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Chemistry

Realização de espectroscopia em nanopartículas Plasmonicas com microscopia de contraste de interferência diferencial de tipo Nomarski baseado em transmissão

Published: June 5, 2019 doi: 10.3791/59411
Automatic Translation
1
1Department of Chemistry and Biochemistry, Ohio University

Summary

O objetivo deste protocolo é detalhar uma abordagem comprovada para a preparação de amostras de nanopartículas plasmonicas e para a realização de espectroscopia de partícula única neles com microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC).

Abstract

A microscopia do contraste da interferência diferencial (DIC) é uma ferramenta poderosa da imagem latente que seja empregada a mais geralmente para objetos da microescala da imagem latente usando a luz da visível-escala. O objetivo deste protocolo é detalhar um método comprovado para a preparação de amostras de nanopartículas plasmonicas e realizar espectroscopia de partícula única neles com microscopia DIC. Várias etapas importantes devem ser seguidas cuidadosamente, a fim de realizar experimentos de espectroscopia repetível. Primeiro, os pontos de referência podem ser gravados no substrato da amostra, que auxilia na localização da superfície da amostra e no rastreamento da região de interesse durante os experimentos. Em seguida, o substrato deve ser devidamente limpo de detritos e contaminantes que podem de outra forma dificultar ou obscurecer o exame da amostra. Uma vez que uma amostra é preparada corretamente, o trajeto ótico do microscópio deve ser alinhado, usando a iluminação de Kohler. Com um microscópio padrão do estilo de Nomarski DIC, a rotação da amostra pode ser necessária, particular quando as nanopartículas plasmônicas exibem propriedades óticas orientação-dependentes. Porque a microscopia de DIC tem dois campos ortogonais inerentes da polarização, o padrão comprimento de onda-dependente do contraste de DIC revela a orientação de nanopartículas plasmônicas rod-shaped. Finalmente, a aquisição de dados e análises de dados devem ser cuidadosamente executadas. É comum representar dados de espectroscopia com base em DIC como um valor de contraste, mas também é possível apresentá-lo como dados de intensidade. Nesta demonstração de DIC para espectroscopia de partícula única, o foco está em nanopartículas de ouro esféricas e em forma de haste.

Introduction

Desde a década de 1980, a microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) tem sido largamente vista como um importante método de imagem reservado para objetos de microescala dentro das ciências biológicas. No entanto, durante o seu desenvolvimento na década de 1950 e 1960, foi concebido como uma técnica para a ciência dos materiais1. Com os avanços recentes nas ciências materiais relacionadas às nanopartículas plasmônicas, ocorreu um interesse aumentado na caracterização dos materiais com microscopia ótica.

Muitas técnicas ópticas estão certamente disponíveis para a caracterização nanomaterial (por exemplo, campo escuro, brightfield, luz polarizada, fluorescência, etc.). O campo escuro é amplamente popular na pesquisa da nanopartícula, mas confia unicamente na coleção do scatter e fornece a informação limitada sobre amostras complexas2. A fluorescência pode ser útil, mas somente com amostras que luminesce ou que podem corretamente ser manchadas. A microscopia de DIC tem diversos traços que o fazem uma ferramenta valiosa para a análise das nanopartículas. As vantagens mais frequentemente indicadas do DIC em comparação com outros métodos e em relação às nanopartículas plasmonicas são: nenhuma coloração da amostra exigida, nenhuns efeitos do Halo, profundidade de campo rasa, e definição lateral elevada3. DIC tem pontos fortes adicionais que são valiosos para a pesquisa de nanopartículas plasmônicas. Em primeiro lugar, dois campos de polarização inerente e ortogonal estão presentes, podendo ser medidos simultaneamente para fins de espectroscopia2. Em segundo lugar, o sinal depolarizado de nanopartículas não é capturado na imagem final2, que pode ser uma causa para a preocupação séria em medições de espectroscopia de campo escuro.

A finalidade deste artigo é fornecer uma metodologia desobstruída para utilizar a microscopia de Nomarski DIC da luz transmitida para executar a espectroscopia em nanopartículas plasmônicas. Embora DIC é uma técnica poderosa que pode ser aplicada a materiais altamente diversificados, é também uma técnica que requer grande habilidade e compreensão para operá-lo corretamente quando nanopartículas de imagem. A microscopia de Nomarski DIC baseada em transmissão tem um caminho de luz complexo1 que só será brevemente revisto aqui. O trem óptico de DIC é exibido na Figura 1. A luz é transmitida através do microscópio primeiramente sendo passada através de um polarizador e de um prisma de Nomarski da feixe-rachadura antes de ser focalizada pelo condensador no plano da amostra. Depois de passar pelo objetivo, a luz encontra um prisma de Nomarski feixe-combinando e um analisador antes de sair para o detector. Os dois polarizadores e prismas Nomarski são fundamentais para a formação da imagem DIC e são responsáveis pela produção de dois campos de polarização ortogonal do DIC1. Para o leitor interessado em saber mais sobre os princípios de funcionamento e o trajeto ótico de microscópios de Nomarski DIC, ou as diferenças entre Nomarski DIC e outros estilos de DIC, refira por favor outras contas bem escritas nestes tópicos1, 4. º , 5. º , 6 anos de , o 7.

É igualmente importante compreender a natureza básica das nanopartículas plasmonicas antes de tentar realizar espectroscopia neles, seja com Nomarski DIC, campo escuro ou qualquer outra técnica de microscopia. No campo da plasmómica, as nanopartículas são definidas como particulados com dimensões na escala de 10-100 nm8,9. As nanopartículas podem assumir muitas formas (por exemplo, esferas, hastes, estrelas, halteres, etc.), e a maioria de suas propriedades importantes surgem de interações com a luz na faixa infravermelha ultravioleta-visível-próxima do espectro eletromagnético. O termo "plasmonico" não se restringe a nanopartículas10; Entretanto, ao discutir nanopartículas, é usado na referência à ressonância de superfície localizada do Plasmon (LSPR). LSPR é um fenômeno em que os elétrons de condução em uma nanopartícula oscilam devido a uma interação Coulombic com radiação eletromagnética de uma faixa de freqüência altamente específica e relativamente estreita8. Nessas mesmas frequências, as nanopartículas plasmonicas exibem aumento da absorção e dispersão da luz, tornando-as observáveis com microscopia óptica. Em muitos casos, é preferível observar as nanopartículas ao colocar filtros de bandpass antes do condensador2, para melhorar o contraste de imagem e para eliminar a luz que não induz o efeito lspr. Usando filtros também torna possível realizar experimentos de espectroscopia de partícula única.

O comportamento óptico relacionado ao LSPR é altamente dependente do tamanho e da forma das nanopartículas, podendo ser investigado com muitas técnicas de microscopia óptica. No entanto, a fim de decifrar as informações de orientação de nanopartículas plasmonicas com uma forma anisotrópica (i.e., não esférica), é necessário utilizar a polarização do campo de luz. Ao girar cuidadosamente o campo de polarização ou o substrato da amostra em pequenos incrementos, é possível monitorar as propriedades espectroscópicas dependentes da orientação de nanopartículas individuais. A rotação e a polarização podem igualmente ajudar em determinar se uma característica espectral é devido a uma oscilação dipolar ou mais elevada da ordem dos elétrons de superfície da nanopartícula. No entanto, no caso de nanopartículas isotrópicas (i.e., esféricas), o perfil espectral permanece essencialmente inalterado ao girar a amostra luz polarizada.

Quando visualizado através de um microscópio DIC (Figura 2), as nanopartículas têm um disco arejado com uma aparência branca e preta projetada em sombra contra um fundo cinza. As nanopartículas esféricas conservarão esta aparência a rotação e com a mudança de filtros do bandpass; Entretanto, as partículas desvanecem-se gradualmente da vista porque o comprimento de onda central do filtro torna-se mais separado do comprimento de onda dipolar único11da esfera. A aparência de Nanorods pode mudar muito dramaticamente como eles são girados2. Os Nanorods têm duas bandas LSPR com comportamento dipolar, cuja localização é baseada nas dimensões físicas dos Nanorods. Quando o eixo longitudinal de um diamante é orientado paralelamente a um dos campos de polarização DIC, o disco arejado aparecerá todo branco ou preto, se visualizado com um filtro de passe associado a esse comprimento de onda lspr. Depois de girar a amostra 90 °, ele vai assumir a cor oposta. Alternativamente, uma vez que a linha central transversal de um diamante é perpendicular ao eixo longitudinal, a haste tomará na cor oposta ao comutar entre os filtros que combinam os comprimentos de onda de lspr para os dois machados. Em outras orientações e configurações de filtro, os Nanorods parecerá mais como esferas, apresentando uma variedade de padrões de disco arejados de sombra-Cast. Para Nanorods com um eixo transversal < 25 nanômetro, pode ser difícil detectar o sinal nesse comprimento de onda do LSPR usando a microscopia de DIC.

Para realizar a espectroscopia de partícula única, é importante usar os componentes ópticos corretos e alinhá-los corretamente. Um objetivo capaz da microscopia de DIC deve ser usado. Para experimentos de partículas únicas, os objetivos do óleo 80x ou 100x são ideais. Os prismas de Nomarski DIC ordinariamente vêm em três variedades: padrão, alto contraste, e alta resolução. O tipo ideal depende altamente da finalidade do experimento e do tamanho das nanopartículas. Prismas padrão são bons para muitos experimentos; Mas ao trabalhar com nanopartículas menores (< 50 nm), os prismas de alto contraste podem ser benéficos, pois o contraste de partículas diminui à medida que as partículas diminuem no tamanho11. Ajustar o contraste de DIC é conseguido girando um polarizador ou traduzindo um dos prismas de DIC, dependendo da marca do microscópio ou do modelo6.

Depois de definir a iluminação Kohler e as configurações de polarizador, é fundamental não reajustar essas configurações ao coletar dados de espectroscopia. Além disso, um sinal de fundo médio constante deve ser mantido em todos os momentos durante a coleta de dados, mesmo quando se alterna entre filtros e configurações angulares. O valor de fundo ideal real depende da faixa dinâmica da câmera científica, mas em geral, o fundo deve estar no intervalo de 15% – 40% do nível máximo de detecção da câmera. Isso reduz a probabilidade de saturar o sensor da câmera, permitindo o contraste de partículas ideal. Para coletar dados de espectroscopia, é necessário trabalhar com uma câmera científica que capture imagens em preto e branco, em oposição a uma câmera colorida.

A preparação da amostra é outro aspecto crítico das nanopartículas plasmonicas de imagem. É imperativo que os operadores da microscopia DIC tenham uma compreensão das propriedades ópticas da amostra e do substrato da amostra. O vidro do microscópio "pre-limpado" não é preparado suficientemente para nanopartículas da imagem latente, e deve corretamente ser re-limpada antes da deposição da amostra para assegurar a observação desobstruída da amostra. Muitos protocolos da limpeza para corrediças do microscópio foram documentados previamente12, mas não é uma etapa que seja relatada normalmente em estudos experimentais.

Finalmente, os métodos de análise de dados são o componente final para a espectroscopia de partícula única. As intensidades máximas e mínimas para cada nanopartícula devem ser medidas, bem como a média de fundo local. As partículas de interesse devem estar localizadas em áreas sem detritos de fundo, defeitos de substrato ou iluminação irregular. Um método para determinar o perfil espectral de uma nanopartícula é calcular o contraste de partículas em cada comprimento de onda, utilizando a equação abaixo de11,13,14,15:

Equation

Alternativamente, o espectro de uma única partícula pode ser dividido em seus componentes máximos e mínimos individuais do sinal, que representam os dois campos da polarização de DIC, assim exibindo os dois espectros direccionalmente-dependentes simultaneamente-recolhidos, através das duas equações:

Equation

Equation

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Protocol

1. preparação da amostra com lâminas de microscopia de vidro padrão

  1. Prepare lâminas de microscópio de vidro para deposição de amostras.
    Nota: em algumas circunstâncias, pode ser mais apropriado para armazenar o vidro em água ultrapura em vez de etanol. No entanto, armazenar em água ou ar faz com que o vidro hidrofóbico ao longo do tempo.
    1. Para melhores resultados, compre o vidro ou o microscópio de quartzo desliza e cubra o vidro.
    2. Usando uma pena de scribing, coloc uma marca rasa e curta do risco no centro de cada deslizamento de tampa de vidro.
    3. Limpe todo o vidro do microscópio, mesmo se é comprado "pre-limpado", para remover fragmentos de vidro, poeira, pó, resíduo orgânico, e todos os outros contaminadores que afetam a qualidade de imagem latente ou a deposição da amostra.
      Nota: Este método de limpeza abaixo funciona bem para os tipos de amostras descritas aqui e evita o uso de produtos químicos agressivos. Os produtos químicos mais duros podem gravar o vidro e exigir mais cuidado na manipulação e na eliminação.
      1. Coloc o vidro do microscópio em cremalheiras do armazenamento e então em um Beaker, ou em um frasco de coloração. Não coloc o vidro do microscópio na parte inferior dos copos e dos outros produtos vidreiros do laboratório sem racking, porque cada parte e superfície do vidro do microscópio devem inteiramente ser expor aos agentes de limpeza.
      2. Despeje ~ 1 mL de detergente líquido (tabela de materiais) no recipiente e em cima do recipiente com água. SONICATE por 30 min.
        Nota: uma vez que o processo de limpeza começa, apenas Manuseie o vidro enquanto estiver usando luvas, para evitar deixar resíduos de impressões digitais no vidro.
      3. Despeje o conteúdo líquido do recipiente de limpeza em uma pia. Enxague o recipiente várias vezes com água ultrapura para remover toda a aparência de detergente. Encha o recipiente com água ultrapura. SONICATE o recipiente com vidro microscópio por mais 30 min.
      4. Repita a etapa anterior pelo menos uma vez mais. Realize rodadas adicionais de sonicação em água até que seja óbvio que todos os vestígios do detergente foram removidos.
      5. Despeje o conteúdo do recipiente de limpeza. Enxague o recipiente com água ultrapura. Encha o recipiente com etanol. SONICATE microscópio de vidro para 30 min.
      6. Despeje o conteúdo do recipiente de limpeza em um recipiente de resíduos. Reabasteça com etanol. Cubra o recipiente para evitar a perda de etanol através da evaporação. Armazene o vidro do microscópio neste recipiente até o tempo do experimento. As lâminas permanecem limpas e utilizáveis, desde que permaneçam submersas em etanol dentro de um recipiente coberto.
  2. Preparação de solução de nanopartículas
    1. Utilizando uma micropipeta, retire uma alíquota de 100 μL de 0, 5 mg/mL de solução de nanopartículas de ouro do seu contentor de armazenamento original e ejecte a solução para um tubo de centrifugação de 1,5 mL.
    2. Centrifugue a amostra por 10 min a 6.000 x g.
    3. Retire o sobrenadante com uma micropipeta, a fim de remover o excesso de surfactante.
    4. Utilizando uma micropipeta, coloque 100 μL de água ultrapura no tubo de centrifugação.
      Nota: se nem todo o sobrenadante pode ser retirado na primeira tentativa, repita as etapas de centrifugação e resuspensão.
    5. Momentaneamente Vortex a amostra para ressusciter o pellet. SONICATE imediatamente depois de 20 min para totalmente ressuscite e quebrar agregados de nanopartículas.
      Nota: se a amostra não é usada imediatamente, deve ser sonicated outra vez para 20 minutos antes de depositar a solução no vidro do microscópio.
  3. Deposição de amostras
    1. Remova os deslizamentos limpos da tampa e as corrediças do microscópio de seus recipientes de armazenamento. Seque o vidro com nitrogênio pressurizado ou Argon.
    2. Usando uma micropipeta, drop-Cast 6 μL de solução de nanopartículas a partir do passo 1.2.5 para o deslizamento de cobertura. Para espalhar para fora a gota uniformente, coloc com cuidado um segundo, parte maior do vidro do microscópio sobre a corrediça da tampa, tal como um segundo deslizamento da tampa ou um slide do microscópio. Evite obter bolhas de ar presas entre as duas peças de vidro.
      1. Gire a carcaça da amostra sobre, e sele fora das bordas do deslizamento da tampa com uma linha estreita de lustrador de prego a fim impedir a evaporação da solução média.
      2. Alternativamente, para a imagem da amostra "seco", permitir que a solução para ficar por 5-15 min na tampa do deslizamento, antes de remover a peça indesejada de vidro. Soprar suavemente o deslizamento da tampa seco com nitrogênio pressurizado ou Argon.
    3. Se possível, amostras de imagem imediatamente após a preparação. Se isso não for possível, armazene amostras em um recipiente coberto, como uma placa de Petri até a imagem.

2. imagem latente de DIC

  1. Alinhe o objetivo e o condensador.
    1. Depois de colocar a amostra sobre o microscópio, encontrar o plano focal com a amostra sobre ele. Primeiro Localize e concentre-se na marca de rascunho criada anteriormente. Em seguida, afinar o foco até que as nanopartículas entram em exibição.
    2. Para determinar a colocação exata do condensador, utilize o método da iluminação de Kohler. 5 a iluminação de Kohler na ampliação elevada (80x, 100x) é conseguida mais facilmente ajustando primeiramente a iluminação de Kohler em uma ampliação mais baixa, tal como 20x.
      Nota: normalmente, a iluminação de Kohler não precisa de ser reajustada durante a imagem latente de uma única amostra. Entretanto, é boa prática verificar que a iluminação de Kohler está ajustada corretamente ao comutar a uma corrediça nova do microscópio.
  2. Otimize as configurações de contraste.
    1. Selecione uma região de interesse dentro da amostra para geração de imagens. Centralize a região no campo de visão da câmera e ajuste o foco conforme necessário.
      1. Se o microscópio tem o projeto de Senarmont, comece com o polarizador ajustado perto à extinção máxima do fundo e gire gradualmente o polarizador para diminuir a extinção do fundo. A intensidade do fundo aumentará gradualmente.
      2. Se o microscópio não tem um projeto de Senarmont, comece com o trem ótico ajustado na extinção máxima do fundo. Neste caso, ajuste gradualmente a posição de prisma objetiva para diminuir a extinção do fundo.
        Nota: a definição ideal é alcançada quando as nanopartículas atingem a sua maior diferença de intensidade (i.e., contraste) a partir do valor de fundo local em média. Para nanopartículas plasmônicas, o contraste óptimo é conseguido normalmente com um fundo relativamente escuro, assim em ajustes perto da extinção máxima do fundo.
  3. Imagem da amostra.
    1. Desligue a iluminação da sala para evitar que a iluminação disperda interaja com o processo.
    2. Ao visualizar as nanopartículas com uma câmera de imagem científica, determine o nível de plano de fundo ideal. Usando uma largura cheia de 10 nanômetro no filtro de faixa máximo da metade (FWHM) com seu comprimento de onda central colocalizado com o comprimento de onda principal de LSPR, vista a região do interesse. Ajuste a intensidade da lâmpada ou o tempo de exposição até que o nível de fundo esteja no intervalo de 15% – 40% do nível de capacidade máxima da câmera e nenhum objeto dentro da região de interesse exiba intensidades de sinal que excedam 90% do nível de intensidade máxima da câmera.
      Observação: o objetivo da etapa 2.3.2 é evitar saturar o sensor ao alternar entre os filtros. O nível de fundo ideal variará entre amostras e câmeras. Uma vez que esta etapa é terminada, o tempo da exposição pode ser ajustado mas não a intensidade da lâmpada.
    3. Imagem da amostra com uma série de filtros bandpass que cada um tem um FWHM de 10 nm e que, como um todo, permitir a imagem em toda a gama de comprimento de onda de interesse. Assegure-se de que a intensidade do fundo permaneça consistente da imagem à imagem (dentro de ~ 5% de uma outra) ajustando o tempo da exposição. Depois de alternar os filtros, refoque a amostra antes da captura de imagem.
    4. Salve as imagens como arquivos TIFF descompactados e/ou no formato de arquivo nativo do software, a fim de preservar todas as informações.
  4. Gire a amostra.
    1. Depois de coletar imagens da amostra em sua posição original, a amostra agora pode ser girada e imaged em orientações adicionais no caminho de luz. Realize a rotação em intervalos regulares (por exemplo, 10 ° ou 15 °) através de um intervalo de 180 ° ou de 360 °.
      Nota: a rotação requer um estágio de amostra rotativo.
    2. Como nas secções 2.1-2.3, ajuste as definições da câmara para fornecer um nível de fundo consistente da imagem à imagem.
      Nota: nenhum ajuste à iluminação de Kohler deve ser feito.

3. análise de dados utilizando o ImageJ

Observação: os cálculos a seguir podem ser executados em uma variedade de pacotes de software e, às vezes, no programa nativo usado para coletar as imagens. ImageJ é um software livre disponível dos institutos nacionais de saúde (NIH).

  1. Calcule o contraste ou a intensidade da partícula.
    1. Abra a imagem com o ImageJ.
    2. Selecione a ferramenta retângulo e desenhe um retângulo em torno da região principal de interesse.
    3. Na barra de ferramentas, selecione imagem, em seguida, zoom, em seguida, para seleção. A janela de imagem irá ampliar a área selecionada.
    4. Na barra de ferramentas, selecione imagem, em seguida, ajustar, em seguida, brilho/contraste. Aparece uma nova janela. Para permitir uma melhor visualização da região de amostra, ajuste as quatro configurações: mínimo, máximo, brilho e contraste. Esses ajustes não alteram os dados científicos, eles simplesmente permitem uma melhor visibilidade da região da amostra.
      Nota: as etapas 3.1.3 e 3.1.4 podem ser executadas várias vezes e em ordem inversa.
    5. Usando a ferramenta retângulo novamente, desenhe uma caixa em torno da primeira nanopartícula a ser medido. A caixa deve ser apenas ligeiramente maior do que o disco arejado da nanopartícula.
    6. Na barra de ferramentas, selecione analisare, em seguida, medir. Aparece uma nova janela que relata as intensidades mínima, máxima e média para os pixels localizados dentro da caixa selecionada.
    7. Arraste a caixa usada para medir a nanopartícula para uma área imediatamente adjacente à partícula, onde o contraste de fundo é relativamente mesmo e não há partículas ou contaminantes presentes. Mantenha o tamanho original da caixa.
    8. Use a ferramenta medida para determinar a intensidade média para a área de plano de fundo.
    9. Meça as partículas restantes e uma área de fundo adjacente para cada um.
    10. Repita o processo para cada partícula em todas as imagens da série.
    11. Exporte os dados para uma planilha para calcular o contraste ou a intensidade de cada partícula, em todos os comprimentos de onda e ângulos.
    12. Calcule o contraste de cada partícula, usando a seguinte equação13,14,15:
      Equation
      Observação: usando essa equação, o contraste de partículas deve ser sempre > 0.
    13. Calcule o valor máximo ajustado do fundo da partícula dividindo a intensidade de partícula máxima medida pela média do plano de fundo:
      Equation
    14. Da mesma forma, calcule o valor mínimo ajustado pelo fundo dividindo a intensidade de partícula mínima medida pela média de fundo:
      Equation
      Observação: conforme calculado, o máximo deve ter um valor maior que um, enquanto o mínimo será menor que um. É aceitável para subtrair cada valor por "1", para que o plano de fundo médio é essencialmente zero, o máximo é representado como um valor positivo e o valor mínimo é atribuído um valor negativo16. Esta última abordagem permite ao analista considerar separadamente o que está ocorrendo ao longo de cada um dos campos de polarização, o que é útil ao estudar partículas anisotrópicas.
    15. Para traçar graficamente o perfil espectral em uma determinada posição de nanopartícula, plotar dados com o comprimento de onda ao longo do eixo x e o contraste ou intensidade ao longo do eixo y.
    16. Para representar graficamente o perfil rotacional em um determinado comprimento de onda, plotar o ângulo de rotação ao longo do eixo x e o contraste ou intensidade ao longo do eixo y.

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Representative Results

Ao trabalhar com amostras que são grandes o suficiente para ser visto a olho nu, colocando pontos de referência sobre o substrato de vidro não é normalmente necessário. No entanto, ao trabalhar com nanomateriais ou quando a rotação da amostra é necessária, os pontos de referência podem fornecer um método fácil para localizar, distinguir e rastrear a orientação da amostra. Apesar de técnicas mais sofisticadas podem ser utilizadas para deixar Marcos em substratos de vidro17, arranhando o vidro com uma caneta scribing é um método econômico e simples que funciona em muitas situações. É importante evitar examinar as regiões de amostra que são imediatamente adjacentes a esses pontos de referência, uma vez que as marcas de risco criam um plano de fundo complexo com o potencial de impactar dados (Figura 3). No entanto, nas pontas das marcas de arranhões, "teias de aranha" muitas vezes se estendem para fora do zero. Essas linhas são bastante valiosas como Marcos, mas, novamente, as nanopartículas devem ser evitadas se elas se sobrepõem com esses defeitos.

A fim conseguir a imagem latente óptima com microscopia de DIC, é da importância vital determinar o plano focal apropriado. Objetos que estão ligeiramente fora de foco aparecerá Fuzzy, têm bordas borradas, e têm diminuído contraste. A Figura 4 exibe nanopartículas de ouro que estão fora de foco em graus variados. Nanopartículas no canto inferior direito estão em foco, enquanto nanopartículas tornam-se mais longe de foco como eles se aproximam do canto superior esquerdo desta imagem. Porque DIC tem uma profundidade de campo rasa, não é incomum para algumas nanopartículas estar em foco, enquanto outros estão fora de foco quando a imagem deles em um substrato de vidro. Como resultado, é fundamental concentrar-se consistentemente nas mesmas partículas exatas ao fazer ajustes no microscópio durante um experimento.

A Figura 5 fornece um exemplo do efeito de ajustar as configurações do polarizador enquanto as nanoesferas de ouro de imagem. Cinco nanopartículas estão em foco, enquanto um está ligeiramente fora de foco. Um filtro de bandpass 540 nm com 10 Nm FWHM também estava no caminho óptico. Nesta série de imagens, o brilho de fundo foi ajustado com ImageJ após a aquisição da imagem, a fim de tornar as cinco partículas mais aparente contra o fundo. Quando o polarizador é ajustado em 0 ° em um de senarmont projetou o microscópio de Nomarski DIC, é ortogonal ao analisador (Figura 5a). Em 0 °, as partículas aparecem principalmente branco, com uma listra escura que corre através de seu mid-section. Isso é indicativo de polarização cruzada para amostras de nanoesfera. Quando o polarizador é girado para ângulos diferentes (Figura 5b-E), as partículas parecem estar lançando sombras escuras em direção ao sudoeste. Os componentes em preto e branco para o sinal surgem como resultado dos dois campos de polarização da DIC e fornecem informações sobre a orientação das nanopartículas plasmonicas ao trabalhar com filtros de passa-bandas. Como o polarizador é girado para ângulos mais altos, o padrão de sombra permanece semelhante. No entanto, os valores de contraste de partícula mudam dramaticamente. Isso é melhor demonstrado medindo os valores de contraste para as partículas individuais, usando a equação fornecida acima. A partícula destacada com a caixa preta tem valores de contraste de 0,65 (polarizadores cruzados), 0,84 (deslocamento do polarizador de 5 °), 1,10 (10 °), 0,44 (20 °) e 0,23 (45 °). Conseqüentemente, para esta amostra, a definição óptima da imagem latente é com um deslocamento do polarizador de 10 °. Nanopartículas plasmonicas muitas vezes exigem um ajuste polarizador na faixa de 5 ° – 15 °, e incrementos menores do que estes devem normalmente ser usados para identificar o ajuste ideal. Para mais informações sobre a imagem e análise de nanopartículas de ouro esférico, os leitores são encaminhados para o trabalho prévio de Sun et al.11.

As nanopartículas em forma de anisotrópico produzem padrões de maior complexidade do que as nanoesferas. Os Nanorods do ouro foram imaged (Figura 6) em seu comprimento de onda longitudinal de lspr, 650 nanômetro. Na imagem inicial (Figura 6a), cinco Nanorods brilhantes e várias partículas de dimmer são aparentes. Em vez de ter uma aparência sombra-elenco, três das hastes têm predominantemente preto discos arejados, enquanto dois são principalmente branco. O polarizador foi fixado em 10 ° à esquerda do ajuste de polarização cruzada. Na Figura 6B, utilizou-se a polarização cruzada; apenas três das partículas aparecem, como discos arejados totalmente brancos. Os outros desapareceram ou parecem estar um pouco fora de foco. Com o polarizador fixado a 10 ° à direita da polarização cruzada (Figura 6C), os padrões são agora revertidos do que foi observado na Figura 6a. O polarizador foi girado em seguida para a direita 45 ° da polarização cruzada (Figura 6D), o ajuste máximo, para demonstrar que as partículas mantêm suas cores neste ajuste, mas o contraste declinou significativamente. Nos painéis restantes da figura, a coleção dos Nanorods foi girada incrementalmente um 90 ° no sentido horário completo quando o polarizador foi ajustado em 10 ° à direita da polarização cruzada. O padrão muda gradualmente para cada nanorod, e depois de uma rotação completa de 90 °, as partículas inverteram suas cores a partir da configuração inicial. Em resumo, se um dos eixos de um diamante plasmônicas é alinhado acima com um dos dois campos da polarização, e se o diamante é imaged naquele eixo ' comprimento de onda de lspr, o diamante parecerá ser na maior parte branco ou na maior parte preto, dependendo de que campo da polarização é estão d com (Figura 6a, C)2. Se a nanopartícula é girado um 90 ° completo (Figura 6h), ele agora será alinhado com o campo de polarização oposta e assumir a cor oposta. Se em vez disso, a nanopartícula foi girada apenas 45 ° (Figura 6F), em seguida, ele estará em uma posição onde a partícula irá apresentar sua maior aparência de sombra-elenco, mostrando notável semelhança com o que é observado com as nanoesferas plasmônicas. Em conseqüência deste comportamento ótico, as nanopartículas plasmônicas com uma forma anisotrópica olham frequentemente lisas em vez de ter a aparência sombra-moldada tridimensional das nanoesferas. O resultado desta diferença no comportamento ótico é que pode ser explorado a fim distinguir entre nanopartículas plasmônicas que são esféricas e anisotrópica na forma, como tem sido discutido previamente em estudos de pesquisa múltiplos2, 3,6,7,11,13,16.

Finalmente, a Figura 7 apresenta dados representativos de espectroscopia de partícula única, como contraste de uma nanoesfera de ouro (Figura 7a)11, intensidade de um único diamante de ouro com seu eixo longitudinal orientado paralelamente a uma das polarizações campos (Figura 7B)6, e perfil de intensidade de um único diamante de ouro em seu comprimento de onda do lspr e durante a rotação do estágio (Figura 7C)6. Qualquer método de apresentação revela a largura e a localização do efeito LSPR. Para nanopartículas plasmonicas com forma anisotrópica, os dados de intensidade e rotação revelam a direcionalidade do efeito e, consequentemente, a orientação da partícula sobre o substrato da amostra, que tem sido previamente comprovada através de estudos correlativos em tais partículas usando DIC e microscopia eletrônica de transmissão2,16,18.

Figure 1
Figura 1: o trajeto luminoso na microscopia de DIC de Nomarski-baseada luz transmitida. Depois de deixar a fonte de luz (S), a luz passa através de um polarizador (P), um prisma de corte de feixe Nomarski (NP), o condensador (C), o plano focal (FP), o objetivo (o), um feixe-combinando prisma Nomarski (NP), o analisador (a), e, finalmente, o detector Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: exemplos de nanopartículas plasmonicas imaged em seus comprimentos de onda LSPR com filtros de bandpass de 10 nm, utilizando um microscópio DIC. Ambas as imagens são coletadas em 100x. (A) nanoesferas de prata com 40 nm de diâmetro imaged a 480 nm com um filtro de bandpass com 10 Nm FWHM. (B) as nanopartículas de ouro de Rod-like imaged em 700 nanômetro usando um filtro do bandpass com 10 nanômetro FWHM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: imagem de um arranhão feito em um deslizamento da tampa de vidro com uma pena scribing. Perto do final do recuo real, uma série de linhas estreitas e superficiais "teia de aranha" ramificam-se do próprio arranhão, resultando em um padrão que pode ser utilizado como um marco de imagem. Esta imagem foi coletada usando a ampliação 100x e a luz branca de banda larga. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: nanoesferas de ouro imaged com luz branca de banda larga a 100x. As partículas na parte inferior direita estão em foco, mas as partículas se afastam mais do plano focal para o canto superior esquerdo. O objeto no meio da imagem é restos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: nanoesferas de ouro imaged uma série de diferentes configurações de polarizador em um comprimento de onda de 540 nm e uma ampliação de 100x. O brilho do fundo foi ajustado pós-imagem com ImageJ para tornar as partículas mais aparentes. Ajuste do polarizador de(a) 0 ° (polarizador ortogonal ao analisador), (B) 5 °, (C) 10 ° (o melhor contraste desta série de imagens), (D) 20 °, e (e) 45 °. O contraste medido da partícula nacaixa preta é (A) 0,65, (B) 0,84, (C) 1,10, (D) 0,44, e (e) 0,23. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: exemplo de nanopartículas plasmônicas anisotrópica da imagem latente: Nanorods do ouro em seu comprimento de onda longitudinal de lspr de 650 nanômetro e uma ampliação de 100x. As partículas do interesse principal são incluidas na caixa amarela. As configurações de polarizador são: (A) esquerda 10 °, (B) 0 °, (C) direita 10 °, (D) direita 45 °. Com o polarizador ajustado à direita 10 °, o estágio foi girado no sentido horário por (E) 20 °, (F) 45 °, (G) 70 °, e (H) 90 °. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: resultados representativos de dados de espectroscopia de partícula única. (A) espectroscopia de nanoesfera de ouro exibida em termos de contraste DIC. Cada ponto de dados representa uma média de 20 nanoesferas para cada diâmetro de partícula, e a captura de dados dependia de filtros bandpass FWHM de 10Nm. (B) um único diamante do ouro indicado como dados da intensidade de DIC, usando duas configurações diferentes do polarizador (2 ° em um ou outro lado da polarização cruzada). (C) dados de intensidade de DIC para um único diamante do ouro no comprimento de onda de lspr de 680 nanômetro, quando foi girado 180 ° e o polarizador foi prendido em 2 ° fora da posição cruzada da polarização. A figura 7A é adaptada com a permissão de Sun et al., química analítica. 81 (22), 9203-9208 (2009), e figura 7B, C de Stender et al., química analítica. 84 (12), 5210-5215 (2012). Copyright sociedade química americana. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Quando a imagem latente com microscopia de DIC, é crítico aperfeiçoar os componentes óticos antes de coletar dados. Mesmo pequenos ajustes para o polarizador no meio de um experimento podem resultar em impactos significativos para os dados finais6. Além disso, os materiais diferentes exigem ajustes diferentes do polarizador. Embora os tamanhos grandes da etapa fossem utilizados aqui para demonstrar o efeito do ângulo da polarização, em um experimento real, é imperativo aperfeiçoar o ajuste do polarizador dentro de 1 °-2 ° do ajuste óptimo do contraste. O ajuste do polarizador deve igualmente ser gravado para a referência futura. Também é recomendável trabalhar sempre no mesmo lado do polarizador cruzado (0 °) ponto. Comutar para a frente e para trás não fornece nenhumas vantagens, mas pode conduzir à confusão, devido a uma reversão no teste padrão da sombra.

Em seguida, em importância, é fundamental monitorar a intensidade do plano de fundo ao planejar a realização de espectroscopia. Isso é melhor conseguido ajustando o tempo de exposição da câmera, ou adicionando filtros de densidade neutra para o caminho de luz. O ajuste de aberturas ou intensidades da lâmpada pode impactar a iluminação Kohler e alterar os valores de contraste. O plano de fundo precisa ser relativamente mesmo em toda a amostra, para que a seleção de uma região de plano de fundo não altere o cálculo de contraste. Os espécimes da amostra que não são adjacentes a um espaço de fundo limpo devem ser evitados. Além disso, a intensidade de fundo não pode ser inicialmente definida muito alta ou muito baixa. Se a intensidade do plano de fundo estiver muito alta, há um risco aumentado de que alguns sinais excederão o alcance máximo da câmera, o que torna impossível calcular o contraste nessas regiões. Se a intensidade do fundo for ajustada demasiado baixa, será extremamente difícil conseguir o bom contraste entre o componente escuro do sinal de DIC e o sinal do fundo. Compreender o comportamento típico ou esperado de uma amostra pode ajudar na seleção da intensidade de fundo adequada.

Encontrar o plano focal adequado também é essencial. Uma das vantagens de Nomarski DIC é que ele tem uma profundidade de campo rasa. No entanto, isso torna mais desafiador para se concentrar em amostras finas, como nanopartículas. Com amostras mais grossas, o desafio é encontrar o plano focal real de maior interesse. Muitos aviões focais podem ser interessantes e têm nanopartículas neles, por isso é importante determinar precocemente as nanopartículas de maior interesse.

No caso de nanopartículas, é importante para o microscopista reconhecer que eles estão vendo um disco arejado ou "função spread ponto" do objeto2. Geralmente, o disco arejado é útil em determinar se uma nanopartícula plasmônicas tem uma forma que seja isotrópico ou anisotropic, mas a imagem latente da nanopartícula é de facto muito mais complexa do que o que é discutido aqui. Agregados de nanopartículas complexas podem às vezes assemelhar-se a partículas isotrópicas, e, como resultado, métodos de microscopia eletrônica são então necessários para caracterizar os padrões de nanopartícula2,16,18, 19. para a imagem de nanopartículas plasmonicas com um microscópio DIC, é crucial o uso de imagens filtradas e a imagem das partículas em um de seus comprimentos de onda plasmonicos altamente absorventes6. A imagem latente em um comprimento de onda impróprio ou sem filtros pode conduzir à captação de testes padrões da sombra-molde que são difíceis de decifrar.

Quando as nanopartículas de imagem ao lado de objetos que são maiores do que o limite de difração de luz, é importante lembrar que o objetivo do microscópio "vê" um plano focal relativamente plano. Um equívoco comum de DIC é que permite A visualização de um objeto no relevo 3D real. Isso é causado pela padronização do elenco de sombras, o que realmente faz com que muitos objetos pareçam ser tridimensionais. No entanto, para coletar informações verticais sobre vários planos focais, seria necessário elevar ou abaixar o estágio e coletar uma sequência de imagens. Isso pode ser muito difícil de executar e interpretar, especialmente para amostras mais grossas, como células. Assim, o microscopista precisa de uma compreensão profunda de todos os materiais envolvidos ao realizar tais experimentos e deve registrar as posições dos planos focais individuais que foram utilizados.

Finalmente, a etapa de análise de dados é tão crítica quanto a coleta de dados. Ao medir os valores de contraste ou intensidade da amostra, vários fatores devem ser mantidos em mente. Normalmente, o analista está interessado principalmente nos valores mínimos e máximos para a partícula de interesse. Quando a relação contraste/ruído para a amostra for suficientemente alta, e se a área de fundo estiver limpa e uniformemente iluminada, uma forma geométrica simples pode ser desenhada em torno da região da amostra sem a preocupação de que o sinal seja introduzido por contaminantes. Além disso, se o fundo é limpo e uniformemente iluminado, uma medição de fundo pode ser feita em qualquer área imediatamente adjacente à amostra. No entanto, se houver contaminantes ou se o plano de fundo é desigual, o analista deve fazer uma revisão crítica dos arredores da amostra, e o analista precisa avaliar se é mesmo possível fazer uma medição de fundo razoável. Também é fundamental medir as áreas de amostra e de fundo com a mesma ferramenta de tamanho e forma, a fim de evitar a introdução de viés no cálculo. Em geral, as áreas de medida de menor porte têm uma menor probabilidade de detectar outliers (por exemplo, contaminantes, pixels ruins, etc.), mas áreas de amostragem maiores geralmente fornecem uma medida mais confiável do valor médio do fundo.

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Disclosures

O autor não tem nada a revelar.

Acknowledgments

Dr. Anthony S. Stender deseja reconhecer o apoio técnico através do nanoscale e Quantum fenômenos Institute (NQPI) na Universidade de Ohio. Este artigo foi tornado possível com o financiamento do start-up fornecido ao Dr. Stender pela Universidade de Ohio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Contrad 70 Decon Labs, Inc. 1002 For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers
Ethanol Fisher Scientific A962-4 For cleaning and storing microscope glass
Glass microscope cover slips Ted Pella 260148
Glass microscope slides Ted Pella 26007
Gold nanorods Nanopartz DIAM-SPR-25-650
Gold nanospheres (80 nm) Sigma Aldrich 742023-25ML
ImageJ NIH N/A Free Software availabe for data analysis from NIJ
Nail polish Electron Microscopy Sciences 72180
Nikon Ti-E microscope Nikon N/A
Nitrogen gas Airgas N/A
ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera Hamamatsu 77054098
Scribing pen Amazon N/A Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version.
Ultrapure water 18 megaohm

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References

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Química edição 148 ressonância Plasmon de superfície localizada espectroscopia de partícula única polarização DIC comprimento de onda nanoescala Nomarski
Realização de espectroscopia em nanopartículas Plasmonicas com microscopia de contraste de interferência diferencial de tipo Nomarski baseado em transmissão
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