Summary
Burada, siyanobakteryal serbest karbonhidrat polimerlerinin izolasyonu ve exoproteomlarının izolasyonu için protokoller açıklanmıştır. Her iki prosedür de, daha fazla analiz veya uygulama için kullanılabilecek yüksek saflık derecelerine sahip Polimerler veya proteinleri elde etmek için önemli adımları somutlaştırmak. Ayrıca, belirli kullanıcı ihtiyaçlarına göre kolayca adapte edilebilir.
Abstract
Siyanobacteria, heteropolizakkaritler ve proteinler gibi, geniş bir yelpazede biomolekülleri hücre içi ortama aktif olarak salgılasabilir. Bu Biomoleküllerin tanımlanması ve karakterize edilmesi, salgısı yolları hakkında bilgi geliştirebilir ve onları manipüle etmenize yardımcı olabilir. Ayrıca, bu biyomoleküllerin bazıları da biyoteknolojik uygulamalar açısından ilginç. Burada açıklanan cyanobacterial serbest karbonhidrat polimerleri ve proteinlerin kolay ve hızlı yalıtım için iki protokol vardır. Yayımlanan karbonhidrat polimerlerinin yalıtım yöntemi, organik çözücüler kullanarak sulu çözümlerde polisakkaritlerin geleneksel yağış tekniklerini temel alır. Bu yöntem polimer özelliklerini korur ve aynı anda hücre enkaz ve kültür ortamından kirleticilerin varlığını önler. Sürecin sonunda, liyofilize polimer kullanılmak üzere hazır veya karakterize veya son amaçlanan kullanıma bağlı olarak, arıtma daha fazla tur maruz kalabilirler. Cyanobacterial exoproteomun izolasyonu ile ilgili olarak, teknik, büyük kirleticilerin santrifüjleme ve filtrasyon ile kaldırılmasından sonra hücre içermeyen ortamın konsantrasyonuna dayanır. Bu strateji, membran taşıyıcıları veya dış membran veziküller üzerinden ekstrülüler ortama ulaşan proteinleri güvenilir bir şekilde yalıtmayı sağlar. Bu proteinler daha sonra standart kütle spektrometresi teknikleri kullanılarak tespit edilebilir. Burada sunulan protokoller sadece geniş bir siyanobacteria yelpazesine değil, aynı zamanda diğer bakteriyel suşların da uygulanabilmektedir. Ayrıca, bu prosedürler, ürünlerin son kullanımına, gerekli saflık derecesine ve bakteriyel gerilime göre kolayca uyarlanmış olabilir.
Introduction
Siyanobacteria, umut verici biyoteknolojik/biyomedikal uygulamalar ile doğal ürünlerin üretken kaynakları olarak yaygın olarak tanınır. Bu nedenle, siyanobakteryal salgılanma mekanizmaları ve ekstraksiyon/kurtarma yöntemlerinin optimizasyonu anlayışı, etkili mikrobiyal hücre fabrikaları olarak siyanobasitemi uygulamak için esastır.
Birçok siyanobacterial suşları, ağırlıklı olarak heteropolizakkaritler tarafından oluşturulan, hücre yüzeyine ilişkili kalan veya orta1' e serbest bırakılan, ekstrülüler polimerik maddeler (EPS) üretebilir. Bu serbest karbonhidrat polimerleri, diğer bakterilere kıyasla farklı özelliklere sahiptir, bu da onları geniş bir uygulama yelpazesi için uygun hale getiren (örn., antiviral2, immünostimulatuar3, antioksidan4, Metal-şelasyon5, Emulsifying6, ve ilaç teslim ajanlar7,8). Bu polimerlerin yalıtım metodolojisi büyük ölçüde sadece geliştirilmiş verim için değil, aynı zamanda artan saflık ve polimerin spesifik fiziksel özellikleri elde9katkıda bulunur. Polimerlerin izolasyonu için bu yöntemlerin büyük bir çoğunluğu, polimer güçlü anyonik doğa9,10nedeniyle kolayca gerçekleştirilen kültür ortamından yağış stratejileri güveniyor. Ayrıca, yağış adımda kullanılan çözücüler kaldırılması hızla buharlaşma ve/veya lyophilization ile elde edilebilir. Öngörülen uygulamaya bağlı olarak, trichloroasetik asit (TCA) tedavisi, filtrasyon veya boyut dışlama Kromatografi (SEC) dahil olmak üzere son ürünü terzi etmek için polimer yağışından sonra veya önce farklı adımlar birleştirilebilir. sütun arıtma10.
Cyanobacteria da membran taşıyıcıları (klasik)11 veya veziküller (klasik olmayan)12tarafından aracılı bağlı yollar aracılığıyla çeşitli proteinleri salgılayarak edebiliyoruz. Bu nedenle, siyanobakterial dış proteomun analizi, siyanobacterial protein salgısı mekanizmalarını anlamak/manipüle etmek ve bu proteinlerin belirli bir hücre dışı fonksiyonunu anlamak için önemli bir araçtır. Gizli proteinlerin bolluğu nispeten düşük olduğu için, exoproteomlerin güvenilir yalıtımı ve analizi, ekstrüler ortamın konsantrasyonunu gerektirir. Buna ek olarak, diğer fiziksel veya kimyasal adımlar (örneğin, santrifüjleme, filtrasyon veya protein yağış) elde edilen dış proteomun kalitesini optimize edebilir, protein içeriği13' ü zenginleştirebilir ve kirleticilerin varlığını önleyerek (örn. Pigmentler, karbonhidratlar, vb.) 14 , 15 veya numunelerde hücre içi proteinlerin üstünlüğü. Ancak, bu adımlardan bazıları da tespit edilebilir protein kümesini kısıtlayabilir, önyargılı bir analiz yol.
Bu çalışma, serbest karbonhidrat polimerleri ve siyanobacteria kültür medyadan exoproteomes izolasyonu için etkili protokoller açıklar. Bu protokoller, burada sunulan temel adımları korurken, çalışmanın belirli hedeflerine ve Kullanıcı ihtiyaçlarına kolayca adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. siyanobacterial serbest karbonhidrat polimer yalıtım
-
Polimer yalıtım ve kirleticilerin çıkarılması
- Standart koşullar altında siyanobacterial gerginliği geliştirin [Örneğin, 12 saat ışık altında 30 °C (50 μE m− 2s− 1)/12 h karanlık rejim, 150 RPM 'de orbital sallayarak). Standart protokolleri kullanarak büyüme ölçmek [örn., 730 nm optik yoğunluğu (OD730nm), klorofil a, Kuru ağırlık, vb], sonra fenol-sülfürik asit yöntemine göre yayımlanan polisakkaritler üretimini ölçmek16.
- Kültürü diyaliz membranlarına aktarın (12-14 molekül ağırlığı kesme kDa) ve sürekli karıştırma ile 24 saat boyunca en az 10 hacimde deiyonize suya karşı Dialyze edilir.
Not: Dialyze ve orta kompozisyon kültür hacmine bağlı olarak, Dializ suyu değiştirmek için gerekli olabilir. - 4 °C ' de 15 dakika için 15.000 x g 'de kültürü santrifüjle. Yeni bir şişeye süpernatant aktarmak ve Pelet (hücreler) atın.
- Hücre duvarı enkaz veya lipopolysaccharides (LPS) gibi kirleticileri kaldırmak için 4 °C ' de 15 dk 20.000 x g 'de tekrar santrifüjler.
- Süpernatant bir cam kabı aktarmak ve pellet atın.
-
Polimer yağış
- Supernatant için 96% etanol 2 hacim ekleyin.
- Süspansiyonu 4 °C ' de en az bir gecede kulyın.
- Polimer geri kazanımı
- Küçük veya görünmez miktarda çöktürülmüş polimer için: süspansiyonu 13.000 x g 'de 25 dakika boyunca 4 °c ' de santrifüjler. Süpernatant atın ve 1 ml veya 2 ml otoklav deiyonize su Pelet pelletini. Sulu süspansiyonu bir şişeye aktarın.
Dikkat: süpernatant kolayca resuspended hale gelebilir gibi, yavaşça atılmalıdır. - Çöktürülmüş polimer görünür/büyük miktarlarda için: bir şişeye steril metal forseps ile çökelmiş polimer toplamak. Polimer sıkın ve aşırı etanol atın.
- Küçük veya görünmez miktarda çöktürülmüş polimer için: süspansiyonu 13.000 x g 'de 25 dakika boyunca 4 °c ' de santrifüjler. Süpernatant atın ve 1 ml veya 2 ml otoklav deiyonize su Pelet pelletini. Sulu süspansiyonu bir şişeye aktarın.
- Opsiyonel: gerekli polimer arıtma derecesine bağlı olarak, deiyonize suda polimerlerin Resuspension sonra% 96 etanol ile yağış adımı tekrarlayın.
-
Polimerin lyophilization
- En az bir gecede-80 °C ' de çöktürülmüş polimer ile şişeleri tutun.
- Dondurma-kuru (lyophilize) en az 48 h için polimer (donma-kurutmadan önce süspansiyon defrost izin vermeyin).
- Daha fazla kullanım kadar oda sıcaklığında (RT) kurutulmuş polimer saklayın.
Not: bir kurutucu içinde polimer depolamak tavsiye edilir, zaman içinde su absorbe gibi.
2. cyanobacterial exoproteome yalıtım
-
Orta konsantrasyon
- Standart koşullarda siyanobacteria geliştirin [Örneğin, 12 saat ışık altında 30 °C (50 μE m− 2s− 1)/12 h karanlık rejim, 150 RPM 'de orbital sallayarak). Standart prosedürleri kullanarak siyanobacterium büyümesini izleyin (örn. , od730nm, klorofil a, Kuru ağırlık, vb.).
- 4.000 x g 'de kültürleri Santrifüjü , RT 'de 10 dk.
- Süpernatant bir Flask aktarmak ve hücre Pellet atın.
- 0,2 μm gözenek boyutu filtresiyle yapıştırılı ortamı filtreleyin.
Not: ortam 4 °C ' de tutulduğunda protokol kısa bir süre için burada duraklatılabilir. - 3 kDa nominal moleküler ağırlık kesme ile santrifüj Konsantratörleri kullanarak, orta yaklaşık 500x (filtrelenmiş orta ilk hacmi dikkate alınarak) konsantre. Santrifüjleme 15 °C ' de 4.000 x g (santrifüjleme başına maksimum 1 saat) olarak çalıştırılmalıdır.
Dikkat: konsantratör markalarının çoğunluğu için, filtre cihazının kullanmadan önce Ultra Saf suyla santrifüjleme ile durulması gerekir. Filtre Islandıktan sonra, kurumasına izin vermeyin. Cihaz kullanılırken rezervuar üzerinde yeterli sıvı bırakın.
Not: santrifüjleme sıcaklığını 4 °C ' ye düşürmek, amaç protein aktivitesini incelemek ise, numune konsantrasyonu için gerekli süreyi arttıracak olsa da yararlı olabilir. Ortam 4 °C ' de tutulduğunda, kısa zaman dilimleri için santrifüjleme adımları arasında protokol duraklatılabilir. - Filtre cihazı örnek rezervuar duvarlarını konsantre örnekle durulayın ve içeriği bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Maksimal exoproteome kurtarma sağlamak için Otoklavlanmış kültür orta ile filtre cihazı örnek rezervuar ek bir yıkama adım gerçekleştirin.
Not: kurtarma yüzdesini ölçmek Için, belirli üreticinin talimatlarını izleyin. - Exoproteome örneklerini daha fazla kullanıma kadar-20 °C ' de saklayın.
Not: uzun süreli depolama için proteaz inhibitörlerinin eklenmesi önerilir.
-
Exoproteome Analizi
- Üreticinin talimatlarına göre 96-Well plaka BCA protein tahlil tarafından protein içeriği ölçmek.
- Proteinleri, standart boyama protokolleri (örn. Coomassie mavi, gümüş boyama) kullanılarak sodyum dodecil sülfat-Poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) ile ayırın.
- İlgi bantları/jel bölgeleri kes ve ultra saf su uygun hacimleri içeren farklı mikrosantrifüjler tüpleri onları toplamak.
- Kütle spektrometresi ile proteinlerin tanımlanması ve analizine devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1' de, siyanobakteryal kültürlerden serbest bırakılan karbonhidrat polimerlerini ayıklamak için açıklanan yöntemin şematik bir gösterimi gösterilmiştir. Orta EPS üreticilerinden siyanobacterium Synechocystis Sp. pcc 6803 ve verimli EPS üreticisi cyanothece sp. ccy 0110 ' den çöktürülmüş polimerler Şekil 2' de gösterilir. Şekil 3' te, farklı kirlilik derecelerine sahip likofilize polimerler gösterilir ve son ürün saflığı için santrifüjleme adımlarının önemini vurgulmaktadır. Şekil 4 cyanobacterial exoproteome için izolasyon yöntemini tasvir ediyor. Şekil 5' te farklı hücre içermeyen orta konsantre numuneler (değişik büyüme aşamalarında kültürlerden elde edilen ve alt karotenoid üretim ile siyanobacterial bir gerinim) görülmektedir. İki morfolojik olarak farklı siyanobacterial suşların exoproteome numuneleri, SDS-sayfası ile ayrılmış tek hücreli Siyanobacteria Synechocystis Sp. PCC 6803 ve filasentöz Siyanobacteria anabaena Sp. PCC 7120, Şekil 6.
Şekil 1 : Yalıtım Için Iş akışı siyanobacterial serbest karbonhidrat polimerleri. Siyanobacterial kültürden başlayarak ve kirleticilerin çıkarılması ve polimer yalıtım ve lyophilization ile biten. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Yağış sonrası Siyanobacterial polimerler. (A) orta EPS üreticisi Synechocystis Sp. PCC 6803 ' den gelen polimer, yağmurdan sonra santrifüjün duvarında (oklar) santrifüj Flask. (B) verimli EPS üreticilerinden gelen polimer kümeleri cyanothece Sp. ccy 0110, yağış sonrası cam kabı 'da yüzen. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Likofilize siyanobacterial polimerler. (A) Synechocystis Sp. PCC 6803 ' den izole edilmiş üç bağımsız polimerdir: görünür kontaminasyon (AI)olmadan ve karotenoidler (ALL ) veya hücre enkaz (aııı) ile kontaminasyonun göstergesidir . (B) cyanothece sp. ccy 0110 den lyophilized polimer. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Iş akışı için siyanobacterial dış Proteom yalıtımı. Cyanobacterial kültürden orta ayırma ve konsantrasyona, exoproteome analizi ile biten. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Konsantre hücreli olmayan orta örneklere sahip Mikrosantrifüjlerin tüpleri. (A) Synechocystis Sp. PCC 6803 Wild-tip ' d A n konsantre orta numune, farklı od730nm (0,5, 1 ve 2) ile toplanır. (B) Synechocystis ∆sigf'den konsantre orta numune, karotenoidlerin üretim bozukluğu olan bir mutant15. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6 : Coomassie mavi-LEKELI SDS-sayfa jelleri siyanobacterial hücre içermeyen konsantre ortamda birikmiş proteinleri gösteren. (A) tek hücreli siyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 Wild-Type ve ∆sigf mutant gelen exoproteome. (B) Synechocystis için exoproteome ∆sigf yüksek düzeyde polisakkaritler ile kontamine. (C) filasentöz siyanobacterium anabaena sp. PCC 7120 gelen exoproteome. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriyel salgılanma mekanizmalarını daha iyi anlamak ve serbest bırakılan ürünleri incelemek için, ekstraselüler bakteriyel ortamda mevcut olan Biomoleküllerin verimli yalıtımı ve analizini göstermek çok önemlidir (örneğin, serbest karbonhidrat polimerler ve proteinler).
Siyanobacterial ekstraküler karbonhidrat polimerleri, özellikle kompozisyon1' i oluşturan farklı monosakkaritlerin sayısı ve oranı nedeniyle son derece karmaşıktır. Bu polimerik maddelerin yalıtım için kullanılan konvansiyonel yöntemler bu şeker açısından zengin maddelerin sulu çözümlerde çözünür ve organik çözücüler (örneğin aseton veya etanol gibi) ek olarak çöktürülmüş olabilir basit kavramı güveniyor9 ,17,18. Bu, polimerlerin hidrasyon kabukları su molekülleri ekstraksiyonu nedeniyle oluşur ve sürecin verimliliği polimerin moleküler ağırlığı (daha yüksek moleküler ağırlık fraksiyonları daha verimli), kimyasal yapı üzerinde özünde bağlıdır ve konsantrasyon9,18. Yağış adımının yanı sıra, burada açıklanan Yöntem diyaliz ve santrifüjün kritik adımlarını içerir. Diyaliz verimli tuzları ve diğer bileşikleri orta, toz benzeri yapıları olarak lyophilization sonra görünebilir, santrifüjleme adımları büyük kirleticiler ve hücre enkaz kaldıracak iken kaldıracaktır.
Bu adımlar sırasında arızalar, yalıtım toplu işlemine bağlı olarak yüksek kirlilik seviyeleri ve farklı özelliklere sahip polimerlere yol açabilir. Bazı kontaminasyonlar, polimer likofilizasyon sonrası makroskopik olarak kolayca tespit edilebilir, çünkü polimer pigmentasyonunu (genellikle beyaz veya açık kahverengi) değiştirecekler. Örneğin, yeşil veya turuncu olan liyofilize polimerler genellikle hücre enkaz/klorofil veya karotenoidler ile son derece kontamine. Bu, santrifüjleme adımlarında yetersiz zaman veya g kuvveti ile ilişkilidir. Ancak, bazı siyanobacterial suşlar, polimerlerle doğal olarak ilişkili kalan pigmentleri ve salgını proteinlerini serbest bırakabilirler ve bu son ürün19' da analiz edildiğinde dikkate alınmalıdır. Polimerleri daha da arındırmak için ek adımlar eklenebilir (örn. TCA tedavileri)10. Bununla birlikte, bu arıtma adımları da son üründe olumsuz bir etkiye sahip olabilir, proteinleri ve diğer bileşenleri kaldırarak polimer özelliklerini değiştirebilir (örneğin, viskozite, hidrofobite, vb.) 1 , 20. hatta yağış/lyophilization adımları tekrarlayan polimerleri olumsuz etkileyebilir, özellikle onların Fizikokimyasal özellikleri kolayca değiştirmek donma-çözme döngüleri nedeniyle21. Polimer verimleri iyileştirmek için, Isıtma uygulamaları yağış öncesinde tüm kültürlere uygulanabilir. Bu ekstra adım hücre yüzeyi ile ilişkili polimer bültenleri, ama aynı zamanda depolimerizasyon yol açabilir18,20. Özetle, protokol seçiminin izole polimerlerin hem miktarını hem de kalitesini etkileyecektir fark önemlidir9,20.
Ekstraselüler ortamda tanımlanan siyanobacterial proteinler ile ilgili olarak, çok çeşitli moleküler ağırlıkları ve izoelektrik noktalarını görüntüler ve çözünebilir veya membran ile ilişkili olabilir. Fizikokimyasal özelliklerin bu çeşitliliği, exoproteom yalıtımı için en uygun yöntemin seçilmesi konusunda bir sorunu temsil eder. Burada sunulan yöntem, ekstraselüler ortamda biyolakkülerin konsantrasyonuna büyük ölçüde bağlıdır. Bu yöntem sadece orta içine salgılanan proteinlerin değil, aynı zamanda dış membran veziküller (OMVs) proteinleri bulunan ve hücre lizinden türemiş proteinleri yalıtır. Bu nedenle, santrifüjleme adımları hafifçe hücre kesintileri önlemek için gerçekleştirilmelidir, ancak aynı zamanda OMVs toplamak. Verimli OMVS üreticileri olan siyanobacterial suşlarda, bu lipidik yapıları ile ilişkili karotenoidlerin varlığı nedeniyle exoproteome preparatları genellikle turuncu14,15. Ancak, bu özellik, siyanobacterial gerilme ve büyüme aşamasına bağlı olarak önemli ölçüde değişebilir. Proteinlerin OMVs tarafından katkılarını değerlendirmek için, ultrakentübasyon adımları prosedüre22eklenmelidir. Ayrıca, hücre lizisi nedeniyle ekstrüler alana ulaşan proteinler farklı büyüme aşamalarında numune toplayarak ve çoğalan sayısının artması ile tespit edilebilir.
Söz konusu olduğu gibi, birçok siyanobacterial suşları ekstrelüler karbonhidrat polimerleri (EPS) üreten, dış Proteom preparatları da bileşiminde EPS olabilir. Filtrasyon adım daha karmaşık ve büyük EPS korumak gerekir, ancak daha basit EPS kesirler sonunda geçebilir. Sonuç olarak, büyük miktarlarda karbonhidrat ile kontaminasyon dış Proteom analizine engel olabilir. Örneğin, bu kontaminasyon Poliakrilamid jellerde protein ayrımı sırasında bir gecikme neden olabilir, hem de maske daha az bol protein. Dış ortamda bulunan kontamine biomolekülleri kaldırmayı amaçlayan exoproteome yalıtım için alternatif protokoller önerilmiştir, ancak çok seçici olduğu gösterilmiştir, bu da önyargılı exoproteome profillerine yol açabilir13. Öte yandan, belirli bir miktarda protein, filtrede sıkışmış ise daha karmaşık EPS fraksiyonları içinde sıkışıp olabilir. Bu durumda, farklı büyüme aşamaları/deneysel durumlardan gelen dış Proteom preparatlarının analizinin yanı sıra EPS fraksiyonları içindeki proteinlerin analiz edilmesi, sıkışmış proteinlerin belirlenmesine yardımcı olabilir.
Genel olarak, burada açıklanan protokoller, siyanobakteryal serbest karbonhidrat polimerlerinin ve exoproteomların verimli yalıtımı için önemli adımları emvücut. En önemlisi, onlar kolayca belirli kullanıcı ihtiyaçlarına göre uyarlanmış ve diğer bakteriyel suşları dahil olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Fundo Europeu de desenvolvimento Regional (FEDER) fonları tarafından rekabetçilik 2020-Operacional YARıŞMA ve uluslararasılaşma programı (POCı), Portekiz 2020 ve Portekiz fonları ile FCT-Fundação para a Ciência e aracılığıyla finanse edilmiştir. bir Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino proje çerçevesinde POCI-01-0145-FEDER-028779 ve Grant SFRH/BD/99715/2014 (CF) üstün.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis membranes | Medicell Membranes Ltd | DTV.12000.07 | Visking Tubing Size 7, Dia 23.8 mm, Width 39-41 mm 30m Roll |
| Ethanol 96% | AGA - Álcool e Géneros Alimentares, S.A. | 4.000.02.02.00 | Fermentation ethyl alcohol 96% AGA |
| PES Filter 0.2 μm | Fisher Scientific, Lda | 15206869 | Syringe filter polystyrene 33MM 0.2µM STR |
| Amicon Ultra-15, Ultracel-3K | Merck Millipore Ltd. | UFC900324 | Centrifugal filters with a nominal molecular weight cut-off of 3 kDa |
| Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay | Fisher Scientific, Lda | 10741395 | Green-to-blue, precise, detergent-compatible assay reagent to measure total protein concentration |
| Brillant Blue G Colloidal Concentrate | Sigma Aldrich Química SL | B2025-1EA | Coomassie blue |
References
- Pereira, S., et al. Complexity of cyanobacterial exopolysaccharides: composition, structures, inducing factors and putative genes involved in their biosynthesis and assembly. FEMS Microbiology Reviews. 33 (5), 917-941 (2009).
- Kanekiyo, K., et al. Isolation of an Antiviral Polysaccharide, Nostoflan, from a Terrestrial Cyanobacterium, Nostoc flagelliforme. Journal of Natural Products. 68 (7), 1037-1041 (2005).
- Løbner, M., Walsted, A., Larsen, R., Bendtzen, K., Nielsen, C. H. Enhancement of human adaptive immune responses by administration of a high-molecular-weight polysaccharide extract from the cyanobacterium Arthrospira platensis. Journal of Medicinal Food. 11 (2), 313-322 (2008).
- Wang, H. B., Wu, S. J., Liu, D. Preparation of polysaccharides from cyanobacteria Nostoc commune and their antioxidant activities. Carbohydrate Polymers. 99, 553-555 (2014).
- Ozturk, S., Aslim, B., Suludere, Z., Tan, S. Metal removal of cyanobacterial exopolysaccharides by uronic acid content and monosaccharide composition. Carbohydrate Polymers. 101, 265-271 (2014).
- Han, P. P., et al. Emulsifying, flocculating, and physicochemical properties of exopolysaccharide produced by cyanobacterium Nostoc flagelliforme. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (1), 36-49 (2014).
- Leite, J. P., et al. Cyanobacterium‐Derived Extracellular Carbohydrate Polymer for the Controlled Delivery of Functional Proteins. Macromolecular Bioscience. 17 (2), 1600206 (2017).
- Estevinho, B. N., et al. Application of a cyanobacterial extracellular polymeric substance in the microencapsulation of vitamin B12. Powder Technology. 343, 644-651 (2019).
- Klock, J. H., Wieland, A., Seifert, R., Michaelis, W. Extracellular polymeric substances (EPS) from cyanobacterial mats: characterisation and isolation method optimisation. Marine Biology. 152 (5), 1077-1085 (2007).
- Delattre, C., Pierre, G., Laroche, C., Michaud, P. Production, extraction and characterization of microalgal and cyanobacterial exopolysaccharides. Biotechnology Advances. 34 (7), 1159-1179 (2016).
- Costa, T. R., et al. Secretion systems in gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nature Reviews Microbiology. 13 (6), 343-359 (2015).
- Roier, S., Zingl, F. G., Cakar, F., Schild, S. Bacterial outer membrane vesicle biogenesis: a new mechanism and its implications. Microbial Cell. 3 (6), 257-259 (2016).
- Sergeyenko, T. V., Los, D. A. Identification of secreted proteins of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 193 (2), 213-216 (2000).
- Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
- Flores, C., et al. The alternative sigma factor SigF is a key player in the control of secretion mechanisms in Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 21 (1), 343-359 (2018).
- Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28 (3), 350-356 (1956).
- Parikh, A., Madamwar, D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria. Bioresource Technology. 97 (15), 1822-1827 (2006).
- Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. Methods to identify the unexplored diversity of microbial exopolysaccharides. Frontiers in Microbiology. 6, 565 (2015).
- Pathak, J., Rajneesh, R., Sonker, A. S., Kannaujiya, V. K., Sinha, R. P. Cyanobacterial extracellular polysaccharide sheath pigment, scytonemin: A novel multipurpose pharmacophore. Marine Glycobiology. , CRC Press. 343-358 (2016).
- Nguyen, A. T. B., et al. Performances of different protocols for exocellular polysaccharides extraction from milk acid gels: Application to yogurt. Food Chemistry. 239, 742-750 (2018).
- Jamshidian, H., Shojaosadati, S. A., Mousavi, S. M., Soudi, M. R., Vilaplana, F. Implications of recovery procedures on structural and rheological properties of schizophyllan produced from date syrup. International Journal of Biological Macromolecules. 105, 36-44 (2017).
- Couto, N., Schooling, S. R., Dutcher, J. R., Barber, J. Proteome profiles of outer membrane vesicles and extracellular matrix of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Proteome Research. 14 (10), 4207-4222 (2015).
