从鸡蛋蛋黄中分离脂蛋白颗粒以研究细菌病原体脂肪酸向膜磷脂的掺入

摘要

该方法为研究复杂宿主来源中外源性脂肪酸掺入细菌膜（特别是Staphylococcus aureus）提供了框架。为此，本文描述了从鸡蛋蛋黄中富集脂蛋白颗粒的方案，以及利用质谱技术对细菌磷脂进行脂肪酸谱分析的方法。

摘要

Staphylococcus aureus 及其他革兰氏阳性病原菌可将环境中存在的脂肪酸整合到膜磷脂中。在感染过程中，外源性脂肪酸主要存在于宿主的脂蛋白颗粒内。目前尚不明确宿主脂肪酸的具体储存库，以及细菌从脂蛋白颗粒中获取脂肪酸的作用机制。本研究中，我们描述了从鸡蛋蛋黄中富集低密度脂蛋白（LDL）颗粒的实验方案，并验证LDL是否可作为S. aureus的脂肪酸来源。该方法利用非偏向性脂质组学分析和鸡源LDL——一种研究LDL与细菌相互作用的有效且经济的模型系统。通过高分辨率/精确质量质谱和串联质谱技术，分析S. aureus从LDL中整合外源性脂肪酸的情况，从而表征细菌膜的脂肪酸组成，并非偏向性地鉴定细菌膜脂质在暴露于LDL后所产生的新型脂肪酸组合。这些先进的质谱技术能够揭示被整合至磷脂中的特定外源性脂肪酸，为研究脂肪酸的摄取提供了前所未有的视角。本文所述方法可推广应用于其他细菌病原体及复杂脂肪酸不同来源的研究。

引言

耐甲氧西林S. aureus（MRSA）是医疗机构相关感染的首要致病原因，其伴随的抗生素耐药性构成了重大的临床挑战^1,2,3。因此，开发新型治疗策略具有高度优先性。针对革兰氏阳性病原菌的一种有前景的治疗策略是抑制脂肪酸合成，该过程是膜磷脂生成所必需的，在S. aureus中包括磷脂酰甘油（PG）、赖氨酰-PG和心磷脂⁴。在细菌中，脂肪酸的生成通过脂肪酸合成II途径（FASII）进行⁵，该途径与真核生物中的对应途径存在显著差异，使得FASII成为抗生素开发的有吸引力靶点^5,6。FASII抑制剂主要靶向FabI，即脂肪酸碳链延长所必需的一种酶⁷。FabI抑制剂三氯生被广泛用于消费品和医疗用品中^8,9。多家制药公司正在开发其他FabI抑制剂，用于治疗S. aureus感染^{10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}。然而，许多革兰氏阳性病原菌（包括S. aureus）能够摄取外源性脂肪酸用于磷脂合成，从而绕过FASII的抑制作用^27,28,29。因此，由于我们对宿主脂肪酸来源以及病原体从宿主提取脂肪酸的机制仍存在显著认知空白，FASII抑制剂的临床潜力仍存在争议^27,28。为填补这些空白，我们开发了一种无偏倚的脂质组学分析方法，用于监测S. aureus膜磷脂中外源性脂肪酸从脂蛋白颗粒中的整合情况。

在脓毒症期间，宿主脂蛋白颗粒可作为血管系统内宿主来源脂肪酸的潜在来源，因为大多数宿主脂肪酸均与这些颗粒相关³⁰。脂蛋白由磷脂和蛋白质组成的亲水性外壳包裹着甘油三酯和胆固醇酯的疏水性核心构成³¹。宿主产生四类主要的脂蛋白——乳糜微粒、极低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白（LDL），它们作为脂质运输载体，通过血管系统将脂肪酸和胆固醇递送至宿主细胞或从宿主细胞运出。LDL富含酯化脂肪酸，包括甘油三酯和胆固醇酯³¹。我们先前已证明，高度纯化的人源LDL可作为PG合成所需的外源性脂肪酸的有效来源，从而提供一种FASII抑制剂绕过机制³²。纯化人源LDL在技术上具有挑战性且耗时较长，而商业来源的纯化人源LDL价格昂贵，难以常规使用或用于大规模细菌筛选。为克服这些局限性，我们改进了一种从鸡卵黄中富集LDL的方法，卵黄是脂蛋白颗粒的丰富来源³³。我们已成功利用非靶向、高分辨率/精确质量质谱及串联质谱技术，监测人源LDL来源的脂肪酸掺入S. aureus细胞膜的过程³²。与以往报道的方法不同，该方法可对三种主要葡萄球菌磷脂类型的每一种中的单个脂肪酸异构体进行定量。油酸（18:1）是一种不饱和脂肪酸，存在于所有宿主脂蛋白颗粒中，并可被S. aureus readily 掺入其磷脂中^29,30,32。S. aureus无法自身合成油酸²⁹；因此，磷脂中掺入的油酸含量可反映葡萄球菌细胞膜中存在宿主脂蛋白来源的脂肪酸²⁹。这些磷脂种类可通过本文所述的先进质谱方法进行鉴定，从而以前所未有的分辨率揭示S. aureus在感染过程中可能遇到的脂肪酸来源存在条件下培养时的细胞膜组成。

方案

注意：以下从鸡蛋蛋黄中富集低密度脂蛋白（LDL）颗粒的实验方案源自 Moussa 等人 2002 年的研究³³。

1. 准备鸡蛋黄以富集低密度脂蛋白颗粒

1. 用70%乙醇溶液清洗两个大型鸡蛋的蛋壳以进行消毒，并使其自然风干。
2. 使用70%乙醇溶液对蛋清分离器进行消毒，并使其自然风干。将蛋清分离器固定在中等大小烧杯的边缘。
3. 将每个鸡蛋单独打入蛋清分离器中，使蛋清流入烧杯，完整的蛋黄则被分离器保留。
4. 用30 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗蛋黄两次，以去除残留的蛋清。
5. 将蛋黄轻轻放置在滤纸上。
6. 用无菌移液器吸头刺破卵黄膜，将膜内内容物排入无菌的50 mL锥形离心管中。弃去卵黄膜和滤纸。

2. 从鸡蛋蛋黄中分离含低密度脂蛋白（LDL）的血浆组分

1. 向蛋黄中加入约两倍体积的 0.17 M NaCl（pH 7.0），并剧烈混合。然后在 4 °C 下搅拌该溶液 60 分钟。
2. 在 10 °C 下以 10,000 x g 离心蛋黄稀释液 45 分钟。将血浆组分（上清液）从颗粒组分（沉淀）中分离，转移至无菌的 50 mL 锥形管中。
3. 重复步骤 2.2。

3. 从血浆中分离低密度脂蛋白颗粒

1. 在 4 °C 条件下，将血浆组分与 40%（w/v）硫酸铵混合，持续 60 分钟。
2. 使用 420 mM 氢氧化钠溶液将血浆组分的 pH 值调节至 8.7。
3. 在 4 °C、10,000 × g 条件下离心蛋黄稀释液 45 分钟。将上层半固体黄色组分转移至孔径为 7 kDa 的透析管中，并在管中预留空间以允许其膨胀。
4. 在 3 L 超纯水中于 4 °C 透析过夜，以去除硫酸铵。使用搅拌子轻轻搅动水。
5. 将透析后的溶液转移至无菌的 50 mL 锥形离心管中。
6. 在 4 °C、10,000 × g 条件下离心该溶液 45 分钟。小心地将上层半固体黄色组分转移至无菌管中，并在 4 °C 下保存。

4. 评估鸡 LDL 作为脂肪酸来源

1. 将S. aureus细胞接种于5 mL无脂肪酸的1%胰蛋白胨肉汤中，于37 °C振荡培养（225 rpm）过夜。对于脂肪酸营养缺陷型菌株，需在培养基中添加脂肪酸来源进行补充。
2. 将过夜培养物用1%胰蛋白胨肉汤稀释至600 nm处的光密度（OD₆₀₀）为0.1。用移液器将50 μL菌液加入圆底96孔板的每个孔中。
   注意：处理脂肪酸营养缺陷型菌株时，在测定菌液OD值前，需用两倍体积的胰蛋白胨肉汤洗涤过夜培养物，并重悬于5 mL胰蛋白胨肉汤中，以减少脂肪酸的残留。
3. 对于未处理对照组所在的孔，每孔加入50 µL 1%胰蛋白胨肉汤。
4. 对于含有实验组菌悬液的孔，每孔加入50 µL含有10%卵黄来源低密度脂蛋白（LDL）、2 μM三氯生，或同时含有10%卵黄来源LDL和2 μM三氯生的1%胰蛋白胨肉汤。
   注意：此时每个孔的总体积为100 μL，卵黄来源LDL和三氯生的终浓度分别为5%和1 µM。
5. 使用设定为37 °C并带有连续线性振荡功能的酶标仪，随时间测定OD₆₀₀以监测细菌生长情况。

5. 用于膜脂质分析的S. aureus与低密度脂蛋白（LDLs）孵育。

1. 将分离的单菌落接种于5 mL无脂肪酸的1%胰蛋白胨液体培养基中，37 °C、225 rpm振荡培养过夜。
2. 将过夜培养物按1:100比例稀释，接种于含50 mL 1%胰蛋白胨液体培养基的无菌250 mL带挡板三角瓶中，37 °C振荡培养至对数中期（约4小时）。
3. 取25 mL培养物转移至无菌50 mL离心管中，离心收集菌体。弃上清，将菌体沉淀重悬于750 µL 1%胰蛋白胨液体培养基中。
4. 将重悬后的菌液混合均匀，分装300 µL至无菌1.5 mL离心管中。
5. 加入低密度脂蛋白（LDLs）至所需终浓度，37 °C、225 rpm振荡孵育4小时。
6. 4 °C、16,000 x g 离心2分钟，收集菌体，用两倍体积无菌PBS洗涤菌体沉淀，重复一次。
7. 称量每份湿菌体沉淀的重量。将菌体沉淀在干冰或液氮中迅速冷冻，于-80 °C保存，或直接进入第6节操作。

6. 提取 S. aureus 膜脂质

1. 将冻存的 S. aureus 细胞沉淀置于干冰上。在每个细胞沉淀上加入0.5 mm的氧化锆珠，珠子的体积大约等于细胞沉淀的体积。
   注：作为该脂质提取方法的替代方案，研究人员可以采用已确立的Bligh和Dyer法或Folch法从细菌细胞中精确提取脂质³⁴。
2. 向细胞沉淀中直接加入740 µL预冷至-80 °C的75%甲醇（HPLC级）。
3. 每1 mg细胞加入2 μL用甲醇配制的50 µM二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱作为内标。盖紧试管，将含有各样品的1.5 mL离心管插入Bullet Blender组织匀浆仪的可用孔位中。以低速（设定2-3级）匀浆3分钟。
4. 目视检查样品的均一性。若可见细胞团块，则在Bullet Blender中继续匀浆，每次增加2分钟。
5. 从Bullet Blender中取出样品，转移至化学通风橱中。
6. 向每个样品管中加入270 µL氯仿。剧烈涡旋震荡样品30分钟。
   注意：氯仿可能具有致癌性。
7. 在台式离心机中以至少2,000 x g 离心最多30分钟。若使用兼容的离心管，可采用更高速度，并将离心时间缩短至10分钟。
8. 在化学通风橱中，收集单相上清液并转移至新的试管中，注意避免吸入提取管底部的蛋白沉淀。
9. 向蛋白沉淀中加入740 µL 75%甲醇（HPLC级）和270 µL氯仿，按照上述步骤6.6–6.8所述方法重新提取每个样品。将第二次提取所得的上清液与之前收集的上清液合并。
10. 在惰性气体（如氮气或氩气）气流下或使用离心浓缩仪（材料表）在真空条件下蒸发提取溶剂。
11. 用1.0 mL水相10 mM碳酸氢铵溶液洗涤干燥的脂质提取物三次，并按照步骤6.10的方法重新干燥样品。
12. 将干燥的脂质提取物重悬于合适的非极性溶剂（如异丙醇）中。根据步骤5.7测定的每1 mg新鲜细胞重量使用20 µL溶剂重悬样品。或者，若细胞沉淀重量未知，则将样品重悬于200 µL异丙醇中，并继续进行第7节操作。

7. 分析 S. aureus 使用高分辨率/高精度质谱法进行脂质谱分析

1. 在进行完整的脂质分析之前，从实验组中选取具有代表性的测试样品，并在一系列样品稀释倍数下进行分析，以确定样品总脂质浓度处于质谱仪检测器响应线性范围内的稀释范围，具体方法如前所述³⁵。
2. 将用于脂质分析的各样品脂质提取液等分试样在惰性气体下或使用离心浓缩仪在真空条件下干燥，以蒸发溶剂（材料表）。
3. 将每份干燥的脂质提取物重新悬浮于含有20 mM甲酸铵的液相色谱-质谱（LC-MS）级异丙醇:甲醇（2:1, v:v）溶液中，所用体积应相当于步骤7.1中确定的最佳样品稀释倍数。
4. 对于非靶向脂质分析，样品可通过流动注射或直接进样方式直接引入高分辨/准确质量质谱平台，无需色谱分离^35,36。将步骤7.3中制备的稀释脂质提取液转移至合适的自动进样瓶或96孔板中。
5. 对于基于流动注射的分析，将自动进样瓶放入可进行毛细管/低流速应用的高效液相色谱（HPLC）系统（材料表）的温控（15 °C）自动进样器中，该系统需配备电子流量比例调节和流量监测装置。
6. 用含有20 mM甲酸铵的LC-MS级异丙醇:甲醇（2:1, v:v）填充HPLC溶剂储液瓶。
7. 使用Agilent Chemstation软件，设置HPLC自动进样器进行5 µL样品进样。在仪器菜单中选择设置进样器，在“进样体积”字段中输入5.0，单位为微升。确保HPLC设置为等度洗脱，流动相为含20 mM甲酸铵的2:1（v:v）异丙醇:甲醇，流速为1 µL/min。
8. 在Chemstation的仪器菜单中选择设置泵…，然后选择微流模式切换开关。
9. 在时间表字段中输入：时间 0.00，100% B，流速 1.0。按回车键，并通过输入时间 10.0，100% B，流速 1.0创建第二行时间表。点击设置泵菜单底部的确定按钮。这些设置将实现10次分析运行，流速为1.0 µL/分钟。
10. 使用配备低流速（34 G）金属针的电喷雾电离源，将HPLC传输管线中的洗脱液引入质谱仪。
11. 使用Thermo Tune Plus仪器控制软件，选择设置菜单并选择加热式ESI源。在对话框的相应字段中输入离子化电压为4000 V，鞘气为5（任意单位）。同样地，将毛细管温度设为150 °C，S透镜设为50%。
    注意：这些参数需针对每种质谱平台进行优化。
12. 对于非靶向脂质分析，使用高分辨/准确质量质谱平台（材料表）作为检测器。
13. 使用Thermo Tune Plus软件，点击定义扫描按钮，在分析器菜单中选择FTMS。将质量范围字段设为正常，在分辨率字段中选择100,000。确保扫描类型设置为全扫描。在扫描范围菜单下，在起始质量（m/z）字段中输入200，在终止质量（m/z）字段中输入2000。
14. 确保使用负离子模式以检测最丰富的S. aureus脂质。
15. 为确认脂质结构及脂肪酸组成，重复样品分析，采用离子映射串联质谱（MS/MS）对目标质谱区域内所有脂质离子进行碎裂分析。或者，在第8节完成初步脂质鉴定后，可对感兴趣的特定脂质离子进行MS/MS分析。

8. 数据库搜索以鉴定内源性S. aureus和外源性LDL来源的脂质

1. 使用 Thermo Xcalibur 软件进一步优化观测质量精度。在 Xcalibur 中，位于 工具 菜单，选择 离线重新校准。在 离线重新校准 窗口打开后，通过选择要重新校准的质谱文件进行加载 文件 菜单并选择 开放 选项
2. 打开感兴趣的文件，切换 插入行 单击视图窗口顶部的按钮，查看质谱运行的总离子色谱图。在总离子色谱图中，用鼠标左键单击所观测信号峰的一侧边缘，然后将鼠标拖动至峰最宽处，以对采集到的质谱信号进行平均。
3. 在……之下 扫描滤光片 菜单中，选择对应于全扫描质谱数据的滤镜。加载一个参考文件，其中包含至少三种已知物质的理论单同位素质量 S. aureus 通过选择内源性脂质 加载参考… 按钮并选择参考文件。检查 使用 每个脂质单一同位素质量旁的方框。
4. 点击 搜索 查看窗口底部的按钮。像之前一样，在总离子色谱图的信号峰范围内重新对质谱信号进行平均。
5. 点击 转化 视图窗口底部附近的按钮。当 转化 对话框打开后，单击 好的如果数据是在非赛默飞世尔科技（Thermo Scientific）的质谱平台采集的，则省略此步骤。
6. 使用 Xcalibur 软件，将每个未经处理或经 LDL 处理的样品的重新校准精确质量峰列表导出至 Excel 文件的不同工作表中。选择 Qual Browser 图标。通过选择感兴趣的重新校准文件来打开该文件 文件 菜单并选择 打开… 选项
7. 按照第8.2步所述，对总离子色谱图中宽峰范围内的信号取平均值。
8. 右键单击质谱图查看窗口中的图钉图标，然后选择 查看 | 光谱列表. 从同一菜单中选择 显示选项 然后 所有峰 切换框中的 显示 菜单。单击 好的 关闭查看窗口按钮。
9. 再次右键单击质谱图查看窗口中的图钉图标，然后选择 导出 | 剪切板（精确质量）将导出的数据粘贴到新 Excel 工作簿第一个工作表的 A1 单元格中。
10. 删除导出数据文件的前8行文本，使得Excel电子表格的A1单元格包含质谱中的第一个质荷比数据点。对每个重新校准的质谱文件重复导出操作，每个导出的峰列表使用Excel文件中的一个新工作表。
11. 使用脂质质谱分析（LIMSA）软件³⁷ Excel 加载项，构建包含已知分子式的数据库 S. aureus 如 Hewelt-Belka 等人所述的脂质种类. 2014³⁸以及可能存在于LDL中的脂质种类的分子式。
    注意：此外，在数据库中应考虑包含可能的分子式，以涵盖已整合主要低密度脂蛋白脂肪酸（如油酸（18:1）和亚油酸（18:2））的假定细菌脂质。³².
12. 构建数据库时，打开一个空白的 Excel 工作表。在第一个工作表的 A1 单元格中，输入待添加至数据库的脂质种类的理论/计算单同位素质量，该质量对应于质谱仪中检测到的脂质种类离子状态的质量。在 B1 单元格中，输入该脂质种类的名称，例如 PG(34:0)。
13. 在 C1 单元格中输入脂质种类的分子式，该分子式需对应质谱仪中观察到的脂质离子状态。在 D1 单元格中输入质谱仪中观察到的脂质种类电荷数。移至 A2 单元格，开始输入下一个待录入可搜索数据库的脂质种类新条目。
14. 重复步骤 8.12 和 8.13，直至所有目标脂质种类均已录入数据库。保存数据库文件，并保持其在 Excel 中打开状态。
15. 在 Excel 中，选择 加载项 菜单中选择 LIMSA 启动LIMSA软件。从主菜单中，点击 化合物库 按钮。在出现的新窗口中，单击 导入化合物这将上传化合物数据库，供LIMSA软件使用。
16. 根据厂商说明，使用 Excel 的 LIMSA 软件插件对所有质谱谱图进行基于精确质量数的脂质鉴定³⁵从 LIMSA 主菜单中选择 峰列表 在……之下 光谱类型 菜单。选择 正离子模式 或 负离子模式 以匹配质谱数据采集时的极性。
17. 在 峰宽半高（m/z） 窗口，输入峰检测所需的质荷比搜索范围。对于高分辨率/精确质量的质谱数据，建议采用0.003–0.005 m/z的质荷比容差搜索窗口。
18. 在 灵敏度 窗口中输入所需的基线截断值（例如，0.01% 相对丰度）。在 同位素校正 菜单，选择 线性拟合 或 减去 算法，两者均可与峰列表数据一起使用。
19. 通过点击数据库搜索中要包含的目标脂质种类来高亮显示脂质化合物 可获取的化合物 窗口。单击 添加 单击按钮，将高亮的脂质种类添加到搜索组中。
20. 通过点击添加的化合物并更改内部标准 浓度 对应内标物浓度的窗口
21. 确保内标物与待定量的目标脂质种类属于相同的类别名称，方法是选择每种添加的脂质种类和内标物，并在“类别”字段中输入类别名称（如 PG 或 Lipid）。
22. 要保存可搜索的脂质化合物组以供将来使用，请点击 保存 按钮旁边的下一个 组别 菜单
23. 确保包含所有导出的质谱峰列表的 Excel 文件已打开，并显示对应于第一个的表格 S. aureus MS 运行，然后单击 搜索 从 LIMSA 主菜单中点击按钮。
    注意：LIMSA 数据库搜索结果将包含与步骤 8.12–8.13 中构建的数据库中脂质相匹配的质谱特征列表，以及在对一个或多个选定的内标进行归一化后，每个匹配特征的浓度。
24. 使用 Xcalibur 软件分析对应于目标脂质离子的 m/z 准确质量 MS/MS 谱图，以确认各鉴定脂质分子种类中存在的脂肪酸组成成分。选择 Qual Browser 打开感兴趣的MS/MS文件，方法是选择 文件 下拉菜单并选择 打开… 选项
25. 在质谱图查看窗口中，通过右键单击图钉图标，选择与目标脂质 m/z 的 MS/MS 分析相对应的扫描过滤器 范围 从菜单中。在出现的新窗口中，选择 过滤 菜单中选择扫描。
26. 对总离子流色谱图中的信号进行平均，具体操作如步骤8.2所述。使用MetaboAnalyst（www.metaboanalyst.ca）软件进行适当的统计学检验。评估具有统计学意义的差异 S. aureus 通过比较未经处理和经LDL处理条件下标准化后的脂质丰度来分析脂质组成。

结果

从鸡蛋蛋黄中富集低密度脂蛋白（LDL）的实验方案如图1所示。该过程首先用生理盐水稀释全蛋黄，将蛋黄中的固体成分（称为颗粒）与含有LDL的可溶性或血浆组分分离（图1）³³。通过沉淀分子量约为30–40 kDa的β-卵黄蛋白（β-livetins），可进一步富集血浆组分中的LDL含量（图2）³³。在140、80、65、60和15 kDa处出现的蛋白条带与LDL的载脂蛋白相对应（图2）^33,39。三氯生（triclosan）可在无脂肪酸培养基中抑制S. aureus的生长³²

讨论

S. aureus 可将外源性脂肪酸整合到其膜磷脂中^27,32,43。利用外源性脂肪酸进行磷脂合成可绕过FASII的抑制作用，但也会改变膜的生物物理特性^27,32,44。尽管外源性脂肪酸整合入革兰氏阳性病原菌磷脂的过程已有充分记载，但关于宿主脂肪酸储存库的具体身份，以及外源性脂肪酸整合后对金黄色葡萄球菌三种主要磷脂类型的结构改变，目前仍存在研究空白。本文描述了可用于以下目的的实验方案：i）从鸡蛋蛋黄中富集低密度脂蛋白（LDL）颗粒，作为脂肪酸来源；ii）测定外源性脂肪酸对S. aureus生长的影响；以及iii）采用非偏倚的脂质组学分析方法，监测外源性脂肪酸在S. aureus膜磷脂中的整合情况。本研究提供的先进质...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硫酸铵	Fisher	BP212R-1	≥99.5% 纯度
细胞培养箱	Thermo	MaxQ 6000
离心机	Thermo	75-217-420	Sorvall Legen XTR，转子 F14-6x250 LE
Costar 检测板	Corning	3788	96 孔
滤纸	Schleicher & Schuell	597
大型鸡卵	N/A	N/A	普通市售鸡蛋
微孔板分光光度计	BioTek	Epoch 2
NaCl	Sigma	S9625
S. aureus 菌株 AH1263	N/A	N/A	由科罗拉多大学 Alex Horswill 提供
透析管	Pierce	68700	截留分子量 7,000
胰蛋白胨	Becton, Dickison and Company	211705
0.5 mm 氧化锆珠	Next Advance	ZROB05
Bullet Blender 匀浆仪	Next Advance	BBX24B
甲醇（LC-MS 级）	Fisher	A4561
氯仿（试剂级）	Fisher	MCX10559
异丙醇（LC-MS 级）	Fisher	A4611
二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱	Avanti Polar Lipids	850345C-25mg
碳酸氢铵	Sigma	9830	≥99.5% 纯度
甲酸铵	Sigma	70221-25G-F
Xcalibur 软件	Thermo Scientific	OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos 质谱仪	Thermo Scientific		高分辨率/精确质量质谱
Agilent 1260 毛细管高效液相色谱仪	Agilent
SpeedVac 真空浓缩仪	Thermo Scientific