Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

多端根结核细胞迁移的实时监测

Published: December 13, 2019 doi: 10.3791/59744
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Molecular Neuro-oncology Laboratory, Brown University, Rhode Island Hospital, 2University of Minnesota, College of Veterinary Medicine, 3Department of Neurosurgery, Brown University

Summary

在这里，我们提出了一个前活体混合单层培养系统，用于实时研究人类胶质瘤细胞（hGC）迁移。该模型提供了观察hGCs与隔板腔内骨髓和非骨髓化斧子之间的相互作用的能力。

Abstract

胶质母细胞瘤是最具攻击性的人类癌症之一，由于广泛的细胞异质性和hGCs的迁移特性。为了更好地了解胶质瘤细胞迁移背后的分子机制，研究hGC和斧子在肿瘤微环境中的相互作用的能力至关重要。为了模拟这种细胞相互作用，我们开发了一个混合培养系统，由hGC和背根神经结膜（DRG）的斧状-寡核苷酸共培养物组成。选择DRG文化是因为它们可以有效地隔离，并可以形成长期、广泛的投影，非常适合这种性质的迁移研究。然后，在纯化大鼠DRG斧子上加入纯化大鼠寡核苷酸，并诱导至骨髓酸。在确认形成紧凑型骨髓后，hGCs最终被添加到共培养物中，并使用延时显微镜实时监测它们与DRG斧子和寡核苷酸物的相互作用。在这些条件下，hGCs形成肿瘤状的聚合结构，表达GFAP和Ki67，沿着骨髓和非骨髓化的斧道迁移，并通过伪波迪亚的形成与这些斧子相互作用。我们的前体共培养系统可用于识别hGC迁移的新型细胞和分子机制，并可能用于体外药物疗效测试。

Introduction

胶质母细胞瘤是人脑中最具攻击性和致命性的肿瘤之一。目前的护理标准包括肿瘤的手术切除，然后是辐射1加上伴随的特莫佐洛米德2的辅助和辅助。即使采用这种多疗法，肿瘤复发也是不可避免的。这部分是由于肿瘤细胞的广泛迁移性质，它侵入大脑胸痛，在大脑4内产生多个手指状的投影，使得完全切除的可能性不大。

近年来，胶质细胞瘤的侵略性明显增强，部分原因在于肿瘤质量5、6中存在一群癌症干细胞，其中7、8、抗化疗和放疗9、10和形成继发性肿瘤11的能力具有很高的迁移潜力。当异种移植到裸鼠5时，GsCs能够重述原始的多克隆肿瘤。

尽管关于胶质细胞瘤遗传背景的知识丰富，但缺乏有效的体外或体内迁移模型目前阻碍了对胶质瘤细胞（GC）迁移的研究。值得注意的是，虽然由细胞和环境因素调节的胶质瘤细胞-斧理相互作用是胶质瘤入侵的核心组成部分，但据我们所知，目前没有实验系统能够模拟这些相互作用12、13、14。为了解决这一缺陷，我们开发了一种与纯化DRG的腺苷酸联合培养的原生hG的体外培养系统，该系统导致分化肿瘤标记物的表达升高，以及hGCs与骨髓化和非骨髓化纤维的广泛迁移和相互作用。这个外体平台由于其条块分割的布局，适合测试新疗法对hGC迁移模式的影响。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

罗德岛医院IRB委员会批准了患者源性人类胶质瘤细胞的收集、分离和繁殖方案。所有动物都按照NIH《实验室动物护理和使用指南》进行维护。所有动物使用协议都通过了罗得岛医院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 媒体和缓冲准备

  1. 制备50 mL的神经球培养基：1x神经基底培养基培养基，不含维生素A，1x血清免费补充剂，不含维生素A，2 mM L-谷氨酰胺，20纳克/mL表皮生长因子（EGF），20纳克/mL基本纤维细胞生长因子（FGF），2微克/mL肝素，和1x抗生素抗肌（抗抗）。
  2. 准备50 mL补充神经基底培养基：1x神经基底培养基，1x血清免费补充，4 g/L D-葡萄糖，2 mM L-谷氨酰胺，和50纳克/mL神经生长因子（NGF）。
  3. 准备 500 mL N2B2 介质： 1：1 Dulbecco 的改良鹰中-哈姆的 F12 营养混合物 （DMEM-F12）， 1x 胰岛素-转移素-硒 （ITS-G）， 66 毫克/mL 牛血清白蛋白 （BSA）， 0.1 毫克/mL 转移素， 0.01毫克/mL生物素，6.29毫克/mL孕酮，5微克/mL N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC），和1 mM普瑞辛。在-20°C时进行等分并冷冻。
  4. 制备 500 mL 的 C-Media：1x 最小必需介质 （MEM）、D-葡萄糖（最终 4 g/L）、10% 胎儿牛血清 （FBS） 和 2 mM L 谷氨酰胺。在-20°C时进行等分并冷冻。在使用前添加神经生长因子 （NGF） 新鲜 （50 纳克/mL）。
  5. 准备200 mL的帕平缓冲液：1x厄尔平衡盐溶液（EBSS），100 mM Mg2SO 4，30%葡萄糖，0.25 M EGTA和1M NaHCO3。
  6. 准备 10 mL 的 DMEM-ITS-G 介质：1x DMEM、0.5% BSA 和 1x ITS-G。
  7. 制备 200 mL 的 PB 缓冲液：1x Dulbeco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS），不含 Ca2+和 Mg2+和 0.5% BSA。使用前将缓冲液除气，并保持在冰上。

2. 胶质瘤干细胞神经球的分离与培养

  1. 神经球的隔离
    1. 从手术室收集IRB批准和患者同意的新鲜人类胶质细胞瘤（GBM）组织。将含有 2 倍抗性剂的 DPBS 冰上 GBM 样品转移到 BL2 认证的生物安全柜中。
    2. 将一个1厘米3 GBM样品，将最小的坏死或红细胞污染转移到60毫米的板中，切成1毫米3个碎片;删除任何多余的 DPBS。
    3. 在37°C下用5 mL胶原酶/消脂酶（1mg/mL）消化30分钟，每5-10分钟轻轻旋转一次。
    4. 将消化的片段转移到50 mL管中，并通过用10mL移液器多次移液进行三聚体，以分离组织。
    5. 加入同等体积的神经圈介质，并再次对组织进行三聚体;允许大碎片沉降。
    6. 去除没有组织碎片的介质，缓慢通过放置在新鲜 50 mL 管上的 70 μM 细胞滤网。
    7. 重复步骤 2.1.5-2.1.6，直到所有组织都分离，根据需要更换细胞滤网。
    8. 将细胞悬架在 110 x g下旋转 10 分钟。
    9. 去除上清液，将颗粒重新悬浮在10 mL的ACK赖清缓冲液中，以消除红细胞污染。在室温下孵育10分钟。
    10. 将细胞悬架在 110 x g下旋转 5 分钟。
    11. 去除上清液，并在10 mL的神经圈介质中重新悬浮细胞。取10μL的细胞悬浮液，用10μL的试青蓝稀释。在100mm悬浮培养板中，在10mm悬浮培养板中，在3 x 106个细胞的密度下，使用自动细胞计数器或血细胞计和板在10mL的神经圈介质中计数10μL细胞悬浮液。
    12. 每周2-3次，向培养中加入2 mL的新鲜神经球介质。
      注：神经球将在3-4周内形成悬浮状态。分培养2-4次后，通过限制稀释测定和肿瘤重述，在免疫功能低下小鼠中进行异种移植，如前所述22，确认其干细胞。
  2. 亚培养神经球
    1. 当球体形成并达到直径在200-500 μm之间时，将神经球转移到15 mL管中，以110 x g旋转5分钟。
    2. 在预热细胞分离溶液的1 mL中重新悬浮神经球。
    3. 转移到1.5 mL管，在37°C孵育5分钟。
    4. 将 P200 移液器设置为 150 μL，并通过上下移液到分离神经球进行三聚。
    5. 分离细胞转移到15 mL管。添加 4 mL 的神经圈介质，以 300 x g旋转 5 分钟。
    6. 去除上清液，并在5 mL的神经圈介质中重新悬浮细胞。取10μL的细胞悬浮液，用10μL的试青蓝稀释。使用自动细胞计数器或血细胞计和板在1 x 106细胞/60毫米盘的密度，最终体积为4 mL的细胞悬浮液计数10 μL。
    7. 每周刷新媒体 2 次，并根据需要进行亚培养。在神经基基培养基中冷冻整个神经球，维生素A补充10%DMSO。神经球可用于P4后的实验。

3. 大鼠大鼠根甘利亚（DRG）、奥洛根德罗基特（OpCs）和hGC的隔离培养

  1. 准备分舱文化菜肴
    注：在计划收获 DRG 前几天执行以下步骤。
    1. 组装分舱文化菜肴。
    2. 在无菌蒸馏H2O中稀释胶原蛋白库存溶液至500微克/mL;彻底混合。
    3. 使用无菌转移移液器，用 2 mL 胶原蛋白溶液填充 35 mm 培养盘;去除溶液，留下一层胶原蛋白薄膜，并将其放入下一个35毫米的盘中。重复此过程，根据需要添加更多胶原蛋白溶液，直到所有菜肴都涂覆。
    4. 涂覆所有板后，将板放在 245 mm x 245 mm 培养盘中，并在托盘中心放置三个 1 mm x 1 mm 纱布垫。
    5. 为了聚合胶原蛋白，湿纱布垫与1 mL的浓缩氢氧化铵和覆盖托盘15分钟。
    6. 拆下纱布垫，让 35 mm 的盘子在层流罩中干燥。
    7. 当洗碗干燥时，用高真空润滑脂装入注射器润滑脂施用器的桶。将隔腔室放入装满蒸馏水的大口介质瓶中。通过高压灭菌和冷却来消毒两者。
    8. 文件关闭点18G需要使一个钝提示。在70%乙醇中消毒。将针头连接到润滑脂注射器。
    9. 浸泡70%乙醇，对针铲进行消毒;使其在层流罩中风干。
    10. 从干燥的胶原蛋白涂层 35 mm 盘中取下盖子。将盘子放在拇指和指针手指之间。用另一只手握住销刀。施加稳固的压力，在盘子中心形成 200 μM 宽的划痕。
    11. 使用牧场移液器，在划痕的中心放置两滴补充神经基底介质。
    12. 重复步骤 3.1.10-3.1.11，直到所有盘子都划伤。
    13. 在层流罩中干燥隔腔室。
    14. 使用无菌止血钳，抓住中心分频器的一个隔间室。翻转止血钳，使腔室底部朝上。
    15. 将硅胶润滑脂涂抹到隔腔室，从顶部开始。确保润滑脂放置整齐，并在所有角落重叠。
    16. 从 35 mm 盘上取下盖子。反转盘子，将划痕放在造型室上。用一对钳子轻轻轻敲盘子的底部。
    17. 使用止血钳轻轻翻转板。松开钳子。
    18. 在中心隔间底部放置一堆润滑脂。用补充的神经元基底介质 （NB） 填充每个腔室，并检查有无泄漏。根据需要用硅胶密封泄漏。
    19. 继续组装所有文化菜肴，并在 37°，5% CO2中隔夜存储。
  2. 大鼠DRG神经元与隔离室中的分离
    1. 通过CO2窒息或化学过量牺牲一个及时怀孕的E16斯普拉格-道利大鼠。
    2. 将动物置于清洁表面上的上部位置;用70%乙醇对腹部进行消毒。
    3. 用钳子抓住下腹部的皮肤，轻轻抬起。
    4. 用剪刀，沿着动物的中线切开一个"I"切口，注意不要刺穿腹壁的肌肉。
    5. 用一对干净的钳子，抓住肌肉壁，用干净的剪刀做横向切口，小心不要刺穿子宫或肠子。
    6. 用一对钝钳，抓住子宫，轻轻地从围肠腔中抬起。
    7. 使用新鲜无菌剪刀，夹住每个子宫角底部的结缔组织。
    8. 将整个子宫放入无菌的 100 mm 组织培养盘中。
    9. 将子宫带到层流罩进行解剖。
    10. 从子宫中取出胚胎，一次一个，通过羊水囊剪贴，轻轻地戏弄胚胎出来，并进入一个60毫米的盘子，含有5 mL的L-15与1倍笔链球菌。
    11. 用细钳子，将3-4个胚胎放入含有5mL L-15的60毫米盘中，并带有1倍笔链球菌。
    12. 在解剖显微镜下工作，一次使用一个胚胎，通过斩首来安乐死。
    13. 将胚胎腹侧向上躺着，取出四肢和尾巴。
    14. 用细钳子，在动物中做一个中线切口。
    15. 去除内部器官和组织，以暴露背膜结构，特别是脊髓，在完成时应可见。
    16. 在椎骨柱和脊柱管之间放置一把微解剖剪刀，并仔细切开椎骨柱，露出脊髓。小心不要夹住脊髓。
    17. 用细钳子，轻轻抓住脊髓的脊柱，慢慢从胚胎中抬起来。DRG 将连接到脊髓。
    18. 转移脊髓，并将DRG连接到含有2mlL-15的35毫米管菜，带1倍笔链球菌。放在冰上
    19. 一旦所有脊髓被分离，使用细钳从脊髓中单独拔下DRG。将 DRG 放入新鲜的 35 mm 盘中。
    20. 如果 DRG 上存在神经根，则将其夹走。
    21. 从 37°C、5% CO2培养箱中取出准备好的 35 mm 盘子。从前一天删除媒体。将含有10μM 5-Fluoro-2'-脱氧尿碱（FUDR）的80 μL补充神经基底介质（NBF）放在中心隔间内，在每个外舱中放置250μL介质。
    22. 在每个中心隔间中放置 2 个侧心。将菜肴返回到 37°C，5% CO2培养箱。
    23. 第二天添加 2.5 mL 的 NBF。
    24. 按照表 1中的计划馈送区域性，根据选择开始 DRG 准备的时间更改计划。
    25. 在第21天（或当斧子到达远端腔末端时），要么用GBM神经球（继续执行步骤3.2.26）的种子培养物，要么用寡核苷酸培养物（继续到步骤3.3）进行种子培养，然后用GBM神经球进行种子培养。骨髓后。
    26. 在每个远端隔间室中更换补充的 NB 介质，该腔室将采用包含 10% FBS 的加补 NB 介质的 GBM 神经球进行种子。
    27. 将 P20 移液器设置为 10 μL 时，从培养皿中取出一个 GBM 神经球。GBM 神经球的大小应约为 200 微米。
    28. 将移液器的尖端放在远端室中，缓慢地排出 GBM 神经球圈，使其轻轻地落在离中心室最近的远端室部分的斧头上，越过中心室附近的斧头。小心不要让移液器尖端打乱斧头。
    29. 在室温下将培养层留在生物安全柜中 1 小时，以便 GBM 神经球连接。
    30. 一旦神经球连接，非常小心地用补充NB介质替换远端隔间中的介质。
    31. 实时图像培养 3-7 天，根据需要添加媒体。在这种情况下，一个受控的CO2活细胞外壳连接到显微镜（例如，蔡司Axiovert）使用明场连续监测细胞迁移7天。使用相关软件每 10 分钟获取一次图像。使用经过稳定转染以表达 GFP 的 hG 重复相同的协议，并使用亮场和 488 nm 激光的组合捕获图像。
      注：神经球可能用慢病毒转导，或转染质粒或siRNA。隔间也可以用所需的小分子抑制剂处理，以研究迁移。
  3. DRG 阿克森与奥利戈多德罗基特的骨髓
    1. 在寡核苷酸分离的前一天，用C-介质替换DRG中的NB介质。
    2. 解剖前，将 10 mL 的 Papain 缓冲液放入培养箱中的 60 mm 盘中以进行平衡。
    3. 在层流罩中，用冰冷的 HBSS 填充一个 100 mm 的盘子和一个 60 mm 的盘子。放在冰上。
    4. 通过斩首牺牲一只P2鼠崽。用剪刀去除皮肤。去除皮肤后，用一把细剪刀沿着中线切割头骨。
    5. 用细钳轻轻取出头骨。使用铲子，轻轻地从头骨底部铲脑，并转移到一个倒置的组织培养板盖。
    6. 取出小脑，将大脑分成两个脑半球。去除每个半球大脑皮层以下的嗅球、海马和基底神经节。将大脑皮层放在含有 HBSS 的 100 mm 盘中。对其余动物重复步骤 3.3.4-3.3.6。
    7. 一次使用一个皮层，用精细的杜蒙特钳子去除脑膜炎。使用 HBSS 将所有无护月皮放入新鲜的 60 mm 菜肴中。
    8. 将皮质组织切成 1 毫米3片。放在冰上。
    9. 将平衡的 Papain 缓冲液放入 15 mL 管中。加入200单位的木瓜和2毫克L-半胱氨酸。过滤消毒并加入200 μL无菌DNase I。
    10. 从切碎的脑组织中取出 HBSS，从 3.3.2 中更换使用 Papain 缓冲液。将菜放在37°C，5%CO2孵化器80分钟，每15分钟轻轻摇动一次。
    11. 将消化的组织转移到50 mL管中，加入2 mL的C-培养基。
    12. 用5mL血清学移液器进行三聚，以分离组织;允许较大的组织块沉降。去除上清液，放入无菌的15 mL管中。
    13. 再次添加 2 mL 的 C-Media，再使用 5 mL 血清移液器重复三次三聚。切换到 1 mL 移液器尖端并三聚，直到组织完全分离。转移到 15 mL 管。
    14. 在 300 x g下旋转三聚体 15 分钟。小心地去除上清液，并在 8 mL 的 DMEM-ITS-G 介质中重新悬浮颗粒。
    15. 预湿无菌 30 μM 细胞过滤器，带 2 mL PB 缓冲液。将细胞过滤器置于 50 mL 管上，并一次过滤细胞悬浮液 1 mL。用 5 mL 的 PB 缓冲液冲洗过滤器。
    16. 将细胞悬浮液转移到100毫米细菌板;在37°C，5%CO2培养箱中孵育15分钟，使微胶合附着。
    17. 取出介质并放入 15 mL 管中。用 2 mL 的 DMEM-ITS-G 介质轻轻冲洗板，并转移到 15 mL 管中。
    18. 轻轻重新悬挂细胞悬浮液。取10μL的细胞悬浮液，用10μl的试青稀释。使用自动细胞计数器或血细胞计对细胞悬浮液进行10μl计数。
    19. 将细胞悬架旋转 300 x g 10 分钟。
    20. 完全吸升上清液，每1 x107个细胞在70μL的PB缓冲液中重新悬浮细胞。混合良好，在4°C下孵育10分钟。
    21. 每1 x107细胞加入20μl抗A2B5微珠。混合良好，在4°C下孵育。
    22. 每1 x 107个细胞加入1-2 mL的PB缓冲液，在4°C离心机中以300 x g离心10分钟。
    23. 完全吸气上清。在 500 μL 的 PB 缓冲液中重新悬浮最多 108个细胞。保持冰上。
    24. 在分离器的磁场中放置磁珠柱。
    25. 使用 500 μL 的 PB 缓冲液进行浸干，准备列。将单元格挂起应用于列。丢弃废物容器中的流过（其中包含未标记的单元）。
    26. 用 500 μL 的 PB 缓冲液清洗柱 3 次。丢弃流通过。
    27. 从磁性分离器中取出柱并放置在收集管中。
    28. 将 PB 缓冲液的 1 mL 移液到柱上。将柱塞牢固推入柱塞，将磁性标记的电池冲洗。
    29. 将 4 mL 的 C-Media 添加到细胞分数中，以 300 x g旋转 10 分钟。
    30. 去除上清液，并在 N2B2 介质的 5 mL 中重新悬浮。取10μL的细胞悬浮液，用10μL的试青蓝稀释。使用自动细胞计数器或血细胞计对细胞悬浮液进行计数10 μL。
    31. 每个隔间室的浓度为150，000个细胞的板寡核苷酸，其中含有具有完全扩展的斧突的DRG。
    32. 第二天，将分舱室中的介质更改为 N2B2，以允许骨髓。每 2-3 天更换一次介质。骨髓将在14天内完成。
    33. 第14天，具有GBM神经球的种子培养，如3.2.26-3.2.32。在任何实验期间，在N2B2介质中保持骨髓培养。
      注：该协议如图1中的流程图原理图所示。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

为了研究hGCs与斧子的相互作用，我们产生了纯化的DRG斧子，如前面描述的15，16，17，18。这些纯化的DRG斧子然后用hG进行种子，形成GFAP+/Ki67+肿瘤状结构，这些结构集成在斧网中，而单个hGCs在联结或斧子之间迁移（图2）。为了确定hGCs如何与髓化的斧子相互作用，我们用纯化的大鼠寡核苷酸细胞和诱导骨髓化（如前所述的19、20、21）播种了DRG斧子培养物。在骨髓化DRG-寡核苷酸共培养物上添加hGCs表明，hGCs与骨髓化的斧子结合迁移，并通过伪波迪亚的形成从肿瘤质量中迁移，如我们最近的论文（图3）22所示。寡核苷酸骨髓可以通过对培养物的骨髓基本蛋白 （MBP） 染色来确定。为了量化这些文化中hG的迁移，我们使用图像J软件22测量了迁移hGC所占用的区域性的总面积。

星期一 星期三 星期五
第1天 NBF
第 1 周 铌 NBF 铌
第2周 NBF 铌 铌
第3周 铌 铌

表1：DRG培养物的喂养时间表。

Figure 1
图 1：协议的架构摘要。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2：hGCs与DRG斧子共同培养形成肿瘤状结构。肿瘤标记GFAP（红色）和Ki67（绿色）的培养物是固定和染色的，而斧子则沾有神经丝（蓝色）。刻度条：200 μm。这个数字已由我们最近发表的第22篇论文修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：hGCs沿骨髓化的斧道迁移。表达绿色荧光蛋白（GFP）的hGC-DRG-寡核苷酸培养系统中，绿色荧光蛋白（GFP）沿骨髓状的斧道染色红色为MBP迁移。刻度条：200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

可以使用博伊登腔室系统或划痕检测来执行 hGC 的迁移研究。然而，虽然这些实验未能提供有关肿瘤细胞与其他周围组织相互作用的任何信息，但目前的系统可以重述GC与骨髓和非骨髓化纤维的相互作用。此外，为了研究肿瘤的形成和端点迁移，啮齿动物大脑的器官切片培养物或胶质瘤细胞在体内植入啮齿动物大脑或侧翼之前已被利用23、24、25。最近对胶质瘤细胞进行三维建模的努力已经利用了胶原层26、27、28、星形细胞基架29、30、细胞外基质层31、电旋纳米纤维32和水凝胶33等系统。虽然这些实验在迁移方面产生了令人满意的最终结果，但它们缺乏通过高分辨率显微镜进行实时研究的能力。

在这里，我们展示了一种研究hG迁移的新方法，方法是在一个隔间中准备一个DRG共同文化。如果可以访问新的 GBM 组织，hGC 可以分离并可靠地培养。虽然hGCs最初需要很长时间才能形成神经球，但一旦球体形成，文化就很容易维持，亚文化就会形成。为了确保hGC培养的成功，组织应尽快处理。切除和加工之间的时间应尽可能缩短，样品应始终在冰上运输。

DRG 也易于分离，其斧子延伸时间比皮质神经元长，并且很容易在培养中与寡核苷酸体进行骨髓化。hGC 神经球或分离的 hGC 在腔室的远端隔间中共同培养，允许活细胞成像和细胞与斧子和骨髓纤维相互作用的实时定量。此外，该协议并不仅限于DRG培养，因为皮质神经元也可以被隔离和骨髓，很少修改该协议。这个模型也可以用来研究其他形式的脑癌。

虽然 DRG 相对简单的隔离和维护，但添加隔间会非常耗时，并造成许多技术限制，需要培训和实践才能成功。由于不均匀或过厚的胶原蛋白容易剥落，因此此方案成功的关键是均匀的胶原蛋白涂层和培养皿的划伤。在隔热室放置硅胶润滑脂时，也应格外小心。如果在分配硅胶润滑脂时未使用均匀压力，则隔腔室底部会有间隙，需要用多余的润滑脂进行密封，以防止介质泄漏。此外，将隔腔室粘附在培养盘地板时，应使用最小压力。如果斧子在第一周后未能从中间隔间中穿过，并且 DRG 看起来正常，则在放置隔室时可能会施加过大的压力或使用过量的润滑脂。

由于缺乏高效和可重复的外生模型，大脑中沿骨髓和非骨髓化的突生带迁移没有得到很好的描述。我们在这里描述一个创新的体外培养系统的发展，以研究胶质瘤细胞如何沿着斧子和骨髓迁移，这是开发专门针对肿瘤细胞迁移的新疗法的关键组成部分。我们的培养系统是多功能的，因为隔间之间有流体隔离，有助于研究各种新疗法或影响胶质瘤细胞迁移的不同浓度物质的能力。我们的共文化系统的另一个优点是能够实时监控 hGC 迁移和各种处理的影响。此处描述的协议目前被用作开发更精密的仿生三维外体系统的基础，该系统只使用完全用于评估新药的毒理学和疗效的人体细胞成分。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了布朗大学神经外科内部基金的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Suspension Culture Dish Corning 430591
2.5S NGF ENVIGO B.5025
60 mm Suspension Culture Dish Corning 430589
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher A1049201
Ammonium Hydroxide Solution Fisher Scientific A669-500 Concentrated
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech AF-100-18B
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat Miltenyi Biotec 130-093-392
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher 15240062
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) Miltenyi Biotec 130-091-222
B27 Supplement Thermo Fisher 17504044
B27 Supplement, minus vitamin A Thermo Fisher 12587001
Bacteriological Plate BD Falcon 351029
Biotin Sigma B4639
BSA Sigma A9418
Campenot Chamber Tyler Research CAMP-10
Cell Culture Dish Corning 430165 35mm X 10mm
Cell Strainer BD Falcon 352350 70 uM, Nylon
Cell Strainer BD Falcon 352340 30 uM, Nylon
Collagenase/Dispase Roche 11097113001
Cultrex Rat Collagen I Trevigen 3440-100-01
D-Glucose Sigma G5146
DMEM Thermo Fisher 10313021
DNase I Sigma D7291
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Scientific 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5045
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat
EBSS Sigma E7510
EGTA Sigma E3889
FBS Hyclone SH30070.02
FUDR Sigma F0503
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35050061
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher 11765054
HBSS Thermo Fisher 14175095
Hemostatic Forceps Roboz RS-7035
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS Stem Cell Technologies 07980
Hypodermic Needle, 18G BD 511097
Insulin-Transferrin-Selenium G Thermo Fisher 41400045
L-Cysteine Sigma C7477
L-Glutamine Thermo Fisher 25030081
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MEM Thermo Fisher 1190081
Mg2SO4 Sigma M2643
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MS Columns plus tubes Miltenyi Biotec 130-041-301
NAC Sigma A8199
NaHCO3 Sigma S5761
Neurobasal Medium Thermo Fisher 21103049
Neurobasal-A Medium Thermo Fisher 10888022
Ordinary forceps
P2 Sprague Dawley Rat Pups
Papain Worthington LS003126
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140148
Pin Rake Tyler Research CAMP-PR
Progesterone Sigma P8783
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher A1110501
Syrine Grease Applicator Tyler Research CAMP-GLSS
Transferrin Sigma T2036
Uridine Sigma U3003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
  3. Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
  4. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  5. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  6. Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).
  7. Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
  8. Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
  9. Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
  10. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  11. Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).
  12. Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U. Glioblastoma. De Vleeschouwer, S. , (2017).
  13. Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
  14. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
  15. Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
  16. Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
  17. Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
  18. Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
  19. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  20. Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
  21. Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
  22. Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
  23. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).
  24. Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
  25. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  26. Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
  27. Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
  28. Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
  29. Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
  30. Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  31. Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
  32. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
  33. Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).

Tags

癌症研究， 问题 154， 胶质瘤干细胞， 迁移， 前体模型， 共培养， DRG斧子， 骨髓
多端根结核细胞迁移的实时监测
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zepecki, J. P., Snyder, K. M.,… More

Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Tapinos, N. Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures. J. Vis. Exp. (154), e59744, doi:10.3791/59744 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter