Summary
Мы внедряем воспроизводимый и стабильный метод оптической записи для ломтиков мозга с помощью чувствительных к напряжению красителя. В статье описывается напряжение чувствительных красителя окрашивания и записи оптических сигналов с помощью обычных гиппокампа срез препаратов.
Abstract
Широкоугольное однополевое фотонное напряжение-чувствительное красителя (VSD) изображение препаратов среза мозга является полезным инструментом для оценки функциональной связи в нейронных цепях. Из-за дробного изменения светового сигнала было трудно использовать этот метод в качестве количественного анализа. В этой статье описана специальная оптика и системы обработки срезов, которые делают этот метод стабильным и надежным. В настоящей статье демонстрируется обработка ломтиков, окрашивание, и запись VSD окрашенных гиппокампа ломтиками в деталях. Система поддерживает физиологические условия в течение длительного времени, с хорошим окрашиванием, и предотвращает механические движения ломтика во время записи. Кроме того, это позволяет окрашивать ломтики с небольшим количеством красителя. Оптика достигает высокой численной диафрагмы при низком увеличении, что позволяет записывать сигнал VSD при максимальной частоте кадров 10 кГц, с 100 пиксельным х 100-пиксельным пространственным разрешением. Благодаря высокой частоте кадров и пространственному разрешению, этот метод позволяет применять фильтры после записи, которые обеспечивают достаточное соотношение сигнала к шуму для оценки изменений в нейронных схемах.
Introduction
Широкоугольное однополевое фотонное напряжение-чувствительное красителя (VSD) изображение навалом окрашенных препаратов ломтик мозга стало полезным количественным инструментом для оценки динамики нейронных цепей1,2,3,4 . После анализа изменений в оптических свойствах из-за возбуждения мембраны5,6,7, VSD изображений был впервые описан в начале 1970-х годов Коэн и другие6,8, 9. ; это подходящий метод для мониторинга функций мозга в режиме реального времени, как краситель непосредственно зондирует мембраны потенциальных изменений (т.е. основной сигнал нейронов).
Самые ранние VSD обладали желательными характеристиками, чтобы понять систему мозга, такие как быстрое время-постоянная следовать быстрой кинетики нейрональных мембранных потенциальных событий, и линейность с изменением мембранного потенциала9, 10 Лет , 11 Год , 12 Лет , 13 Год , 14 Год , 15. Как и в других экспериментах изображений, этот метод требует широкого спектра конкретных тюнингов, таких как камеры, оптика, программное обеспечение и срез физиологии, для достижения желаемых результатов. Из-за этих технических трудностей ожидаемые выгоды в ходе первоначальных усилий не обязательно материализовались для большинства лабораторий, которые не специализируются на этом методе.
Основной причиной технической сложности была низкая чувствительность VSD к мембранному потенциальному изменению при применении к объемному окрашиванию среза. Величина оптического сигнала (т.е. дробное изменение флуоресценции) обычно составляет 10-4-10-3 сигнала управления (F0) в физиологических условиях. Временной масштаб мембранного потенциального изменения в нейроне составляет примерно миллисекунды до нескольких сотен миллисекунд. Для измерения изменений в мембранном потенциале нейрона камера, используемая для записи, должна иметь возможность приобретать изображения с высокой скоростью (от 10 кГц до 100 Гц). Низкая чувствительность VSD и скорость, необходимая для следовыза тье нервного сигнала, требует большого количества света, который будет собираться на камеру на высокой скорости, с высоким соотношением сигнала к шуму (S/N)2,16.
Оптика системы записи также является критическим элементом для обеспечения сбора достаточного количества света и улучшения S/N. Увеличение достигается оптики часто чрезмерно низким, таких как 1X до 10X, чтобы визуализировать локальные функциональные нейронной цепи. Например, для визуализации динамики гиппокампа цепи, увеличение примерно 5 будет подходящим. Такое низкое увеличение имеет низкую эффективность флуоресценции; поэтому передовая оптика была бы полезна для такой записи.
Кроме того, срез физиологии также имеет важное значение. Так как анализ изображений требует, чтобы ломтики были нетронутыми, тщательная обработка срезов необходимо17. Кроме того, меры, принятые для поддержания жизнеспособности ломтик в течение более длительного времени имеют важное значение18.
В настоящей статье описывается протокол для подготовки ломтиков, VSD окрашивания, и измерений. В статье также излагаются улучшения VSDs, устройства визуализации и оптики, а также другие дополнительные уточнения экспериментальной системы, которые позволили использовать этот метод в качестве простого, мощного и количественного анализа для визуализации модификация функций мозга19,20,21,22,23,24,25. Техника также может быть широко использована для долгосрочного потенцирования в области CA1 гиппокампа ломтиками1. Кроме того, этот метод также полезен в оптической записи мембранных потенциалов в одной нервной клетке26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и использованию Университета Токусима Бунри. Следующий протокол для подготовки ломтика почти стандартная процедура27 , но изменения были протоколы окрашивания и записи с VSD.
1. Подготовка перед днем эксперимента
- Подготовка акции A (Таблица 1), акции B (Таблица 2), и акции C (Таблица 3) решений и хранить в холодильнике.
- Приготовьте 1 л искусственной спинномозговой жидкости (ACSF)(Таблица 4, см. шаг 3) и держите его в холодильнике.
- Подготовка 1 L модифицированных ACSF(Таблица 5) и держать его в холодильнике.
- Распределите 500 аликвот плода из сыворотки крупного рогатого скота (FBS) в флаконах 2 мл и храните в морозильной камере.
- Растворите 4% порошка агара в ACSF (около 120 мл) в микроволновой печи и вылейте его в 90 мм одноразовую чашку Петри. Агар пластины должны быть охлаждены перед дальнейшим использованием.
- Поместите следующие предметы в морозильную камеру за день до эксперимента: хирургический лоток, контейнер для слайса и алюминиевый охлаждающий блок (120 x 120 x 20 мм3).
- Убедитесь, что есть достаточно еленросы кольца с мембранными фильтрами для системы обработки ломтиков17,28 (см. шаг 6.12).
- Растворите 2% порошка агара в 50 мл 3 М ККл в микроволновой печи. Возьмите около 85 л теплого растворителя агар-KCl в 200 наконечниках Л л с помощью микропипетта для заземления электрода. Отсоедините кончик в еще теплый гель агар агар агар агар агар 3 M KCl. Повторите шаг, чтобы заполнить около 20-40 советов с 2% агара.
2. Подготовка акционерного решения VSD (di-4-ANEPPS)
- Приготовьте 1 мл 10% полиэтиледовка касторового раствора с ультра-чистой водой.
- Добавьте 1 мл этанола в флакон ди-4-ANEPPS (5 мг флакона), вихрь и соникат в течение 10 мин. Раствор превратится в темно-красный цвет с возможными небольшими остатками кристаллов di-4-ANEPPS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этанол, используемый в этом шаге, должен быть свежераскрытым. - Перенесите раствор на микротрубку 2 мл с O-кольцом. Скрутите раствор и добавьте 500 л 10% полиэтилеобразного касторового раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Краситель очень липофильные. DMSO и poloxamer также могут быть использованы для растворения ди-4-ANEPPS, но с точки зрения оптического сигнала при изменении мембранного потенциала, мы обнаружили, что использование этанола -полиэтиксилатного касторового масла дает лучший сигнал к соотношению шума. Это может быть связано с скоростью передачи растворителя в клеточную мембрану. - Вихрь и соники, пока краситель полностью не растворится.
- Избегайте воздействия света и держите его в холодильнике. Не храните в морозильной камере. Акции могут длиться в течение нескольких месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: В день эксперимента следуйте шагам 3-9.
3. Ежедневная подготовка ACSF (1 L) (таблица 4)
- Взвесить NaCl, NaHCO3и глюкозу в колбе.
- Добавьте 950 мл дистиллированной воды в колбу иначните кипит 95% O 2/5% CO2 газа.
- Добавьте 2,5 мл бульона Раствор в колбу и инкубировать в течение примерно 10 минут при комнатной температуре.
- Добавьте в колбу 2,5 мл бульона С.
- Добавить дистиллированную воду, чтобы сделать решение до 1 л.
4. Ежедневная подготовка окрашивания VSD Ssolution
- Сноуcate флакон 500 л FBS и VSD фондового раствора (шаг 2) в ультра-звуковой в течение 5 минут.
- Добавьте 500 л свежеприготовленного ACSF во флакон FBS.
- Добавьте 20 (в случае мышей) или 40 (в случае крыс) Зл VSD стокового раствора к флакону.
- Ультра-sonicate и вихрь флакон до раствора становится бледно-оранжевый.
5. Подготовка к хирургии
- Возьмите 100 мл охлажденных ACSF отдельно в 300 мл контейнера из нержавеющей стали, стакан 300 мл, и пластиковый контейнер, и поместите их в морозильную камеру. Налейте 150 мл охлажденных модифицированных ACSF(Таблица 2) в другой стакан и поместите его в морозильную камеру. Подождите, пока решения охлаждаются; задейтесь времени должны быть измерены и определены заранее.
- Сложите, чтобы сломать лезвие бритвы (углеродная сталь, промышленный сорт толщиной 0,13 мм, лезвие с обеих сторон) пополам для среза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другая половина может быть использована для вскрытия с надлежащей держатель лезвия. - Подготовьте блок из 4% агаровой пластины ACSF с регулируемым джигом(рисунок1).
- Подготовьте влажную инкубационную камеру (камера типа интерфейса; модифицированная 1,2 л плотно йенсеной коробки с силиконовой упаковкой) для сохранения срезов мозга физиологически живыми(рисунок2); добавить ACSF в небольшой контейнер и карбонат с 95% O2/5% CO2 газа, и заполнить 90 мм х 20 мм Петри блюдо с ACSF в к началу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Меньше едрые блюда Петри (60 мм х 20 мм) должны быть размещены в центре 90 мм блюдо для поддержки фильтровальной бумаги на блюдо. - Положите коробку на нагревательное устройство и подождите 20 минут, чтобы прогреть ее до 28 градусов по Цельсию.
- Добавить дробленый лед в контейнер слайсера. Поместите следующие инструменты в чане из нержавеющей стали (маленький) на льду: скальпель, держатель лезвия, кольцо пинцет, агар блок, и этап слайсера. Храните замороженные ACSF и модифицированные ACSF на льду и пузырь с 95% O2/5% CO2 газа (ака. карбоген).
- Поместите следующие инструменты в чан (большой): ножницы (большой, маленький), пинцет, шпатель, ложка, и диагональные плоскогубцы.
6. Хирургия (Мыши)
- Анестезируйка мыши с помощью изофлюран в дымовом капюшоне. Оцените уровень анестезии, проверив педали рефлекса животного на ноге щепотку.
- Обезглавить мышь и погрузить голову в ледяной ACSF в хирургический лоток из нержавеющей стали.
- Извлеките мозг в течение 1 мин и поместите его в стакан, содержащий охлажденный ACSF в течение 5 минут.
- Возьмите мозг из стакана и, используя скальпель, обрезать мозговой блок(рисунок 3A).
- Поместите блок мозга на 4% агар блок (шаг 5.3, Рисунок 3B). Оба полушария могут быть установлены на агар блок. Протрите избыток ACSF из блока с фильтровальной бумагой.
- Нанесите тонкий клей (супер клей) на стол слайсера. Поместите агар блок на него и протрите избыток клея с помощью фильтровальной бумаги.
- Аккуратно нанесите небольшое количество ледяного ACSF (5 мл) с помощью пипетки из верхней части мозга-агар блока. Это поможет укрепить избыток супер клей и предотвратить клей от покрытия мозга и тревожные нарезки.
- Закрепите стол слайсера на лоток для срезов(рисунок 3C)и залейте модифицированный ACSF.
- Установите срез на медленной скорости, с частотой лезвия на максимуме.
- Установите толщину ломтика до 350-400 мкм и начните нарезку(рисунок 3C). Поместите ломтики на углу среза лотка в последовательности, так что глубина ломтиков можно легко отличить. Обычно три-пять ломтиков могут быть получены из одного полушария.
- Отрежьте часть ствола мозга с помощью иглы 30 G(рисунок 3D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Микрохирургия на ломтике мозга, таких как разрез между границей CA3-CA1 должно быть сделано на данном этапе под бинокулярным микроскопом, если это необходимо. - Используя небольшую наконечником кисти краски, поместите ломтик на центр мембранного фильтра (0,45 мкм поры, PTFE-мембрана, 13 мм диаметр) провел с кольцом плексиглас17 (15 мм внешнего диаметра, 11 мм внутреннего диаметра, 1 мм толщина, рисунок 3E). Поместите кольцо во влажную камеру восстановления(Рисунок2) и закрепите крышку, чтобы сохранить высокое внутреннее давление.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ломтики будут прилипать к мембране в течение 30 минут и могут быть обработаны с кольцами в последующих шагах в камере записи. Существует нет необходимости использовать веса или другие меры, чтобы сохранить кусок на месте. - Отрегулируйте направление и положение среза в кольце, чтобы убедиться, что он хорошо централен и имеет последовательное направление (см. шаг 9.3).
- Оставьте образец при температуре 28 градусов по Цельсию в течение 30 мин, а затем при комнатной температуре в течение по крайней мере 10-30 мин для восстановления ломтиков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ломтики теперь могут сохранять хорошее физиологическое состояние по крайней мере в течение 15 ч.
7. Окрашивание и промывка ломтиков (мышей)
- Аккуратно нанесите 100-110 л окрашивающего раствора (Шаг 4) на каждый ломтик на кольце с помощью микропайпета. Восемь-девять ломтиков могут быть окрашены одним раствором для окрашивания, подготовленным в шаге 4. Оставьте ломтики на 20 минут для окрашивания.
- Приготовьте 50-100 мл ACSF в контейнер и положите кольцо с нарезанным образцом в него, чтобы промыть раствор окрашивания.
- Храните промытый ломтик в другую инкубационную камеру. Подождите более 1 ч для восстановления до эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубационную камеру можно отсоединить от газа и перенести на место записи в плотно запечатанном состоянии. Кусочек может оставаться в живых, по крайней мере 20 мин без газоснабжения. Это полезно в случае, если вам нужно переместить срез в другое место для записи.
8. Ежедневная подготовка экспериментального аппарата
- Включите усилитель, компьютер и систему камеры и проверьте, работает ли программное обеспечение.
- Поместите ACSF в трубку 50 мл и пузырь с карбогеном.
- Используйте перистальтический насос для распространения ACSF. Отрегулируйте скорость потока примерно до 1 м/мин.
- Отрегулируйте высоту всасывающей пипетки так, чтобы уровень жидкости внутри экспериментальной камеры всегда был постоянным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень раствора важен для получения стабильной записи, поэтому корректировка должна быть выполнена с помощью микроманипулятора. - Установите молотый электрод, состоящий из желтого чипа, наполненного агаром 3 M KCl (2%) (шаг 1.8) в держатель с проводом Ag-AgCl с небольшим количеством 3 M KCl решения.
- Заполните небольшое количество ACSF (примерно две трети объема) в стеклянный электрод (1 мм внешнего диаметра, 0,78 мм внутреннего диаметра вытащил с микропипететом шкив) с помощью конической тонкой трубки желтый наконечник и поместить его в держатель электрода.
- Прикрепите держатель к стержню, установленному в манипуляторе. Убедитесь, что с помощью усилителя устойчивость электрода составляет примерно 1 МЗ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длиннохвостый широкое отверстие (4-8 мкм открытия) патч типа электрода должно быть хорошо для записи поля и в качестве стимулирующего электрода.
9. Начало сессии звукозаписи
- Возьмите ломтик подготовки из влажной камеры с щипками.
- Быстро поместите ломтик на экспериментальную камеру под микроскопом(рисунок 4).
- Нажмите край кольца твердо в силиконовой O-кольцо. Будьте осторожны, чтобы не сломать мембрану или дно камеры эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Направление среза следует учитывать в отношении направления стимулирующих и записывающих электродов в поле зрения. Здоровый ломтик должен прилипать к мембранному фильтру, поэтому нет необходимости использовать другие устройства, чтобы исправить ломтики, такие как вес и нейлоновые сетки. - Поместите кончик стимулирующего электрода и полевой потенциал записи электрода на ломтик под микроскопом с передаваемым светом.
- Используйте электрофизиологическую систему записи, чтобы проверить реакцию. Подтвердите обычную (неокрашенную) электрофизиологическую запись с данной конфигурацией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Электрод записи может быть опущен, но полезно проверить физиологию среза. - Отрегулируйте интенсивность возбуждения света примерно до 70-80% от максимальной мощности камеры, что соответствует 13-15 мВт/см2 при взятии проб при выборке при 10 кГц с объективом 5x погружения воды объективной и 1x план-аПО трубки объектива. Длина волнеции возбуждания составляет 530 нм, а эмиссионный фильтр должен быть 590 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте затвор, чтобы свести к минимуму количество возбуждания света. Непрерывное воздействие света может ухудшить физиологию ломтика. Возможный вредный эффект света зависит от интенсивности и продолжительности света. Используйте электрофизиологическую запись, чтобы судить о воздействии света. В случае силы 13-15 мВт/см2,около 1 с экспозицией должна быть верхний предел толерантности. - Отрегулируйте фокус с системой приобретения, используя флуоресцентный источник света, потому что фокус может быть разным в зависимости от длины волны и начать приобретение.
- Изучите данные в программном обеспечении для приобретения изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали оригинальный пакет микропрограммирования программного обеспечения численного анализа для детального анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 5 показан представительный оптический сигнал при электрической стимуляции залога Шаффера в области CA1 из среза бегемота мыши. Последовательные изображения на рисунке 5A показывают оптический сигнал до применения каких-либо пространственных и временных фильтров, в то время как на рисунке 5B показаны те же данные после применения фильтра 5 x 5 x 5 кубического (свертка гауссийского ядра, 5 x 5 пространственных и 5 к временное измерение) дважды. Из-за высокой частоты кадров (0,1 мв.м/рама) и высокого пространственного разрешения (100 пикселей х 100 пикселей) применение фильтра не изменило сигнал, а отфильтровало шум, который также можно наблюдать в ходе времени, записанном в пикселях в одном испытании ( Рисунок 5С,без фильтра; Рисунок 5D,с фильтром; и рисунок 5E, наложенный).
Рисунок 6 сравнивает типичный ответ в области CA1 из гиппокампа ломтик между мышью(рисунок 6A) и крысы (рисунок6B). Как видно на рисунке, гиперполяризация ответ из-за ингибирующих входов проявляется в крысы гиппокампа ломтик при применении того же стимула для залога Шаффер вблизи границы CA1/CA3. Небольшой гиперполяризации ответ наблюдается в дистальной стороне CA1 после 24 мс в мыши гиппокампа ломтик, но более массивные гиперполяризации ответ догнал деполяризации ответ в крысы гиппокампа ломтик. VSD изображения могут четко продемонстрировать разницу между мыши и крысы гиппокампа ломтиками.
Рисунок 1 : Иллюстрация агар блок используется для монтажа ткани мозга для нарезки и джиг, чтобы сделать блок. (A) Схематическая иллюстрация блока мозга и 4% агар блок (B). (C, D) Фотография регулируемого джига, сделанного из пластины плексигласа (толщиной 5 мм каждый), чтобы сделать агар блок. При подготовке агар блока, верхние и нижние пластины должны быть уложены, как показано в D. (E) Вставив лезвие в длинные тонкие слоты (1) и (2), треугольная часть вырезается, слот (3) используется для обрезки всей глубины блока. (4) Удаление верхней пластины позволяет нарезки из ненужных частей. Используя слот 1 и 2, сделайте только 5 мм глубокие разрезы, так что в результате блок, как показано в (A) и (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Иллюстрация инкубации типа интерфейса камеры, используемой для поддержания физиологии срезов. (A) Обзор системы. (B) Детали интерьера. (C) Иллюстрация камеры восстановления. Specimen должны быть помещены на фильтровальную бумагу, расположенную на acSF заполненные 90 мм и 60 мм Петри блюдо. Последнее блюдо для поддержки фильтровальной бумаги. Посуда и контейнер acSF, кипящий, хранятся на месте с пластиной плексигласа. Фильтровная бумага не должна касаться стенки герметичной коробки, ни контейнера. Воздух поставляется через кипящую бутылку, которая включает в себя смоченные газы в камере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Гиппокампа ломтик препаратов из мозга мыши. (A) Изолированный мозг мыши должен быть вырезан сначала на пунктирной линии (а), затем (б). Наконец, разрез должен быть сделан вдоль линии (c). Разрез должен быть перпендикулярно дну. (B) Блок мозга должен быть установлен на агар блок. (C) Агар блок должен быть помещен на слайсер. (D) Результированный срез. Избыток ткани следует вырезать на линии. (E) Срез должен быть помещен в центре мембранного фильтра с держателем плексигласа (внешний диаметр 15 мм, Внутренний диаметр 11 мм, мембранный фильтр PTFE 13 мм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Система записи оптических сигналов от срезаных препаратов. (A) Фотография микроскопа, используемого для изображения ломтиков в текущей рукописи. Оптика состоит из объективного объектива (5x NA0.60), зеркальной коробки для дихроического фильтра (580 нм) и проекционной (трубки) объектива (PLAN APO x1.0). Высокоскоростная камера крепится в верхней части проекционного объектива через c-mount. Существует еще одна обычная камера USB для наблюдения. Возбуждая свет вводится с помощью волоконной оптики. (B) Фотография линз, которые совместимы с зеркальным ящиком. (C) Схематическая диаграмма системы записи. Система визуализации и электрофизиологическая система записи управляются компьютером. В качестве источника света использовалась светодиодная система освещения с системой управления фотодиодной обратной связи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Представитель оптического сигнала в области CA1 мыши гиппокампа ломтик в одном испытании. (A) Последовательные изображения показывают распространение нейронального сигнала, приобретенного со скоростью кадра 0,1 мс/кадр вдоль залогового пути Шаффера перед применением каких-либо пространственных и временных фильтров (каждые 0,2 мс). Возбуждение составило 530 нм, а выбросы составили 590 нм. (B) Те же данные после применения трехмерного гауссианского ядра 5 х 5 х 5 в два раза. (C, D) Следы оптических сигналов в репрезентативных пикселях (каждый два пикселя (36 мкм) вдоль линии в середине CA1 показан в квадрате в A, обозначает пиксель в пирамиде слоя из данных, показанных в A и B. (E) Наложенный сигнал от оптические сигналы в C и D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6 : Сравнение оптического сигнала между ломтиками мыши и крысиных гиппокампов. Представитель последовательных изображений на электрическую стимуляцию залогового пути Шаффера вблизи границы CA3/CA1 мыши (A) и крысы (B)гиппокампа ломтик. Видео 1 показывает мыши гиппокампа ломтик и видео 2 показывает крысы гиппокампа ломтик. Право всего на рисунке показана временной курс оптического сигнала в середине CA1 на пирамиде прослойки (st. pyr.) и радиате слоя (st. rad.). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Финал mM | Вес | |
| 2PO4 2H2O | 1,25 мМ | 3,90 г |
| MgSO4No7H2O | 2 мМ | 9,86 г |
| Kcl | 2,5 мМ | 3,73 г |
| Добавить H2O, чтобы сделать 50 мл |
Таблица 1: Фондовый А.
| Финал mM | Вес | |
| MgSO4No7H2O | 2 мМ | 12,32 г |
| Добавить H2O, чтобы сделать 50 мл |
Таблица 2: Фондовый B.
| Финал mM | Вес | |
| CaCl2No2H2O | 2 мМ | 5,88 г |
| Добавить H2O, чтобы сделать 50 мл |
Таблица 3: Фондовый C.
| Финал (mM) | Вес | |
| Nacl | 124 мМ | 7,25 г |
| NaHCO3 | 26 мМ | 2,18 г |
| Глюкозы | 10 мМ | 1,8 г |
| Акции А | 2,5 мл л. | |
| Добавить около 950 мл H2O и пузырь со смешанным газом (95 % O2/5 % CO2) (10 мин) | ||
| Фондовый C (CaCl2) | 2 мМ | 2,5 мл л. |
| Добавить H2O, чтобы сделать 1000 мл | ||
Таблица 4: Ежедневная подготовка ACSF.
| Финал (mM) | Вес | |
| NaHCO3 | 26 мМ | 2,18 г |
| Сахароза | 205,35 мМ | 70,29 г |
| Глюкозы | 10 мМ | 1,8 г |
| Акции А | 2,5 мл л. | |
| Фондовый B | 2,0 мл л. | |
| Добавить около 900 мл H2O и пузырь со смешанным газом (95 % O2/5% CO2) (10 мин) | ||
| Акции C | 0,4 мМ | 0,5 мл л. |
| Добавить H2O, чтобы сделать 1000 мл | ||
Таблица 5: Модифицированный ACSF (резка раствор).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Физиология срезов имеет жизненно важное значение для сбора правильного сигнала. Использование кольцевой системы фильтра в этом протоколе гарантирует, что срез остается здоровым и неискаженным на протяжении всей процедуры2,16,17. Другие системы могут быть использованы для сохранения среза физиологии во время записи, но ломтик не должен деформироваться в любое время, как изображение требует каждой части ломтика, чтобы быть здоровым. Кольцево-мембранная система фильтра также лучше для окрашивания, так как это помогает нам свести к минимуму объем окрашивающего раствора требуется. Важно также контролировать интенсивность возбуждания света, так как он должен быть низким по отношению к фракции времени. Непрерывное освещение может повредить образец; поэтому необходимо надлежащее использование затвора.
Токсичность VSD часто обсуждается29, но это результат нелинейного умножения концентрации красителя, интенсивность возбуждения света, и продолжительность воздействия света. Процедура окрашивания, показанная в этом протоколе, не вызвала каких-либо измеримых изменений в физиологических параметрах среза, таких как входные и выходные отношения полевых потенциальных записей и данных о долгосрочной потенции (LTP), парной пульсе упрощение (PPF). Ухудшение физиологии среза является значительным особенно при непрерывном освещении16, но это может управляться путем мониторинга потенциала поля. Используя эти меры предосторожности, мы можем записать LTP с непрерывной оптической записью с помощью VSD для более чем 12 ч24, что сопоставимо с лучшими условными экспериментами in vitro.
Во время записи воздушный стол может быть полезен, но изоляция от других устройств должна быть разрешена из-за низкого увеличения оптики. Тем не менее, механические нарушения являются одной из существенных причин плохой визуализации. Если значительное количество ложного сигнала на изображении состоит из противоположных знаков на краю объекта, то разница в яркости, скорее всего, вызвана механическими нарушениями. Движения образца и жидкости являются наиболее частыми причинами шума движения, и, следовательно, следует избегать или минимизовать.
Сигнал VSD (фракционное изменение интенсивности света) небольшой (10-3 - 10-4 от первоначальной флуоресценции). Чтобы обнаружить такое небольшое изменение, флуоресценция должна превысить от 105 до 106 фотонов на детекторе в долю времени, чтобы преодолеть эффект фотон-выстрел амортизм шума. Кроме того, чтобы следить за активностью нейронов, частота кадров должна быть быстрой, близкой к константам времени, необходимым для выполнения электрофизиологической записи, такой как, что вокруг диапазона кГц. Сочетание этих двух условий требует количества флуоресценции, которая является гораздо более обширной, чем другие виды флуоресцентной визуализации. Это требует высокой численной диафрагмы во всей оптике, а обычный микроскоп не лучший вариант. Более крупный зрачок и диафрагма необходимы, как показано на рисунке 4.
Система кодирования должна соответствовать большей глубине фотонных скважин, быстрой частоте кадров и низкому шуму. Выбор во многом зависит от скорости нервной системы. Более быстрый сигнал, такой как трансдукция гиппокампа, нуждается в специализированной ультрабыстрой, низкошумной системе. Тем не менее, медленный сигнал, такой как медленное распространение активности в кортиках может быть обнаружен с помощью обычных, но научных камер класса.
Выбор источника света также имеет решающее значение. Выбор света зависит от его интенсивности, стабильности и области освещения. В случае с низким увеличением широкоугольной визуализации, источник точечного света, такой как дуги и лазеры, должен расширяться, что затрудняет использование этих источников. Дуги, такие как ртуть и ксенон лампы, являются источником яркого света, но, как правило, не являются стабильными. Тем не менее, недавнее развитие Ксенон свет может преодолеть эту проблему. Галогенная лампа стабильна и имеет большую площадь нити, которая может легко сочетаться с широкоугольным изображением, но ограничена в прочности, особенно на 530 нм. Недавнее развитие питания светодиод позволил нам использовать его в качестве потенциального источника света, но он должен иметь стабилизатор обратной связи из-за температурной зависимости. Лазеры могут быть использованы, но высокая согласованность приводит к пятнистому шуму, который обычно неприемлем для широкоугольной визуализации.
Протокол визуализации VSD, представленный в данной статье, измеряет значение относительно состояния покоя. Абсолютное измерение мембранного потенциала не может быть выполнено с использованием текущей техники. Для оценки абсолютных мембранных потенциалов можно использовать измерения сроков действия коэффициента и флуоресценции.
Изображение мозговых ломтиков с массированными VSD при низком увеличении может продемонстрировать потенциальные изменения субпороговой мембраны в микрозамычных взаимодействиях мозга. Такая функциональная область связи между микросхемами в режиме реального времени будет полезна во многих областях исследований мозга, особенно для анализа патологических аспектов, которые, скорее всего, вызваны таким возбуждательным и ингибирующим функциональным связи между различными областями мозга. Это приложение будет иметь решающее значение для расследования изменений в нейронных цепей, связанных с определенными типами нейропсихиатрических заболеваний30,31,32.
Развитие генетически закодированного индикатора напряжения33,34 является будущим направлением для оптических мембранных потенциальных записей, которые проложат путь для привлекательных применений клеточного типа специфического анализа нейронных события уровня цепи.
Существует много возможностей для совершенствования оптики, особенно для визуализации широкоугольных функциональных соединений. Наша новая конфопальная оптика35 позволит высокоскоростную и высокоскоростную запись сигнала VSD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
TT получил грант JSPS KAKENHI (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 и JP15K00413) от MEXT и гранты от Министерства здравоохранения, труда и социального обеспечения (MHLW-kagaku-ippan-H27 и H30 Мы хотели бы поблагодарить Editage (www.editage.jp) за редактирование английского языка.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM - Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| Poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| Polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R.
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. Tominaga, T., Ichikawa, M. , US 6,448,063 B2 (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W.
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
