Summary
여기서, 시안박테리아 방출 된 탄수화물 중합체의 분리 및 그들의 엑소프로테옴의 격리에 대한 프로토콜이 설명된다. 두 절차 모두 추가 분석 또는 응용 분야에 사용할 수 있는 고순도의 중합체 또는 단백질을 얻기 위한 주요 단계를 구현합니다. 또한 특정 사용자 요구에 따라 쉽게 조정할 수 있습니다.
Abstract
시아노박테리아는 이종대당및단백질과같은세포외환경으로광범위한생체분자를능으로분비할수있습니다. 이 생체 분자의 확인 및 특성화는 그들의 분비 경로에 대한 지식을 향상시키고 그(것)들을 조작하는 것을 도울 수 있습니다. 또한, 이러한 생체 분자 중 일부는 생명 공학 응용 분야에서도 흥미롭습니다. 여기서 설명된 것은 시안박테리아 방출 탄수화물 중합체 및 단백질의 쉽고 신속한 분리를 위한 두 가지 프로토콜이다. 방출된 탄수화물 중합체의 분리 방법은 유기 용매를 사용하는 수성 용액에서 다당류의 기존 침전 기술을 기반으로합니다. 이 방법은 중합체의 특성을 보존하고 동시에 세포 파편 및 배양 배지에서 오염 물질의 존재를 방지한다. 공정의 끝에서, 용약화된 중합체는 최종 의도된 용도에 따라 사용 되거나 특성화될 준비가 되거나 추가의 정제를 실시할 수 있다. 시아노박테리아 엑소프로테오메의 분리에 관해서는, 이 기술은 원심분리 및 여과에 의한 주요 오염물질을 제거한 후 무세포 배지의 농도에 기초한다. 이 전략은 막 수송기 또는 외부 막 소포를 통해 세포외 milieu에 도달하는 단백질의 믿을 수 있는 격리를 허용합니다. 이 단백질은 표준 질량 분석 기술을 사용하여 이후에 확인될 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 광범위한 시아노 박테리아뿐만 아니라 다른 박테리아 균주에도 적용 될 수 있습니다. 더욱이, 이러한 절차는 제품의 최종 사용, 필요한 순도 및 세균 균주에 따라 용이하게 맞춤화될 수 있다.
Introduction
시아노박테리아는 유망한 생명공학/생명의학 응용 분야와 함께 천연 제품의 다산 공급원으로 널리 인정받고 있습니다. 따라서, 시아노박테리아 분비 메커니즘을 이해하고 추출/회수 방법의 최적화는 효율적인 미생물 세포 공장으로서 시아노박테리아를 구현하는 데 필수적입니다.
많은 시아노박테리아 균주는 주로 이종대당에 의해 형성된 세포외 고분자 물질(EPS)을 생성할 수 있으며, 이는세포 표면과 연관되거나 배지 1로 방출된다. 이 방출된 탄수화물 중합체는 다른 박테리아에서 그들에 비해 명백한 특징을 가지고 있습니다, 이는 응용의넓은 범위에 적합하게 (예를 들어, 항 바이러스 2, 면역 자극3,항산화44) 금속 킬레이트5, 유화6, 약물 전달 제7,8). 이들 중합체의 분리를 위한 방법론은 크게 수율 향상뿐만 아니라 수득된 폴리머의 증가된 순도 및 특이적 물성에기여한다. 중합체의 분리를 위한 이들 방법의 대부분은 중합체의 강한 음이온 성질9,10으로인해 쉽게 달성되는 배양 배지로부터의 침전 전략에 의존한다. 또한, 침전 단계에서 사용되는 용매의 제거는 증발 및/또는 호혜화에 의해 급속히 달성될 수 있다. 예측 된 응용 프로그램에 따라, 다른 단계는 트리클로로 아세트산 (TCA) 처리, 여과, 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 포함하는 최종 제품을 맞추기 위해 중합체 침전 후 또는 전에 결합 될 수있다 열 정제10.
시아노박테리아는 또한 막 수송기(classical)(11) 또는 소포(non-classical)에 의해 매개되는 경로를 통해 광범위한단백질을 분비할 수 있다(12). 따라서, 시아노박테리아 엑소테오솜의 분석은 시아노박테리아 단백질 분비 메커니즘을 이해하고 조작하고 이들 단백질의 특정 세포외 기능을 이해하는 데 필수적인 도구를 구성한다. 탈전의 신뢰할 수있는 격리 및 분석은 분비 된 단백질의 풍부가 상대적으로 낮기 때문에 세포 외 밀리외의 농도를 필요로합니다. 또한, 다른 물리적 또는 화학적 단계(예를 들어, 원심분리, 여과 또는 단백질 침전)는 얻어진 엑소테오므의 품질을 최적화할수 있고, 단백질 함량을 풍부하게 하고, 오염물질의 존재를 피할 수 있다(예를 들어, 안료, 탄수화물 등) 14세 , 샘플에서 세포내 단백질의 우위 또는 15. 그러나, 몇몇은의 이 단계는 또한 편향된 분석으로 이끌어 내는 검출될 수 있는 단백질의 세트를 제한할 수 있습니다.
이 작품은 시안박테리아 배양 배지로부터 방출된 탄수화물 중합체 및 엑소프로테옴의 분리를 위한 효율적인 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 여기에 제시된 기본 단계를 유지하면서 연구의 특정 목표및 사용자 요구에 쉽게 적응할 수 있습니다.
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Protocol
1. 시아노박테리아 방출 탄수화물 폴리머 분리
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폴리머 분리 및 오염 물질 제거
- 표준 조건하에서 시아노박테리아 균주를 배양[예를 들어, 12h 빛 하에서 30°C(50 μEm-2s-1)/12h 암흑 요법, 150 rpm에서 궤도 흔들림]. 표준 프로토콜을 이용한 성장을 측정[예를 들어, 730 nm(OD730nm)에서의광학 밀도), 엽록소 a,건식 중량 등], 페놀-황산 방법에 따라 방출된 다당류의 생산을 측정한다 16.
- 배양을 투석 막(분자량 컷오프의 12-14 kDa)으로 옮기고 연속 교반을 통해 24시간 동안 최소 10부량의 탈이온수에 대해 투석을 합니다.
참고 : 투석 및 중간 조성물에 대한 배양량에 따라 투석 수를 변경해야 할 수도 있습니다. - 4°C에서 15분 동안 15,000 x g에서 배양한다. 상급체를 새로운 바이알로 옮기고 펠릿(세포)을 버린다.
- 다시 20,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리를 하여 세포벽 파편 또는 리포폴리당류(LPS)와 같은 오염물질을 제거한다.
- 상급자를 유리 비커로 옮기고 펠릿을 버립니다.
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중합체의 침전
- 상급체에 96% 에탄올 2부 볼륨을 추가합니다.
- 적어도 하룻밤 동안 4°C에서 현탁액을 배양한다.
- 폴리머 회수
- 침전 된 폴리머의 작거나 눈에 보이지 않는 양의 경우 : 4 °C에서 25 분 동안 13,000 x g에서 현탁액을 원심 분리합니다. 상급물을 버리고 1 mL 또는 2 mL의 오토 클레이브 탈이온수에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 수성 현탁액을 바이알로 옮김.
주의: 상급제는 쉽게 다시 일시 중단 될 수 있으므로 부드럽게 버려야합니다. - 가시적/다량의 침전된 폴리머의 경우: 멸균 금속 집게가 있는 침전된 폴리머를 바이알에 수집합니다. 중합체를 짜내고 여분의 에탄올을 버립니다.
- 침전 된 폴리머의 작거나 눈에 보이지 않는 양의 경우 : 4 °C에서 25 분 동안 13,000 x g에서 현탁액을 원심 분리합니다. 상급물을 버리고 1 mL 또는 2 mL의 오토 클레이브 탈이온수에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 수성 현탁액을 바이알로 옮김.
- 선택 사항: 필요한 중합체 정제 정도에 따라, 탈이온수에서 폴리머를 재증탁한 후 96% 에탄올로 침전 단계를 반복한다.
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중합체의 부호 애용
- 침전된 폴리머를 가진 바이알을 -80°C, 적어도 하룻밤 사이에 유지한다.
- 적어도 48 시간 동안 폴리머를 동결 건조 (lyophilize)(동결 건조 전에 현탁액을 해동시키지 마십시오).
- 건조된 폴리머를 실온(RT)에 보관하여 추가 로 사용하십시오.
참고: 시간이 지남에 따라 물을 흡수할 수 있으므로 폴리머를 건조기에 보관하는 것이 좋습니다.
2. 시아노박테리아 엑소프로테오메 분리
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중간 농도
- 표준 조건하에서 시아노박테리아를 배양[예를 들어, 12시간 빛 하에서 30°C(50 μEm-2s-1)/12h 암흑 요법, 150 rpm에서 궤도 흔들림]. 표준 절차 (예 : OD730nm,엽록소 a, 건조 중량 등)를 사용하여 시아노박테리움 성장을 모니터링하십시오.
- RT에서 10 분 동안 4,000 x g의 배양액을 원심 분리합니다.
- 상급자를 플라스크에 옮기고 세포 펠릿을 버립니다.
- 0.2 μm 기공 크기 필터를 통해 디캔트 된 배지를 필터링합니다.
참고: 배지가 4°C로 유지되는 경우, 프로토콜은 짧은 기간 동안 여기서 일시 중지될 수 있다. - 3 kDa의 명목 분자량 차단을 가진 원심 농축기를 사용하여 약 500x (여과 된 매체의 초기 부피를 고려)에 매체를 집중시다. 원심분리는 15 °C에서 4,000 x g (최대 1 시간 의 원심 분리 라운드)에서 작동해야합니다.
주의: 대부분의 농축기 브랜드의 경우, 필터 장치는 사용하기 전에 초순수로 원심분리하여 헹구어야 합니다. 필터가 젖으면 건조시키지 마십시오. 장치를 사용하지 않을 때는 저장소에 충분한 액체를 두십시오.
참고: 원심분리 온도를 4°C로 낮추면 단백질 활성을 연구하는 것이 도움이 될 수 있지만, 샘플 농도에 필요한 시간이 늘어납니다. 이 프로토콜은 배지가 4°C에서 유지되는 경우 짧은 기간 동안 원심분리 단계 사이에서 일시 중지될 수 있다. - 농축 된 샘플로 필터 장치 샘플 저장소의 벽을 헹구고 내용물기를 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김.
- 필터 장치 샘플 저장소의 추가 세척 단계를 오토클레이브 배양 배지로 수행하여 최대 외아 체회수를 보장합니다.
참고: 복구 비율을 정량화하려면 특정 제조업체의 지침을 따르십시오. - 외프로테오메 샘플을 추가 사용 전까지 -20°C에서 보관하십시오.
참고 : 장기간 보관에는 프로테아제 억제제첨가가 권장됩니다.
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외시 분석
- 제조업체의 지침에 따라 96웰 플레이트에서 BCA 단백질 분석법으로 단백질 함량을 정량화합니다.
- 나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해 단백질을 분리하고, 표준 염색 프로토콜(예를 들어, 쿠마시 블루, 은 염색)을 사용한다.
- 관심있는 밴드 / 젤 영역을 잘라 초순수의 적절한 볼륨을 포함하는 다른 미세 원심 분리튜브에서 수집합니다.
- 질량 분석법에 의한 단백질의 식별 및 분석을 진행합니다.
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Representative Results
시아노박테리아 배양물로부터 방출된 탄수화물 중합체를 추출하기 위해 기술된 방법의 개략적 표현은 도1에 도시되어 있다. 적당한 EPS 생산자시아노박테리움 시네시스ss. PCC 6803 및 효율적인 EPS 생산자 시아노테스 sp. CCY 0110으로부터의 침전된 중합체는 도2에 도시되어 있다. 그림3에서는 다른 오염 도를 가진 동색화된 폴리머가 도시되어 최종 제품 순도에 대한 원심분리 단계의 중요성을 강조합니다. 도 4는 시아노박테리아 외각에 대한 격리 방법을 도시한다. 뚜렷한 무세포 배지 농축 샘플(즉, 상이한 성장 단계의 배양물및 낮은 카로티노이드 생산을 가진 시아노박테리아 균주로부터 수득됨)은 도5에 나타내었다. 두 개의 형태학적으로 구별되는 시아노박테리아 균주로부터의 엑소프로테오메 샘플, 단세포 시아노박테리아 시네시스 sp. PCC 6803 및 필라멘트 시아노박테리아 아나바에나 sp. PCC 7120, SDS-PAGE로 구분된 그림 6.
그림 1 : 격리를 위한 워크플로우 시아노박테리아는 탄수화물 폴리머를 방출했다. 시아노박테리아 배양으로부터 시작하여 오염물질의 제거와 중합체 분리 및 동독화로 끝납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 침전 후 시아노박테리아 폴리머. (a) 적당한 EPS 생산자 시네시스리스에서 중합체 는 침전 및 원심분리 (화살표) 후 원심 분리기 플라스크의 벽에 PCC 6803. (b) 효율적인 EPS 생산자 시아노테스 sp. CCY 0110에서 고분자 덩어리가 침전 후 유리 비커에 떠있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 동색 시아노박테리아 폴리머. (A) Synechocystis sp. PCC 6803에서 분리된 3개의 독립적인 폴리머 배치: 눈에 보이는 오염(AI)및 카로티노이드(AII) 또는 세포 파편(AIII)으로 오염을 나타내는 색소 침착 . (B) 시아노테스 sp. CCY 0110에서 동포화 폴리머. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 워크플로우 시아노박테리아 엑소테오메 격리. 시아노박테리아 배양에서 중간 분리 및 농도에 이르기까지, 엑소프로테오메 분석으로 끝납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 무세포 배지 시료가 농축된 마이크로원심지 튜브. (a) Synechocystis sp. PCC 6803 야생형으로부터 농축배지 샘플을, 상이한 OD730nm(0.5, 1, 및 2)에서 수집하였다. (b) 시네시스에서 농축 배지 샘플 □sigF,손상된 카로티노이드 생산15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 시아노박테리아 무농축 배지에 축적된 단백질을 보여주는 쿠마시 블루 스테인드 SDS-PAGE 젤입니다. (a) 단세포 시아노박테리아로부터의 엑소프로테오메 시네시스 스p. PCC 6803 야생형 및 □시그F 돌연변이체. (B) 시네시스티스의 엑소프로테오메는 높은 수준의 다당류로 오염된시그F를 말한다. (C) 필라멘트 시아노박테리움 아나바에나 sp. PCC 7120으로부터의 엑소프로테오메. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
세균 분비 메커니즘을 더 잘 이해하고 방출된 제품을 연구하기 위해 세포외 세균 환경에 존재하는 생체 분자의 효율적인 격리 및 분석을 입증하는 것이 매우 중요합니다(예: 방출됨) 탄수화물 중합체 및 단백질).
시아노박테리아 세포외 탄수화물 중합체는 그들의 조성물을 구성하는 상이한 단당류의 수및 비율로 인해 극도로 복잡하다 1. 이러한 고분자 물질의 분리에 사용되는 기존의 방법은 이러한 설탕이 풍부한 물질이 수용성 용액에 용해되고 유기 용매 (예 : 아세톤 또는 에탄올)의 첨가에 의해 침전 될 수 있다는 단순한 개념에의존9 ,17,18. 이는 폴리머의 수화 쉘에서 물 분자를 추출하기 때문에 발생하며, 공정의 효율은 본질적으로 폴리머의 분자량(더 높은 분자량 분획에서 보다 효율적), 화학 적 구조 및 농도9,18. 강수 단계 이외에, 여기에 기술된 방법은 투석 및 원심분리의 중요한 단계를 포함한다. 투석은 분말과 같은 구조로 호우 필화 후 나타날 수있는 배지에서 염및 기타 화합물을 효율적으로 제거하고 원심 분리 단계는 주요 오염 물질과 세포 파편을 제거합니다.
이러한 단계 중 고장은 절연 배치에 따라 오염 수준이 높고 특성이 다른 폴리머로 이어질 수 있습니다. 일부 오염은 폴리머 색소 침착 (일반적으로 흰색 또는 밝은 갈색)을 변경하기 때문에 폴리머 용이성 접종 후 거시적으로 쉽게 감지 할 수 있습니다. 예를 들어, 녹색 또는 주황색인 용이성 고분자는 일반적으로 세포 파편/엽록소 또는 카로티노이드로 매우 오염됩니다. 이는 원심분리 단계에서 시간 또는 g 힘이 부족한 경우와 관련이 있습니다. 그러나, 일부 시아노박테리아 균주는 안료를 방출하고 고분자와 자연적으로 연관된 단백질을 분비할 수 있으며, 이는 최종 생성물(19)을 분석할 때 고려될 필요가 있다. 추가단계는 중합체(예를 들어, TCA 처리)를 추가로 정제하기 위해 첨가될 수있다(10). 그럼에도 불구하고, 이러한 정제 단계는 단백질 및 기타 성분을 제거하면 중합체 특성(예: 점도, 소수성 등)을 변경할 수 있기 때문에 최종 제품에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 1개 , 20. 강수량 / 동결 건조 단계를 반복하더라도 주로 물리 화학적 특성(21)을쉽게 변형시키는 동결 해동 주기로 인해 중합체에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 중합체 수율을 향상시키기 위해, 가열 처리는 강수 전에 전체 배양에 적용 될 수있다. 이러한 추가 단계는 세포 표면과 관련된 중합체를 방출하지만, 또한18,20을중합으로 이어질 수 있다. 요약하면, 프로토콜의 선택이 단리 된 중합체9,20의양 과 품질 모두에 영향을 미친다는 것을 주목하는 것이 중요하다.
세포외 밀리외에서 확인된 시아노박테리아 단백질에 관해서는, 그들은 광범위한 분자량 및 등전점을 표시하며 수용성 또는 막 연관이 있을 수 있다. 이러한 다양한 물리화학적 성질은 엑소프로테오메 격리에 가장 적합한 방법의 선택에 대한 문제점을 나타낸다. 여기에 제시된 방법은 세포외 군대에서 생체 분자의 농도에 크게 의존한다. 이 방법은 배지로 분비되는 단백질뿐만 아니라 외부 막 소포 (OMV)에 존재하는 단백질을 분리하고 세포 라해에서 파생됩니다. 따라서 세포 중단을 피하기 위해 원심 분리 단계를 부드럽게 수행해야하지만 동시에 AUV를 수집합니다. 효율적인 OMV 생산자인 시아노박테리아 균주에서, 엑소프로테옴 제제는 보통 이들 지질 구조와 관련된 카로티노이드의 존재로 인해 주황색이다14,15. 그러나, 이 특징은 시아노박테리아 균주 및 성장 기에 따라 상당히 달라질 수 있다. OMV에 의한 단백질의 기여도를 평가하기 위해, 초원심분리 단계는 절차22에추가되어야 한다. 더욱이, 세포 포리해로 인하여 세포외 공간에 도달하는 단백질은 상이한 성장 단계에서 견본을 수집하고 복제의 수를 증가해서 검출될 수 있습니다.
앞서 언급했듯이, 많은 시아노박테리아 균주가 세포외 탄수화물 고분자(EPS)를 생성하기 때문에, 엑소테오메 제제는 또한 그들의 조성물에 EPS를 가질 수 있었다. 여과 단계는 더 복잡하고 큰 EPS를 유지해야하지만, 간단한 EPS 분획은 결국 통과 할 수있다. 따라서 다량의 탄수화물로 오염하면 엑소테오메 분석을 방해할 수 있습니다. 예를 들어, 이러한 오염은 폴리아크릴아미드 겔의 단백질 분리지연을 야기할 수 있을 뿐만 아니라 덜 풍부한 단백질을 마스크할 수 있다. 세포외 배지에 존재하는 생체분자를 오염시키는 것을 목표로 하는 엑소프로테오메 격리에 대한 대체 프로토콜이 제안되었으나, 이들은 매우 선택적인 것으로나타났으며, 이는 편향된 엑소프로테오메 프로파일(13)으로 이어질 수 있다. 한편, 일정량의 단백질이 필터에 갇혀 있는 경우 보다 복잡한 EPS 분획에 갇혀 있을 수 있다. 이 경우, 다른 성장 단계/실험 조건에서 exoproteome 준비를 분석 뿐만 아니라 EPS 분획에 있는 단백질의 분석은 포획된 단백질을 확인하는 것을 도울 수 있습니다.
전반적으로, 여기에 기술된 프로토콜은 시안균 방출 된 탄수화물 중합체 및 엑소프로테옴의 효율적인 격리를위한 중요한 단계를 구현합니다. 가장 중요 한 것은, 그들은 쉽게 특정 사용자 요구에 따라 맞춤 될 수 있으며 다른 세균성 긴장을 포함.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 FUNdo Europeu de Desenvolvimento 지역 (FEDER) 기금을 통해 COMPETE 2020 - 경쟁력 및 국제화를위한 오페라 프로그램 (POCI), 포르투갈 2020, FCT를 통해 포르투갈 어 펀드에 의해 지원되었습니다 - Fundação para a Ciência e Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino 슈페리어 프로젝트 POCI-01-0145-FEDER-028779 및 보조금 SFRH/BD/99715/2014(CF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
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