généralement tranchés à une plage d'épaisseur de 8 à 10 m et montés sur des toboggans. Pour la coloration immunoperoxidase, l'échantillon peut nécessiter des mesures supplémentaires pour démasquer les épitopes pour la liaison des anticorps, y compris la déparaffinisation et l'antigène retrieveal25,26. Il faut garder à l'esprit que la surfixation peut causer le masquage épitope, tandis que la sous-fixation peut causer peu ou pas de signal positif avec la coloration bord lourd.

Blocage et réduction des arrière-plan

Dans la méthode d'immunoperoxidase, l'affinité élevée de l'avidine pour la biotine est probablement responsable de la production rapide de coloration de fond. En outre, puisque la réaction avidin-biotine est irréversible, le fond ne peut pas être enlevé18,27. Pendant le CiSE, le fond élevé peut également être produit par liaison non spécifique aux biotines endogènes de tissu. Les interactions hydrophobes et ioniques (comme celles produites par le collagène et d'autres tissus conjonctifs tels que l'épithélium et les adipocytes), ainsi que l'activité endogène endogène des enzymes, sont des causes majeures de coloration de fond. La biotine endogène ou les enzymes et la liaison hydrophobe doivent être réduites au minimum avant la coloration d'anticorps, qui peut être réalisée par l'ajout d'un détergent, tel que Triton X-100, dans les tampons de blocage28.

L'utilisation de 0,3%-0.4% Triton X-100 dans les tampons de blocage permet également une perméabilisation complète des anticorps dans les sections de tissu. En outre, bien que les anticorps soient préférentiellement spécifiques pour un épitope, la liaison partielle aux sites sur les protéines non spécifiques est possible, conduisant à la coloration de fond élevé29. Les fixations non spécifiques peuvent masquer le signal de l'antigène cible30. Pour réduire la coloration de fond non spécifique, les échantillons doivent être incubés avec un tampon qui bloque les sites réactifs non spécifiques. Les tampons de blocage courants comprennent l'albumine de sérum bovin normale ou bovine30. L'espèce du sérum de blocage doit être la même que l'hôte de l'anticorps secondaire. Il est recommandé de déterminer le meilleur temps d'incubation. La concentration du sérum normal dans le tampon de blocage est une autre détermination importante31. En outre, pour éliminer la coloration de fond, il est crucial d'utiliser la dilution optimale des anticorps primaires et secondaires. Ainsi, le temps d'incubation doit être choisi avec soin, en plus de la température (c.-à-d., augmenter le temps si performant à 4 oC, diminuer le temps si à RT) et le système de détection.

Choix d'anticorps

La sélection d'anticorps pour la coloration iHC est importante et peut affecter les résultats expérimentaux32. Pour s'assurer que l'anticorps répondra de façon appropriée, l'épitope reconnu par celui-ci doit être pris en considération. Comprendre la protéine cible et sa fonction, la localisation tissulaire et subcellulaire, et si elle subit des modifications post-traductionnelles peut aider à déterminer le choix de l'anticorps. Une autre étape importante est l'essai de différentes concentrations d'anticorps primaires/secondaires pour maintenir l'arrière-plan et la spécificité à un niveau minimum compatible avec un signal spécifique. En outre, il est important de vérifier la réactivité des espèces pour confirmer la compatibilité des anticorps primaires et secondaires et la capacité de l'anticorps primaire à reconnaître la cible antigène dans sa conformation indigène. Une autre étape importante pour le choix des anticorps primaires est l'alignement des gènes. Cela garantit que l'anticorps primaire réagit avec la biomolécule d'intérêt et fournit des informations sur l'épitope qui est reconnu par l'anticorps dans un modèle animal spécifique. L'alignement génique offre également la possibilité de choisir des anticorps capables de reconnaître les épitopes qui sont conservés à l'évolution.

Contrôles

Pour clarifier la spécificité des anticorps, un aspect important est la performance des contrôles, ce qui permet la détection de taches spécifiques. Les contrôles comprennent: i) un tissu connu pour exprimer l'antigène comme un contrôle positif; ii) un tissu connu pour ne pas exprimer l'antigène comme un contrôle négatif; iii) l'omission de l'anticorps primaire ou l'absorption de l'anticorps primaire avec un peptide spécifique pour confirmer que l'anticorps secondaire ne réagit pas avec d'autres composants tissulaires14,33.

Dans les techniques du CSI, plusieurs étapes peuvent causer des problèmes avant d'atteindre la coloration finale. La coloration de fond forte et la coloration d'antigène cible non spécifique peuvent être provoquées par la biotine endogène ou primaire/secondaire d'anticorps contre la réactivité et l'activité pauvre d'enzyme ou la puissance primaire d'anticorps, respectivement. La coloration de fond et la liaison non spécifique peuvent être évitées en bloquant les enzymes endogènes avant l'incubation avec l'anticorps primaire. L'utilisation du sérum normal est la meilleure façon de bloquer les interactions non spécifiques30. Le choix de la mémoire tampon de blocage dépend de la méthode de détection utilisée. En outre, un tissu connu pour ne pas avoir l'expression de l'antigène cible comme contrôle négatif peut agir comme la référence pour déterminer la quantité de taches de fond34. Le dépôt du signal chromogénique ou fluorescent dans le contrôle négatif confirme la présence de taches non spécifiques. En outre, le blocage insuffisant de temps de blocage conduit à un fond élevé, tandis que le blocage excessif conduit à un signal faible35.

Dans la coloration immunoperoxidase, la présence de peroxidase endogène dans le tissu est une autre cause de dépôt brun de fond. Le traitement avec H2O2 avant l'incubation avec l'anticorps primaire bloque la peroxidase endogène36,37. Au contraire, dans l'immunofluorescence, la fixation joue un rôle clé dans la génération de l'autofluorescence. Pour éviter l'autofluorescence, la meilleure méthode de fixation, le temps de fixation et la préparation des tissus doivent être soigneusement choisis. Une autre étape critique de l'IHC est la validation de l'anticorps primaire. Un anticorps est considéré comme valide s'il produit un modèle de coloration cohérent et spécifique dans un tissu particulier ou des composants cellulaires/subcellulaires et si la préabsorption de l'anticorps primaire avec un peptide spécifique ne donne pas de coloration38. Dans l'immunofluorescence, la liaison non spécifique montre l'intensité fluorescente semblable sous trois détecteurs de fluorescence de couleur, alors que le signal est variable puisque différents anticorps secondaires conjugués fluorescents sont employés. Ces aspects de la préparation des tissus du CSI et de la coloration des anticorps doivent être abordés pour surmonter les problèmes de coloration.

IHC, bien qu'une technique relativement simple, présente certaines limitations et dépendent de nombreux facteurs39. L'un des points cruciaux est la fixation de la formaline, qui peut modifier l'expression des protéines modifiées post-traduction. D'autre part, les tissus intégrés à la paraffine fixés par la formaline peuvent être stockés à long terme à température ambiante, tandis que les tissus congelés ne peuvent être conservés que jusqu'à un an à -80 oC. En outre, les tissus congelés peuvent être endommagés par la formation de cristaux de glace, ce qui peut affecter les détails subcellulaires altérant la coloration du CSI40,41. En ce qui concerne nos études, l'aspect le plus difficile a été de trouver des anticorps primaires spécifiques contre les molécules de poisson zèbre. Bien que le poisson zèbre ait été reconnu comme un modèle animal valide avec un degré de structure très conservé, très peu d'anticorps ont été développés qui peuvent reconnaître des protéines spécifiques et d'autres molécules chez le poisson zèbre. Pour surmonter ces limitations, il est important de valider la spécificité des anticorps par l'analyse de l'ouest des ballonnements et l'alignement des gènes.

L'intérêt croissant pour les méthodes IHC a conduit à la mise au point d'immunostaining très spécifiques qui peuvent aider les études d'investigation42. IHC est utilisé de plus en plus fréquemment pour identifier la présence de marqueurs moléculaires spécifiques et leurs changements à travers différentes pathologies. Les deux approches illustrées ici, l'immunoperoxidase et l'immunofluorescence, ont des avantages et des inconvénients respectifs43. Le tissu incorporé à la paraffine, utilisé dans la technique de l'immunoperoxidase, peut permettre une haute résolution des cellules et des tissus et révéler des détails sur la distribution et la quantité de protéines cibles44,45. Cependant, les tissus incorporés à la paraffine ne conviennent pas à l'immunofluorescence, puisque la paraffine peut masquer l'antigénicité et conduire à la fluorescence non spécifique46. D'autre part, la cryosection du tissu PFA-fixe préserve l'antigénicité endogène et mène à une diminution de la fluorescence non spécifique. Même si la qualité technique des cryosections est beaucoup plus faible que celle des tissus incorporés à la paraffine, elles peuvent donner des résultats valides en utilisant la technique du CSI47.

De plus, bien que l'intégration de la paraffine préserve mieux les détails morphologiques, la cryoconservation préserve mieux l'expression des enzymes et des antigènes, ce qui conduit à une immunostaining plus détaillée. La technique d'immunofluorescence permet également la détection contemporaine de deux ou trois biomolécules différentes, révélant les interactions possibles, comme l'illustrent nos travaux précédents pour les systèmes orexinetetés et endocannabinoïdes10. Parmi les techniques utilisées pour détecter la distribution et les niveaux de biomolécules spécifiques, iHC permet non seulement la détermination de l'expression morphologique spécifique et la distribution des molécules et des protéines, mais aussi la possibilité d'effectuer des analyse.

En utilisant l'immunofluorescence, la codistribution et la coexpression des biomolécules peuvent également être mieux comprises, ainsi que les interactions possibles et leurs changements dans les cas de différentes pathologies48. La microscopie confocale, au cours des 20 dernières années, a souvent été utilisée pour étudier la distribution cellulaire et subcellulaire de nombreuses protéines dans le cerveau des mammifères. La microscopie fluorescence permet également la visualisation (à l'aide de fluorophores ou de colorants fluorescents) de structures d'intérêt spécifiques, telles que les protéines, les organites et d'autres matières biologiques; ces signaux peuvent être utilisés dans les systèmes biologiques fixes et vivants pour imager des structures sous-cellulaires spécifiques49. La fonction modulatrice potentielle des biomolécules dans des compartiments cellulaires spécifiques peut être explorée par la visualisation de leurs modèles d'expression, tandis que le rôle de la signalisation protéique dans les tissus peut être découvert par la distribution neuroanatomique de l'expression métabolique des enzymes ou des récepteurs.

Les travaux techniques présentés introduisent des approches IHC, principalement l'immunofluorescence, à l'étude de deux systèmes hautement conservés, l'orexine et l'endocannabinoïde, dans un modèle adulte de poisson zèbre. En particulier, les méthodes d'immunofluorescence peuvent être utilisées pour déterminer la distribution, la quantité relative et les interactions anatomiques de protéines spécifiques dans les tissus cibles. La cryoconservation des tissus fixés par PFA préserve mieux les protéines très sensibles susceptibles de se détériorer rapidement. En outre, la cryoconservation est pensé pour mieux préserver l'antigène et l'antigénicité, et il permet d'étudier les protéines modifiées post-traduction et l'ADN.

Même si les tissus congelés (par rapport aux sections incorporées à la paraffine) sont plus épais, ce qui entrave la capacité d'observer la morphologie tissulaire en détail, la microscopie confocale permet une visualisation de l'échantillon en détail et améliore les capacités d'imagerie. En outre, l'immunofluorescence peut être utilisée pour l'analyse quantitative de l'intensité de coloration, et l'analyse densitométrique du signal fournit des données quantitatives. Cela permet de déterminer les corrélations des niveaux de signal fluorochrom avec les niveaux d'expression des protéines en examinant les zones de co-localisation. Ce travail décrit et illustre les protocoles qui peuvent être utilisés pour étudier la conservation évolutive des protéines importantes chez le poisson zèbre adulte. L'utilisation du CiSE, principalement l'immunofluorescence, chez le poisson zèbre adulte peut aider à mettre en évidence l'utilité de ce modèle animal dans l'étude de l'expression morphologique et la distribution de biomolécules hautement conservées, ainsi que de révéler des altérations possibles à travers différentes conditions pathologiques se corrélées avec la physiopathologie humaine.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par Fondi Ricerca di Ateneo (FRA)2015-2016, Université de Sannio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CB1 Abcam ab23703
Anti OX-2R Santa Cruz sc-8074
Anti-OXA Santa Cruz sc8070
Aquatex Merck 1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goat Vector Lab BA-5000
citric acid Sigma Aldrich 251275
Confocal microscope Nikon Nikon Eclipse Ti2
Cryostat Leica Biosystem CM3050S
DAPI Sigma Aldrich 32670
Digital Camera Leica Biosystem DFC320
Digital Camera for confocal microscope Nikon DS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodies Thermo Fisher A21207
Ethanol absolute VWR 20,821,330
Frozen section compound Leica Biosystem FSC 22 Frozen Section Media
H2O2 Sigma Aldrich 31642
HCl VWR 20,252,290
ImmPACT DAB Vector lab SK4105
Microscope Leica Biosystem DMI6000
Microtome Leica Biosystem RM2125RT
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763
NaCl Sigma Aldrich S7653
NaH2PO4H2O Sigma Aldrich S9638
NaOH Sigma Aldrich S8045
Normal Donkey Serum Sigma Aldrich D9663
Normal Rabbit Serum Vector lab S-5000
paraffin wax Carlo Erba 46793801
Paraphormaldeyde Sigma Aldrich P6148
sodium citrate dihydrate Sigma Aldrich W302600
Triton X-100 Fluka Analytical 93420
Trizma Sigma Aldrich T1503
VectaStain Elite ABC Kit Vector lab PK6100
Xylene Pure Carlo Erba 392603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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