Förbättrad rabies övervakning med hjälp av en direkt snabb immunohistokemisk test

Summary

Den direkta Rapid immunohistokchemical test (DRIT) erbjuder en världsorganisation för djurhälsa och Världshälsoorganisationen (OIE/WHO) erkänt alternativ till den direkta fluorescerande antikropp (DFA) test för rabies diagnos. Detta test gör det möjligt för fältbaserade program som kan utföras i cirka 1 h på hjärnan intryck med hjälp av ljus mikroskopi.

Abstract

Laboratoriebaserad övervakning är integrerad för att förebygga, kontrollera och förvalta rabies. Medan DFA är guldmynt standard för rabies diagnos, det finns ett behov av att validera ytterligare diagnostiska metoder för att förbättra rabies övervakning, särskilt i utvecklingsländer. Här presenterar vi ett standardprotokoll för DRIT som ett alternativt, laboratorium eller fältbaserat testalternativ som använder ljusmikroskopi jämfört med DFA. Tryck intryck av hjärnvävnad som samlats in från misstänkta djur är fast i 10% buffrad formalin. Den DRIT använder rabies virusspecifika monoklonala eller polyklonala antikroppar (konjugerat till biotin), en streptavidin-peroxidas enzym, och en kromogen reporter (såsom acetyl 3-amino-9-etylkarbazol) att upptäcka viral inneslutningar inom infekterade vävnad. I cirka 1 h, ett hjärnvävnad prov kan testas och tolkas av DRIT. Utvärdering av misstänkta djur hjärnor testas från en mängd olika arter i Nordamerika, Asien, Afrika och Europa har illustrerat hög känslighet och specificitet av DRIT närmar sig 100% med resultat jämfört med DFA. Sedan 2005, Förenta staternas Department of Agriculture ' s Wildlife Services (USDA WS) program har genomfört storskaliga förstärkt rabies övervakning insatser med hjälp av DRIT att testa > 94000 prover som samlats in från vilda djur i strategiska områden rabies förvaltning . Den DRIT ger ett kraftfullt, ekonomiskt verktyg för rabies diagnos som kan användas av laboratorierna och fältbiologer att förbättra nuvarande rabies övervakning, förebyggande och kontrollprogram globalt.

Introduction

Medan DFA är den mest använda test för rutinmässig rabies diagnos¹, kostnaden för att köpa och underhålla ett fluorescerande Mikroskop kan vara att begränsa till utvecklingsländer^2,3,4 och för breda, storskaliga förbättrade rabies övervakningsprogram^3,4. Dessutom kräver DFA förmåga att kyla prover under fixering och att Inkubera prover över omgivningstemperaturen under antikropp-antigenreaktioner, vilket kan vara ett betydande hinder i länder utan lämplig infrastruktur. Delvis på grund av de begränsningar som är förknippade med modern DFA-testning, har den globala effekten av rabies länge underskattats⁵.

I detta avseende finns det ett behov av att validera ytterligare diagnostiska metoder för att förbättra övervakningen av rabies globalt, särskilt i utvecklingsländerna. Det DRIT-protokoll som presenteras här erbjuder ett laboratorium eller fältbaserat testalternativ till DFA som använder ljusmikroskopi och inte kräver kylning eller laboratorieinkubering under provningen⁶. Den DRIT och DFA är liknande i att båda teknikerna använder Touch intryck av hjärnan prover som samlats in från potentiellt rabiat djur. Emellertid, det första steget i DRIT använder formalin som en historisk fixativ för prover, som inaktiverar rabiesvirus. Detta ger en betydande biosäkerhet förbättring jämfört med aceton används för att fastställa prover i DFA protokoll³, vilket är viktigt inte bara i laboratoriet, men kanske ännu mer i fält-baserade eller decentraliserade labbmiljöer. Hittills visar Drit känslighet och specificitet lika med DFA^2,7,8,9.

Sedan 2005, den USDA WS programmet har genomfört storskaliga förstärkt rabies övervakning insatser i Nordamerika med hjälp av DRIT som en del av ett omfattande djurliv rabies Management program¹⁰. Förbättrad rabies övervakning används som ett komplement till exponeringsbaserad folkhälsoövervakning och tester främst djurlivet meso-Carnivore arter, inklusive tvättbjörnar (Procyon lotor), randig skunkar (Mephitis Mephitis), grå rävar ( Urocyon cinereoargenteus), Rödrävar (Vulpes vulpes) och Coyotes (Canis latrans) som inte har varit inblandade i exponering av människor eller husdjur. Djurkroppar som används i tester lämnades in till USDA WS genom förbättrad rabies övervakning insatser och omfattade rabies vektor arter som är: sjuk eller konstig agerar; hittats döda, väg-dödade, eller en olägenhet; och inte är förknippade med exponering av människor eller husdjur. Den DRIT ger en rabies diagnostiska test som kan användas av utbildad fältbiologer med liten eller ingen laboratorie erfarenhet för att förbättra rabies övervakning och minska den ekonomiska bördan och arbetsbördan för folkhälso diagnostiska laboratorier¹⁰. Den grundläggande DRIT utbildning för USDA WS fält anställda tar vanligtvis 1,5 till 2 dagar, vilket inkluderar cirka 4 h av klassrummet undervisning som omfattar grundläggande principer för biosäkerhet, metoder för provtagning och DRIT processer samt > 8 h av laboratorie tid som utför provet. Utbildningsmöjligheter har varit tillgängliga för USDA WS och program samarbetsvilliga genom centra för sjukdomskontroll och prevention (CDC), Lyssa LLC, och Wistar Institute.

Inom strategisk ledning områdena, USDA WS har provat över 94 000 Wildlife proverna användande den DRIT och har upptäckt mer än 1 850 rabiat proverna så pass skulle har sannolik bort oupptäckt förlitande bara på exponeringsbaserat allmänhet hälsa provande av misstänkt djuren. Enhanced rabies övervakningsdata från DRIT resultat är avgörande för att ge en mer komplett tidsmässiga och rumsliga representation av rabies på landskapet till stöd för muntliga rabies vaccinationsprogram för vilda djur i hela USA^{10, 11}. Likaså Provincial Wildlife byråer i Kanada har införlivat DRIT i storskaliga djurlivet rabies övervakning insatser tillsammans med sina folkhälsoprogram med framgång⁸. Både USDA WS och kanadensiska DRIT övervakningsprogram har använt nationella referenslaboratorier för att bekräfta rabies av DFA och utföra viral variant skriva som lämpligt⁸. Dessutom USDA WS fältbiologer skicka 10% av negativa prover för DFA bekräftelse till referenslaboratorier och sedan 2008, har deltagit i halvårsvis DRIT kompetenstest som tillhandahålls av Wisconsin State Laboratory of hygien, som en del av standard kvalitetssäkringsåtgärder.

Målet med denna metod är att erbjuda en alternativ metod för testning av rabies diagnostiska tester som kan göras i decentraliserade laboratorier, på fältet, eller i områden utan rutinmässig tillgång till elektronmikroskopi.

Protocol

Varje person som utför rabies diagnostiska tester bör få en standard pre-exponering rabies vaccinationsserie och genomgå regelbunden serologisk antikropp utvärdering, med booster vaccinationer som behövs. Unimmunized personer bör inte gå in i laboratorier eller områden där sådant arbete bedrivs. All manipulering av vävnader och diabilder bör utföras för att inte aerosolisera vätskor eller producera luftburna partiklar. Rök kåpor behövs inte, men när det är möjligt kan de ge extra skydd mot lukt, ektoparasiter och benfragment. Minsta personliga skyddsutrustning, inklusive handskar och ögonskydd, bör bäras hela tiden under provtagning och provtagning.

1. hjärnstammen samling

1. Samla hjärnstammen prover antingen omedelbart efter slaktkroppen samling eller se till att slaktkroppar placeras i frysar för lagring tills senare provning. Om djurkadaver fryses, Tina vid omgivningstemperatur före hjärn stammens insamling för att underlätta insamlingen. Under vissa omständigheter samlas proverna in direkt från ett fryst djur.
2. För djur som är nyinsamlade eller har tinats till omgivningstemperatur, placera djuret liggande på en plan yta med halsryggen något vriden mot granskaren. Palpate att identifiera atlanto-occipital gemensamma på den laterala aspekten av halsryggen.
   1. För slaktkroppar som fortfarande är helt frysta, placera djuret liggande enligt beskrivningen ovan, om det är praktiskt. Använd sågar, knivar, bensaxar eller liknande utrustning för att helt separera huvudet från kroppen.
      Anmärkning: All utrustning som används som inte är engångsanvändning bör rengöras grundligt mellan proverna.
3. Med hjälp av en skalpell blad, göra ett snitt på nivån av atlanto-occipital gemensamma vid den ventrala aspekten, skära igenom alla lager av muskler och mjuk vävnad, inklusive luftstrupen och matstrupen. Fortsätt tills approximera främre aspekten av cervikal ryggrad Kotor. För fryst vävnad, Använd en skalpell blad för att avlägsna eventuella kvarvarande lager av muskler och mjuk vävnad att exponera foramen magnum.
4. Flytta huvudet av djuret till slut-Range förlängning tills hjärnstammen är synlig. Använd en skalpell blad för att ta bort alla synliga hjärnstammen/centralanervsystemet (CNS) vävnad för provtagning. För ett fryst prov, Använd en skalpell blad för att ta bort så mycket av den frysta hjärnstammen/CNS vävnad som möjligt inifrån skallen.
5. Placera hjärnstammen proverna i en okrossbar behållare (dvs. metallsalva tenn, Cryo-Vial, etc.) och etikett i enlighet med detta.
6. Se till att hjärnstammen-proverna testas omedelbart efter uppsamling via Drit-provet, kylda (4 ° c) i upp till 24 timmar före provningen, eller frysta (-20 ° c) fram till testets gång om provningen kommer att äga rum mer än 24 timmar efter prov insamlingen.

2. beredning av material för DRIT

1. Inställning av 10 bild färgning rätter (figur 1)
   Anmärkning: Infärgning rätter är tillräckligt djupa för att möjliggöra fullständig nedsänkning av Slide (diameter 96 mm, höjd 72 mm, djup 42 mm, volym 250 mL). ⁶
   1. Fyll skålen 1 med 10% fosfatbuffrad formalin. Ersätt formalin efter 2 testkörningar eller veckovis.
   2. Fyll rätter 2, 4 och 5 med fosfatbuffrad saltlösning med 1% Tween-80 (TPBS). Ersätt med färskt TPBS före varje test.
   3. Fyll skålen 3 med 3% väteperoxid. Byt ut väteperoxid före varje test.
   4. Fyll rätter 6, 8, 9 och 10 med destillerat eller avjoniserat vatten. Byt vatten före varje provning.
   5. Fyll skålen 7 med gälar hematoxylin formulering #2 utspädd i en 1:1 förhållandet i destillerat vatten⁶. Ersätt hematoxylin efter 2 provkörningar eller veckovis.
      Anmärkning: Enligt den ursprungliga DRIT protokoll som utvecklats av CDC¹², en 1:2 förhållandet mellan gälar hematoxylin till vatten kan användas om motfärgning är för mörkt.
2. Beredning av amino-etylcarbazole (AEC) stamlösning
   1. Använd en glaspipett och placera 5 mL N, N-dimetylformamid i en glasbehållare.
   2. Tillsätt 1 20 mg tablett 3-amino-9-etylcarbazole och skaka tills den är helt upplöst. Märk burken med "AEC lager" och det datum då beståndet gjordes.
      Anmärkning: AEC-lagerlösningen kan förvaras under kylning (4 ° c) och användas under 1-2 månader.
3. Beredning av AEC-arbetsutspädning
   1. Tillsätt 7 mL acetatbuffert till ett 15 mL centrifugerör.
   2. Tillsätt 0,5 mL av AEC-lagerlösningen till centrifugerröret med hjälp av en glaspipett.
   3. Tillsätt 0,075 mL 3% väteperoxid till röret.
   4. Filtrera lösningen med en 10 mL spruta med ett spruta filter på 0,45 μm.
      Anmärkning: AEC-arbetsutspädningen bör skapas strax före varje DRIT-test eftersom den endast är stabil för 2-3 h.

3. direkt snabb immunohistokemi test

1. Etikett glas Mikroskop diabilder med ett unikt nummer för varje preparat med en smutskastnings säker, vattentät, permanent bläck markör.
   1. Använd en skalpell blad, ta bort hjärnstammen från behållaren och placera på pappershandduk. Försiktigt blot bort allt överskott av vätska, blod, eller päls med en andra pappershandduk för att avslöja bara hjärnstammen vävnad¹³. Om det behövs, avsnitt hjärnstammen vävnad att avslöja ett tvärsnitt.
   2. Tryck mycket försiktigt på Mikroskopbilden till tvärsnittet av hjärnstammen vävnad. Peka på bilden till hjärnstammen på flera punkter utan lateral förflyttning för att tillåta flera områden av hjärnstammen att överföras till bild¹³. Se till att endast 1 eller 2 lager av celler överförs från hjärnvävnaden till bilden med en mild beröring. Ingen monteringsmedel behövs för att fästa hjärnstammen vävnad till bilderna. Inkludera både en positiv och negativ kontroll i varje DRIT-körning.
2. Låt bilderna lufttorka i ca 5 min vid rumstemperatur.
3. Sänk ned diabilderna i 10% buffrad formalin i 10 min (skålen 1).
4. Ta bort glasen från formalin och doppa-skölj i en lösning av TPBS (skålen 2).
5. Sänk ned bilderna i 3% väteperoxid i 10 min (skålen 3).
6. Ta bort bilderna från väteperoxid och doppa-skölj i färskt TPBS (skålen 4). Efter avlägsnande av överskott väteperoxid, placera bilderna i färskt TPBS (skålen 5) och arbeta med en bild i taget medan de andra bilderna stanna nedsänkt i TPBS.
7. Ta bilderna från TPBS (skålen 5) en i taget, skaka av och blot överflödig buffert, och placera på en fuktad pappershandduk på Lab bänk, som grund för en "fuktighet kammare". Med hjälp av en pipett, släpp tillräckligt primär anti-rabiesvirus antikropp på varje bild för att täcka CNS vävnad. Inkubera glidskenorna i 10 minuter i fuktighets kammaren (dvs. täcka diabilder med bra plåtar eller annat enkelt skydd medan de lägger på den fuktade pappers handduken) i rumstemperatur (figur 2).
8. Ta bort glasen från fuktkammaren, skaka och torka bort överflödigt konjugat och doppa-skölj bilderna i TPBS (återanvända samma TPBS i skålen 5).
9. Arbeta med en bild i taget medan andra stannar nedsänkt i TPBS – Använd en pipett för att släppa tillräckligt med streptavidin-peroxidaskomplex för att täcka CNS-vävnaden. Inkubera i fuktighets kammaren i 10 minuter vid rumstemperatur.
10. Ta bort bilderna från fuktkammaren, skaka och torka av överflödigt komplex, och doppa-skölj bilderna i TPBS (skålen 5).
11. Arbeta med en bild i taget, skaka av dig och torka av överflödig buffert, medan andra stannar nedsänkt i TPBS – Använd en pipett för att släppa tillräckligt med AEC (beredning förklaras ovan och bör göras omedelbart före användning) för att täcka CNS vävnad. Inkubera i fuktighets kammaren i 10 minuter vid rumstemperatur.
12. Doppa-skölj glasen i destillerat vatten (skålen 6).
13. Placera bilderna i motfärgning av gälar hematoxylin (utspädd 1:1 med destillerat vatten) för 2 min (skålen 7).
14. Skölj genast alla bilder i destillerat vatten (skålen 8). Upprepa två gånger med friskt dricksvatten varje gång (rätter 9 och 10).
15. Arbeta med en bild i taget medan andra stannar nedsänkt i destillerat vatten (skålen 10) — skaka och torka av överflödigt vatten och Använd ett vattenlösligt monteringsmedium för att fästa en täckslip.
16. Använd ett ljusmikroskop med en 20x målsättning att visa bilderna och en 40x mål om närmare inspektion behövs.

Representative Results

Positiva resultat från Drit visar röda intracytoplasmatisk viral inkluderingar som kan variera i form och storlek (figur 3) i cytoplasman hos blåaktiga cell kroppar. Inneslutningar verkar släta med mycket ljusa marginaler och en mindre intensivt färgade centrala området. Intensitet och antigen fördelning registreras när inneslutningar upptäcks. Intensitet graderas från + 4 till + 1. Den positiva kontroll bilden bör ha en intensiv, skriande Magenta briljans som kallas en + 4 intensitet. En liten förlust av färg kan förekomma särskilt när provhantering inte har varit optimala (dvs., prov vävnad har sönderdelas något) och dessa bör bedömas som + 3. Märkbart tråkig fläck är graderat så en + 2 till + 1, är inte betraktat som diagnos för rabiesvirus infektion och är märket så obestämd.

Dessutom är antigen distribution graderad från + 4 till + 1 med + 4 representerar antigen distribution består av ett överflöd av stora och små inneslutningar varierande i storlek och form, och förekommer i varje fält (eller nästan alla fält) av syn inom CNS vävnad Tryck på exponering. Den positiva kontrollen har normalt en + 4-antigen fördelning. En antigen fördelning av + 3 skulle tilldelas när det finns inneslutningar i en mängd olika storlekar i de flesta men inte alla av de områden av syn. Om inneslutningar påträffas i 10%-50% av Mikroskop fälten, tilldelas en + 2-antigenfördelning. När inneslutningar påträffas i < 10% av Mikroskop fälten tilldelas en + 1-antigenfördelning.

De flesta CNS-vävnad med rabiesvirus uppvisar typiska virala inkluderingar graderade som + 3 eller + 4 intensitet och antigen distribution. Om resultaten indikerar a + 2-eller + 1-intensitet eller a + 2 eller + 1-antigendistribution, deklareras provet som obestämt och upprepade tester är befogade. Om samma prov har ett upprepat obestämt testresultat, skall provet sändas till ett referenslaboratorium för DFA eller därtill hörande bekräftande test.

Ett test prov med hjälp av DRIT anses negativt för rabiesvirus antigener efter att bilden som innehåller CNS-vävnaden har skannats med en förstoring på 200X eller mer och inga typiska virus inkluderingar upptäcks (figur 4). Negativa prover uppvisar blåaktiga cell kroppar med liten eller ingen ospecifik färgning.

Bild 1: inställning av 10 bild färgning rätter med reagens för testning. Rätterna är märkta med reagensnamn i den ordning som behövs för att följa protokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: enkel fuktighets kammare skapad med våt pappershandduk och cellodlingsplattor.  En enkel fuktighets kammare med hjälp av en våt pappershandduk och cellkultur plattor möjliggör fältbaserad applikation.  Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: representativa diabilder av rabies positiva virala inkluderingar med + 4 intensitet och + 4 antigen fördelning. (A och B) visar positiva rabies viral inneslutningar på 200x förstoring. (C och D) visar positiva rabies viral inneslutningar på 400x förstoring. Skalstreck = 5 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: representativa diabilder av negativa prover utan rabiesvirus inneslutningar. (A och B) Visa prover negativa för rabies viral inneslutningar på 200x förstoring. (C och D) Visa prover negativa för rabies viral inneslutningar på 400x förstoring. Skalstreck = 5 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: representativa fotografier av DRIT-testanläggningar som används av USDA ws. A) mobil provningsanläggning i en sluten släpvagn för transport. B) fritidsfordon som eftermonteras för Drit-provning. (C) Drit provningsanläggning i samarbete med Universitetslaboratoriet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

DRIT är en flexibel metod lämpad för fältbaserad övervakning för att upptäcka förekomst av rabiesvirus som kan användas i decentraliserade laboratorie områden. Även om det är möjligt att genomföra hela testet i en fältbaserad inställning som på bakluckan på en lastbil, är det idealiskt att ha en liten, inomhus utrymme dedikerad för DRIT på grund av kemisk, utrustning och leverans lagring frågor. Dessutom måste efterlevnad av alla tillämpliga federala, statliga och lokala lagar, och förordningar för kemisk användning och bortskaffande beaktas. För närvarande USDA WS har 15 DRIT anläggningar för att testa prover från 17 stater. Den USDA WS DRIT anläggningar är etablerade i samband med universitet och statliga folkhälso laboratorier, i utsedda rum inom större anläggningar och i slutna släpvagnar som har eftermonteras och konverteras för att fungera som mobila provnings enheter i händelse av ett akut utbrott svar där förstärkt rabies övervakning tester med omedelbar handläggningstid är kritisk (figur 5).

Medan testet har varit framgångsrik med hjälp av hjärnstammen material av varierande kvalitet, färsk hjärnstammen vävnad utan vävnadsnedbrytning är optimal. Som nedbrytning, uttorkning, eller kondensering inträffar, prov kvalitet minskar och testet kan upptäcka mer ospecifik färgning som kan förvirra resultat. Denna observation är likartad mellan DFA och DRIT². Hjärnstammen/CNS ska samlas in så snart som möjligt och därefter förvaras fryst (-20 ° c) tills det testas.

Typiskt, mest USDA WS anläggningar process från 12 till 24 bilder på en gång under en DRIT session, inklusive en positiv kontroll och en negativ kontroll som har bekräftats via DFA. Positiva och negativa kontroller ger en referenspunkt för varje DRIT-körning för att säkerställa att testet lyckades och för att bekräfta om tolkningsfrågor uppstår på test bilderna. Om ett prov inte är fastställt att ha ett klart positivt eller negativt resultat, är det märkt som en obestämd och testas en andra gång av DRIT. Om detta prov inte är en klar positiv eller negativ efter två DRIT-tester, skickas det till ett referenslaboratorium för DFA eller liknande tester.

Som med alla diagnostiska test, "Trouble skytte" är användbart med oväntade fynd. Till exempel, om en DRIT Run är misslyckad (dvs, den positiva kontrollen inte uppvisar + 3 eller + 4 Färgnings intensitet och antigen distribution), se till att alla kemikalier och reagenser inte har löpt ut. Vi har funnit att använda en nyligen öppnad flaska väteperoxid på minst en gång per vecka är till hjälp för att förhindra icke-specifik färgning genom oxidation av hjärnvävnaden. Dessutom rekommenderar vi att ersätta acetat buffert minst en gång per år minst, oavsett det angivna utgångsdatumet.

Det finns ett antal fördelar med DRIT över DFA inklusive lägre kostnader, förmåga att utföra testet utanför ett centraliserat laboratorium, behöver endast ljus mikroskopi i stället för ett fluorescerande Mikroskop, och den relativt enkla träningsprocessen för personer som administrerar och läser provet^2,3,4. Dessa fördelar, tillsammans med känslighet och specificitet av Drit som är jämförbara med DFA^2,7,8,9 har redan bevisat att testet fungerar som ett viktigt verktyg i stor skala förbättrad rabies övervakningsprogram^8,10 i Nordamerika. Dessutom har DRIT potential att möjliggöra ökad övervakning och mer snabba tester i utvecklingsländer eller andra områden med begränsade resurser, särskilt efter senaste OIE/WHO vägledning som ett rekommenderat test.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Amino-9-Ethylcarbazole (AEC tablets; 50 count)	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	A6926
Acetate Buffer, 0.1M, 5.2 pH, 32 oz	Poly Scientific R&D Corp. (https://www.polyrnd.com/)	s140
Ag Tek MiniScalpel, PN110, Non-sterile #10, 40 per package	Patterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)	PN110	Supplemental equipment for sample touch impressions; Also available through Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)
BD Luer-Lok Disposable Syringe without needle, 10 cc	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-823-2A	BD Manufacturer Number 309604
Binocular Light Microscope with Seidentopf Head or equivalent	Multiple Vendors
Blue Rectangular UN-rated Disposal Container, 5G	Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)	1147T01BLU	Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Gill hematoxylin and AEC solution)
Corning Square and Rectangular Cover Glass, 24x60	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	12-553-465	Corning Manufacturer Number 2975246
Corning Universal Fit Pipet Tips: Racked, Nonsterile (1-200ul)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	07-200-300	Corning Manufacturer Number 4863
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes, polypropylene	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-959-70C	Corning Manufacturer Number 352097
Falcon 96-Well Assay Plates (Tissue culture plate lids)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	08-772-5	Corning Manufacturer Number 353910
Fisher Brand 25mm Syringe Filter, Nylon, 0.45 μm, Sterile	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	09-719D
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4L	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	CS401-1D
Fisherbrand Sharps-A-Gator Point-of-Use Sharps Containers, 5 qt	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	14-827-122	Supplemental equipment for proper BSL-2 Laboratory Set-Up
Fluoro-Gel with Tris Buffer (Gel/Mount Media), 20 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	102092-122	Fluoro-Gel Substitute for BioMeda™ Gel-Mount, Electron Microscopy Sciences
Formalin, Buffered, 10%, 4L	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	SF100-4	Available each or in case of 4
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200 μL	Daigger Scientific (https://www.daigger.com)	EF9930E
Hy-Clone Phosphate Buffered Saline, 1x Solution, 1 L (PBS)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	SH30256LS	Alternative dry powder product can be used
Hydrogen Peroxide, 3%	Multiple Vendors		Any commercially available source, such as pharmacy or store brands, etc.
Lens Microscope Objective 20x and 40x	Multiple Vendors
Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1G	Daigger Scientific (https://www.daigger.com)	EF8481	Supplemental materials for proper BSL-2 Laboratory disinfection
Miltex brand Disposable Scalpel Size 22 (alternative size to MiniScalpel)	AMD Next (www.amdnext.com)	999112314	Supplemental equipment for sample touch impressions; Alternative size to Ag Tek MiniScalpel
N,N-Dimethylformamide, Amber Glass Packaging, 500 mL	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	D119-500
Peroxidase Labeled Streptavidin, 50 mL	SeraCare (https://www.seracare.com/)	5550-0001	KPL Immunoassay and Kits Reference Number 71-00-38
Phosphate Buffered Saline Powder (alternative to Fisher liquid PBS)	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	P3813	Must be prepared in 1 L distilled water; Available in quantities of 1, 10 and 50 packs
Primary antibody: Polyclonal anti-nucleoprotein or cocktail of anti-lyssavirus biotinylated antibodies			Store at 4 °C
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 1.0 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-1	VWR Manufacturer Number 89091-220
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 10.0 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-10	VWR Manufacturer Number 89091-106
PYREX Disposable Serological Pipets, Glass, Sterile, Plugged, Corning, 5.0 mL	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	7078D-5	VWR Manufacturer Number 89091-484
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternative to above)	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	22-050-201	Thermo Scientific Manufacturer Number 72504
Slide Holders, 24-place	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	25608-868	Sakura®Finetek Supplier Number 4465; Available through multiple vendors
Specimen Tin Boxes, 1/2 oz	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	101412-452	Supplemental equipment for storage of brain tissue samples
Taylor 2-Event Digital Timer/Clock	Multiple Vendors		Supplemental equipment
Tissue-Tek Slide Staining Kit	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	25608-902	Sakura®Finetek Supplier Number 4551; Available through multiple vendors
TWEEN 80, Polyethylene glycol, 500 mL	Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)	P1754	Also available in 25 mL, 1 L and 1 G volumes
VWR FLIP Pipette Filler (0.05-100 mL)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	53497-055
VWR Soft Nitrile Examination Gloves, L (100 per box)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	89038-272	Supplemental equipment for proper PPE
Water, Deionized (20 L)	VWR, part of Avantor (https://vwr.com)	10806-022
Wheaton Clear Glass Sample Vials, 8 mL	Fisher Scientific (part of Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)	06-408C	DWK Life Sciences Manufacturer Number 224884
White Coated, Double Well Pattern Microscope Slides, 14 mm	Tekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)	2-140
White Rectangular UN-rate Disposal Container, 5G	Berlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)	1147T01WHT	Supplemental equipment for chemical waste storage/disposal (Formalin)