Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ניטור בזמן אמת של הגירה של תא האדם Glioma על גבי גנגליון שורש-אוליגודנדרוציטים שיתוף תרבויות

Published: December 13, 2019 doi: 10.3791/59744
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Molecular Neuro-oncology Laboratory, Brown University, Rhode Island Hospital, 2University of Minnesota, College of Veterinary Medicine, 3Department of Neurosurgery, Brown University

Summary

כאן אנו מציגים מערכת התרבות הvivo לשעבר מעורב מעורבת לחקר התא glioma האדם (hGC) הגירה בזמן אמת. מודל זה מספק את היכולת להתבונן באינטראקציות בין השמאל לבין האקטונים המייאלואידית והלא-מיאלואידית בתוך תא מחולק.

Abstract

גלינובלסטומה הוא אחד מסוגי הסרטן האנושיים האגרסיביים ביותר בשל הטרוגניות הסלולר הנרחבת ומאפייני ההגירה של ההההההבין. כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הגירה של תאים glioma, היכולת ללמוד את האינטראקציה בין האקולונס לבין אקסונים בתוך סביבת מיקרו הגידול היא חיונית. כדי לדגמן את האינטראקציה התאית הזאת, פיתחנו מערכת תרבות מעורבת המורכבת מ-"האוליגודנדרוציטים" ושיתוף התרבויות השורש (DRG). תרבויות DRG נבחרו כי הם יכולים להיות מבודדים ביעילות יכול ליצור את התחזיות ארוך, נרחב אשר אידיאליים ללימודי הגירה של הטבע הזה. Oligodendrocytes הפוך עכברוש מטוהרים הוספו לאחר מכן על מטוהרים מטוהר drg אקסונים והמושרה מיאלואידית. לאחר המאשרת את היווצרות של מיאלין קומפקטי, האזורית הוספו לבסוף לתרבות המשותף והאינטראקציות שלהם עם ה-drg אקסונים ו oligodendrocytes הפוך היה תחת פיקוח בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ הזמן לשגות. תחת התנאים הללו, הגנוזה טופס מבנים צבירה כמו לבטא gfap ו Ki67, להעביר לאורך שניהם שירים מיאלואידית ושאינם מיאלואידית ולקיים אינטראקציה עם סיבי אלה באמצעות היווצרות פסבדו. מערכת שיתוף התרבות vivo שלנו לשעבר ניתן להשתמש כדי לזהות מנגנונים סלולריים ומולקולריים של הרומן של hGC הגירה והוא עלול לשמש עבור בדיקות יעילות התרופה מחוץ גופית.

Introduction

גלינובלסטומה הוא אחד הגידולים האגרסיביים והקטלניים ביותר של המוח האנושי. התקן הנוכחי של טיפול כולל כריתת כירורגית של הגידול ואחריו קרינה1 בתוספת במקביל ומינהל הפסיקה של temozolomide2. אפילו עם גישה זו רב טיפולית, הישנות הגידול הוא בלתי נמנע3. זה בחלקו בשל הטבע הנדידה נרחב של תאי הגידול, אשר לפלוש המוח בתוך מתעליה ביצירת אצבעות מרובות כמו התחזיות במוח4 כי לבצע כריתה מלאה סביר.

בשנים האחרונות, זה הפך להיות ברור כי התוקפנות של gliנובלסטומה היא בשל, בין השאר, לנוכחות של אוכלוסייה של תאי גזע סרטן בתוך מסת הגידול5,6, אשר מוצג פוטנציאל נדידה גבוהה7,8, עמידות כימותרפיה וקרינה9,10 ואת היכולת טופס גידולים משניים11. GSCs מסוגלים ללכוד גידולים פוליבטיים המקורי כאשר xenografted ושתל עכברים עירום5.

למרות העושר של הידע לגבי הרקע הגנטי של glioblastomas, המחקרים על הגירה תא glioma (GC) מפריע כיום על ידי חוסר יעיל בתחום החוץ או במודלים הגירה vivo. במיוחד, בעוד האינטראקציות של התאים glioma cell מאופנן על ידי גורמים סלולריים וסביבתיים הם רכיב ליבה של הפלישה glioma, לידע שלנו אין כיום מערכת ניסיונית עם היכולת לדגמן אלה אינטראקציות12,13,14. כדי להתמודד עם מחסור זה, פיתחנו מערכת התרבות vivo ex של האזורית שיתוף תרבותי עם מטוהרים DRG axon-oligodendrocytes הפוך כי התוצאה ביטוי מוגבר של סמני הגידול הבדיל, כמו גם הגירה נרחבת אינטראקציה של ההאנון עם סיבים מיאלואידית ולא מיאלואידית. זו פלטפורמה vivo ex, בשל הפריסה ממדר שלה, מתאים לבדיקת ההשפעות של הרומן therapeutics על דפוסי הגירה hGC.,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקולים עבור איסוף, בידוד, והתפשטות של תאים האדם glioma של המטופל אושרו על ידי ועדת IRB של בית החולים רוד איילנד. כל החיות היו מתוחזקים על פי מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל הפרוטוקולים לשימוש בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש הוועדה של רוד איילנד החולים.

1. ההכנות לתקשורת ומאגר

  1. הכן 50 mL של מדיה נוירוספירה: 1x בסיס עצבי הבסיסי w/o ויטמין A, 1x סרום מוסף חינם w/o ויטמין A, 2 מ"מ L-גלוטמין, 20 ng/mL גידול באפידרמיס מקדם (EGF), 20 ng/mL בסיסי גידול מקדם צמיחה (FGF), 2 μg/mL הפארין, ו-1x אנטיביוטי-antimycotic (anti
  2. הכינו 50 mL של מדיום בסיס עצבי: 1x מדיום בסיס עצבי, 1x סרום ללא תשלום, 4 g/L D-גלוקוז, 2 מ"מ L-גלוטמין, ו 50 ng/mL הצמיחה העצב גורם (NGF).
  3. להכין 500 mL של N2B2 בינוני: 1:1 בינוני שונה של הנשר בינונית-Ham של חזיר מזון (DMEM-F12), 1x אינסולין-העברת-סלניום (שלה-G), 66 mg/mL סרום אלבומין (BSA), 0.1 mg/ml, 0.01 mg/mL biotin, 6.29 mg/mL הפרוגסטרון, 5 μg/mL N-מרחריל-L-cystine (NAC), ו 1 מ"מ putriscine. . להקפיא ולקפוא ב -20 ° c
  4. הכינו 500 mL של C-Medium: 1x בינוני חיוני מינימלי (הגברת), D-גלוקוז (הסופי 4 g/L), 10% סרום עוברי העובר (FBS), ו 2 מ"מ L-גלוטמין. . להקפיא ולקפוא ב -20 ° c הוסף מקדם צמיחה עצבים (NGF) טרי לפני השימוש (50 ng/mL).
  5. להכין 200 mL של מאגר Papain: התמיסה המאוזנת של 1x ארל מלח (EBSS), 100 mM Mg2SO4, 30% גלוקוז, 0.25 m egta, ו 1 M נחקו3.
  6. הכן 10 מ ל של dmem דיום-שלה-G בינוני: 1x DMEM, 0.5% BSA, ו-1x שלה-G.
  7. הכינו 200 mL של מאגר PB: 1 x מלוחים של Dulbecco פוספט באגירה (DPBS) ללא Ca2 + ו-Mg2 + ו 0.5% bsa. דגה את המאגר לפני השימוש ולשמור על הקרח.

2. בידוד ותרבות של תא גזע של גלימה כדורים

  1. בידוד של הנוירוספירות
    1. לאסוף IRB מאושר והחולה הסכימו האדם טרי gliנובלסטומה (GBM) הרקמה מחדר הניתוח. העברת דגימות GBM על הקרח DPBS המכיל 2x anti-anti-BL2 מוסמך ארון בטיחות ביולוגי.
    2. העברה אחת 1 ס מ3 לדוגמה GBM עם נמק מינימלי או זיהום תא דם אדום לצלחת 60 מ"מ וחותכים לתוך 1 מ"מ3 קטעים; הסיר DPBS עודפים.
    3. לעכל את הרקמה עם 5 מ ל של קולגן של הקולאז/dispase (1 מ"ג/mL) עבור 30 דקות ב 37 ° צ' ובעדינות מערבולת את המנה כל 5-10 דקות.
    4. העבר שברי מתעכל לצינור 50 ml ו קצוצות על ידי ליטוף עם צינורות 10 ml מספר פעמים כדי לנתק את הרקמה.
    5. הוסף נפח שווה של נוירוספירה מדיה ו קצוצות את הרקמה שוב; המאפשרים לשברים הגדולים להתיישב.
    6. הסרת מדיה ללא שברי רקמה ולעבור לאט דרך מסננת התאים 70 μM ממוקם מעל שפופרת חדש 50 mL.
    7. חזור על הצעדים 2.1.5-2.1.6 עד שכל הרקמה כבר הוטלה, שינוי מסננת התא לפי הצורך.
    8. לסובב את ההשעיה התא ב 110 x g עבור 10 דקות.
    9. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב 10 מ ל של מאגר ACK ליסינג כדי להסיר זיהום של תא דם אדום. מודטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    10. לסובב את ההשעיה התא ב 110 x g עבור 5 דקות.
    11. הסר את התאים והשהה מחדש ב-10 מ ל של מדיה נוירוספירה. לקחת 10 μL של ההשעיה התא ולדלל עם 10 μL של טרי, כחול. הרוזן 10 μL של ההשעיה התא באמצעות מונה תא אוטומטי או הומוציטוטומטר וצלחת ב 10 מ ל של נוירוספירה מדיה בצפיפות של 3 x 106 תאים ב 100 מ"מ לוחיות התרבות ההשעיה.
    12. הוסף 2 מ ל של מדיה נוירוספירה טרי לתרבות 2-3 פעמים בשבוע.
      הערה: Neurospheres יהיה ליצור השעיה בתוך 3-4 שבועות. לאחר subculturing עבור 2-4 פעמים, לאשר את הסטנס באמצעות שיטת דילול הגבלת הגידול באמצעות השתלת xenographic בעכברים שנפרצו כמתואר בעבר 22.
  2. נוירוספירות משנה
    1. כאשר הכדורים טופס ולהגיע לקוטר בין 200-500 μm, העברת נוירוספירות לצינור 15 מ"ל ו ספין ב 110 x g עבור 5 דקות.
    2. להשעות מחדש נוירוספירות ב-1 מ ל של פתרון התנתקות מראש מחומם של תאים.
    3. העברה לצינור 1.5 mL ו-דגירה ב 37 ° c עבור 5 דקות.
    4. להגדיר P200 tte כדי 150 μl ו קצוצות על ידי ליטוף למעלה ולמטה כדי לנתק כדורים נוירו.
    5. העבר תאים שעברו הנתק לשפופרת של 15 מ ל. הוסף 4 מ ל של נוירוספירה מדיה ספין ב 300 x g עבור 5 דקות.
    6. הסר את התאים והשהה מחדש ב-5 מ ל של מדיה נוירוספירה. לקחת 10 μL של ההשעיה התא ולדלל עם 10 μL של טרי, כחול. הרוזן 10 μL של ההשעיה התא באמצעות מונה תא אוטומטי או הומוציטוטומטר וצלחת בצפיפות של 1 x 106 תאים/60 מ"מ צלחת בנפח הסופי של 4 מ ל.
    7. רענן מדיה 2 פעמים בשבוע ותאי תת-תרבות לפי הצורך. הקפאת נוירוספירות שלמות כאשר הרצוי במדיה הבזלית העצבית w/o ויטמין A שיושלם עם 10% DMSO. הנוירוספירות עשויות לשמש לניסויים לאחר P4.

3. תרבות המודר של חולדה השורש (DRGs), Oligodendrocytes הפוך (OPCs) והאזורית

  1. הכנת מנות תרבות מודר
    הערה: בצע את השלבים הבאים בימים שלפני הקציר המתוכנן של ה-DRGs.
    1. הרכיבו מנות תרבות ממודר.
    2. לדלל את הפתרון מלאי קולגן כדי 500 μg/mL ב-H2או מזוקקים סטרילי; ערבב היטב.
    3. עם פיפטה העברה סטרילית, למלא 35 מ"מ צלחת התרבות עם 2 מ ל של פתרון קולגן; להסיר את הפתרון, משאיר סרט דק של קולגן מאחור ולמקם אותו לתוך המנה הבאה 35 mm. חזור על תהליך זה, הוספת פתרון קולגן יותר לפי הצורך, עד שכל הכלים היו מצופים.
    4. ברגע שכל הצלחות מצופות, מניחים את הצלחות במגש התרבות של 245 מ"מ x 245 מ"מ ומניחים שלושה רפידות גזה בעובי 1 מ"מ במרכז המגש.
    5. כדי לפולימו את הקולגן, רפידות גזה רטוב עם 1 מ ל של אמוניום הידרוקסיד מרוכז ולכסות את המגשים עבור 15 דקות.
    6. להסיר רפידות גזה ולאפשר את 35 mm מנות להתייבש במכסה הזרם למינארי.
    7. בעוד הכלים הם ייבוש, לטעון את החבית של המוליך משחה משומן עם שומן ואקום גבוה. מניחים את חדרי המודר בבקבוק מדיה בפה גדול מלא מים מזוקקים. לעקר הן על ידי אוטוקלינג ולאפשר קריר.
    8. הקובץ מחוץ לנקודה של 18 גרם. שצריך כדי ליצור טיפ קהה . לחטא ב-70% אתנול . חברו את המחט למזרק הגריז
    9. לחטא את הסיכה לגרוף ידי הטבילה ב 70% אתנול; אפשר לו להתייבש מהאוויר במכסה הזרם הלבינארי.
    10. להסיר את המכסה מן יבש, קולגן מצופה 35 mm צלחת. החזיקו את המנה בין האגודל לאצבע המצביע. החזיקו את הסיכה מגרפה עם היד השנייה. להחיל לחץ המשרד כדי ליצור אפילו 200 μM שריטות רחבות ברחבי המרכז של המנה.
    11. שימוש בפיפטה מספוא, מניחים שתי טיפות של בסיס הבסיס בתוספת נוירואליות במרכז השריטות.
    12. חזור על הצעדים 3.1.10-3.1.11 עד שכל הכלים שרוט.
    13. מייבשים את התאים המודר. במכסה זרם למינארי
    14. , עם מלקחיים סטריליים עם הומוסטטי. תפוס תא מודר אחד ליד המפריד המרכזי הפוך את הלקחיים הסטטיים כך שהחלק התחתון של החדר פונה כלפי מעלה.
    15. למרוח גריז סיליקון לחדר המודר, החל מלמעלה. ודא שגריז ממוקם בצורה מסודרת וחופף בכל הפינות.
    16. הסר את המכסה ממנה 35 מ"מ. הפוך את המנה ומניחים את השריטות מעל החדר. הברז בתחתית הצלחת בעדינות עם זוג מלקחיים.
    17. הפוך את הצלחת בעדינות על-ידי שימוש באמצעות מלקחיים סטטיים. . שחררו את הלקחיים
    18. מניחים תלולית של גריז בבסיס התא המרכזי. למלא כל חדר עם בינונית בסיס שיושלם (NB) ולבדוק דליפות. חותם דליפות עם שמן סיליקון בהתאם לצורך.
    19. המשיכו להרכיב את כל המאכלים התרבותיים ולאחסן לילה ב 37 °, 5% CO2.
  2. בידוד של עכברוש DRG נוירונים ותרבות בחדר מודר
    1. הקרבת עכברוש מתוזמן E16 ג ' ספראג-דאולי על ידי שיתוף2 חנק או על ידי מנת יתר כימית.
    2. מניחים את החיה במצב פרקדן על משטח נקי; לחטא את הבטן עם 70% אתנול.
    3. לתפוס את העור של הבטן התחתונה עם מלקחיים ולהרים בעדינות.
    4. באמצעות מספריים, לעשות חתך "אני" לאורך קו האמצע של החיה, מטפלת לא לנקב את שרירי קיר הבטן.
    5. עם זוג נקי של מלקחיים, לתפוס את קיר השריר ולעשות חתך רוחבי עם זוג נקי של מספריים באמצעות זהירות לא לנקב את הרחם או המעיים.
    6. עם זוג מלקחיים בוטים, אחוז ברחם והרם בעדינות מתוך חלל הצפק.
    7. בעזרת מספריים טריים וסטריליים, הצמד את רקמת החיבור לבסיס כל קרן רחם.
    8. מניחים את הרחם כולו בצלחת התרבות 100 mm סטרילי רקמות.
    9. לשאת את הרחם למכסה. של זרם למינארי לניתוח
    10. להסיר עוברים מן הרחם, אחד בכל פעם, על ידי חיתוך דרך שק השפיר בעדינות להקניט את העובר החוצה לתוך צלחת 60 מ"מ המכיל 5 מ ל של L-15 עם עט-דלקת.
    11. עם מלקחיים עדינים, מקום 3-4 עוברים לתוך הצלחת 60 מ"מ המכיל 5 מ ל של L-15 עם העט של 1x-דלקת.
    12. לעבוד תחת מיקרוסקופ מבתר ועם עובר אחד בכל פעם, המתת חסד על ידי עריפת ראשו.
    13. לשקר את העובר בצד השני ולהסיר את הגפיים ואת הזנב.
    14. עם מלקחיים עדינים, עשה חתך. באמצע הדרך בתוך החיה
    15. להסיר איברים פנימיים ורקמות כדי לחשוף את המבנים האלה, במיוחד חוט השדרה אשר צריך להיות גלוי עם השלמת.
    16. מניחים להב אחד של מספריים מיקרו הקיצוץ בין הטור החוליות לבין תעלת השדרה ולחתוך בזהירות דרך השדרה החוליות כדי לחשוף את חוט השדרה. לדאוג לא לחתוך דרך חוט השדרה.
    17. עם מלקחיים עדינים, לתפוס קלות את הקצה הrostral של חוט השדרה ולהרים לאט את העובר. . הדראגים יצורפו לחוט השדרה
    18. העברת מיתרי עמוד השדרה ומצורף DRGs למנה 35 מ"מ המכיל 2 מ ל של L-15 עם עט-דלקת. . מקום על הקרח
    19. לאחר כל מיתרי השדרה כבר מבודדים, להשתמש מלקחיים עדינים לקטוף בנפרד DRGs מחוט השדרה. מקום DRGs לתוך מאכל טרי 35 mm.
    20. אם שורשי העצבים נמצאים. בדראגים, התרחקו
    21. הסרת מנות 35 מ"מ מוכנות מ-37 ° c, 5% חממה2 . הסר את המדיה מהיום הקודם. מקום 80 μL של המדיה הבזלית העצבית (NBF) המכילה 10 μM 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR) במרכז התא ו 250 μL של מדיה בכל תא חיצוני.
    22. מניחים 2 גאנגליה בכל תא במרכז. החזר כלים ל37 מעלות צלזיוס, 5% חממה2 .
    23. היום שלמחרת מוסיפים 2.5 מ ל של NBF.
    24. להאכיל את התרבויות לאחר לוח הזמנים בטבלה 1, שינוי לוח הזמנים המבוסס על היום שנבחר להתחיל את ההכנה drg.
    25. ביום 21 (או כאשר אקסונים להגיע לסוף של התאים המרוחק), או תרבויות זרע עם נוירוספירה GBM (להמשיך שלב 3.2.26) ולחיות תמונה או מיאלואידית התרבויות עם תרבויות oligodendrocytes הפוך (להמשיך לשלב 3.3) ולאחר מכן זרע עם נוירוספירה GBM אחרי המייאלונציה
    26. החלף שנוספו NB בינונית בכל תא מודר משני כי יהיה הנזרע עם נוירוספירה GBM עם בינוני NB המכיל 10% FBS.
    27. עם P20 להגדיר את הצינורות ל 10 μL, להסיר נוירוספירה אחת של GBM מן התבשיל תרבות. נוירוספירה GBM צריך למדוד כ 200 מיקרון בגודל.
    28. הצב את קצהו של הפיפטה בחדר המרוחק וגרש את הנוירוספירה באיטיות, כך שהיא תיפול בעדינות אל האקסונים בחלק של החדר המרוחק הקרוב ביותר לחדר המרכזי, מעל האקסונים שליד החדר המרכזי. להיזהר לא לתת את הטיפ הצינורות לשבש את האקסונים.
    29. השאר את התרבות בארון הביובטיל בגובה של 1 h בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לנוירוספירה של GBM להתחבר.
    30. לאחר נוירוספירה המצורפת, מאוד בזהירות להחליף את המדיה בתא המרוחק עם שנוספו NB בינונית.
    31. תרביות תמונות חיות במשך 3-7 ימים, הוספת מדיה לפי הצורך. במקרה זה, CO בשליטה2 תא חי מארז מחובר למיקרוסקופ (למשל, Zeiss axiovert) שימש ברציפות לפקח על הגירה התא עבור 7 ימים באמצעות ברייטפילד. התמונות נרכשו כל 10 דקות באמצעות התוכנה המשויכת. חזור על אותו פרוטוקול באמצעות התקנון כי היו מזוהמים לבטא GFP ותמונות נתפסו באמצעות שילוב של ברייטפילד ו 488 לייזר nm.
      הערה: ניתן לשנות את הנוירודורים באמצעות וירוס או מעבר באמצעות פלמידים או סינאס. תאים יכולים גם להיות מטופלים עם מעכבי הרצוי קטן מולקולה ללמוד הגירה.
  3. מיאלונציה של DRG Axons עם Oligodendrocytes הפוך
    1. יום לפני אוליגודנדרוציטים בידוד, להחליף את מדיום NB ב DRGs עם C-Medium.
    2. לפני הניתוח, במקום 10 מ ל של מאגר Papain לתוך צלחת 60 מ"מ בחממה כדי equi,.
    3. בתוך כיפה זרם למינארי, למלא צלחת 1 100 mm ו 1 60 mm צלחת עם קרח קר HBSS. . מקום על הקרח
    4. . להקריב כלבלב מלשן בעריפת ראש להסיר את העור באמצעות זוג מספריים. לאחר הסרת העור, חותכים את הגולגולת לאורך קו האמצע עם זוג מספריים עדינים.
    5. להסיר בעדינות את הגולגולת עם מלקחיים עדינים. באמצעות מרית, בעדינות לגרוף את המוח מהחלק התחתון של הגולגולת ולהעביר למכסה לוחית הפוכה של תרבות הרקמה.
    6. להסיר את המוח ולחלק את המוח לשתי אונות מוחית. הסר את הנורות הריח, ההיפוקמפוס, ואת גנגוליה בסיס מתחת לקליפת המוח של כל האונה. מניחים את קליפת המוח במנה 100 מ"מ המכילה HBSS. חזור על שלבים 3.3.4-3.3.6 עבור שאר החיות.
    7. לעבוד עם קליפה אחת בכל פעם, להסיר את קרום המוח עם מלקחיים משובחים של דומונט. מניחים את כל מערבולות חינם לתוך מאכלים טריים 60 מ"מ עם HBSS.
    8. חותכים את הרקמה הקורטיקלית לתוך 1 מ"מ3 חתיכות. . מקום על הקרח
    9. מניחים את מאגר הפפיין. לתוך שפופרת של 15 מ ל להוסיף 200 יחידות של פפאין ו 2 מ"ג ל-cysteine. מסנן לעקר ולהוסיף 200 μL של DNase מעוקר.
    10. הסר HBSS מן רקמת המוח לקוביות ולהחליף עם מאגר Papain מ 3.3.2. צלחת המקום 37 ° c, 5% בחממה2 עבור 80 דקות, לרעוד בעדינות כל 15 דקות.
    11. העבר את הרקמה מתעכל לצינור 50 mL ולהוסיף 2 מ ל C-medium.
    12. Triturate עם הצנרת 5 מ ל לנתק את הרקמה; אפשר פיסות רקמות גדולות יותר להתיישב. הסירו את הסופרנטאנט והניחו את המקום לצינור של 15 מ ל סטרילי.
    13. הוסף 2 מ ל של C בינונית וחזור על התלת-ממדי עם הצינורות הסרולוגיים של 5 מ ל. מעבר לקצה הפיפטה של 1 מ ל ומחליף את הרקמה עד שהוא מנתק לחלוטין. . העבר לצינור הטורפדו ה -15
    14. לסובב את רקמת triturated ב 300 x g עבור 15 דקות. בזהירות להסיר supernatant ולהשהות את הגלולה ב 8 מ ל של DMEM-שלה-g בינונית.
    15. לפני הרטוב מסננת סטרילי 30 μM תא עם 2 מ ל של מאגר PB. הצב מסננת תאים מעל שפופרת 50 mL ולסנן את התא הבולם 1 mL בכל פעם. שטוף את המסנן עם 5 מ ל של מאגר PB.
    16. להעביר את ההשעיה התא לצלחת בקטיולוגי 100 מ"מ; דגירה עבור 15 דקות ב 37 ° צ', 5% CO2 חממה כדי לאפשר מיקרוגלייה לצרף.
    17. הסירו מדיה ומניחים. לצינור של 15 מ ל שטפו את הצלחת בעדינות עם 2 מ ל של DMEM-שלה-G בינונית והעברה ל-15 מ ל שפופרת.
    18. השהה מחדש את ההשעיה של התא בעדינות. קח 10 μL של ההשעיה התא ולדלל עם 10 μl של טרי, כחול. ספירה 10 μl של ההשעיה התא באמצעות מונה תא אוטומטי או הומוציטומטר.
    19. לסובב את ההשעיה התא ב 300 x g עבור 10 דקות.
    20. מתיף supernatant לחלוטין ומשהה תאים מחדש ב 70 μL של מאגר PB עבור כל 1 x 107 תאים. מערבבים היטב ומשלבים ב -4 ° c עבור 10 דקות.
    21. הוסף 20 μl של מיקרו חרוזי anti-A2B5 עבור כל 1 x 107 תאים. מערבבים היטב הדגירה ב 4 ° c.
    22. להוסיף 1-2 mL של PB מאגר עבור כל 1 x 107 תאים וצנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות בצנטריפוגה 4 ° c.
    23. . מנושף את הסופראנט לחלוטין השהה מחדש עד סך של 108 תאים ב 500 μl של מאגר PB. . המשיכו לאכול
    24. מקם עמודת חרוז מגנטי בשדה המגנטי של מפריד.
    25. הכן את העמודה על-ידי שטיפה עם 500 μL של מאגר PB. החל את ההשעיה של התא על העמודה. התעלם מזרימה במיכל פסולת (מכיל תאים שאינם מסומנים בתווית).
    26. שטוף את העמודה עם 500 μL של מאגר PB 3 פעמים. התעלם מזרימה.
    27. הסר את העמודה ממפריד מגנטי ומקום בשפופרת אוסף.
    28. פיפטה 1 מ ל של מאגר PB על העמודה. ריקון התאים המתויגים על-ידי דחיפת בחוזקה של הבוכנה לתוך הטור.
    29. הוסף 4 מ ל של C-בינוני לשבר תא ו ספין ב 300 x g עבור 10 דקות.
    30. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש ב-5 מ ל של N2B2 בינונית. לקחת 10 μL של ההשעיה התא ולדלל עם 10 μL של טרי, כחול. הרוזן 10 μL של השעיית התא באמצעות מונה תא אוטומטי או הומוציטומטר.
    31. צלחת oligodendrocytes הפוך בריכוז של 150,000 תאים לכל חדר מודר המכיל DRG עם axons מורחב לחלוטין.
    32. למחרת היום לשנות את התקשורת בחדר מודר לN2B2 כדי לאפשר מיאלונציה. החליפו מדיה כל 2-3 ימים. המייאלונציה תושלם. בעוד 14 יום
    33. ביום 14, תרבות הזרעים עם נוירוספירה GBM כמו ב-3.2.26-3.2.32. לשמור על תרבויות מיאלואידית ב N2B2 בינונית למשך כל ניסויים.
      הערה: הפרוטוקול מוצג כסכימטי תרשים זרימה באיור 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

על מנת ללמוד את האינטראקציה עם אקסונים, יצרנו מטוהר drg אקסונים כפי שתוארו בעבר15,16,17,18. לאחר מכן היתה התאגדות drg מטוהרים זו היתה לאחר מכן עם התקנון, אשר יצרו gfap +/ki67 + מבנים כמו גידול משולבים בתוך רשת אקסונים, בעוד הפרט היחיד הועבר או בשיתוף או בין אקסונים (איור 2). כדי לקבוע כיצד הקשר מתקשר עם axons מיאלואידית, אנו הנזרע תרבויות axons עם עכברוש מטוהרים oligodendrocytes הפוך והמושרה מיאלואידית כפי שתוארה בעבר19,20,21. תוספת של הנמל על מיאלואידית drg-אוליגודנדרוציטים שיתוף תרבויות הראה כי האזורית להגר בשיתוף עם אקסונים מיאלואידית והרחק ממסת הגידול באמצעות היווצרות של פסבדו אקראי כפי שמוצג בעיתון האחרון שלנו (איור 3)22. ניתן לקבוע אוליגודנדרוציטים מיאלואידית באמצעות חלבון המיאלין בסיסי (MBP) כתמים של התרבויות. כדי לכמת את הגירה בתרבויות אלה, מדדנו את השטח הכולל של התרבות שנכבשה על ידי העברת התקשורת באמצעות תוכנת Image J22.

יום שני יום רביעי יום שישי
היום הראשון הפקודה NBF
שבוע 1 NB הפקודה NBF NB
השבוע השני הפקודה NBF NB NB
שבוע 3 NB NB

טבלה 1: לוח זמנים של האכלה בתרביות DRG.

Figure 1
איור 1: סיכום סכימטי של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: המלון יוצר מבנים כמו גידול בתרבויות שכונתיות עם DRG axons. התרבות היתה קבועה ומוכתמת עבור סמני הגידול gfap (אדום) ו Ki67 (ירוק), בעוד אקסונים היו מוכתמים נוירופילמנט (כחול). סרגל קנה מידה: 200 μm. הדמות הזו שונתה מהעיתון. שפורסם לאחרונה בעיתון22 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: המלון מעביר לאורך פסי האקסון המייאלולים. האזורית ביטוי חלבון פלורסנט ירוק (gfp) להעביר לאורך מסלולים סיבי מיאלואידית אדום ויטראז עבור mbp במערכת התרבות hgc-drg-אוליגודנדרוציטים. סרגל קנה מידה: 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתן לבצע לימודי הגירה בתחום באמצעות מערכות קאמרית של Boyden או שריטות. עם זאת, בעוד ניסויים אלה להיכשל לתת כל מידע על האינטראקציות של תאים סרטניים עם רקמות אחרות שמסביב, המערכת הנוכחית יכולה ללכוד אינטראקציות GC עם סיבים מיאלואידית ולא מיאלואידית. יתר על כן, כדי ללמוד היווצרות הגידול והגירה נקודת סוף, התרבויות פרוסה של אורגאוטיפקס של המוח מכרסם או השרשה vivo של תאים glioma לתוך המוח מכרסם או האגף כבר נוצל בעבר23,24,25. מאמצים יותר לאחרונה על מידול תלת מימדי של תאים glioma יש מערכות מנוצל כמו קולגן שכבות26,27,28, astrocyte מבוססי פיגומים29,30, שכבות מטריקס של מטריצה31, אלקטרולסובב nanofibers32, ו hydrogels33. בעוד שניסויים אלה מייצרים תוצאות נקודת קצה מספקות לגבי הגירה, אין להם יכולת ללמוד בזמן אמת על ידי מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה.

כאן, הדגמנו גישה חדשה ללימוד הגירה של המודר על ידי הכנת התרבות המשותף של DRG בחדר ה. אם הגישה לרקמת GBM טרייה זמינה, המלון יכול להיות מבודד ומתורבת באופן אמין. למרות שה "לוקח זמן רב ליצור כדורים נוירוטיים בתחילה, התרבויות קלות לתחזוקה ולתת-תרבות פעם בצורת הספירות. כדי להבטיח את הצלחת התרבות hGC, יש לעבד את הרקמה במהירות האפשרית. הזמן בין כריתה ועיבוד צריך להיות ממוזער ככל האפשר, ודגימות תמיד צריך להיות מועבר על קרח.

Drg הוא גם קל לבידוד, מרחיב אקסונים שלה יותר מאשר נוירונים בקליפת התחת והוא יכול להיות בקלות מיאלואידית בתרבות עם oligodendrocytes הפוך. hgc נוירוספירות או הסדר הנכון הם שותפים משותפים בתאי התאים של התאים, ומאפשר הדמיה של תאים חיים וככמת בזמן אמת של אינטראקציות סלולר עם מחשבי אקסונים וסיבים מיאלואידית. בנוסף, פרוטוקול זה אינו מוגבל רק בתרבויות DRG, כמו נוירונים בקליפת העצב יכול להיות גם מבודד מיאלואידית עם כמה שינויים בפרוטוקול זה. מודל זה עשוי לשמש גם כדי ללמוד צורות אחרות של סרטן המוח.

בעוד DRG היא פשוטה יחסית לבודד ולתחזק, התוספת של החדר מודר הוא זמן רב ויוצר שפע של מגבלות טכניות הדורשות הכשרה ותרגול להצליח. קריטי להצלחת פרוטוקול זה הוא ציפוי קולגן אחיד גירוד של מנות התרבות, כי מחוספס או מוגזם קולגן עבה נוטה לקלף. טיפול קיצוני יש לקחת גם בעת הצבת שומן סיליקון על מודר תאי. אם אפילו הלחץ אינו משמש בעת שהוא מחלק את השומן סיליקון, יהיו פערים לאורך החלק התחתון של התא מודר כי ידרוש איטום עם עודף גריז כדי למנוע דליפת מדיה. בנוסף, יש להשתמש בלחץ מינימלי בעת שמירה על התאים המודר לרצפת הצלחת התרבותית. אם אקסונים להיכשל לחצות את התא האמצעי לאחר שבוע אחד ו drg נראה בריא אחרת, סביר להניח כי לחץ רב מדי הוחל בעת הצבת תא מודר או כמות עודפת של גריז שימש.

hGC הגירה לאורך המוני מיאלואידית ושאינו מיאלואידית במוח לא תוארה היטב בשל חוסר יעיל ומvivo מודלים לשעבר. אנו מתארים כאן פיתוח של מערכת חדשנית לשעבר התרבות vivo ללמוד כיצד התאים glioma להעביר לאורך אקסונים ומיאלין, מרכיב מכריע בפיתוח טיפולים חדשים במיוחד היעד הגירה תא הגידול. מערכת התרבות שלנו הוא צדדי מאז יש בידוד flu, בין התאים, הקלה על היכולת ללמוד טיפולים חדשניים שונים או ריכוזי שונות של חומרים המשפיעים על הגירה תא glioma. יתרון נוסף של מערכת שיתוף התרבות שלנו היא היכולת לפקח על הגירה hGC ואת ההשפעות של הטיפולים השונים בזמן אמת. הפרוטוקול המתואר כאן נמצא כעת בשימוש כבסיס לפיתוח מערכות vivo לשעבר תלת-ממדיות מתוחכמות יותר, המשתמשות ברכיבים סלולריים אנושיים בלבד שניתן להשתמש בהם כדי להעריך את הרעלים ואת היעילות של תרופות הרומן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי קרנות פנימיות של המחלקה לנוירוכירורגיה, אוניברסיטת בראון כדי N.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Suspension Culture Dish Corning 430591
2.5S NGF ENVIGO B.5025
60 mm Suspension Culture Dish Corning 430589
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher A1049201
Ammonium Hydroxide Solution Fisher Scientific A669-500 Concentrated
Animal-Free Recombinant Human EGF Peprotech AF-100-15
Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech AF-100-18B
Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat Miltenyi Biotec 130-093-392
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher 15240062
AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2) Miltenyi Biotec 130-091-222
B27 Supplement Thermo Fisher 17504044
B27 Supplement, minus vitamin A Thermo Fisher 12587001
Bacteriological Plate BD Falcon 351029
Biotin Sigma B4639
BSA Sigma A9418
Campenot Chamber Tyler Research CAMP-10
Cell Culture Dish Corning 430165 35mm X 10mm
Cell Strainer BD Falcon 352350 70 uM, Nylon
Cell Strainer BD Falcon 352340 30 uM, Nylon
Collagenase/Dispase Roche 11097113001
Cultrex Rat Collagen I Trevigen 3440-100-01
D-Glucose Sigma G5146
DMEM Thermo Fisher 10313021
DNase I Sigma D7291
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Scientific 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5045
E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat
EBSS Sigma E7510
EGTA Sigma E3889
FBS Hyclone SH30070.02
FUDR Sigma F0503
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher 35050061
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher 11765054
HBSS Thermo Fisher 14175095
Hemostatic Forceps Roboz RS-7035
Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS Stem Cell Technologies 07980
Hypodermic Needle, 18G BD 511097
Insulin-Transferrin-Selenium G Thermo Fisher 41400045
L-Cysteine Sigma C7477
L-Glutamine Thermo Fisher 25030081
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
MEM Thermo Fisher 1190081
Mg2SO4 Sigma M2643
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MS Columns plus tubes Miltenyi Biotec 130-041-301
NAC Sigma A8199
NaHCO3 Sigma S5761
Neurobasal Medium Thermo Fisher 21103049
Neurobasal-A Medium Thermo Fisher 10888022
Ordinary forceps
P2 Sprague Dawley Rat Pups
Papain Worthington LS003126
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140148
Pin Rake Tyler Research CAMP-PR
Progesterone Sigma P8783
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher A1110501
Syrine Grease Applicator Tyler Research CAMP-GLSS
Transferrin Sigma T2036
Uridine Sigma U3003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Stupp, R., Weber, D. C. The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma. Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).
  3. Wick, W., et al. Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma. Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).
  4. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  5. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  6. Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).
  7. Morshead, C. M., van der Kooy, D. Disguising adult neural stem cells. Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).
  8. Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. Neural stem cells and the origin of gliomas. New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).
  9. Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
  10. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  11. Beier, D., et al. CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles. Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).
  12. Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U. Glioblastoma. De Vleeschouwer, S. , (2017).
  13. Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers. Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).
  14. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).
  15. Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).
  16. Wood, P. M. Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue. Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).
  17. Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells. Science. 296 (5569), 927-931 (2002).
  18. Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli. Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).
  19. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  20. Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).
  21. Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells. American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).
  22. Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor. Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).
  23. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).
  24. Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).
  25. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  26. Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes. Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).
  27. Jia, W., et al. Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells. International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).
  28. Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).
  29. Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma. Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).
  30. Gritsenko, P. G., Friedl, P. Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  31. Kaur, H., et al. Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo. Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).
  32. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).
  33. Huang, Y., et al. Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells. Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 154 בתאי גזע Glioma הגירה מודל vivo ex תרבות שיתוף DRG axons מיאלין
ניטור בזמן אמת של הגירה של תא האדם Glioma על גבי גנגליון שורש-אוליגודנדרוציטים שיתוף תרבויות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zepecki, J. P., Snyder, K. M.,… More

Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Tapinos, N. Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures. J. Vis. Exp. (154), e59744, doi:10.3791/59744 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter