Summary
Disulfide bağlantıları uzun birçok proteinlerin yapısını stabilize olduğu bilinmektedir. Bu bağlantıyla stabilize edilmiş multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem, SDS-PAGE analizinin azaltılması yoluyla yapılır. Burada, bu yöntem, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS dutpase nükleer izoformu analiz ederek gösterilmektedir.
Abstract
Birçok proteinlerin yapıları, kovalent disülfür bağlantıyla stabilize edilir. Son zamanlarda bu bağ da bir post-translational modifikasyon olarak sınıflandırılmıştır. Böylece, bu değişiklik yaşam hücrelerinde çalışma muktedir önemlidir. Bu sistein-stabilize multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem olmayan SDS-sayfa analizi ve formaldehit çapraz bağlama iki adımlı bir yöntem aracılığıyla. Bu iki adımlı Yöntem, teknik kolaylığı ve düşük kullanım maliyeti nedeniyle disülfit bağlantıyla stabilize edilmiş multimerik kompleksleri açığa çıkarmak için ilk adım olarak avantajlıdır. Burada, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS özellikle dutpase nükleer izoformu analiz ederek bu yöntemi göstermek için kullanılır.
Introduction
Disulfide bağlantıları uzun birçok proteinlerin yapısını stabilize olduğu bilinmektedir. Son çalışmalar, bu Bond da geri dönüşümlü bir post-translational modifikasyon olarak sınıflandırılmıştır, bir sistein tabanlı olarak hareket "redox anahtarı" protein fonksiyonu modülasyonu için izin, konum ve etkileşim1,2, 3,4. Böylece, bu değişiklik çalışabilmesi önemlidir. Bu sistein-stabilize multimerik kompleksleri analiz etmek için basit bir yöntem olmayan azaltarak SDS-sayfa analizi5. SDS-page analizi, sonuçların hızlı, kolay ve minimal maliyetlerle elde edileceği ve yorumlandığı birçok laboratuvarlarda kullanılan bir tekniktir ve Mass spektrometri 6 gibi disülfit bağlantıları tanımlamak için kullanılan diğer teknikler üzerinde avantajlıdır. ,7 ve dairesel dikroizm8.
Bu yöntem bir çalışmada yardımcı olmak için uygun bir tekniği olup olmadığını belirlemede önemli bir adım iyice sistein kalıntı (ler) mevcut olması için faiz protein birincil sırasını incelemek için. Başka bir yararlı adım yayınlanan herhangi bir önceki kristal yapıları araştırma veya sistein kalıntı (ler) bulunabilir görselleştirmek için ilgi proteininin üç boyutlu yapısını keşfetmek için bir Biyoinformatik uygulama kullanın etmektir. Kalıntı (lar) dış yüzeyde varsa, yapının içinde gömülü bir sistein kalıntı yerine disülfür bağlantı oluşturmak için daha iyi bir aday olabilir. Ancak, proteinlerin substrat etkileşimleri veya protein-protein etkileşimleri üzerine yapısal değişiklikler geçirebilir ve bu kalıntıları daha sonra da çevreye maruz kalmalarına izin vermek önemlidir.
Tanımlanan multimerik kompleksleri daha sonra formaldehit kullanarak kimyasal çapraz bağlama ile doğrulanabilir. Formaldehit, yüksek hücreli geçirgenliği ve ~ 2-3 Å kısa çapraz bağlama aralığı nedeniyle bu doğrulama tekniği için ideal bir çapraz bağlayıcı, spesifik protein-protein etkileşimlerini tespiti sağlamak9,10. Burada, bu yöntem, insan kemiği osteosarkomu hücre hattı U-2 OS11dutpase nükleer izoformu analiz ederek gösterilmiştir. Ancak, bu protokol diğer hücre hatları, dokular ve organizmalar için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ıodoacetamid kullanarak serbest sistein kalıntılarının engellenmesini
- U-2 OS hücrelerini 6 cm2 ' ye% 50 –% 60 ' lık yüksek glikoz içeren asgari esansiyel ortamda% 10 fetal sığır serumu ve 37 °c ' de% 1 Sodyum piruvat% 5 Co2' de büyütün.
- Kullanmadan önce 10 mM iodoacetamid taze bir stok yapmak, daha sonra kullanılmayan reaktif atın.
- 0,1 mM son konsantrasyon iodoacetamid doğrudan hücre kültürü medya ekleyin. Hafifçe 2 dakika için oda sıcaklığında çanak kaya.
2. hücreleri hasat
- Medyayı hücrelerden aspirate.
- Hücreleri üç kez 5 mL soğuk fosfat-tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın. Son PBS yıkama solüsyonu aspirate sonra 1 mL soğuk PBS ekleyin.
- Bir hücre sıyırıcı kullanarak çanak altındaki hücreleri scrape. 1 mL 'Lik bir pipet kullanarak PBS ve hücre süspansiyonunu çizin ve tüm sıvıyı 1,5 mL mikrosantrifüjü tüpüne dağıtın.
- 4 °C ' de üç dakika için 7.500 x g 'de hücreleri döndürün. PBS aspirate, hücre Pelet arkasında bırakarak. Hücre Pelet olarak depolanabilir-80 °c işleme kadar
3. proteinin çıkarılması
- Hazırlamak 100 μL ddH2O seyreltilmiş 1x liziz tampon (bkz. malzeme tablosu). 1 mM final konsantrasyonuna kullanmadan hemen önce phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) ekleyin.
- Ekleme 50 μL 1x liziz tampon doğrudan hücre peleti ve askıya alın. Bunu 5 dakika boyunca buzda kulbe.
- % 40 ' de sabit darbe modunu kullanarak 8 s için sonikat (sonicator için malzeme tablosuna bakın; farklı sonicators için gerektiği şekilde ayarlayın), özü buzun üzerinde tutarak.
- 16.000 x g'de 5 dakika için özü 4 °c ' de döndürün. Süpernatant çözünür protein fraksiyonu olduğunu. Eğer istenirse, protein konsantrasyonu belirlemek için Bradford Analizi yapılabilir.
4. numune hazırlama
- 10 μL çözünür protein ekstresi alın ve 10 μL 1x Laemmli SDS-numune tampon ekleyin (% 4 SDS,% 20 gliserol, 0,004% bromophenol mavi ve 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). Herhangi bir azaltma reaktifleri eklemeyin.
- SDS PAGE Analizi o gün gerçekleştirilecektir Eğer örnekleri buzda tutun; uzun süreli depolama için-20 °C uygundur. Jeli çalıştırmadan hemen önce, numuneyi 85 °C ' de 5 dakika ısıtın.
5. In vivo formaldehit çapraz-U-2 OS hücrelerinde endojen proteinlerin bağlama
- U-2 OS hücrelerini bir 175 cm2 Flask 'e% 70 –% 80 ' e kadar büyütün (bkz. Bölüm 1).
-
Formaldehit çapraz reaksiyonu gerçekleştirin
- Bir duman kaputu, bir 37% formaldehit çözüm ticari kaynaklardan satın kısım. Formaldehit fiktasyonunu doğrudan orta% 1 ' lik bir son konsantrasyona ekleyin ve 15 dakika boyunca yumuşak ajitasyon ile Oda sıcaklığında inküye yapın.
- Reaksiyonu gidermek için, 0,125 m son konsantrasyonuna 1,25 m glisin ekleyin ve 5 dakika boyunca bir rocker üzerinde nazik ajitasyon ile Oda sıcaklığında inküye.
- Hücreleri üç kez 5 mL soğuk PBS ile yıkayın. Son PBS yıkama çözümünü aspirate ve 10 mL PBS ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak Flask altındaki hücreleri scrape.
- 10 mL 'Lik bir pipet kullanarak, PBS ve hücre süspansiyonunu çizin ve tüm sıvıyı 15 mL konik Santrifüjlü tüpüne dağıtın. 500 x g 'de hücreleri 4 °c ' de 2 dakika boyunca döndürün. PBS aspirate, hücre Pelet arkasında bırakarak.
6. çekirdeklerin fraksiyonlama
- 10 mL homojenizasyon tamponu hazırlayın: 0,25 M sakaroz, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES ve pH 7,4 ' de% 0,5 BSA. 1 mM son konsantrasyon ve 3mL çekirdekleri süspansiyon tamponu (0,1% Triton X-100 PBS) için kullanmadan hemen önce PMSF ekleyin.
- Doğrudan hücre Pelet 5 ml homojenizasyon tampon ekleyin ve tamamen askıya. 4 °C ' de 2 dakika için 500 x g 'de süspansiyon Santrifüjü sonra supernatant atın.
- 5 ml homojenizasyon tamponunun içinde Pelet askıya alın. Sıkı sığdırıcı cam Teflon Homogenizer kullanın, 10 Strokes/500 rpm 'de hücreleri homojenize Dons.
- Süspansiyonu 4 °C ' de 10 dakika 1.500 x g 'de Santrifüjden çıkarın, ardından süpernatant 'ı atın.
Not: 10 dakika 10.000 x g santrifügleme ile mitokondri yalıtım için süpernatant kullanın. - 1 ml çekirdeğin süspansiyon tamponunun içinde Pelet askıya alın ve 10 dakika boyunca buzun üzerinde inkübe.
- 600 x g 'de Santrifüjü 10 dakika boyunca çıkarın.
- 1 mL çekirdekleri süspansiyon tamponunun içinde Pelet askıya ve tekrar Santrifüjü. Süpernatant atın. Son Pelet izole çekirdekler olacak.
7. proteinin çıkarılması
- Bölüm 4 ' ü yineleyerek, doğrudan hücre peleti için 25 μL 1x liziz tamponu eklendikten sonra askıya alınması dışında.
8. numune hazırlama
- Çözünür protein özü her biri 10 μL alarak SDS-sayfa için iki numune hazırlamak ve 10 μL 2x Laemmli SDS-numune tampon ve 1 μL 2-mercaptoethanol (BME) ekleyin.
- 37 °C ' de 5 dk ve 98 °C ' de 15 dakika için ikinci numune ile formaldehit çapraz bağlantısını tersine çevirmek için bir numune ısı.
9. SDS-sayfa Analizi
- 1 L 1x Tris-Glycine çalışan tampon (25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0,1% (w/v) SDS) hazırlayın.
-
SDS-PAGE çalışan aparatı ayarlayın.
Not: bu protokol% 16 prekast TGX sds-page kullanır. Not, herhangi bir yüzde jel kullanılabilir.- Üretici protokolüne göre, jelin depolandığı paketi açın ve kaseti çıkarın.
- Kuyuları ve kaseti kasetin alt kısmından kaplayan tarağı çıkarın.
- Jeli çalışan aparatın içine yerleştirin.
- Kuyular sıvıya batıncaya kadar, odası 1x çalışan tampon ile doldurun. Plastik bir pipet kullanarak, kuyuları çalışan tampon ile durulayın.
- 10 μL önceden eklenmiş standart işaretleyiciyle birlikte jel üzerindeki örnekleri yükleyin.
- Jel altında yaklaşık 1 cm boya ön kadar 200 V jeli çalıştırın.
10. Batı Blot
- 1 L 1x transfer tamponu hazırlayın (25 mM Tris, 192 mM gcine,% 20 metanol) ve kullanım kadar 4 °C ' de saklayın.
- Jeli dikkatle çıkarın ve kaseti açın. Bir Razor kullanarak, dikkatle kesme ve istifleme jel atın. Bir köşe kullanarak jel alın ve transfer tampon ile bir tepsi içine yerleştirin, yavaşça 5 dakika boyunca kaya izin.
- Jel sallanan iken, Transfer tankı içine bir buz bloğu (-20 °C saklanır) yerleştirin ve 3/4 tam transfer tampon ekleyin.
- Poliviniliden fluorid (PVDF) membranı, 30 s için% 100 metanol içinde ıslatarak ıslansın.
- 5 dakika geçtikten sonra, Transfer tampon ile bir tepsi içinde transfer kurmak için hazırlayın. Transfer arabelleği, Blot tamamen alt etmek için yeterli olmalıdır. Leke transferini aşağıdaki şekilde ayarlayın: altta, kaset tutucunun alt kısmı (siyah); sonra kalın bir sünger, ekstra kalın Blot kağıt, poliakrilamid jel, PVDF membran, ekstra kalın Blot kağıt, ve kalın bir sünger; sonra sonunda kaset tutucu (beyaz) üst üst.
- Kaseti kilitle ve ünitesi, PVDF membranı ile pozitif anot ve jelin negatif yönüne doğru transfer tankına yerleştirin. Transferiniz tamamen batana kadar transfer tamponunun bulunduğu ünitenin üstü.
- Üniteyi karıştırma plakasının üstüne yerleştirin. Birime bir karıştırın çubuk ekleyin ve 125 RPM 'de karıştırma başlar.
- 60 dk için 100 V 'de çalıştırın.
- Transfer çalışırken, ara-20, pH 7,5 (TBST) ile Tris-tamponlu salin içinde çözünmüş% 5 toz süt çözeltisi hazırlayın.
- Üniteyi sökün ve zarı çıkarın, hangi tarafın jel ile temas ettiğini belirterek; Bu tarafın kalan adımlar için tepsiye kadar kalmasını sağlayın.
- Membranı 2 dakika boyunca Tris-tamponlu tuz (TBS) olarak ıslatarak, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 5 mL 5% süt-TBST çözeltisi içinde inküklenerek membran engelleyerek takip edilir.
- Sütünü taze 4 mL% 5 süt-TBST solüsyonu ile değiştirin ve birincil antikor doğru seyreltme (Bu durumda, seyreltme, dUTPase antikor için 1:2000 ' dir) ve 4 °C ' de hafif sallanan ile gece boyunca inküyeyin.
- Ertesi gün, 4 °c rocker dan bir oda sıcaklığı rocker, birincil antikor çözeltisi atarak leke çıkarın.
- TBST ile üç hızlı yıkayarak, tamamen Blot aşağı, 3 yıkayan, 5 dakika her, yavaş sallanan takip altına almak için yeterli sıvı kullanarak yapın.
- Son yıkama sonrasında, 5% süt-tbst çözeltisi 5 ml ekleyin ve 15 dakika sonra atmak için leke kaya.
- İstenen konsantrasyonda% 5 Milk-TBST ' a seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin. (Bu durumda, 1:5000 keçi Anti-tavşan% 5 süt-TBST çözeltisi 5 mL seyreltilmiş)
- Oda sıcaklığında inküye, 1 h için sallanan, sonra solüsyonu atın.
- TBST ile üç hızlı yıkamayı takip edin, 3 yıkanarak, 5 dakika her, yavaşça sallanan, sonra son yıkama atın ve 5 mL TBS ekleyin.
- Bir ECL chemiluminesans algılama çözeltileri bir 1:1 karışımı hazırlamak (2 ml son hacmi için her reaktif 1 ml) ve 1 dakika boyunca kulyatan leke doğrudan bu ekleyin.
- Membran Cımbız kullanarak çıkarın ve bir laboratuar silme ile köşe DAB, herhangi bir aşırı solüsyonu kaldırarak. Membranı Shrink SARINA yerleştirin ve protein tarafını bir x-ışını kasetine yerleştirin.
- Membranı x-ışını filmini açığa çıkarın. Pozlama süresi farklılık gösterecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nükleer dUTPase her monomerik protein11üçüncü amino asit konumlandırılmış iki sistein kalıntılarının etkileşimi ile istikrarlı bir dimer yapılandırma oluşturan bir moleküllü disülfür bağlantı oluşturur. Bu Şekil 1a, B'de gösterilmiştir. Bu disülfür bağlantıyı sağlamak için sınırlı olmayan ortamda göç anormallikleri nedeniyle spesifik olmayan bir etkileşim değil, t uygun bir kontrol eklenmesi esastı. Not, nükleer dutpase insanlarda mevcut dört izoformlarının biridir. Dört izoformlarının üçü ortak bir katalitik çekirdek11,12paylaşırken benzersiz bir amino Terminal Domain var. Batı Blot üzerinde görüldüğü gibi, hasat sırasında insan hücrelerinde dUTPase monomerik onay en az üç bir kombinasyonudur dUTPase (mitokondri isoform, nükleer isoform, ve bir kesilmiş versiyonu, M24), tüm hangi poliklonal antikor tarafından tanınır. Nükleer izoformu benzersiz amino Terminal alanında sistein kalıntı içeren tek izoformu. Batı Blot üzerinde görülen proteinlerin monomerik durumunun sadece küçük bir yüzdesi olan nükleer izoformu nedeniyle, bu izoformu dimerik durumunu göstermek için daha uzun maruz kaldı.
Mitokondriyal izoformu nükleer isoformda mevcut sistein kalıntı yoksun ve bu moleküllü disülfür bağlantı için bir kontrol olarak kullanıldı. Şekil 1C'de görüldüğü gibi, mitokondri izolasyonu, Batı leke analizinin ardından, azaltılması olmayan koşullarda bu izoformu bir disülfür bağlantı oluşturmadı ve monomerik protein için öngörülen moleküler ağırlığa göç gösterdi.
Bu kompleks bir multimerik kompleks oluşturabilir onaylamak için, formaldehit çapraz bağlama yapılmıştır. Yalıtılmış çekirdekler% 1 formaldehit tedavisine maruz bırakılarak, azaltma koşullarında SDS-sayfa/Batı leke analizini denatur. Şekil 2' de gösterildiği gibi, dimerization görselleştirilmiş. 95 ° c 'de numuneyi 15 dakika boyunca inküterleştirerek Cross-LINK tersine çevrildi, kompleks istikrarsızlaştı ve monomerik durumda görselleştirilebilir.
Resim 1: nükleer dUTPase proteininde moleküllü disülfür Bond oluşumunun gösterilmesi. (A) azaltma ajanı yokluğunda toplam hücre özler (TCE) bir Batı leke analizi, Beta-mercaptoethanol (BME), U-2 OS, Saos2, A549 ve 18co zaman uyumsuz nüfus multimerik kompleks oluşumu gösterir siyah tarafından belirtildiği gibi Kutusu. (B) bu kompleks, bir disülfür bağlantının varlığını gösteren dört hücreli çizginin tümünde BME ilavesi ile kaybolur. (C) U-2 işletim sistemi hücrelerinden elde edilen TCe ve saflaştırılmış mitokondrial ekstrelerin (Mito) Batı leke analizi, ± BME,-BME örneğindeki multimerik kompleks oluşumu gösterir. A, B ve C panellerindeki alt paneller, dUTPase 'nin üç isoformunun monomerik durumunu gösteren, 10 s için X-Ray filme maruz kalışını göstermektedir. A ve B 'deki üst paneller 1 dakika boyunca maruz kaldığında, C 'deki üst panel 2 dakika boyunca maruz kalıyordu. her şeritte eşdeğer miktarlarda protein uygulandı. Blots, dutpase 'nin korunmalı karboksil terminaline karşı poliklonal spesifik bir antikor ile probed edildi. Bu rakam Rotoli ve ark. 11 ' den değiştirildiBu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: formaldehit nükleer dUTPase çapraz bağlantı multimerik kompleks oluşumu göstermektedir. U-2 işletim sistemi hücreleri 15 dk. çekirdekler (N) için% 1 formaldehit ile kuluçkenden sonra, dutpase 'nin (+ formaldehit) korunulmuş karboksil terminaline karşı belirli bir poliklonal antikor kullanarak Batı leke tarafından analiz edildi. Formaldehit çapraz bağlantılarını tersine çevirmek için, nükleer preparatlarından elde edilen özler SDS-PAGE tampon ile karıştırılarak, BME (+ formaldehit, 98 °C 15 dk.) varlığında 15 dakika 98 °C ' ye ısıtılır. Gözlemler ile görülen heterojenlik (yani nDut 'un çiftli bantları) açıklanacak şekilde kalır, ancak formaldehit tedavisi nedeniyle anormal göç nedeniyle olabilir. Alt panel 10 s için X-ışını filmi maruz iken, üst panel 2 dakika için X-ray film maruz iken. Bu rakam Rotoli ve ark. 11 ' den değiştirildiBu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada özetlenen Yöntem, disülfür bağlantıları aracılığıyla stabilize multimerik kompleksleri analizi için düz ileri bir protokol verir. Bu protokol, geniş bir uygulama yelpazesi için izin veren diğer hücre kültürü hatları, dokulara ve organizmalara kolayca adapte edilebilir.
Bu prosedürün önemli bir adımı disülfit bağlantıların ekstraksiyon prosedürün bir sonucu olmadığından emin olmaktır. Herhangi bir ücretsiz sistein kalıntıları iodoacetamid13kullanılarak bloke edilebilir. Bu alkilleyici Ajan, onların tiyol grubu, yeni disülfür tahvil oluşumunu engelleme rağmen sistein kalıntılarına kovalently bağlanır. Ancak, Eğer disülfit bağ tedavi sırasında varsa bu ajan onu bozmaz. İodoacetamid optimizasyonu konsantrasyon ve zaman bir varyasyon kullanılarak yapılabilir. Ancak, bu reakajın üzerinde pozlama hücre ölümü neden olur.
Yardımcı olabilecek bu protokol için ek bir adım formaldehit çapraz bağlama optimizasyonu olduğunu. Formaldehit yüzdesi bir varyasyon yanı sıra çapraz bağlama süresi kullanılabilir9,14. Formaldehit yüzdesi olarak zaman arttıkça, bu nedenle özel olmayan etkileşimlerin oluşturulması olasılığını dikkate almak önemlidir. Multimerik kompleksin aşağı yukarı onayı da gereklidir. Kompleks bir heteromultimerik ise, moleküler ağırlığı ve kimliği belirlemek için yararlı bir teknik, kütle spektrometresi olduğunu. Ayrıca, site yönlendirilmiş mutagenez disülfür bağlantı sorumlu sistein kalıntılarının belirlemek için uygun bir teknik olabilir.
Son olarak, bu iki aşamalı olmayan SDS-PAGE Analizi ve formaldehit çapraz bağlama doğrulama yöntemi, teknik kolaylığı ve düşük maliyeti nedeniyle yararlıdır. Bu disülfit bağlantıları ile stabilize multimerik kompleksleri açığa ilk adım olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu makalenin içeriğiyle ilgili çatışmalara sahip olmadıklarını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu taslağı düzenlemeye yardımcı olmak için tüm çabalarını dutpase poliklonal antikor ve Kerri ciccaglione arıtma için Dr Jennifer Fischer tarafından ileriye koymak çabaları minnettarız. Bu araştırma kısmen New Jersey Sağlık Vakfı (Grant #PC 11-18) bir hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
| Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
| Bromophenol Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
| Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Drill | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
| Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
| Glass-teflon homogenizer | |||
| Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glycine | RPI | 636050 | |
| Heat block | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
| Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Methanol | Pharmco | 339000000 | |
| Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-click tube | Denville | C2170 | |
| Power supply | Biorad | 200120 | |
| Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
| Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
| Sodium chloride | RPI | S23020 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
| Stir plate | Corning | PC353 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ray film | ThermoFisher | 34090 |
References
- Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B.
- Antelmann, H., Helmann, J. D. Thiol-based redox switches and gene regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).
- Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins. Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).
- Groitl, B., Jakob, U.
- Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha. Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).
- Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. Protein disulfide bond determination by mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).
- Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).
- Kelly, S. M., Price, N. C. The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function. Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
- Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585 (2010).
- Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).
- Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut). Protein Science. , (2018).
- Caradonna, S., Muller-Weeks, S. The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity. Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).
- Macpherson, L. J., et al. Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines. Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T.
