Summary
Мы представляем протокол для колористического асссиса цитратной активности синтазы для количественной оценки нетронутой митохондриальной массы в гомогенатах ткани Дрозофилы.
Abstract
Митохондрии играют наиболее заметную роль в клеточном метаболизме, производя АТФ через окислительную фосфорилирование и регулируя различные физиологические процессы. Митохондриальная дисфункция является основной причиной ряда метаболических и нейродегенеративных заболеваний. Intact митохондрии имеют решающее значение для их надлежащего функционирования. Фермент цитрат синтазы локализован в митохондриальной матрицы и, таким образом, может быть использован в качестве количественного маркера фермента нетронутой митохондриальной массы. Учитывая, что многие молекулы и пути, которые имеют важные функции в митохондриях, очень сохраняются между людьми и дрозофилой,и что массив мощных генетических инструментов доступны в Drosophila, Drosophila служит хорошей модельной системой для изучения митохондриальной функции. Здесь мы представляем протокол для быстрого и простого измерения активности цитрата синтазы в ткани гомегената от взрослых мух без изоляции митохондрий. Этот протокол также подходит для измерения активности цитрата синтаза в личинках, культивированных клетках и тканях млекопитающих.
Introduction
Митохондрии наиболее известны как органеллы, производящие энергию в большинстве эукариотических организмов, которые производят энергетическую валюту, АТФ, через цикл трикарбоксилевой кислоты (т.е. цикл Кребса) и окислительного фосфорилирования. Митохондрии также находятся играть важную роль во многих других физиологических процессов, таких как регулирование апоптоза1, Ca 2 "гомеостаз2,3, реактивные виды окисления (ROS) поколения4, и эндоплазмический ретикулум (ER)-стресс ответ5. Митохондриальная дисфункция может повлиять на любой орган в организме в любом возрасте и является основной причиной метаболических, связанных со старением6,и нейродегенеративных заболеваний7. Нетронутые митохондрии механистически связаны с митохондриальной функцией. Таким образом, надлежащая количественная оценка нетронутой митохондриальной массы очень важна для оценки митохондриальной функции8. Цитрат синтазы, ограничивающий скорость фермента в первой ступени цикла трикарбоксилевой кислоты9, локализуется в митохондриальной матрицы в эукариотических клетках, и, таким образом, может быть использован в качестве количественного маркера для присутствия нетронутой митохондриальной массы9,10. Активность цитрата синтазы также может быть использована в качестве фактора нормализации для нетронутых митохондриальных белков11,12.
Плодовая муха, Drosophila melanogaster, является отличной моделью системы для изучения митохондриальной функции, так как многие молекулы и пути, которые играют ключевую роль в митохондриях эволюционно сохранены от Drosophila к людям13,14,15. Здесь мы представляем протокол для быстрого и простого метода измерения активности цитрата синтазы с помощью колористического анализа в ткани Drosophila гомогенатов16 в формате 96 скважин. В цитрат синтазы деятельности анализ, цитрат синтазы в ткани Drosophila гомогената катализации реакции оксалататата с ацетил коэнзим а (ацетил КоА) для формирования цитрат CoA-SH и H. CoA-SH впоследствии реагирует с 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) (DTNB) для создания цветного продукта, 2-нитро-5-тиобензоат (TNB), который может быть легко измерен спектрофотометрически на 412 нм. Активность цитрата синтаза может быть отражена скоростью производства цвета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Колориметрический цитрат Синтаза Деятельности Анализ для D. melanogaster16
- Соберите десять взрослых мух для каждого образца. Соберите хотя бы тройные образцы для каждого генотипа.
- Подготовьте 500 кЛ ледяного буфера экстракции, содержащего 20 мМ HEPES (pH 7.2), 1 мМ EDTA и 0,1% тритона X-100 в пробирке 1,5 мл для каждого образца.
- Анестезия взрослых мух с CO2 на прокладке анестезии и изолировать нужные ткани. Чтобы изолировать взрослую муху грудей, например, зафиксировать грудную клетку мухой парой щиптов, а затем изолировать муху животами, разрезая вдоль границы грудной клетки и живота ножницами. Соберите мухи грудной клетки для мышечной цитрат синтазы деятельности ассеи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Определите свежий вес ткани на этом этапе, если с его помощью для нормализации активности цитрата синтаза. - Передача 10 взрослых летать грудной клетки на 100 л ледяной буфер добычи немедленно и гомогенизации с пестиком на льду. Чтобы сохранить образцы ледяной, гомогенизации образцов для 5-10 s на льду, затем образцы сидят на льду в течение 5 с, и повторять, пока все ткани в трубке гомогенизированы полностью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лента трубки, проверить гомогенаты, чтобы убедиться, что Есть нет сгустков в гомогенатах и что ткани в трубке гомогенизированы полностью. Все образцы лечения должны проводиться на льду. - Возьмите 10 кЛ каждого гомогенизированного образца в новой трубке для измерения содержания белка. Храните образцы для измерения белка на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы белка могут быть заморожены и храниться при -80 градусах по Цельсию для последующего анализа. Концентрации белка служат внутренним параметром для нормализации деятельности цитрата синтаза. - Добавьте 400 qL ледяного буфера извлечения к каждому оставшемуся образцу, чтобы сделать общий объем 500 л. Смешайте хорошо, мягко пайпетируя вверх и вниз, по крайней мере 5x, избегая образования пузырьков. Для каждой реакции добавьте 1 кЛ разбавленного клеточного лизата к 150 л свежеподготовленного раствора реакции (20 мм Tris-HCl (pH 8.0), 0,1 мМ DTNB, 0,3 мм ацетил коА, 1 мм оксалататической кислоты). Тщательно перемешайте и сразу же аккуратно пайпетить, избегая образования пузырьков. Измерьте абсорбцию на уровне 412 нм каждые 10-30 с в течение 4 минут при 25 градусах Цельсия с помощью считывателя пластин, способного измерять абсорбцию на уровне 412 нм с минимальными интервалами 10 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение наконечника перед pipetting другой реагент и избежать формирования пузырьков в колодцах. Неполное смешивание реагентов может привести к колебаниям измерений. Контроль активности цитрата синтазы должен быть сделан при комнатной температуре сразу после сбора образцов, так как этот обзор используется для количественной оценки нетронутой митохондриальной массы. Буфер реакции должен быть подготовлен непосредственно перед использованием и не должен храниться. - Данные участка как оптическая плотность (OD) абсорбция (abs) (Y-ось) по сравнению со временем (в минутах) (X-ось). Затем вычислите наклон для линейной части кривой, где скорость реакции
Разделите значение на концентрацию белка образца для нормализации активности цитрата синтаза. Активность синтаза цитрата рассчитывается как
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация белка образца может быть измерена набором анализов концентрации белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 представляет собой пример кинетических кривых для абсорбции OD на 412 нм с течением времени, полученных с помощью цитрат ажиотажной активности колористовой анализ для измерения drosophila грудной ткани ткани гомогенаты различных генотипов. Хорошо известно, что PGC-1 является мастером регулятора митохондриального биогенеза. PGC-1" функционально сохраняется между дрозофилой и людьми. Дрозофила RNF34 (dRNF34) является E3 убиквитин лигаза для Drosophila PGC-1 ", dPGC-1, и способствует dPGC-1 деградации белка17. Трансмиссия электронной микроскопии и митохондриальной ДНК qPCR показали, что нокдаун dRNF34 в мышцах Дрозофилы увеличивает митохондрийное содержание, которое подавляется нокдауном dPGC-117. Основываясь на этих результатах, мы предположили, что нокдаун dRNF34 в мышце Дрозофилы увеличит активность митохондриального цитрата, которая должна быть обращена вспять путем нокдауна dPGC-1. Действительно, используя колористетрический анализ цитрат синтазы деятельности, описанные здесь, мы обнаружили, что нокдаун dRNF34 в мышце Drosophila увеличение митохондриального цитрата синтазы деятельности, которая была отменена нокдаун dPGC-1. В частности, с использованием метода, описанного здесь, первоначальный линейный ферментативный курс был создан для каждого асссе(рисунок 1). Линии тренда с их формулами и коэффициентом определения (R2) показаны на графике(рисунок 1). Склоны линий тренда представляют максимальные скорости реакции, которые эквивалентны максимальной активности синтазы цитрата различных генотипов. Склоны для различных генотипов различны(рисунок 1). Коэффициент определения ближе к 1; формулы трендовых линий более надежны. Концентрация белка нормализировала максимальную активность синтаза цитрата различных генотипов были рассчитаны на основе данных Рисунка 1 (рисунок 2). Максимальная активность синтаза цитрати мухи грудной клетки с мышцами конкретных dRNF34 нокдаун увеличился, который был отменен мышцы конкретных dPGC-1 нокдаун (Рисунок 2).
Рисунок 1: Пример кинетической кривых для колористического асссеа активности цитрата синтазы. Взрослый летать толага гомогенаты(a ) 24B-Gal4 "gt; " (b) 24B-Gal4 'gt;dRNF34RNAi (II), и(c ) 24B-Gal4'gt;dRNF34RNAi (II), dPGC-1RNAi были подвергнуты colorimetric анализ активности crate synthase. Горизонтальные оси представляют время реакции, а вертикальные оси представляют абсорбции ОД на уровне 412 нм. Для каждого генотипа была установлена линейная ферментативная ставка. Нарисованы линии тренда, а на графике показаны формулы и R2 трендовых линий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Максимальная активность синтазы цитрата рассчитывается из кинетической кривых и нормализуется концентрацией белка. Максимальная активность синтаза цитрати мухи грудной клетки с мышцами конкретных dRNF34 нокдаун увеличился, который был отменен мышцы конкретных dPGC-1 нокдаун. Все данные представлены в виде средств, которые представляют сярприра(p s lt; 0.01, тест ANOVA, и тест Tukey для нескольких сравнений, n no 3, 10 грудных веществ на реплику). Эта цифра изменена с Wei et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метаболические исследования с использованием Drosophila в качестве модели должны принимать во внимание генетический фон, диета, и запас обслуживания мух18. Чтобы избежать воздействия различных генетических фонов на измерение активности цитрата синтаза, различные штаммы Drosophila должны быть перекрещены к контрольному штамму в течение 10 поколений. Генетический фон всех штаммов Drosophila, используемых в наших экспериментах, составляет w 1118,поэтому мы использовали w1118 в качестве контроля. Как правило, мы считаем, ж1118 является хорошим контролем, так как это генетический фон для большинства штаммов Drosophila и гораздо легче backcross, чем Кантон-S. Диета и запас ы обслуживания должны быть точно такими же для всех экспериментальных групп. В наших экспериментах мухи обычно поддерживаются при 25 градусах Цельсия и 50-60% относительной влажности. Шаг подготовки образца также должен быть выполнен с осторожностью. Кресты, настроенные для эксперимента, должны быть в аналогичном и соответствующем масштабе. Чтобы установить крест, 3-4 девственные взрослые мухи содержатся с 2-3 самцов взрослых мух в диаметре 4 см, 15 см высотой флакон поставляется со свежей пищей. Рецепт пищи может варьироваться (например, диета с высоким содержанием жира, нормальная диета, диета с высоким содержанием сахара), в зависимости от экспериментального дизайна. Через два дня родительское поколение мух переносится на новый флакон со свежей пищей. Уход за личинками вылупились в пище включает в себя добавление воды, если это необходимо. Когда поколение мух начинает вылупляться, флаконы переворачиваются каждые 24 ч, мухи желаемого генотипа собираются в новый флакон для эксперимента, а дата люка мух обозначена на каждом флаконе. Приблизительно 20-30 собранных мух одного генотипа, пола и возраста содержатся во флаконе с пищей. Собранные мухи должны передаваться в свежие флаконы с соответствующей пищей каждые два дня до проведения экспериментов. Чтобы избежать влияния возраста на активность цитрата синтаза, мухи различных групп испытания должны люк в тот же день. Кроме того, пол мух должен быть сопоставлен. Обычно размер тела самок больше, чем у мужчин, таким образом, концентрация белка женских тел выше, чем у мужских тел.
Цитрат синтаза деятельности ассможно также может быть использован для измерения активности цитрат синтаза в личинках. С этой целью каждый образец может состоять из пяти блуждающих третьих личинок instar. Третьи личинки instar можно отличить по темно-оранжевому кольцу на кончике задней spiracles, который отсутствует или слабо присутствует во второй instar личинок.
В шаге 6 коэффициенты разбавления образцов могут варьироваться для различных образцов. Для образцов, которые сначала измеряются, несколько коэффициентов разбавления должны быть проверены, чтобы определить соответствующее соотношение разбавления, чтобы установить линейную ферментативную скорость в анализе. Общее время измерения максимальной активности ферментов, которое устанавливает линейную ферментативную скорость в анализе, варьируется в зависимости от соотношения фермента-субстрата. Если субстрат крайне передозирован по сравнению с ферментом, то активность фермента или скорость реакции достигает максимального, что позволяет установить линейную ферментативную скорость в ходе асссе. По мере того как реакция идет дальше, количество субстрата уменьшает, и деятельность энзима или скорость реакции замедляет. Если линейная ферментативная скорость не может быть построена, а это означает, что субстрат не передозируется по сравнению с ферментом, дальнейшее разбавление ткани гомогенаты с помощью реакции или сократить интервал времени для 412 нм чтения до линейного ферментативного графика скорости Установлено. Интервал времени для чтения 412 нм должен быть не более 30 с. Продолжительность чтения 412 нм зависит от скорости реакции и времени. Показания спектрофотометра должны прекращаться, когда для всех реакций не наблюдается дальнейшего изменения цвета.
Активность синтаза цитрата может быть нормализована концентрацией белка образца, пробой свежего веса или номером клеток. Образец свежего веса можно измерить до гомогенизации, как в шаге 3. Номер клетки можно также использовать для того чтобы нормализовать lysate культивированных клеток, но клетки должны быть вполне lysed. Содержание ДНК не является хорошим вариантом для внутреннего контроля, так как процедура экстракции ДНК может привести к изменениям в образцах, особенно для образцов, содержащих небольшое количество ДНК.
Если после реакции не наблюдается изменения цвета, можно предпринять несколько различных мер по устранению неполадок:
1. Проверьте этап подготовки образца, убедившись, что для обработки образцов должным образом, держать образцы на льду, и избежать нескольких циклов замораживания оттепели.
2. Попробуйте использовать более высокую концентрацию белка, потому что некоторые образцы могут иметь гораздо более низкие уровни экспрессии синтазы цитраты, которые не обнаруживаются по анализу активности цитратационного синтаза.
3. Обратите внимание, что некоторые коммерчески доступные комплекты для цитрата синтазы деятельности анализ не может быть использован для Drosophila, потому что эти наборы определить митохондриальной цитрат синтазы деятельности на основе иммунозахвата млекопитающих цитрат синтазы и млекопитающих цитрат синтазы антитела не могут распознать дрозофилы цитрат синтазы.
Аналогичным образом, если есть расхождение между образцами:
1. Убедитесь, что в колодцах нет пузырьков.
2. Изучите, вызвано ли это плохой техникой пипетки.
В отличие от измерения активности цитрата синтазы с помощью колористического анализа в очищенных митохондриях, для очистки которых требуется почти 200 мух для очищения митохондрий каждого генотипа19,мы представляем протокол для быстрого и простого анализа для измерения активности цитратов синтазы колоримерным методом в ткани гомогената или в цельных экстрактах клеток16. Для каждого образца требуется только десять мух, вылупившихся в один и тот же день; для тройных образцов каждого генотипа, 30 мух необходимы. Описанный протокол применим не только к дрозофиле, но и к другим системам, таким как культивированные клетки и ткани млекопитающих.
Помимо оценки активности цитрата, другие методы могут быть использованы для количественной оценки митохондриальной массы. По сравнению с другими широко используемыми количественными методами митохондрий, такими как измерение содержания митохондриальной ДНК по qPCR и количественная оценка митохондриальных белков западными промотированием, которые обнаруживают все митохондрии независимо от их функции, анализ активности цитратной активности используется для количественной оценки наличия нетронутой митохондриальной массы. В отличие от анализа митохондриального дыхания, который нуждается вмитохондриальной очистке и специализированном оборудовании анализа анализа активности цитрата позволяет исследователям проводить быстрые измерения с помощью спектрофотометрии с помощью простой подготовки образца, такой как экстракт цельной клетки или гомогената тканей, и нет необходимости в митохондриальной изоляции. Таким образом, цитрат синтазы деятельности ассы является быстрым и экономичным обзор для количественной оценки нетронутой митохондриальной массы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами От Национального фонда естественных наук Китая (31401013 и 31471010), Научно-технической комиссии муниципалитета Шанхая, Шанхайской программы Пуцзян (14PJ1405900) и Фонда естественных наук Шанхай (19ЗР14446400).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
References
- Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).
- Oxenoid, K., et al.
- Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers! Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).
- Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
- Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
- Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death & Disease. 5, e984 (2014).
- Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
- Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
- Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
- MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
- Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).
- Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).
- Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
- Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
- Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
- Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
- Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).
