Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En Multilayer Microfluidic plattform för ledning av långvarig cell-fri genuttryck

Published: October 6, 2019 doi: 10.3791/59655
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 3, 1,2
1Institute for Complex Molecular Systems, Department of Biomedical Engineering, Computational Biology Group, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Molecules and Materials, Radboud University, 3Institute of Bioengineering, School of Engineering École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

Summary

Tillverkningsprocessen av en PDMS-baserad, Multilayer, mikroflödessystem enhet som möjliggör in vitro-transkription och översättning (ivtt) reaktioner som skall utföras under längre perioder beskrivs. Dessutom tillhandahålls en omfattande översikt över den maskinvara och programvara som krävs för att automatisera och underhålla dessa reaktioner för långvariga varaktigheter.

Abstract

Begränsningarna i cellbaserad syntetisk biologi blir allt tydligare eftersom forskarna strävar efter att utveckla större och mer komplexa syntetiska genetiska reglerings kretsar. Analysen av syntetiska genetiska reglerings nätverk in vivo är tidskrävande och lider av brist på miljökontroll, med exogena syntetiska komponenter interagerar med värdprocesser vilket resulterar i oönskat beteende. För att övervinna dessa frågor, cell-fri karakterisering av nya kretsar blir allt vanligare. In vitro-transkription och översättning (IVTT) blandningar möjliggör reglering av försöks miljön och kan optimeras för varje unikt system. De protokoll som presenteras här detalj tillverkning av en Multilayer mikroflödessystem enhet som kan utnyttjas för att upprätthålla ivtt reaktioner för långvarig varaktighet. Till skillnad från satsvis reaktioner, där resurserna är uttömda över tid och (av-) produkter ackumuleras, användning av mikroflödessystem enheter möjliggör påfyllning av resurser samt avlägsnande av reaktionsprodukter. På detta sätt emuleras den cellulära miljön genom att bibehålla en miljö utanför jämvikts miljön där det dynamiska beteendet hos gen kretsar kan undersökas under längre tidsperioder. För att fullt ut utnyttja Multilayer mikroflödessystem enheten, hårdvara och mjukvara har integrerats för att automatisera ivtt reaktionerna. Genom att kombinera ivtt reaktioner med den mikroflödessystem plattform som presenteras här, blir det möjligt att heltäckande analysera komplexa nätverk beteenden, främja vår förståelse av de mekanismer som reglerar cellulära processer.

Introduction

Celler kan känna och reagera på sin omgivning med hjälp av komplexa dynamiska reglerings nätverk1,2. Området syntetisk biologi utnyttjar vår kunskap om de naturligt förekommande komponenterna som omfattar dessa nätverk för att konstruera biologiska system som kan utöka funktionaliteten i cellerna3,4. Omvänt är det också möjligt att vidareutveckla vår förståelse av de naturliga nätverk som styr livet genom att designa förenklade, syntetiska analoger av befintliga kretsar eller genom frambyggnads biologiska system som uppvisar naturligt förekommande beteenden. De Novo Engineering av sådana biologiska system utförs i en bottom-up-mode där nya genetiska kretsar eller signalvägar är konstruerade på ett rationellt sätt, med hjälp av väldefinierade delar5,6. Genom att kombinera den rationella utformningen av nätverk med utformningen av biologiskt relevanta system kan man fördjupa karakteriseringen och studera biologiska regleringssystem med olika abstraktionsnivåer7.

De banbrytande verken av Elowitz och Leibler8 och Gardner et al.9 var de första att demonstrera det framgångsrika införandet av syntetiska genetiska nätverk i cellulära värdar. Under det följande decenniet har många forskare fortsatt att bygga vidare på dessa inledande framgångar trots uppkomsten av flera begränsningar när det gäller införandet av syntetiska kretsar i celler7,10,11 ,12. Helst bör införandet av syntetiska kretsar i cellulära värdar ske på ett modulärt sätt. Tyvärr gör komplexiteten i den cellulära miljön detta särskilt utmanande, med funktionen av många delar och nätverk är mycket kontextberoende12,13,14. Som ett resultat av nätverk upplever ofta oönskade interaktioner med infödda värd komponenter som kan påverka funktionen av den syntetiska kretsen. På samma sätt kan komponenterna i det exogena nätverket hämma värdprocesser, konkurrera om delade resurser inom värden och påverka tillväxtkinetik15,16,17. Följaktligen, för att rationellt utforma och förutsäga beteendet hos syntetiska nätverk i en in vivo miljö, krävs en omfattande modell av alla värd och krets-specifik dynamik18.

Ett lönsamt alternativ till användning av cellulära värdar för karakterisering av syntetiska nätverk är tillämpningen av in vitro-transkription och översättning (IVTT) teknik. Fungerar som en testbädd för syntetiska nätverk, reaktioner utförs i lösningar som omfattar alla de komponenter som krävs för att möjliggöra genuttryck19,20,21. På detta sätt skapas en biologiskt relevant, om än konstlad, miljö inom vilken syntetiska nät kan testas22,23,24,25,26, 27,28. En stor fördel med att använda IVTT Solutions är förmågan att utföra reaktioner under användarspecificerade förhållanden, med forskare som kan finjustera den exakta sammansättningen av varje reaktion2. Dessutom möjliggör den cell fria metoden testning av syntetiska nätverk med högt dataflöde, eftersom den eliminerar behovet av att utföra tidskrävande cellulära klonings steg. Som ett resultat, varaktigheten av successiva konstruktion-build-testcykler är signifikant reducerad29,30,31,32. Konstruktions cykeln kan påskyndas ytterligare genom att använda cellfria kloningstekniker som Gibson Assembly för att snabbt konstruera nya nätverk, och genom att bygga nätverk från linjära DNA-mallar som-till skillnad från de plasmider som krävs för in vivo-testning- kan amplifieras via polymeraskedjerereaktioner (PCR)33,34.

Batchreaktioner är den enklaste metoden med vilken IVTT-reaktioner kan utföras, vilket kräver ett enda reaktionskärl vari alla reaktions komponenter kombineras35. Sådana reaktioner är tillräckliga för proteinuttryck och grundläggande krets testning ännu inte visat sig vara otillräckliga när man försöker studera det långsiktiga dynamiska beteendet hos ett nätverk. Under loppet av en sats reaktion, reagenser är antingen utarmat eller genomgå nedbrytning vilket resulterar i en kontinuerlig minskning av transkriptionen och omräkningskurserna. Dessutom, som reaktioner framsteg biprodukter ackumuleras som kan störa-eller helt hämma-en korrekt funktion av nätet. I slutändan, användning av batch reaktorer begränsar dynamiskt beteende som kan observeras, med negativ reglering är särskilt utmanande att genomföra5,36.

Mångsidigheten hos ivtt-system möjliggör flera alternativa metoder genom vilka förlängda ivtt-reaktioner kan utföras, alltifrån kontinuerligt flöde till dropp-baserade metoder samt enklare dialys metoder2,30, 37,38,39,40. Tillämpningen av mikroflödessystem enheter ger användarna ökad kontroll över sina reaktioner samtidigt öka genomströmningen och minimera kostnaderna35,41,42, med varje specifik metod med sin egna fördelar. Användning av kontinuerligt flöde kan lätt optimeras för att öka uttrycks avkastningen men oförmåga att effektivt ta bort specifika reaktionsprodukter gör studiet av dynamiskt beteende icke-trivialt39. Medan anställa dropp baserade mikroflödessystem system möjliggör hög genomströmning screening av nya nätverk, svårigheten att leverera färska reagenser till reaktionen resulterar i droppar som liknar små volymer batchreaktioner43. Dialys baserade reaktorer möjliggöra införandet av färska reagenser samt avlägsnande av vissa reaktionsprodukter men, RNA-molekyler och större proteiner ackumuleras i reaktorn, är för stor för att diffusa genom membranet porer. Dessutom krävs stora mängder reagenser för att upprätthålla dessa reaktioner under längre perioder30,44. I 2013, Maerkl et al. presenterade en multi-Layered mikroflödessystem enhet som utformats speciellt för att genomföra förlängda ivtt reaktioner36,45. Användningen av flerskiktade mikroflödessystem enheter möjliggör direkt kontroll över vätskeflödet, vilket möjliggör omdirigering av flödet samt isolering av vätska i vissa regioner i anordningen46,47. Dessa isolerade regioner kan fungera som självständiga reaktions kammare med nanoliter-skala vari IVTT-reaktioner kan utföras. Under loppet av en enda IVTT-reaktion används periodiska injektioner av färska reagenser i reaktorn för att fylla på IVTT-komponenter och DNA-mallar. Samtidigt är en lika volym av den gamla reaktions lösningen förskjuten, ta bort reaktionsprodukter. På detta sätt bibehålls en miljö utanför jämvikt där de basala transkriberingen och omräkningskurserna kvarstår i steady-state, vilket förlänger livslängden för IVTT-reaktioner och tillåter att rika dynamiska beteenden uppstår. Genom att tillämpa detta tillvägagångssätt, forskare har möjlighet att undersöka den kinetiska frekvenser av de enskilda processer som förekommer inom en viss krets, medhjälp i framåt-Engineering av nya genetiska nätverk. Till exempel genomförde Niederholtmeyer et al. denna metod för att karakterisera olika delar av en genetisk ring oscillator, bestämning av kinetiska priser därav36. I ytterligare studier, Yelleswarapu et al. visade att de kinetiska talen av Sigma Factor 28 (σ28) bestäms under sats villkor var otillräckliga för att beskriva beteendet hos en σ28-baserad oscillator, och att tillägg av flödesbaserade data förbättrade modell förutsägelser för nätverksbeteendet22.

Målet med detta manuskript är att presentera ett komplett protokoll för tillverkning av Multilayer mikroflödessystem enheter som kan utföra långsiktiga ivtt reaktioner. Dessutom kommer detta manuskript beskriva all hårdvara och mjukvara som krävs för att utföra förlängda IVTT reaktioner. Aktivering av den mikrofluidiska anordningen-nödvändig för att kontrollera flödet av vätskor däri-uppnås med hjälp av en serie av pneumatiska ventiler som ansluts direkt till mikroflödessystem enheter via längder av slangar. De pneumatiska ventilerna styrs i sin tur via ett specialbyggt virtuellt styrgränssnitt. Vätskeflödet inom de mikrofluidiska anordningarna uppnås med hjälp av kontinuerligt tryck som tillhandahålls av ett kommersiellt tillgängligt tryckreglering system. IVTT-reaktioner utförs vanligtvis mellan 29 ° c och 37 ° c och ett Mikroskop inkubator används för att reglera temperaturen under reaktioner. Men funktionaliteten hos IVTT-blandningen försämras gradvis vid förvaring över 4 ° c. Som sådan kommer detta manuskript expandera på off-chip kylsystem som används för att kyla ivtt blandningen före injektion i den mikroflödessystem enheten. Sammanfattningsvis ger detta manuskript en omfattande översikt av de förfaranden som krävs för att framgångsrikt utföra förlängda ivtt reaktioner med hjälp av en mikroflödessystem flödes reaktor så att andra forskare kommer att kunna replikera denna teknik med relativ Lätthet.

Protocol

1. wafer beredning

Obs: våra protokoll är specifika för 40 XT positiv fotoresist och SU8 3050 negativ fotoresist används under denna forskning. Alternativa photoresists kan användas, men den specifika spinn hastigheter, bakning temperaturer och bakning gånger varierar. Den mikroflödessystem anordning design som niederholtmeyer et al.36 är kopplad i tabellen av material.

  1. Placera två rena kisel rån (100 mm diameter, < 1-0-0 > orienterad, 525 μm tjocklek) i en förvärmd ugn inställd på 250 ° c och lämna rån att torka över natten (~ 16 h).
    Obs: det är också möjligt att Prime The rån med HMDs Vapor deposition; Detta är dock inte nödvändigt om rån är tillräckligt uttorkade.
  2. Ta bort en kisel wafer från ugnen och låt den svalna till rumstemperatur innan du fortsätter med spinn beläggningen. Applicera 3-4 ml av 40 XT fotoresist till mitten av Wafer.
  3. För att få en funktions höjd på 25 μm, applicera följande spin-protokoll: snurra för 20 s vid 500 rpm (110 rpm/s), öka rotationshastigheten till 3100 rpm (300 rpm/s) och håll här i 30 s, och bromsa wafer till 0 rpm med en retardation på 200 rpm/s. med en microfibervävnad ta försiktigt bort alla kant beading som kan ha inträffat under spinn beläggningen.
  4. Mjuk Grädda med två separata värmeplattor som är inställda på 70 ° c och 120 ° c på följande sätt: låt wafer sitta vid 70 ° c i 30 s. Överför sedan wafer till 120 ° c värmeplattan och låt den vila här för 3,5 min innan du återvänder wafer till 70 ° c kokplatta för ytterligare 30 s. ta bort rån från värmeplattan och-undvika plötsliga temperatur chocker-låt den svalna till rumstemperatur.
  5. Placera flödes skiktet photomasken (emulsion sida ner) på fotoresist filmen och exponera wafer med en UV-lampa tills en total exponering av 200 MJ/cm2 uppnås.
  6. Efter exponering baka med två kokplattor (70 ° c och 105 ° c) på följande sätt: låt wafer att sitta vid 70 ° c för 20 s innan du överför wafer till 105 ° c kokplattan och lämnar den här för 40 s. Slutligen returnera wafer till 70 ° c kokplatta för ytterligare 20 s för att slutföra efter exponeringen baka.
  7. Låt wafer svalna till rumstemperatur på en bunt mikrofibervävnader. Utveckla wafer genom att överföra den till en petriskål fylld med 726 MIF fotoresist utvecklare att starta utvecklingsprocessen. Utvecklingen accelereras när den utförs på en bänkskiva shaker och hela wafer är nedsänkt i exploatören.
  8. Skölj wafer med demineraliserat vatten och använda ett stereomikroskop för att kontrollera wafer ytan för alla fotoresist rester. Om fotoresist rester kan ses, sedan tillbaka wafer till utvecklaren.
  9. Reflow den positiva fotoresist genom att placera wafer på en värmeplatta inställd på 110 ° c i 25 min. Denna process kommer att resultera i rundade funktioner samt glödgning eventuella sprickor som kan ha dykt upp under tillverkningsprocessen. Fortsätt att silanisera wafer som beskrivs i steg 1,17.
  10. Ta bort den andra kisel rånen från ugnen, så att den kan svalna till rumstemperatur innan du fortsätter med spinn beläggningen. Applicera 5 ml SU8 3050 fotoresist till mitten av Wafer.
  11. För att få en funktions höjd på 30 μm, Använd följande spin-protokoll: snurra för 20 s vid 500 rpm (110 rpm/s), öka rotationshastigheten till 4 000 rpm (330 rpm/s) och håll här för 42 s, och bromsa wafer till 0 rpm med en retardation på 200 rpm/s. med en microfibervävnad ta försiktigt bort alla kant beading som kan ha inträffat under spinn beläggningen.
  12. Mjuk Grädda med två separata värmeplattor (65 ° c och 95 ° c) på följande sätt: låt wafer sitta vid 65 ° c i 30 s. Överför sedan wafer till 95 ° c värmeplattan och låt den vila här i 14 min innan du återvänder wafer till 65 ° c kokplatta för ytterligare 30 s. ta bort rånen från plattan och låt den svalna till rumstemperatur.
  13. Mät intensiteten av UV-lampan före exponering och Använd detta för att bestämma den exponeringstid som krävs för att uppnå en total exponeringsdos av 260 mJ/cm2. Placera photomasken (emulsionssidan nedåt) på fotoresist-filmen och placera wafer under UV-ljuskällan. Exponera wafer med hjälp av en UV-lampa tills en total exponering av 260 mJ/cm2 uppnås.
  14. Efter exponering baka med hjälp av två kokplattor (65 ° c och 95 ° c) på följande sätt: låt wafer att sitta vid 65 ° c för 60 s innan du överför wafer till 95 ° c kokplattan och lämnar den här för 4,5 min. tillbaka waferen till den 65 ° c kokplatta för ytterligare 30 s för att slutföra efter exponering baka.
  15. Låt wafer svalna till rumstemperatur på en bunt mikrofibervävnader. Utveckla wafer genom att överföra den till en petriskål fylld med mrdev-600 fotoframkallaren att starta utvecklingsprocessen. Utvecklingen accelereras när den utförs på en bänkskiva shaker och hela wafer är nedsänkt i exploatören.
  16. Skölj wafer med isopropanol och Använd ett stereomikroskop för att kontrollera wafer ytan för alla fotoresist rester. Om fotoresist rester kan ses, sedan tillbaka wafer till utvecklaren. När den är fullt utvecklad, hård Grädda fotoresist genom att placera wafer på en värmeplatta inställd på 150 ° c för 1 h.
  17. Silanize båda rån för att förhindra vidhäftning av PDMS under mjuk-litografi processer. För att utföra silanisering, Pipettera 2-3 droppar (per wafer) av silan i en liten glas flaska. Placera denna injektionsflaska, tillsammans med rån i en exsickator och dra vakuum för 5-10 min. försegla exsickatorn och låt rånarna vara under vakuum under en period av 12 – 16 timmar.
    FÖRSIKTIGHET: silanen är giftig och bör inte inhaleras. Var noga med att arbeta i en draghuv och att använda nitrilhandskar vid hantering av SILANE. Detta inkluderar att placera vakuumpumpen i rök huven när du drar vakuum på exsickatorn.
  18. Frigör vakuum från exsickatorn och ta bort de silaniserade wafers. Skölj med vatten och Använd en ånga av N2 för att torka av wafers. Vid denna punkt kan rån placeras i förvaring tills det behövs.

2. microfluidic enhet tillverkning

Obs: den mjuka litografi process som används för att fabricera PDMS baserade Multilayer mikroflödessystem enheter kan delas in i tre olika steg: 1) PDMS beredning av både flöde och kontroll skikt, 2) anpassningen och limning av de två PDMS lager, 3) den slutförande av enheten.

  1. PDMS förberedelse
    1. Förbered två PDMS föregångare lösningar genom att kombinera basen och härdningsmedel i en Plastbägare och med hjälp av en blandnings stav att röra de två komponenterna tills den är helt blandad. Kontroll skiktet kräver 20 g bas medel och 1 g härdningsmedel (20:1 ratio). Flödes skiktet kräver 40 g av bas medlet och 8 g av härdnings medlet (5:1 ratio). Degas lösningarna i en exsickator.
    2. Placera flödet lager wafer i en petriskål och häll 5:1 förhållandet PDMS blandningen över wafer. Degas PDMS för 30 min för att ta bort luftbubblor.
    3. Spin Coat kontroll skiktet wafer (beredd att använda den negativa SU8 3050photoresist) med 20:1 ratio PDMS. Häll 5-10 mL av PDMS på mitten av Wafer och kör följande spin Protocol (behåll vänster över PDMS för senare användning): snurra på 500 rpm för 15 s (100rpm/s), öka rotationshastigheten till 1450 rpm (300 rpm/s) för 45 s och sedan bromsa upp rån till 0 rpm (200 rpm/s).
    4. För att säkerställa en homogen PDMS film tjocklek, placera PDMS belagda wafer på en nivå yta i en sluten petriskål (för att undvika damm förorening). Låt wafer sitta i 30 min.
    5. Ta bort flödes skiktet från exsickatorn och placera både flödes-och kontroll lagren i en ugn (80 ° c). Bota båda lagren för 28-30 min och ta bort när PDMS är formbar nog att manipulera, medan resterande något klibbigt. Fortsätt omedelbart med justeringsprocessen.
  2. Anpassning och bindning
    1. Med hjälp av en skalpell, ta bort var och en av de fyra enheterna från PDMS på flödet lager wafer. När du tar bort PDMS lagret från kisel wafer, omedelbart täcka funktionssidan med tejp för att undvika damm partikel förorening.
    2. Ungefär justera flödet lager block på kontroll skiktet genom ögat, placera funktionssidan av enheten i kontakt med kontroll skiktet PDMS. Därefter göra fina justeringar av placeringen av varje flöde lager block att anpassa kanalerna i flödet skikt med kontroll skikt kanaler, med hjälp av ett stereomikroskop för att underlätta visualisering av justeringarna.
    3. Tryck på för att avlägsna luftfickor mellan de två PDMS-lagren. Häll resterande 20:1 ratio PDMS sparas tidigare runt den justerade flödet lager block. Placera 100 g vikter på varje enhet för att säkerställa tillräcklig kontakt under bindningsprocessen.
    4. Returnera de justerade enheterna (inklusive vikterna) till ugnen 80 ° c och låt dem vara på Bond i minst 1,5 h och inte längre än 6 h.
  3. Avsluta enheten
    1. Ta bort wafer från ugnen och extrahera var och en av de enskilda enheterna från kontroll skiktet wafer, som täcker funktionssidan av varje enhet med scotch tape.
    2. Iterativt, punch ett enda hål för var och en av de 9 flöde lager inlopp, 24 kontroll lager kanal inlopp, och den enda flöde lager utlopp för varje enhet. Slå enheten med funktionssidan vänd uppåt och Använd en kamera för att se till att hålen stansas inom funktions gränserna.
    3. För varje anordning, rengör en enda Mikroskop bild med isopropanol och aceton och torka av bilderna under en ström av N2. Därefter placera mikroskopet glider på en värmeplatta inställd på 150 ° c i 15 min.
    4. Använd syre plasmaföraskning för att binda PDMS enheter till glas rutschbanorna, tillämpa en ashing effekt av 50 W för 45 s. se till att funktionssidan av enheten är vänd uppåt vid föraskning. När du är klar placerar du enhetens funktions sida nedåt på glas bilden och trycker på för att ta bort instängd gas mellan ytorna.
    5. Placera de bundna enheterna på en värmeplatta inställd på 110 ° c i 1 h. vikter kan placeras ovanpå enheterna för att förbättra vidhäftning av anordningen.

3. inställningar för maskinvara

Anmärkning: för att uppnå kontroll över mikroflödessystem chips, många bitar av hårdvara måste installeras och anslutas med varandra. Tre distinkta grupper av hårdvara krävs: 1) pneumatiskt styrsystem för kontroll kanalerna, 2) en pneumatisk Tryckregulator för att kontrollera flödet av reaktionsreagenser i anordningen, och 3) ett kylsystem för att kyla IVTT reaktions lösning före injektion i mikroflödessystem-enheten. En översikt över maskinvaruinställningarna finns i figur 1. Det bör noteras att de protokoll som ges här försök att vara så allmänt som möjligt, men vissa specifika delar av utrustning som används i hela vår forskning refereras. All hårdvara kan bytas ut mot alternativ för att kunna utföra samma funktion. I sådana fall kan protokollen här användas för att beskriva de allmänna steg som behövs för att ställa in systemet och kraven för var och en av komponenterna. Alternativa maskinvaruinställningar presenteras av Brower et al.48 och White and Streets49.

  1. Pneumatiskt styrsystem (se figur 2)
    1. Upprätta en TCP-anslutning mellan fält buss styrenheten och användarens arbetsstation med hjälp av tillverkarens protokoll. Använd kontrollprogramvara (som kompletterande filer) för att komponera MODBUS-kommandon som skickas via TCP-anslutningen till styrenheten, och aktivera magnetventilerna.
    2. Utöka fält buss styrenheten med åtta 4-kanals digitala utgångsmoduler, en för varje magnetventil som används. Varje magnetventil presiderar över en kopplings stift. Anslut den positiva kabeln till en av de fyra positiva utgångarna på en av de digitala utgångsmodulerna samtidigt som du ansluter den negativa kabeln till en av markportarna i de digitala utgångsmodulerna.
      Anmärkning: för att systemet ska fungera korrekt bör solenoider anslutas systematiskt, med den första solenoiden som ansluts till den första utgångsporten, den andra solenoiden till den andra utgångsporten och så vidare. I vårt system används två ventil kedjor med 8 respektive 22 magnetventiler. Utgångsportar 1-8 Anslut till 8-ventils-matrisen och utgångs portarna 9-30 Anslut till matrisen med 22 ventiler.
    3. Anslut båda ventil arrayer till en tryckluftskälla med hjälp av 1/4 "slangar. Använd Tryckregulatorer för att ställa in trycket från 22-ventilens matris till 3 bar, och 8-ventils matrisen till 1 bar.
  2. Flödes tryckreglering (se figur 3)
    Anmärkning: för att strömma vätskor genom flödes skiktet på mikroflödessystem-enheten, används en kommersiellt tillgänglig 4-portars tryckregulator. Utgångstrycket för varje port regleras via programvara som medföljer tryckregulatorn. Anslut tryckregulatorn till en dator med den medföljande USB-kontakten.
    1. Anslut tryckregulatorn till en tryckluftskälla och se till att det levererade trycket inte överskrider det maximala tryck som tillåts av regulatorn.
    2. Anslut en hane Luer till 3/32 "Barb Connector till var och en av de fyra kvinnliga Luer lås utgång portar av tryckregulatorn. Anslut en längd av mjuka slangar (OD: 3 mm, ID: 1 mm, L: 10 cm) till Barb.
    3. Anslut en andra hane Luer till 3/32 "Barb Connector till den öppna änden av den mjuka slangen och bifoga detta till vätskebehållaren kontakt portar.
    4. Använd medföljande programvara för att ställa in önskat tryck på varje utlopp i flödesregulatorn, pressa reagenser som lagras i reservoarerna för att resultera i flödet av reagenser i mikroflödessystem enheten. Anslutningen av reservoarerna till mikroflödessystem enheten kommer att diskuteras i avsnitt 4,2.
  3. Inställning av off-chip kyla (se figur 4)
    1. Använd PVC-slangar (OD: 10 mm, ID: 6 mm) för att ansluta vatten kylsystemet till kyl plattans vatten block med kompressions beslag. Fyll vätskebehållaren i vatten kylsystemet med ett kylmedel och försiktigt luta enheten för att tränga undan eventuell instängd luft, kontinuerligt lägga till kylvätska till behållaren för att säkerställa att den förblir full. När all gas avlägsnas från systemet, Fyll reservoaren till cirka 90-95% av dess maximala volym.
    2. Coil PTFE slangar (OD: 0,042 ", ID: 0,022") på den kalla ansikte Peltier elementet och säkra detta med tejp. Se till att ena änden av PTFE-slangen är ansluten till reservoarerna i flödes skiktet tryckkontrollsystem (som beskrivs i avsnitt 4,3). Den andra änden av PTFE-slangen bör sticka ut inte mer än 1 cm från Peltier ytan. Sätt i en 5 – 10 cm lång PEEK-slang (OD: 0,794 mm, ID: 0,127 mm) i den utskjutande änden av PTFE-slangen. Fyllningen av slangen och anslutningen till mikroflödessystem-enheten förklaras närmare i avsnitt 4,3.
    3. Placera den varma ytan av Peltier elementet på kallt plattan av vatten blocket, tillämpa tillräcklig termisk förening till två ansikten. Se till att slangen, Peltier elementet och kylblocket är i direkt kontakt med varandra hela tiden.
    4. Anslut Peltier-elementet till temperaturregulatorn (via en seriell bussanslutning), så att den spänning som tillförs Peltier kan regleras. Placera en termistor på Peltier-ytan och Anslut utmatningen till temperaturregulatorn. Efter att ha vridit på Vattenkylaren, anpassa spänningen som tillförs Peltier tills temperaturen är stabil vid 4 ° c.
      Obs: med denna inställning, den Peltier temperaturen styrs manuellt genom att anpassa den medföljande spänningen, medan termistor tjänar bara för att övervaka temperaturen.

4. förbereda ett experiment

Anmärkning: innan ett experiment påbörjas måste mikroflödessystem-anordningen förberedas, och reaktionsreagenser måste sättas in i rätt slang för injektion i anordningen. Detta avsnitt kommer att diskutera: 1) anslutningen av styr kanal slangen till anordningen, 2) anslutningen av okylda inflödes reagenser till enheten, och 3) anslutning av kylda inflödes reagenser till enheten.

  1. Anslutning av styr kanals slangen
    1. För varje kontroll kanal för mikroflödessystem enheten, skär en längd av slangen (OD: 0,06 ", ID: 0,02"). I ena änden, sätt stiftet på en 23 G, 1/2 "luer stub och på andra sätt in en rostfri kopplings stift (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm).
    2. Anslut Luer stub till en hane Luer till 3/32 "Barb nylon Connector. För in kopplingen i en längd av polyuretanslangen (OD: 4 mm, ID: 2,5 mm). Sätt in denna polyuretanslang direkt i en av magnetventilerna.
    3. Fäst en 23 G, 1/2 "luer stub till en spruta och sätt in den i en kort (3-4 cm) bit av slangen (OD: 0,06", ID: 0,02 "). Placera den öppna änden av slangen i en reservoar av ultrarent vatten och Fyll sprutan med ultrarent vatten.
    4. Numrera varje kontroll kanal för mikroflödessystem-enheten som visas i figur 5. För varje kanal (exklusive kontroll kanalerna 1 till 3, som inte är fyllda med vatten), hitta motsvarande slang (ansluten till magnetventiler) och sätt i en metallnål i den öppna änden av slangen fäst på sprutan. Injicera vatten i styr kanals slangen tills halva längden har fyllts.
    5. Koppla bort slangen från sprutan och sätt in den rostfria kopplings stiftet i motsvarande hål på mikroflödessystem-enheten. Upprepa för alla kontroll kanaler.
    6. Använd kontroll gränssnittet för att öppna alla magnetventiler. Detta kommer att pressa vätskan inom styr kanal slangen, tvinga den in i mikroflödessystem enheten och stänga alla membran baserade ventiler i enheten. Ett exempel på öppna och slutna membran i anordningen finns i figur 6.
  2. Ansluta okylda reagenser till enheten
    1. För var och en av de okylda reagenser, skär en längd av slangen (OD: 0,06 ", ID: 0,02") för att ansluta behållaren utlopp till mikroflödessystem anordningen inlopp.
    2. Ta ena änden av slangen och sätt in detta i behållaren, se till att slangen når basen av reservoaren. Behållarens slang utlopp bör dras åt så att en lufttät tätning uppnås. Sätt i en anslutnings pinne av rostfrittstål (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm) i den öppna änden av slangen.
    3. Fäst en 23 G, 1/2 "luer stub till änden av en liten (1 mL) spruta. Tillsätt en kort slanglängd (OD: 0,06 ", ID: 0,02") till Luerstub. Placera änden av slangen i önskad reagensmedels lösning, Fyll sprutan med reagensen.
    4. Sätt in den rostfria kontaktstiftet i polyuretanslangen som är ansluten till sprutan och fyll slangen med reagensen. Vid användning av små reaktions volymer kommer reagensen inte in i behållaren, och själva slangen kommer att fungera som reservoaren. Koppla bort sprutan och sätt in kopplings stiftet i ett av flödes skiktets inloppshål på mikroflödessystem-enheten.
    5. Tryck på varje reservoarer med hjälp av tryckregulatorn programvara för att tvinga reagenser i mikroflödessystem enheten.
  3. Ansluta kylda vätskor till mikroflödessystem enheten
    1. Se till att vattenkylare och Peltier elementet har aktiverats, med Yttemperaturen på Peltier inställd på 4 ° c. Montera kyl inställningen så nära den mikrofluidiska enheten som möjligt, vilket minimerar den okylda volymen mellan Peltier och enhetens inlopp.
    2. Anslut den öppna änden av PTFE-slangen till slangar anslutna till en av vätskebehållarna (som beskrivs i avsnitt 4,2) med en kontaktstift av rostfrittstål (OD: 0,65 mm, ID: 0,35 mm, L: 8 mm).
    3. Anslut en liten spruta (1 mL) till en Luerstub (23 G, 1/2 ") med en kort längd på slangen (OD: 0,06", ID: 0,02 ") fäst på änden. Fyll sprutan med den att-be-cooled reagens (här, den IVTT reaktions lösning).
    4. Anslut PEEK slangen till sprutan via den bindväv slangen och tillämpa konstant tryck på sprutan, tvinga reagensen genom PEEK slangen och in i PTFE slangen. Koppla bort Peek-slangen från sprutan och sätt in den direkt i en av flödes kanalens inlopp på mikroflödessystem-enheten. När trycket appliceras via tryckregulatorns programvara kommer det kylda reagensen att tvingas in i den mikrofluidiska enheten.

5. experimenterande

Anmärkning: innan experiment utförs alla hårdvara och slangar anslutningar som beskrivs i protokollen avsnitt 3 och 4 bör slutföras, och alla reagenser bör anslutas till enheten. Det experimentella förfarandet kan sedan delas in i fyra distinkta delar: 1) lastning av mikroflödessystem enhet, 2) förbereda Mikroskop, 3) kalibrering av anordningen, och 4) utför experimentet. Det anpassade virtuella kontroll gränssnittet (se figur 7) som används i denna forskning tillhandahålls som en kompletterande resurs via materiallistan)

  1. Ladda mikroflödessystem-enheten
    1. Placera mikroflödessystem-enheten med alla styr-och flödes lager slangar fästa i mikroskopet och Stäng eventuella öppningar på inkubatorn. Ställ in inkubatorens omgivningstemperatur på 29 ° c. Säkerställ att kylsystemet är påslaget och inställt på 4 ° c innan försöket påbörjas.
    2. Säkerställ att alla flödes-och kontroll kanaler är trycksatta. Ställ in trycket på kontroll kanalerna 1-3 vid 1 bar, och tryckkontroll kanalerna 9-29 på 3 bar. Reagenserna kräver ett tryck på mellan 20 och 100 mbar som skall appliceras på vätskebehållarna med hjälp av tryckregulatorns programvara.
    3. Ta bort luft från mikroflödessystem-enheten med en av reagensen. Stäng uttaget på enheten (tryck på kontroll kanal 29) och tryck samtidigt på kontroll kanalerna 1-3 och 15-28. Sedan selektivt trycksätta kontroll kanalerna för multiplexer så att den valda reagensen att flöda in i enheten. Använd mikroskopet för att övervaka avlägsnandet av luft.
      Anmärkning: om reagenser inte laddas in i enheten på rätt sätt, eller att luftbubblorna inte tas bort, kan trycket ökas upp till 350 mbar.
    4. Se till att alla reagenser flyter på rätt sätt, utan att tillföra luft med hjälp av spolfunktionen i styr programvaran. Övervakning av vätskeflödet kan förenklas genom att först ladda en fluorophore och övervaka dess förskjutning av enskilda reagenser.
  2. Förbereda mikroskopet
    1. Med hjälp av mikroskopet, lokalisera alla punkter av intresse (en enda punkt inom varje reaktor är tillräcklig) inom den mikroflödessystem enheten, och lagra koordinaterna därav. Dessa punkter kommer att avbildas under kalibrerings-och experiment processerna.
      Obs: under kalibrerings-och experiment procedurerna som ingår i styr programvaran instrueras mikroskopet att regelbundet ta bilder på de tidigare lagrade koordinaterna. För att uppnå detta kommunicerar styr programvaran med Mikroskop programvaran och informerar den om att spela in nya bilder. Denna kommunikation är unik för varje Mikroskop setup, och som sådan denna funktion har ändrats inom det medföljande programvarugränssnittet. Förutsatt är en dummy körbara, som kan ändras av slutanvändaren för kompatibilitet med sina egna Mikroskop system.
  3. Kalibrera mikroflödessystem-enheten
    1. Bestäm den vätskevolym som förflyttas från varje reaktor under ett enda inflödes steg (pumpsekvens som tillhandahålls av peristaltiskt manövrerande manöver kanaler 15-17, innefattande 6 MODBUS-kommandon utförda sekventiellt), genom att köra kalibrerings protokollet som finns i programvarupaketet.
    2. Ställ in följande datafält i styr programvaran: Elueringskanalen, fluorophore-kanalen, antal utspädningar (Standardvärdet är 10 späder), antal inflödes steg (standard är 15 steg), antal blandnings cykler (standard är 4 cykler), och tid mellan Blandningscykler (Standardvärdet är 0 sekunder). Initiera kalibreringen genom att trycka på utför kalibrerings experiment.
      Obs: under kalibreringsprocessen fylls alla reaktorer med en fluorophore och bilder registreras. Därefter utförs en serie utspädningar där en elueringslösning mäts in i reaktorerna (baserat på det inställda antalet inflödes steg) och därmed tränger undan fluorophore. Efter noggrant mixning tas nya bilder. Den här processen upprepas för det inställda antalet utspädningen cykler.
    3. Efter avslutad kalibrering, Följ stegen som presenteras av styr programvaran, slutföra analysen av kalibrerings experimentet.
      Obs: analysen kommer att ge användarna uppdaterings förhållandet för varje reaktor baserat på fluorescensminskningen som registrerats under varje utspädnings cykel. Detta värde anger den del av reaktor volymen som fördrivits av det inställda antalet inflödes steg. Detta värde kommer i sin tur att användas under experiment för att bestämma hur många inflödes steg som krävs för att förflytta en viss reaktor volym.
  4. Utföra experimentet
    1. Ange nödvändiga värden för det önskade experimentet i det virtuella kontroll gränssnittet. Kritisk är uppdaterings fraktionen [%] som bestämmer reaktor volymen som förflyttas per experiment cykel och bör ställas in mellan 15 och 40%.
      Anmärkning: det specifika experimentella protokollet kommer att avgöra vilka fält i kontroll gränssnittet som ska ställas in innan experimentet inleds. Vissa mindre kodning kommer att krävas för att anpassa kontroll gränssnittet för nya experiment.
    2. Initiera experiment protokollet genom att trycka på knappen utför experiment i kontroll gränssnittet.
      Obs: oförändrat, den medföljande programvaran initierar ett enkelt proteinuttryck. Reaktorer 1 och 8 utnyttjas som kontroller, medan reaktorerna 2-7 hus identiska experiment. Här består 75% av reaktor volymen av ivtt-lösning och 25% är antingen ultrarent vatten eller en 2,5 NM linjär DNA-lösning. Utspädningar inträffar var 15: de minut, och 30% av reaktor volymen förskjuts per utspädning. Bilderna registreras i slutet av varje utspädnings cykel.

6. analys av data

Obs: skript har tillhandahållits för analys av bilderna (se kompletterande filer eller tabellen av material), som utnyttjar "bfopen" analyspaket, som krävs för översynen av ". nd2" filer (som tillhandahålls av våra installation av Mikroskop).

  1. Kör analys skriptet "Calibrationscript. m" och en gång uppmanas välja önskad ". nd2" fil. En enda reaktor bild kommer att visas med vilken rätt bildintensitet kan bestämmas. Använd reglaget för att optimera bildens intensitet så att kanterna på mikroflödessystem-kanalen syns tydligt.
  2. En bild av reaktorn visas. I den här bilden väljer du ett område inuti reaktor kanalen där fluorescensintensiteten ska bestämmas.
    Obs: fluorescensintensiteten för varje reaktor, för varje inspelad bild kommer att bestämmas med de resultat som visas i en enkel Plot, vilket gör att visualiseringen av resultaten.

Representative Results

För att demonstrera effektiviteten av Multilayer mikroflödessystem plattform för ledning av ivtt experiment, den beskrivna installationen användes för att uttrycka degfp proteinet. Försöket genomfördes i en kommersiellt tillgänglig30 ivtt reaktionsblandning-som omfattar alla nödvändiga transkription och översättning komponenter-kompletteras med reaktions substrat och DNA-mallar. Experiment utfördes vid en temperatur på 29 ° c. en temperatur som befunnits vara optimal för IVTT-uttrycket av proteiner.

Den mikroflödessystem enheten besitter nio unika inlopp, varav fyra utnyttjades under detta experiment. Den första innehöll den kommersiellt erhållna IVTT reaktionsblandningen. Den ivtt reaktionsblandningen rymmer alla komponenter som krävs för att framgångsrikt uttrycka proteiner men, renade GAMS lades till reaktionsblandningen-vid en slutlig koncentration av 1,3 μm-före lastning i mikroflödessystem enheten. Tillsatsen av GamS protein tjänar till att minimera nedbrytningen av linjära DNA-arter vid utförandet av experimenten. Avgörande var den ivtt blandningen injiceras i polytetrafluoreten (PTFE) slang lindade på ett Peltier element med en yttemperatur på 4 ° c för att kyla lösningen före injektion därav i mikroflödessystem enheten; förhindra nedbrytning av reaktions lösningen innan den används. Micro-Bore polyetereterketon (PEEK) slangar användes för att ansluta PTFE slangen lämnar Peltier element ytan med mikroflödessystem enheten, minska volymen av ivtt reaktionsblandningen inte kyls. Den andra lösningen insatt i anordningen innehöll den linjära DNA-mallen kodning för degfp-upplöst i ultrarent vatten-vid en koncentration av 10 nm. Den tredje lösningen, ultrarent vatten, tjänade flera syften under experimentella förfaranden. I första hand användes ultrarent vatten för att säkerställa att den fördrivna volymen per utspädning var lika för alla reaktorer, i egenskap av ersättning för DNA i kontroll reaktionerna. Dessutom användes ultrarent vatten för att späda ut fluorophore under kalibrering av enheten och för att spola enhetens döda volym vid växling mellan reagenser. Den slutliga lösningen som satts in i enheten var en renad FITC-dextran-lösning (25 μM) som krävdes för att utföra den initiala kalibrering av enheten. DNA-, vatten-och fluorophore-lösningarna injicerades i slangar (0,02 "ID, 0,06" OD) som senare kunde sättas in i en av inflödes kanalerna för mikroflödessystem-enheten enligt avsnitt 4,2 i protokollen. Dessa lösningar lagrades vid 29 ° c i hela experimenten.

Aktivering av kontroll kanalerna på mikroflödessystem-enheten uppnås via anpassad kontrollprogramvara där var och en av kontroll kanalerna kan manövreras individuellt. Utförandet av förlängda IVTT reaktioner kan inte uppnås genom denna manuella process och kräver användning av automatiserade protokoll som ingår i kontrollprogram varan. När du förbereder en mikroflödessystem enhet för experiment, liknande automatiserade protokoll kan utnyttjas för att utföra ett antal användbara processer: spolning av enheten död volym med en ny reagens, blandning av reagenser i ring reaktorn, och lastning av en ny reagens i reaktorn samtidigt som den tränger in i en lika volym av den aktuella lösningen. Dessutom finns två komplexa processer: ledning av en anordning kalibrering, och utförandet av ett långvarigt cellfritt proteinuttryck. Alla de ovan nämnda processerna kan enkelt utföras från huvudgränssnittet, tillsammans med möjligheten att konfigurera flera parametrar för att variera specifika processinställningar som inflödes kanalen, inflödes volymen och blandningstiden.

På grund av variationer i tryck och ojämnheter vid mikrofluidisk tillverkning kan vätskevolymen som förflyttas under en enda injektions cykel variera mellan olika enheter. Före utförandet av IVTT-experiment bestämdes den förflyttade reaktor volymen per injektions cykel (uppdaterings fraktion). Denna kalibrering kräver fyllning av alla åtta reaktorer med en fluorescerande referenslösning. I detta fall användes en renad FITC-dextran-lösning (25 μM). Därefter späds reaktorerna ut 10 gånger med ultrarent vatten. Genom att mäta minskningen av fluorescensen per utspädnings cykel för varje reaktor bestämdes den vätskevolym som fördrivits under en enda injektions cykel. I kontrollprogram varan registrerades detta värde ( uppdaterings förhållandet) för användning under ivtt-experimentet. Avgörande är att hänsyn till variationer i flödet över anordningen, samt avvikelser i de enskilda reaktorvolymerna, uppdaterings förhållandet bestäms och lagras för varje enskild reaktor. Sekvensen av fyllning och utspädning reaktorerna genomfördes automatiskt med hjälp av utföra kalibrerings program som utgör en del av styr programvaran. Resultaten av kalibrerings experimentet visas i figur 8.

Den mest komplexa förprogrammerade processen utför en lång varaktighet IVTT experiment, så att användarna kan initiera experimentet och därefter låta den fungera obevakad tills slutförandet. Under experimentet användes reaktorer 1 och 5 som ämnen, där endast vatten tillförs reaktorerna under utspädningar. Reaktorerna 2 och 6 utnyttjades som negativa kontroller och innehöll endast ivtt reaktions lösning och ultrarent vatten. De kvarvarande reaktorerna (3, 4, 7 och 8) innehöll IVTT reaktions lösningar och 2,5 nM linjär DNA-kodning för deGFP-genen. Initialiseringen av reaktorerna uppnås genom att helt fylla alla reaktorer (exklusive 1 och 5) med ivtt reaktions lösning, innan 25% av reaktor volymen förflyttades med ultrarent vatten. Hädanefter initierades den periodiska injektionen av reagenser i reaktorerna. Experimentet genomfördes så att nya reagenser injicerades i reaktorerna var 14,7 minuter, med 30% av reaktor volymen som förskjuts under varje utspädnings cykel. Sammansättningen av varje injektion var sådan att 75% av den injicerade vätskan bestod av färsk ivtt-lösning, medan resterande 25% bestod av antingen DNA eller ultrarent vatten. Efter varje injektion av nya reagenser blandades reaktorerna kontinuerligt, varefter en fluorescensbild av varje reaktor spelades in med hjälp av mikroskopet. Reaktionen fick därefter köras kontinuerligt för 68 cykler, vilket resulterade i en experimentell varaktighet på 16,5 h. Resultaten av detta experiment ges i figur 9.

När du utför förlängda IVTT experiment, det finns två huvudsakliga orsaker till misslyckandet av en reaktion; införandet av luft i den mikrofluidiska anordningen eller nedbrytningen av IVTT reaktions lösning. Förekomsten av luft i mikroflödessystem enheten är oftast det direkta resultatet av små luftbubblor som finns i inflödes lösningar, som därefter injiceras i mikroflödessystem enheten. Vid inträdet i enheten, närvaron av luft hämmar korrekt flöde av vätskor, varvid reaktionerna inte längre periodiskt uppdateras leder till bildandet av partiet reaktioner inom reaktor ringarna. I vissa fall avlägsnas luften långsamt från anordningen genom upprepad spolning av reagenser, varefter reaktionen fortsätter som avsett (som visas i figur 9). I andra fall luften förblir fångade, och kan endast avlägsnas genom att avbryta försöket och därefter tillämpa kontinuerligt (högt) Tryck på flödet lagret av mikroflödessystem enheten, analogt med fyllningsprocessen som beskrivs i avsnitt 5,1 i protokollen. Under våra experiment cellen lysate lagras i PTFE slangar på ett Peltier element kyls till 4 ° c. Båda åtgärderna stöd för att begränsa nedbrytningen av IVTT reaktions lösning över tid, med inert PTFE slangar säkerställa begränsad interaktion mellan slangen och reaktions lösningen och de kalla temperaturerna bevara funktionella (BIO) molekylära komponenter krävs för att utföra ivtt. Skulle nedbrytning av reaktions lösningen inträffa-som ett resultat av otillräcklig kylning eller oönskade interaktioner mellan reaktions lösningen och lagringsmiljön-då detta kommer att ställa ut sig experimentellt som en gradvis minskning av protein uttryck över tid. När den har försämrats kan inte IVTT-reaktionslösningen återvinnas och ett nytt experiment bör förberedas.

Figure 1
Figur 1. Den maskinvaruinställning som krävs för att utföra kontinuerliga IVTT-reaktioner. A) Schematisk inställning av maskinvara. B) fotografi av den inställning som används i detta manuskript. Implementeringen av en Multilayer mikroflödessystem enhet för kontinuerlig ivtt reaktioner kräver en omfattande hårdvara setup för att reglera flödes trycket, aktivera styr kanaler, värme och kyla reaktioner och reagenser, lagra vätskor, och bildenheten under Experiment. Experiment utförs vid temperaturer på 30 ° c, vilket uppnås genom att mikroskopet placeras i en inkubator inställd på denna temperatur. För att förhindra försämring av IVTT reaktions lösning, det lagras inom PTFE slang lindade över det kalla ansiktet på en Peltier element. Temperaturen på Peltier elementet är inställd på 4 ° c, med en vattenkylare och vatten block som används för att bibehålla denna temperatur. Reagenser som inte kräver kylning lagras i vätskebehållare utanför Mikroskop inkubatorn. Konstant tryck appliceras på dessa reservoarer av en datorstyrd tryckregulator. På detta sätt, vätskorna tvingas genom utlopp rören av reservoarerna, som ansluts direkt till inflöde kanaler av mikroflödessystem enheten. Varje kontroll kanal för mikroflödessystem enheten är ansluten till en pneumatisk ventil. Hela ventilmatrisen är under konstant tryck. Öppna ventilen, möjliggör trycksättning av vätskan i slangen ansluter pneumatisk ventil till kontrollkanalen av mikroflödessystem enheten, vilket öppnar och stänger PDMS membran som finns i mikroflödessystem enheten. De pneumatiska ventilerna öppnas och stängs via ett användargränssnitt som befaller en fält buss styrenhet (ej visad) att öppna och stänga specifika pneumatiska ventiler. Figur anpassad från Yelleswarapu et al.22. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Översikt över pneumatisk ventilinställning och kontroll kanalanslutning. En 8-ventils matris visas med tre kontroll kanalanslutningar monterade på ventiler 1, 2 och 3. Tryckluft kan levereras till ventilen array via 1/4 "slangar. För ansättningar av kontroll kanalerna används två tryck: 1 bar för de lägre tryckkontroll kanalerna (1, 2 och 3) och 3 bar för de högre tryckkontroll kanalerna (9 till 30, visas inte här). Slangen kan fyllas med ultrarent vatten och infogas i en av de kontroll kanal inlopp med en rostfri kontaktstift. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Översikt över den kommersiella flödes trycks regulatorn och reservoarsystemet. En kommersiellt tillgänglig tryckregulator används för att injicera vätskor i flödes skiktet i Multilayer mikroflödessystem enhet. Anslutning av tryckregulatorn till en dator möjliggör modulering av det tryck som används för att utföra vätske injektioner. Reagenser kan förvaras i en vätskebehållare som är direkt kopplad till tryckregulatorn. Tillämpningen av trycket på reservoaren tvingar vätskan ut ur behållaren via utloppsslangen. Denna utlopp kan anslutas direkt till en av vätske inlopp av mikroflödessystem enheten med en rostfri kontaktstift. I händelse av att reagensmedels volymen inte kan nå vätskebehållaren, fungerar utloppsslangen som en reservoar för reagensen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Översikt över kylsystemet som används för att kyla reaktions reagenser. (Vänster) isolerad kylning setup och (höger) kylning setup placeras i Mikroskop och ansluten till mikroflödessystem enheten. En Peltier element används för att kyla ivtt reaktions lösning före injektion i den mikroflödessystem enheten. Reagensen lagras inom PTFE slang lindade över den kalla-ansikte av Peltier elementet. En längd av Peek slang används för att överföra den kylda vätskan till mikroflödessystem enheten, med den lilla inre diameter (0,005 ") minimerar reagensvolymen inte längre kyls. Vid sidan av lindade PTFE slangar, är en termistor placerad, vilket möjliggör realtid temperaturövervakning på ytan av Peltier elementet. Den spänning som appliceras på Peltier är inställd så att Yttemperaturen på Peltier förblir mellan 0 ° c och 4 ° c. För att avlägsna överskottsvärme som produceras av Peltier elementet, är den varma ansikte Peltier placerad mot en vattenkyld block, med tillsats av silikonfri kylfläns fett säkerställa optimal värmeöverföring mellan de två ansikten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Översikt över mikrofluidic-enhetens design. Den mikroflödessystem flödes reaktorn för kontinuerliga ivtt reaktioner består av åtta reaktor ringar, vardera med en volym av 10,7 nl. Nio inlopp möjliggör inflödet av nio unika reaktions lösningar i anordningen. 24 styr kanaler reglerar flödet av vätskor i enheten. Styrkanalerna 9 till 14 bildar en multiplexer. Dessa kontroll kanaler bör vid alla tidpunkter vara trycksatta för att hämma vätskeflödet i enheten. Trycksättning av två styr kanaler samtidigt möjliggör inflödet av en enda reagens. Kontroll kanalerna 15, 16 och 17 används för att på ett kontrollerat sätt pumpa reagenser i enheten. Kontrollera kanalerna 18 till 25 varje kontroll inloppet av en av de åtta reaktorer som finns i enheten. Kontroll kanal 26 kan stänga spolkanalen, vilket tvingar in vätska i reaktorerna. Kontroll kanal 27 stöd i en homogen fyllning av reaktorerna. Kontroll kanalerna 28 och 29 reglerar ring reaktorns utlopp och det enda enhets uttaget. Slutligen, kontroll kanalerna 1, 2, och 3 används för att peristaltically pumpa vätskan i ring reaktorerna, vilket resulterar i blandning av reagenser. Utformningen av denna mikroflödessystem enhet och figuren är båda anpassade från neiderholtmeyer et al.29. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Membran baserad ventil i mikroflödessystem-enheten. A) flödeskanal inom mikroflödessystem-enheten. Två kontroll kanaler kan ses i bakgrunden. Dessa kanaler är inte trycksatta och som sådana ventilerna är öppna (vätska kan flöda). B) de två kontroll kanalerna som genomskär flödes skikts kanalerna har tryckts och stänger ventilerna (dvs. vätskeflödet hindras). Vid trycksättning av kontroll kanalerna reflekeras det tunna PDMS-membranet som separerar flödes-och kontroll skikts kanalerna uppåt (kontroll skiktet ligger under flödes skiktet) som stänger kanal för flödes skiktet. Avrundningen av kanalen flödes skikt är kritisk för att säkerställa att det reflekerade membranet helt stänger flödeskanalen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7. Användargränssnitt som används för att styra mikroflödessystem enhet. Under hela denna forskning, ett anpassat kontroll gränssnitt har använts för att kontrollera flödet av vätskor inom mikrofluidic enheter. Gränssnittet tillåter användare att individuellt manövrera var och en av kontroll kanalerna (numrerade 1-3 och 9-29), eller att utföra utarbetade protokoll som resulterar i spolning och lastning av reagenser, kalibrering av mikroflödessystem enheten, och utförandet av Experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8. Resultat av ett kalibrerings experiment. Under ett kalibrerings experiment fylls reaktorerna med en fluorophore (25 ΜM FITC-dextran) varefter fluorescensintensiteten registreras. Därefter följer en serie utspädningar, där ett inställt antal inflödes steg (15) används för att injicera ultrarent vatten i reaktorerna. Efter varje spädning blandas reagenserna och fluorescensen mäts. Minskningen av fluorescensintensiteten per utspädning avslöjar volymen av reaktor ringen förskjuten för det inställda antalet inflödes steg. ett värde som kallas uppdaterings förhållandet. a) den genomsnittliga intensiteten och standardavvikelsen för alla åtta reaktorerna visas i rött, med de enskilda intensitetsspåren som visas i grått. B) det genomsnittliga uppdaterings förhållandet och standardavvikelsen visas för varje spädningssteg i rött. De individuella uppdaterings kvoterna för varje enskild reaktor visas i grått. Det kan ses att sju av de åtta reaktorerna visar mycket liknande beteende, men en reaktor visar fluktuationer i uppdaterings förhållandet efter den sjunde utspädnings cykeln. Detta belyser behovet av unika uppdaterings förhållanden för var och en av reaktorerna, i motsats till att använda ett genomsnittligt uppdaterings förhållande för injektion av reagens i reaktorerna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9. Resultat av ett IVTT experiment som uttrycker deGFP-proteinet. En förlängd IVTT reaktion initierades så att 30% av reaktor volymen förskjuts var 14,6 minut. Reaktionen tilläts löpa i över 16 timmar innan den avslutades. Två reaktorer av mikroflödessystem enheten användes som ämnen, med endast ultrarent vatten flögs genom reaktorerna under hela experimentet (reaktorer 1 och 5). Alla andra reaktorer bestod av 75% ivtt reaktions lösning och 25% av antingen ultrarent vatten (reaktorer 2 och 6) eller 2,5 NM linjära DNA-mallar kodning för uttrycket av degfp (reaktorer 3, 4, 7 och 8). I alla fyra reaktorer där DNA lades till finns det tydliga deGFP-uttryck. Tre av de fyra reaktorerna ger liknande fluorescensintensitet, med en reaktor som uppvisar lägre fluorescens-signal. Detta kan bero på en skillnad i flöde som leder till att mindre DNA kommer in i reaktorn, eller på grund av variationer i reaktorns dimensioner. Efter 14 timmar ses en plötslig ökning i signalen från reaktorerna som innehåller DNA. Detta orsakas av en luftbubbla in i flödet lagret av mikroflödessystem enheten, förmodligen kommer från en av inflödet lösningar. Svällning av luft i mikroflödessystem enheten begränsar avsevärt flödet av vätskor genom kanalerna, varvid inga färska reagenser kan läggas till eller avlägsnas från reaktorerna tills luften har passerat. Vid återupptagande av flödet återgår experimentet till sin tidigare fluorescensintensitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande filer. Vänligen klicka här för att ladda ner dessa filer. 

Discussion

En PDMS-baserade Multilayer mikroflödessystem enhet har presenterats, och dess förmåga att upprätthålla ivtt reaktioner under längre tid har visats. Även om väl lämpad för detta specifika exempel, kan denna teknik tänkas användas för många andra program. Den extra kontrollen över vätskeflödet-ihopkopplad med förmågan att kontinuerligt fylla på reaktionsreagens samtidigt som man tar bort (av) produkter-är idealisk för kontinuerliga syntes reaktioner, utredning av olika dynamiska beteenden och samtidig överledning av flera varianter av en enda reaktion.

Trots den relativt enkla tillverkningsprocessen av PDMS-baserade enheter kräver användningen av dessa en omfattande hårdvaruinstallation. Bestående av ventil kedjor, tryckregulatorer, tryck pumpar, inkubatorer och kylaggregat är övergången från tillverkning till användning inte elementär, och kräver en betydande initial investering. Dessutom kräver förmågan att konsekvent sätta upp och utföra lyckade experiment med dessa enheter en betydande tid-investeringar; en punkt som detta manuskript syftar till att ta itu med. Men en gång på plats, kan hela installationen ändras för en rad syften. Dessutom, hårdvara setup omfattar många modulära element, som var och en kan utökas för att tillåta mer komplexa mikroflödessystem enhet mönster som skall användas. Dessutom möjliggör den modulära designen utbyte av maskinvarukomponenter genom liknande fungerande alternativ, så att användarna inte är begränsade till den specifika inställning som beskrivs här48,49.

Variationer mellan enskilda enheter och i de yttre förhållandena (t. ex. tryckfluktuationer) kan resultera i felaktigheter när du utför experiment med hjälp av dessa enheter. För att lösa problemet bör en kalibrering av systemet utföras före varje experiment, vilket ger ett unikt uppdaterings förhållande för var och en av reaktorerna. Även om kalibreringen åtgärdar variationer mellan enhet och enhet och experiment till experiment, är det en tidskrävande process och inte felfri. Vätskor med olika viskositeter kommer inte att flöda med samma hastighet när de utsätts för samma tryck, och som sådan utför kalibreringen med flera reagenser kan inte ge identiska uppdaterings förhållanden. Denna effekt dämpas genom att använda tre styr kanaler för att peristaltiskt pumpa reagenser i mikroflödessystem enheten, i motsats till reglering av flödet genom att variera det levererade trycket endast. Som en sista utväg i fall där skillnaden i viskositet är mycket stor, kan ett unikt uppdaterings förhållande implementeras för varje enskild reagens genom att utföra flera kalibrerings experiment.

Användning av en Peristaltisk pump för att injicera reagenser i mikroflödessystem enheten dämpar effekterna av att använda lösningar med varierande viskositeter, men det skapar också ett sekundärt problem. Använda diskreta steg för att pumpa vätskor i mikroflödessystem enheten, innebär att upplösningen av injektioner i en enda reaktor, begränsas av volymen injiceras när du utför en enda pump cykel. Inom vår forskning är detta värde-fastställt under kalibreringen-ungefär lika med 1%, vilket indikerar att en enda pump cykel förflyttar cirka 1% av reaktor volymen (ca 0,1 nL). Som sådan, undantränger 30% av reaktor volymen kräver utförandet av 30 pumpcykler, med 23 pumpcykler av ivtt reaktions lösning tillsätts, och endast 7 pumpcykler av DNA eller ultrarent vatten som tillsätts. Även om det är tillräckligt för vår forskning, kan alternativa experimentella protokoll stöta på problem när man försöker lägga till ett större antal unika reagenser, använda en lägre uppdaterings fraktion, eller lägga till mindre volymer av en enda reagens till en reaktor. I sådana fall kan mikrofluidic-enhetens design anpassas för att ge reaktorer en större volym. Ett exempel på sådant rapporteras i Niederholtmeyer et al.36.

Det är avgörande att den anordning som beskrivs i detta manuskript medger att reaktioner kan upprätthållas under längre perioder, vilket leder till att transkription och omräkningskurser vid steady-state upprätthålls. Genom att regelbundet injicera nya reagenser i reaktorerna-och ta bort reaktionsprodukter (biprodukter)-är reaktionerna ihållande och komplexa dynamiska beteenden kan övervakas. På detta sätt har en plattform skapats som-i viss mån-härmar den cellulära miljön. Vidare, denna plattform möjliggör utforskning av systemets dynamik, genom att anpassa perioden mellan injektioner och den specifika sammansättningen av injektionerna. Som ett resultat, dessa Multilayer mikroflödessystem enheter är ett kraftfullt verktyg för karakterisering och optimering av nya syntetiska nätverk som visar komplexa dynamiskt beteende.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet, ERC (projekt n. 677313 BioCircuit), ett NWO-VIDI-stipendium från den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO, 723.016.003), finansiering från undervisnings-, kultur-och vetenskapsministeriet (Gravity program, 024.001.035 & 024.003.013), Human Frontier Science program Grant RGP0032/2015, Europeiska forskningsrådet inom Europeiska unionens Horisont 2020 forsknings-och innovationsprogram Grant 723106, och en schweizisk National Science Foundation Grant 200021_182019.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetone VWR 20063.365
AZ 40 XT Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Positive Photoresist
AZ 726 MIF Developer Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Developer Positive Photoresist
Isopropanol Merck KGaA (Darmstadt, Germany) 109634
Microscope slides VWR ECN 631-1550
mr Dev 600 Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) - Developer Negative Photoresist
Silicon Free Heat Sink Grease Circuit Works CW7270 Thermal Compound
Silicon wafers Silicon Materials - <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness
SU-8 3050 Microchem Corp. (Newton, MA) - Negative Photoresist
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) The Dow Chemical Company 01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931-10G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
4 channel digital input/output module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-504 8x
Camera lens The Imaging Source -
Compression fitting Koolance, Inc. FIT-V06X10 Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x
Controller end module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
Device connecting tubing Saint-Gobain Performance Plastics AAD04103 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Device connector pins Unimed SA (Lausanne, Switserland) 200.010-A AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Controller WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
Female bus connector Encitech DTCK15-DBS-K 15 pole female bus connector
Fluid reservoirs Fluigent Fluiwell-4C
Fluigent pressure system Fluigent MFCS-EZ 0 - 345 mbar
Hg short arc lamp Advanced Radiation Corporation - 350W
Hot plate Torrey Pines Scientific HP61
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-E
LabVIEW Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Liquid coolant Koolance, Inc. LIQ-705CL-B
Luer stubs Instech Laboratories, Inc. LS23
Male Luer to barb connectors Cole Parmer 45505-32 3/32" ID
Matlab Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Microcamera The Imaging Source DMK 42AUC03
Microscope camera Hamamatsu Photonics OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
Orbital shaker Cole Parmer EW-513000-05
Oven Thermo Scientific Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher Quorum Technologies K1050X
PDMS puncher SYNEO Accu-Pucnh MP10
PEEK tubing Trajan 1301005001-5F 0.005" ID, 1/32" OD, Red
Peltier element European Thermodynamics APH-127-10-25-S
Peltier temperature controller Warner Instruments CL-100
Photomask CAD/Art Services, Inc. -
Photomask Design Maerkl Lab, EPFL https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatic valve array FESTO - 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.
Power adapter Koolance, Inc. ADT-EX004S 110/220V AC Power Adapter
PTFE tubing Cole Parmer 06417-21 #24 AWG Thin Wall PTFE
Punching pin SYNEO CR0320245N21R4 OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC Tubing Koolance, Inc. HOS-06CL 6 mm ID, 10 mm OD
Single edge blades GEM Scientific -
Soft tubing Fluigent - Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)
Spin coater Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope Olympus Corporation SZ61
Thermistor cable Warner Instruments TA-29 Cable with bead thermistor
UV exposure system ABM, USA - Near UV Exposure System, 350W
Vacuum pump Vacuumbrand GmbH MD1C
Water cooled cold plate block Koolance, Inc. PLT-UN40F
Water cooler Koolance, Inc. EX2-755
Weighing scales Sartorius M-prove

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Roekel, H. W. H., et al. Programmable chemical reaction networks: emulating regulatory functions in living cells using a bottom-up approach. Chemical Society Reviews. 44, 7465-7483 (2015).
  2. Hori, Y., Kantak, C., Murray, R. M., Abate, A. R. Cell-free extract based optimization of biomolecular circuits with droplet microfluidics. Lab on a Chip. , (2017).
  3. Del Vecchio, D., Sontag, E. D. Dynamics and control of synthetic bio-molecular networks. Proceedings of the American Control Conference. , 1577-1588 (2007).
  4. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 410-422 (2009).
  5. Padirac, A., Fujii, T., Rondelez, Y. Bottom-up construction of in vitro switchable memories. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3212-E3220 (2012).
  6. Guido, N. J., et al. A bottom-up approach to gene regulation. Nature. 439, 856-860 (2006).
  7. Genot, A. J., Fujii, T., Rondelez, Y. In vitro regulatory models for systems biology. Biotechnology Advances. 31, 789-796 (2013).
  8. Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403, 335-338 (2000).
  9. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
  10. Montagne, K., Plasson, R., Sakai, Y., Fujii, T., Rondelez, Y. Programming an in vitro DNA oscillator using a molecular networking strategy. Molecular Systems Biology. 7, 466-466 (2014).
  11. Khalil, A. S., Collins, J. J. Synthetic biology: applications come of age. Nature Reviews Genetics. 11, 367-379 (2010).
  12. Hockenberry, A. J., Jewett, M. C. Synthetic in vitro circuits. Current Opinion in Chemical Biology. 16, 253-259 (2012).
  13. Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33, 111-119 (2015).
  14. Cardinale, S., Arkin, A. P. Contextualizing context for synthetic biology - identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnology Journal. 7, 856-866 (2012).
  15. Venturelli, O. S., et al. Programming mRNA decay to modulate synthetic circuit resource allocation. Nature Communications. 8, 1-11 (2017).
  16. Scott, M., Mateescu, E. M., Zhang, Z., Hwa, T. Interdependence of cell growth and gene expression: origins and consequences. Science. 330, 1099-1103 (2010).
  17. Borkowski, O., Ceroni, F., Stan, G. B., Ellis, T. Overloaded and stressed: whole-cell considerations for bacterial synthetic biology. Current Opinion in Microbiology. 33, 123-130 (2016).
  18. Liao, C., Blanchard, A. E., Lu, T. An integrative circuit-host modelling framework for predicting synthetic gene network behaviours. Nature Microbiology. , (2017).
  19. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).
  20. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19, 751-755 (2001).
  21. Oberholzer, T., Nierhaus, K. H., Luisi, P. L. Protein expression in liposomes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 261, 238-241 (1999).
  22. Yelleswarapu, M., et al. Sigma factor-mediated tuning of bacterial cell-free synthetic genetic oscillators. ACS Synthetic Biology. 7, (2018).
  23. Karig, D. K., Iyer, S., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Expression optimization and synthetic gene networks in cell-free systems. Nucleic Acids Research. 40, 3763-3774 (2012).
  24. Dunlop, M. J., et al. Distinct timescales of RNA regulators enable the construction of a genetic pulse generator. Biotechnology and Bioengineering. , (2019).
  25. Yoshiyama, T., Ichii, T., Yomo, T., Ichihashi, N. Automated in vitro evolution of a translation-coupled RNA replication system in a droplet flow reactor. Scientific Reports. 8, 1-8 (2018).
  26. Iyer, S., Karig, D. K., Norred, S. E., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Multi-input regulation and logic with T7 promoters in cells and cell-free systems. PLoS ONE. 8, 1-12 (2013).
  27. de los Santos, E. L. C., Meyerowitz, J. T., Mayo, S. L., Murray, R. M. Engineering Transcriptional Regulator Effector Specificity Using Computational Design and In vitro Rapid Prototyping: Developing a Vanillin Sensor. ACS Synthetic Biology. 5, 287-295 (2016).
  28. Guo, S., Murray, R. M. Construct functional feedforward loop biological circuits in a cell-free system and in cells. ACS Synthetic Biology. , (2019).
  29. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9, (2017).
  30. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The all E. coli TX-TL toolbox 2.0: A platform for cell-free synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5, 344-355 (2016).
  31. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  32. Lee, J. W., et al. Creating single-copy genetic circuits. Molecular Cell. 63, 329-336 (2016).
  33. Gibson, D. G., et al. Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a mycoplasma genitalium genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
  34. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3, 387-397 (2014).
  35. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: new opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16, 269-281 (2016).
  36. Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15985-15990 (2013).
  37. Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Y., Alakhov, Y. B. A continuous cell-free translation system capable of producing polypeptides in high yield. Science. 242, 1162-1164 (1988).
  38. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345, 829-832 (2014).
  39. Timm, A. C., Shankles, P. G., Foster, C. M., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Toward microfluidic reactors for cell-free protein synthesis at the point-of-care. Small. 12, 810-817 (2016).
  40. Doktycz, M. J., Foster, C. M., Retterer, S. T., Timm, A. C., Shankles, P. G. Characterization of extended channel bioreactors for continuous-flow protein production. Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 33, 06FM02 (2015).
  41. Khnouf, R., Beebe, D. J., Fan, Z. H. Cell-free protein expression in a microchannel array with passive pumping. Lab on a chip. 9, 56-61 (2009).
  42. Siuti, P., Retterer, S. T., Doktycz, M. J. Continuous protein production in nanoporous, picolitre volume containers. Lab on a Chip. 11, 3523-3529 (2011).
  43. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16, 2168-2187 (2016).
  44. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: Application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synthetic Biology. 1, 29-41 (2012).
  45. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, 1-18 (2015).
  46. Galas, J., Haghiri-Gosnet, A. -M., Estévez-Torres, A. A nanoliter-scale open chemical reactor. Lab on a Chip. 13, 415-423 (2013).
  47. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288, 113-116 (2004).
  48. Brower, K., et al. An open-source, programmable pneumatic setup for operation and automated control of single- and multi-layer microfluidic devices. HardwareX. 3, 117-134 (2018).
  49. White, J. A., Streets, A. M. Controller for microfluidic large-scale integration. HardwareX. 3, 135-145 (2018).

Tags

Bioteknik mikrofluidik in vitro-transkription och översättning syntetisk biologi förlängda reaktioner mikroreaktorer proteinuttryck
En Multilayer Microfluidic plattform för ledning av långvarig cell-fri genuttryck
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Linden, A. J., Yelleswarapu, … More

van der Linden, A. J., Yelleswarapu, M., Pieters, P. A., Swank, Z., Huck, W. T. S., Maerkl, S. J., de Greef, T. F. A. A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression. J. Vis. Exp. (152), e59655, doi:10.3791/59655 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter