Summary
Denne protokollen introduserer en standard laboratorium driftsprosedyre for diagnostisk testing av lyssavirus antigener i ball i Taiwan.
Abstract
Virus i slekten Lyssavirus er zoonotiske patogener, og minst syv Lyssavirus arter er forbundet med menneskelige saker. Fordi ball er naturlige reservoarer av de fleste lyssaviruses, en lyssavirus overvåking program av ball har vært gjennomført i Taiwan siden 2008 for å forstå økologi av disse virusene i ball. I dette programmet, ikke-statlige bat bevaring organisasjoner og lokale dyr sykdom kontroll sentre samarbeidet for å samle døde ball eller ball døende av svakhet eller sykdom. Hjernevev av ball ble innhentet gjennom obduksjon og utsatt for direkte fluorescerende antistoff test (FAT) og omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon (RT-PCR) for påvisning av lyssavirus antigener og nukleinsyre syrer. For det Basin, det vil si to annerledes rabiat diagnosis konjugater er anbefalt. For RT-PCR brukes to sett med primere (JW12/N165-146, N113F/N304R) til å forsterke en delvis sekvens av det lyssavirus nucleoprotein genet. Dette Overvåkningsprogrammet overvåker lyssaviruses og andre zoonotiske midler i ball. Taiwan bat lyssavirus finnes i to tilfeller av den japanske pipistrelle (Pipistrellus abramus) i 2016 – 2017. Disse funnene bør informere offentligheten, helsepersonell, og forskere av den potensielle risikoen ved å kontakte ball og annet dyreliv.
Introduction
Virus i slekten Lyssavirus er zoonotiske patogener. Det er minst syv lyssavirus arter forbundet med menneskelige tilfeller1. I tillegg til de 16 artene i denne slekten1,2,3, Taiwan bat lyssavirus (TWBLV)4 og Kotalahti bat lyssavirus5 har nylig blitt identifisert i ball, men deres taksonomisk statuser har ennå å bestemmes.
Ball er de naturlige vertene av de fleste lyssaviruses, med unntak av Mokola lyssavirus og Ikoma lyssavirus, som ennå ikke er identifisert i noen ball1,2,3,6. Informasjonen på lyssaviruses i asiatiske ball er fortsatt begrenset. To uncharacterized lyssaviruses i asiatiske balltre (ett i India og den andre i Thailand)7,8 har blitt rapportert. Ettall Human rabiat rettssak forbundet med en bat bit inne Porselen var rapportere inne 2002, bortsett fra diagnosen var fremstilt bare av klinisk observasjon9. I Sentral-Asia ble Aravan lyssavirus identifisert i mindre mus-eared bat (Myotis blythi) i kirgisistan i 1991, og Khujand lyssavirus ble identifisert i denne bat (Myotis Mystacinus) i Tadsjikistan i 200110. I Sør-Asia, Gannoruwa bat lyssavirus ble identifisert i den indiske flygende reven (Pteropus Medius) i Sri Lanka i 20153. I Sørøst-Asia, flere serologisk studier på ball i Filippinene, Thailand, Bangladesh, Kambodsja og Vietnam vistevariable seroprevalensdata11,12,13,14, 15av dem. Selv om Irkut lyssavirus ble identifisert i den større rør-nese bat (Murina leucogaster) i Jilin provinsen, kina i 2012 til16, forblir den eksakte arten og plasseringene av Lyssaviruses i øst-asiatiske bat populasjoner ukjent.
For å vurdere tilstedeværelsen av lyssavirus i taiwanske bat populasjoner, et overvåkningsprogram ansette både direkte FAT og RT-PCR ble igangsatt. Taiwan bat lyssavirus ble identifisert i to tilfeller av den japanske pipistrelle (Pipistrellus abramus)4 i 2016 – 2017. I denne artikkelen er et laboratorium standard driftsprosedyre innført for lyssavirus overvåking av bat befolkningen i Taiwan. Flyten diagram av bat lyssavirus diagnose i vårt laboratorium er presentert i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sikkerhetsforanstaltninger ved håndtering av lyssaviruses
- Sikre det alle laboratorium arbeidere handling bat prøver få pre-avsøring rabiat forebygging17. Dataskjerm det rabiat antistoff høyder av arbeiderne på forhånd og re-eksamen seg enhver 6 måneder17. Oppfølging rabies vaksinasjon er nødvendig for dem som antistoffnivåer er lavere enn 0,5 IU/mL17.
- Avhengig av biosafety forskrifter i landet der laboratoriet er plassert, må du sørge for at følgende prosedyrer utføres i egnede biosafety nivå laboratorier (for eksempel BSL-2 laboratorier i Taiwan og BSL-3 laboratorier i Australia), og at arbeidstakere er for tiden kvalifisert og ha riktig personlig verneutstyr18.
Merk: rabies vaksinasjon gir liten eller ingen beskyttelse mot lyssaviruses tilhører phylogroups II og III18. Arbeiderne må informeres om at flere zoonotiske patogener har blitt identifisert i ball19 og bør håndtere prøvene under egnede biosafety nivå laboratorieforhold med riktig personlig verneutstyr.
2. samling av eksempler
- Bruk funnet svake eller syke ball eller skrotter.
NOTE: svak eller syk ball er leverte å det bat Conservation samfunnet av Taipei for veterinary bekymre eller forskning, stund skrotter er innleverte direkte å det dyr sunnhet forskning off. Ingen sunne ball har vært euthanized i dette Overvåkningsprogrammet. - Ha en bat økolog identifisere bat arter gjennom morfologiske egenskaper20.
- Utføre DNA barcoding av balltre arter når lyssavirus positive er diagnostisert, ved hjelp av tidligere publiserte prosedyrer21.
- Send inn et informasjonsark for hver stamme (samlingssted, arter, kliniske tegn osv.).
3. obduksjon av bat prøver
- Forbered materialer.
- Forbered et rent disseksjon Board og Plasser en steril, absorberende pute for obduksjon.
- Forbered samling rør for å samle bat organer.
- Forbered en gangs pinsett og skalpeller for obduksjon. Endre verktøy mellom hver bat ' s obduksjon. Forbered bomulls kuler fuktet med 70% etanol for rengjøring pinsett og skalpeller under prøvetaking.
- Forbered to mikroskop lysbilder for FAT. Samle ferske prøver og fikse dem i formalin løsning for histopathological undersøkelse.
- Undersøk alle eksterne orifices før obduksjon. Fotografere bat ' s eksterne funksjoner, spesielt hode, ører og vinger, for arter differensiering.
- Samle en oral serviett prøve. Plasser balltre i ventrale recumbency på brettet og fikse balltre hode med pinsett. Skjær huden langs midtlinjen av calvaria med en skalpell og trekk huden til lateral sidene. Skjær skallen langs midtlinjen av calvaria med en skalpell og åpne den med pinsett for å avdekke hjernevevet.
- Fjern hjernevevet fra skallen og legg det på en steril tungen depressor, og gjøre inntrykk smøres utover fra hjernevevet (se trinn 4,2). Samle et lite stykke friskt hjernevev og fikse det i formalin for histopathological undersøkelse. Inneholder de resterende hjernevev i et rør for nukleinsyre syre utvinning.
- Rengjør pinsett og skalpell med bomulls kuler fuktet med 70% etanol for å fjerne beholdt vev mellom prøven samling.
- Plasser balltreet på brettet i rygg recumbency og fest det på brettet med nåler på begge sider av axilla og hale hælen.
- Incise huden langs midtlinjen av kroppen fra kjeven til anus. Løft og Skill huden og underliggende muskel vev med pinsett. Samle spyttkjertler, som er i nærheten av søvnapnéskinne benet.
- Løft brystbenet litt med pinsett, og skjær brystbenet og bukveggen langs midtlinjen med en skalpell. Skjær clavicles med en skalpell. Fest venstre og høyre ribbe bur til styret med nåler for å åpne bryst hulen.
- Skriv ned brutto lesjoner og graden av obduksjon endres.
- Fjern visceral vev (dvs. hjerte, lunger, lever, nyrer, tarm) fra slaktkroppen ved hjelp av pinsett og en skalpell. Samle inn visceral eksemplarer etter behov for fremtidig forskning.
Merk: innsamling av duplikat prøver anbefales. Man skal samles for molekylær diagnose, og den andre skal være frosset på-80 ° c med eller uten viral transportmedium for viral kultur22.
4. direkte fluorescerende antistoff test (FAT)
- Gjør inntrykk smøres utover av hjernevevet for FAT. Utfør fat som tidligere beskrevet18,23 med følgende modifikasjoner.
- Forsiktig skille hjernevevet fra det tilkoblede nerve vevet med pinsett og overføre hjernevevet til et sterilt tungen depressor. Skjær tverrsnitt av hjernen, inkludert hjernestammen og lillehjernen18,23. Gjør inntrykk flekker av hjernevevet ved lett berøre klippe overflaten av hjernevevet, og trykk på lysbildet på linsen vev for å fjerne overflødig vev.
- Fest lysbildene med aceton ved-20 ° c i 30 min. Tørk de testede lysbildene og de positive og negative kontrollene før du flekker med bøy.
- Ved hjelp av hver av de to kommersielt tilgjengelige FITC-bøyd anti-rabies antistoffer for farging lyssavirus antigen er sterkt anbefalt23. Bestem arbeids konsentrasjonen av den kommersielle bøy før første farging. Slipp den fortynnede konjugater gjennom et sprøyte filter på 0,45 μM på lysbildene og ruge lysbildene ved 37 ° c i 30 minutter i et vått kammer.
- Tøm overskytende bøy fra lysbildene og vask lysbildene med fosfat-bufret saltvann (PBS) etter inkubasjons.
- Drop en liten mengde på 10% glyserol på lysbildene og dekk med Cover lysbilder.
- Undersøk lysbildene med et fluorescerende mikroskop.
5. nukleinsyre syre utvinning
- Legg riktig volum av MEM-10 (minimum essensielle medium supplert med 10% fosterets storfe serum) til hjernevevet (10% w/v).
- Homogenate hjernevevet med en 5 mm stål perle i et homogenisator instrument og sentrifuger ved 825 x g i 10 min.
- Pakk ut den nukleinsyre syre, det endelige volumet som er 50 μL, innen 200 μL av supernatanten ved hjelp av kommersielt tilgjengelig total nukleinsyre acid Extraction Kit med instrument.
6. RT-PCR-og Fylogenetiske-analyse
Merk: flere primer sett har blitt publisert for å oppdage alle kjente lyssaviruses eller spesifikke lyssaviruses. Protokollen som beskrives her er et eksempel på at vårt laboratorium bruker og kanskje ikke passer alle eksperimentelle behov. Velg passende grunning i henhold til laboratorie behov.
- Klargjør ett-trinns RT-PCR-reagens som følger: tilsett 5 μL av ekstrahert nukleinsyre yre i reaksjonsblandingen som inneholder 2,5 μL av 10x reaksjonsbuffer, 0,5 μL av forover og revers primere (10 μM av hver), 4 μL av 1,25 mM dNTP, 0,3 μL av RNase-hemmere (40 U/μL) , 0,3 μL av revers transkriptase (10 U/μL), 0,4 μL av DNA-polymerase (5 U/μL) og 11,5 μL av DEPC-behandlet vann.
Merk: primer settet som brukes i denne protokollen er JW12 (5 '-ATGTAACACCYCTACAATG-3 ') og N165-146 (5 '-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3 ')24. Endre utarbeidelse av reagenser og sykkelforhold i henhold til primer settene som brukes. - Utfør Sykling under følgende forhold: inkubasjons ved 42 ° c for 40 min; første denaturering ved 94 ° c i 10 min; 35 sykluser på 94 ° c i 30 s, 55 ° c for 30 s og 72 ° c til 30 s; og til slutt, ytterligere forlengelse ved 72 ° c i 10 min.
- Bruk et annet eller flere primer sett for å øke diagnose følsomheten.
- Bruk N113F (5 '-GTAGGATGCTATATGGG-3 ') og N304R (5 '-TTGACGAAGATCTTGCTCAT-3 ')25,26 for å klargjøre ett-trinns RT-PCR-reagens på følgende måte: tilsett 5 μL av ekstrahert nukleinsyre syre i en reaksjons blanding som inneholder 5 μL 10x buffer, 5 μL av fremover og omvendt grunning (4 μM av hver), 5 μL av 1,25 mM dNTP, 0,5 μL av RNase-hemmer (40 U/μL), 0,2 μL av revers transkriptase (10 U/μL), 1 μL av DNA-polymerase (5 U/μL) og 23,3 μL av DEPC vann.
- Utfør Sykling under følgende forhold: inkubasjons ved 42 ° c for 40 min; første denaturering ved 95 ° c i 5 min; 35 sykluser på 95 ° c i 1 min, 55 ° c for 1 min og 20 s, og 72 ° c i 1 min; og til slutt, ytterligere forlengelse ved 72 ° c i 10 min.
Merk: avhengig av laboratorie behov, Velg egnet grunning for diagnostisering. N113F var opprinnelig beregnet på rabiat virus forsterkning, bortsett fra den kanskje ikke arbeide frisk for annet lyssaviruses. Det sette av N113F og N304R arbeider frisk for rabiat virus (Taiwan oppspore Badger variant) og Taiwan bat lyssavirus. Det vil være lettere å få hele nucleoprotein sekvenser ved hjelp av sett med JW12 og N304R primere hvis lyssavirus forsterkes av begge de ovennevnte to primer sett.
- Analyser PCR-produktet på 2% agarose gel elektroforese og Visualiser av UV lys belysning.
- Sekvens av PCR-produktet ved kommersiell sekvensering service.
- Skriv inn eller Last opp sekvensen til websiden for nukleotid Basic Local Alignment søkeverktøy (BLAST). Velg "andre (nr etc.)" database og angi organismen som Lyssavirus. Velg MegaBlast algoritme og kjøre BLAST.
7. virus isolasjon
Merk: Utfør virus isolasjon når enten 1) FAT eller 2) RT-PCR indikerer positivitet.
- Homogenisere hjernen prøven i en 10% (w/v) suspensjon i MEM-10. Sentrifuger på 825 x g i 10 min.
- Vaksinere 200 μL av supernatanten med en suspensjon på 3 x 106 MNA (Mouse-neuroblastom) celler i 1 ml mem-10 for 1 time ved 37 ° c med 1% co2. Overfør hjernen homogenate til en 25 cm2 kolbe og tilsett 6 ml mem-10.
- Dyrke 1 mL av hjernen homogenate i en 4 godt Teflon-belagt glass Slide med 6 mm diameter på samme tid.
- Etter 3 – 4 dager med inkubasjons ved 37 ° c med 1% CO2, fest cellene på de 4 brønn raset med 100% aceton (v/v).
- Flekk det lysbilder med to FITC-bøyd anti-rabiat Antistoffene fulgte skritt 4.4 – 4.7. Cellene er infisert når Intracytoplasmatisk inkluderinger undersøkes. Registrere prosentandelen av infiserte celler.
- Utfør trypsinization og under kultur av den inokulert celle kulturen når lysbildene er flekkete som negative:
- Fjern medium og skyll flasken med 5 mL PBS.
- Tilsett 1 mL Trypsin til flasken og fast streik bunnen av flasken.
- Tilsett 6 mL MEM-10 og resuspend cellene.
- Sett celle fjæringen i en ny vevs flaske (6 mL) og på et 4-brønn bilde (1 mL).
- Gjenta trinn 7.4 – 7.6 til 100% infectivity er nådd.
- Samle supernatanten etter 24 h av inkubasjons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fra 2014 til mai 2017, ble 332 bat skrotter fra 13 arter samlet for overvåking. To testet positivt. I den første bat tilfelle, hjernen inntrykk testet negativt ved hjelp av FAT med en av de kommersielle FITC-bøyd anti-rabies antistoffer (figur 2), mens RT-PCRene ansette hver av de to primer sett (JW12/N165-146, N113F/N304R) gitt positive resultater (Figur 3). En 428 BP sekvens av amplicon (forsterket med N113F/N304R og inneholder delvis nucleoprotein genet) ble innhentet. Sekvensen ble utsatt for BLAST spørring av GenBank databasen. Resultatet viste at sekvensen var lik lyssaviruses med identiteter på mindre enn 79% (Figur 4), som støtter identiteten til den oppdagede lyssaviruses.
Senere ble to lyssaviruses isolert med hell fra disse to hjerner, og virusene ble bekreftet av FAT (figur 5) og sekvensering. Den identifiserte lyssavirus ble utpekt som Taiwan bat lyssavirus (TWBLV) basert på sekvens analysen4. I det andre tilfellet, resultatene innhentet fra fett ansette hver av de to kommersielle FITC-bøyd anti-rabies antistoffer var inkonsekvent, som beskrevet for det første tilfellet.
Figur 1: bat lyssavirus diagnose flytskjema.
Flytdiagram som viser gjeldende prosess og diagnostiske metoder som vårt laboratorium brukte nå. Virus isolasjon bør utføres når enten direkte fluorescerende antistoff test eller omvendt transkripsjon polymerase kjedere reaksjon er positiv. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Direct FAT med to kommersielle FITC-bøyd anti-rabies antistoffer av hele hjernen kompresjon fra en TWBLV-infiserte bat gir inkonsekvente resultater.
Saksnummer: 2016-2300: (A) FETTET med reagens A (5x fortynning), som viser Eple grønne positive signaler. (B) FETTET med reagens B som viser et negativt resultat (20x fortynning). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: produkter av RT-PCRene ansette to primer sett.
Primer settet som ble brukt i baner 1 til 3 var JW12/N165-146, og den forventede produkt størrelsen var 111 base parene. Primer settet brukes i felt 4 til 6 var N113F/N304R, og den forventede produkt størrelsen var 521 base parene. Begge testene av prøven (kjørefelt 1 og 4) var positive. M = 100 BP DNA stige; baner 1 og 4 = testet prøve; baner 2 og 5 = positive kontroller; baner 3 og 6 = negative kontroller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: BLAST resultat av N113F/N304R produkt av TWBLV infiserte bat.
BLAST resultater viste at saken var mest lik lyssavirus, men identiteten med lyssavirus i databasen var bare 79%. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: sammenligning av lyssavirus antigen distribusjon av virus isolering av TWBLV med to FITC-bøyd anti-rabies konjugater.
Det 10% bat hjerne emulsjon (TWBLV infisert) var inokulert i musen neuroblastom celler for virus isolasjon. Fettet ble utført ved tiende passasje og beiset med to FITC-bøyd anti-rabies antistoffer. Antigen distribusjon av mus neuroblastom celler med to rabies konjugater viste betydelige forskjeller. (A) FETTET med reagens A (5x fortynning). (B) FETTET med reagens B (5x fortynning). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette laboratoriet standard driftsprosedyre (SOP) gir en seriell prosess for å teste bat prøver for tilstedeværelsen av lyssavirus antigener i Taiwan. De viktigste trinnene inkluderer ansettelse av FAT og RT-PCR. Utvalget av egnede prøver og vellykket isolering av viruset er også viktig. I tillegg ble noen feilsøking utført under overvåkingen av bat lyssaviruses. Den største forskjellen var målet dyrene. Opprinnelig (2008-2009), målet dyrene i bat lyssavirus overvåking var live ball, som var fanget i Kinmen Island i Taiwan deretter testet for lyssavirus etter døds aktiv. De fleste av de fanget ball var friske og usannsynlig å bære lyssavirus, og denne tilnærmingen til overvåking var ikke humane. Derfor, i det tredje året, bare døde eller døende ball ble samlet og utvide overvåking området fra regionale til nasjonale. Etter åtte år med kontinuerlig overvåkning, den første bat lyssavirus saken ble endelig oppdaget i Taiwan.
Til tross for Basin er de fleste vidt anvendt metoden for rabiat diagnosis og anbefalt av OIE og hvem18, få studier ha bevist inkonsekvent resultater når annerledes konjugater var anvendt inne det Basin5,27. Lignende inkonsekvente resultater dukket også opp i TWBLV-infiserte tilfeller. I de TWBLV-infiserte MNA-cellene viste resultatene av FAT signifikante forskjeller i 2 konjugater (figur 5). En av de FITC-bøyd anti-rabies antistoffer ikke reagerer godt, selv ved høyere konsentrasjoner. På grunn av variasjonen av lyssavirus antigen i prøvene og variasjonen av antistoff avidity og affinitet av antistoffer i konjugater, anbefales det at to forskjellige konjugater brukes i FAT for å hindre falske negative resultater i lyssavirus diagnose23,28,29.
RT-PCR kan gi bekreftende diagnose for inkonsekvente resultater fra FAT. På grunn av det høye genetiske mangfoldet i lyssavirus, anbefales det at mer enn én primer satt i RT-PCR brukes til å øke nøyaktigheten av lyssavirus screening29,30. En primer sett designet av svært bevarte nucleoprotein gener er den mest brukte sett i lyssavirus deteksjon29. RT-PCR kan også brukes til diagnostisering i putrefactive prøver når fettet ikke kan utføres31,32. For å unngå falske negativitet hindre oppdagelsen av en roman lyssavirus, er flere verktøy anbefales for deteksjon. To romanen lyssaviruses4, Taiwan bat lyssavirus, ble identifisert under denne undersøkelsen ansette SOP.
I tillegg en svært mangfoldig TWBLV belastning og en roman nye arter av lyssavirus ble funnet i ball i Taiwan i 2018 (upubliserte data). Funnene viste at sysselsetting av både FAT og RT-PCR å oppdage lyssaviruses i ball er nyttig. Noen begrensninger av RT-PCR primer sett brukes i denne SOP bør bemerkes. Inne det primer sette av N113F/N304R, N113F var opprinnelig beregnet på rabiat virus forsterkning, bortsett fra den kanskje ikke arbeide frisk for annet lyssaviruses. Flere primere for lyssavirus deteksjon har blitt publisert av andre forskere29,30 og kan velges i henhold til laboratorie behov.
Denne artikkelen er en steg-for-steg introduksjon til bat lyssavirus overvåking i Taiwan. Håpet er at denne SOP vil være nyttig for forskere som er interessert i bat lyssavirus overvåking. Ettersom flere forskere utfører undersøkelser av ball, mer lyssaviruses vil bli identifisert i fremtiden. Dette SOP overvåker ikke bare lyssaviruses men også andre zoonoser agenter i ball. Slike funn kan informere offentligheten, helsepersonell, og forskere av den potensielle risikoen for kontakt med ball og annet dyreliv. Det vil også bidra til å øke forståelsen av utviklingen og opprinnelsen til lyssavirus og føre til betydelig fremgang i vitenskapelig forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæres.
Acknowledgments
Vi takker Tien-Cheng Li, Yi-tang Lin, Chia-Jung Tsai, og ya-LAN Li for deres assistanse i løpet av denne studien. Denne studien ble støttet av Grant no. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) fra Bureau of Animal and Plant Health inspeksjon og karantene, Council of Agriculture, Executive yuan, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090046 | Trypsin |
| 25 cm2 flask | Greiner bio-one | 690160 | |
| Acetone | Honeywell | 32201-1L | |
| Agarose I | VWR Life Science | 97062-250 | |
| Alcohol | NIHON SHIYAKU REAGENT | NS-32294 | |
| AMV Reverse Transcriptase | Promega | M5101 | |
| Antibiotic-Antimycotic(100X) | Gibco | 15240-062 | MEM-10 |
| Blade | Braun | BA215 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5424R | |
| Chemilumineance system | TOP BIO CO. | MGIS-21-C2-1M | |
| Collection tube | Qiagen | 990381 | |
| Collection tube | SSI | 2341-SO | |
| Cover slide | Muto Pure chemical Co., LTD. | 24505 | |
| DNA analyzer | Applied Biosystems | 3700XL | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437028 | MEM-10 |
| FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin | Fujirebio Diagnostic Inc. | 800-092 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent B |
| Four-well Teflon-coating glass slide | Thermo Fisher Scientific | 30-86H-WHITE | |
| Gel Electrophoresis System | Major Science | MJ-105-R | |
| HBSS (1x) | Gibco | 14175095 | Trypsin |
| Incubator | ASTEC | SCA-165DS | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | A2916801 | MEM-10 |
| LIGHT DIAGNOSTICS Rabies FAT reagent | EMD Millipore Corporation | 5100 | FITC-conjugated anti-rabies antibodies: reagent A |
| MagNA Pure Compact Instrument | Roche | 03731146001 | |
| MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1 | Roche | 03730964001 | |
| MEM (10x) | Gibco | 11430030 | MEM-10 |
| MEM NEAA (100x) | Gibco | 11140050 | MEM-10 |
| MEM vitamin solution | Gibco | 11120052 | MEM-10 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | MEM-10 |
| Needle | Terumo | NN*2332R9 | |
| PBS | Medicago | 09-8912-100 | |
| Primer synthesis | Mission Biotech | ||
| RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
| Sequencing service | Mission Biotech | ||
| Slide | Thermo Scientific | AA00008032E00MNT10 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360070 | MEM-10 |
| Stainless Steel Beads | QIAGEN | 69989 | |
| Sterile absorbent pad | 3M | 1604T-2 | |
| Syringe filter | Nalgene | 171-0045 | |
| Taq polymerase | JMR Holdings | JMR-801 | |
| Thermal cycler | Applied Biosystems | 2720 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Tongue depressor | HONJER CO., LTD. | 122246 | |
| Tweezer | Tennyson medical Instrument developing CO., LTD. | A0601 | |
| Tylosin Tartrate | Sigma | T6271-10G | MEM-10 |
References
- Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).
- Aréchiga Ceballos, N., et al.
- Gunawardena, P. S., et al. Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka. Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).
- Hu, S. C., et al.
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat. Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).
- Pal, S. R., et al. Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India. Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).
- Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand. Nature. 216 (5113), 384 (1967).
- Tang, X. Pivotal role of dogs in rabies transmission, China. Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al. Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences. Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).
- Arguin, P. M., et al. Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines. Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).
- Lumlertdacha, B., et al. Survey for bat lyssaviruses, Thailand. Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).
- Kuzmin, I. V., et al.
- Reynes, J. -M., et al. Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia. Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).
- Nguyen, A. T., et al.
- Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097 (2013).
- Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. , World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).
- World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf (2019).
- Smith, I., Wang, L. F. Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans. Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).
- Corbet, G. B., Hill, J. E. The mammals of the Indomalayan region: a systematic review. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).
- Mayer, F., von Helversen, O.
- Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases. Wang, L. F., Cowled, C. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2019).
- Hayman, D. T. S., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
- Franka, R., et al. A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus). Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).
- Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. Rabies, 1st ed. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. , Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).
- Moldal, T., et al. First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway. BMC Veterinary Research. 13, 216 (2017).
- Robardet, E., et al. Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates. Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).
- Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. Rabies, 3rd ed. Jackson, A. C. , Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).
- Fischer, M., et al. A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories. PLoS ONE. 8 (3), 58372 (2013).
- David, D., et al. Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains. Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).
- Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques. Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).
