Summary
Una canalización bioinformática, a saber, miRDeep-P2 (miRDP2 para abreviar), con criterios de miRNA de plantas actualizados y un algoritmo revisado, podría analizar con precisión y eficiencia transcriptometrías de microARN en plantas, especialmente para especies con genomas complejos y grandes.
Abstract
Los MicroRNAs (miRNAs) son pequeños ARN endógenos (sARN) de 20 a 24 nucleótidos (nt) que existen ampliamente en plantas y animales que desempeñan un papel potente en la regulación de la expresión génica a nivel post-transcripción. La secuenciación de bibliotecas de ARNS mediante métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) se ha empleado ampliamente para identificar y analizar transcriptomías de miRNA en la última década, lo que ha dado lugar a un rápido aumento del descubrimiento de miRNA. Sin embargo, surgen dos grandes desafíos en la anotación de miRNA vegetal debido a la creciente profundidad de las bibliotecas de ARNS secuenciados, así como al tamaño y la complejidad de los genomas de las plantas. En primer lugar, muchos otros tipos de ARN, en particular, ARN de interferencia corta (siRNAs) de bibliotecas de SRNA, son erróneamente anotados como miRNAs por muchas herramientas computacionales. En segundo lugar, se convierte en un proceso extremadamente lento para analizar transcriptomes de miRNA en especies vegetales con genomas grandes y complejos. Para superar estos desafíos, recientemente actualizamos miRDeep-P (una herramienta popular para los análisis de transcriptoma de miRNA) a miRDeep-P2 (miRDP2 para abreviar) empleando una nueva estrategia de filtrado, revisando el algoritmo de puntuación e incorporando miRNA de planta recién actualizado criterios de anotación. Probamos miRDP2 contra poblaciones de ARNS secuenciados en cinco plantas representativas con creciente complejidad genómica, incluyendo Arabidopsis, arroz, tomate, maíz y trigo. Los resultados indican que miRDP2 procesó estas tareas con muy alta eficiencia. Además, miRDP2 superó a otras herramientas de predicción con respecto a la sensibilidad y precisión. En conjunto, nuestros resultados demuestran miRDP2 como una herramienta rápida y precisa para analizar los transcriptomes de miRNA de plantas, por lo tanto, una herramienta útil para ayudar a la comunidad a anotar mejor los miRNAs en las plantas.
Introduction
Uno de los descubrimientos más emocionantes de las últimas dos décadas en biología es el papel proliferante de las especies de ARNS en la regulación de diversas funciones del genoma1. En particular, los miRNAs constituyen una clase importante de ARN de 20 a 24 nt en eucariotas, y funcionan principalmente a nivel post-transcripcional como reguladores genéticos prominentes a lo largo de las etapas de desarrollo del ciclo de vida, así como en respuestas de estímulo y estrés2,3. En las plantas, los miRNAs surgen de transcripciones primarias llamadas pri-miRNAs, que generalmente son transcritas por ARN polimerasa II como unidades de transcripción individuales4,5. Procesados por maquinaria celular evolutivamente conservada (Drosha RNase III en animales, como DICER en plantas), los pri-miRNAs se extirpan en los precursores inmediatos del miRNA, pre-miRNAs, que contienen secuencias que forman estructuras de bucle de tallo intramolecular6,7. Los pre-miRNA se procesan en intermedios de doble cadena, a saber, dúplex de miRNA, que consisten en la hebra funcional, miRNA maduro y el socio menos frecuentemente funcional, miRNA*2,8. Después de cargarlos en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), los miRNAs maduros podrían reconocer sus objetivos de ARNm en función de la complementariedad de la secuencia, lo que dio lugar a una función reguladora negativa2,8. los miRNAs podrían desestabilizar sus transcripciones objetivo o impedir la traducción de objetivos, pero la forma anterior está dominada en las plantas8,9.
Desde el descubrimiento fortuito del primer miRNA en el nematodo Caenorhabditis elegans10,11, se ha investigado mucho con la identificación de miRNA y su análisis funcional, especialmente después de la disponibilidad del método NGS. La amplia aplicación del método NGS ha promovido en gran medida la utilización de herramientas computacionales que fueron diseñadas para capturar la característica única de los miRNAs, como la estructura de bucle de vástago de precursores y su acumulación preferencial de lecturas de secuencia en miRNA maduro y miRNA*. Como resultado, los investigadores han logrado un éxito notable en la identificación de miRNAs en diversas especies. Basándonos en un modelo de probabilidad12descrito anteriormente, desarrollamos miRDeep-P13, que fue la primera herramienta computacional para descubrir miRNAs de plantas a partir de datos NGS. miRDeep-P estaba específicamente dirigido a la conquista de los desafíos de la decodificación de miRNAs vegetales con longitud precursora más variable y grandes familias paralocitas13,14,15. Después de su lanzamiento, este programa ha sido descargado miles de veces y utilizado para anotar transcriptomes de miRNA en más de 40 especies de plantas16. Propulsado por herramientas basadas en NGS como miRDeep-P, se ha producido un aumento espectacular en el número de miRNAs registrados en el repositorio público miRNAmiRBase 17,donde actualmente se alojan más de 38.000 elementos de miRNA (versión 22.1) en comparación con sólo 500 elementos de miRNA (versión 2.0) en 200818.
Sin embargo, han surgido dos nuevos desafíos a partir de la anotación del miRNA vegetal. En primer lugar, las altas proporciones de falsos positivos han afectado en gran medida la calidad de las anotaciones de miRNA vegetal16,19 por las siguientes razones: 1) un diluvio de ARN (ARN) de interferencia corta endógena (SIRNAs) de las bibliotecas de ARNS de NGS fueron erróneamente anotados como miRNAs debido a la falta de un criterio de anotación de miRNA estricto; 2) para las especies sin información de miRNA a priori, los falsos positivos previstos sobre la base de los datos de NGS son difíciles de eliminar. Utilizando miRBase como ejemplo, Taylor yotros 20 encontraron que un tercio de las entradas de miRNA de plantas en el repositorio público21 (versión 21) carecían de pruebas de apoyo convincentes e incluso tres cuartas partes de las familias de miRNA de plantas eran cuestionables. En segundo lugar, se convierte en un proceso extremadamente lento para predecir miRNAs vegetales con genomas grandes y complejos16. Para superar estos desafíos, actualizamos miRDeep-P agregando una nueva estrategia de filtrado, revisando el algoritmo de puntuación e integrando nuevos criterios para la anotación de miRNA de planta, y lanzamos la nueva versión miRDP2. Además, probamos miRDP2 utilizando conjuntos de datos de ARN NGS con tamaños de genoma sin aumento gradual: Arabidopsis, arroz, tomate, maíz y trigo. En comparación con otras cinco herramientas ampliamente utilizadas y su versión antigua, miRDP2 analizó estos datos de ARNS y analizó los transcriptomas de miRNA más rápido con una precisión y sensibilidad mejoradas.
Contenido del paquete miRDP2
El paquete miRDP2 consta de seis scripts Perl documentados que el script bash preparado debe ejecutar secuencialmente. De los seis scripts, tres (convert_bowtie_to_blast.pl, filter_alignments.ply excise_candidate.pl) se heredan de miRDeep-P. Los otros scripts se modifican de la versión original. Las funciones de los seis scripts se describen a continuación:
preprocess_reads.pl filtra las lecturas de entrada, incluidas las lecturas demasiado largas o demasiado cortas (<19 nt o >25 nt), y lee correlacionadas con secuencias de Rfam ncRNA, así como lecturas con RPM (lecturas por millón) inferiores a 5. A continuación, el script recupera las lecturas correlacionadas con secuencias maduras de miRNA conocidas. Los archivos de entrada son lecturas originales en formato FASTA/FASTQ y salida bowtie2 de asignaciones de lecturas a secuencias miRNA y ncRNA.
La fórmula para calcular RPM es la siguiente:
convert_bowtie_to_blast.pl cambia el formato bowtie al formato BLAST-parsed. El formato analizado por BLAST es un formato separado por tabular personalizado derivado del formato NCBI BLASToutput estándar.
filter_alignments.pl filtra las alineaciones de las lecturas de secuenciación profunda a un genoma. Filtra las alineaciones parciales, así como las lecturas multialineadas (corte de frecuencia especificado por el usuario). La entrada básica es un archivo en formato BLAST-parsed.
excise_candidate.pl elimina las posibles secuencias precursoras de una secuencia de referencia utilizando lecturas alineadas como directrices. La entrada básica es un archivo en formato BLAST-parsed y un archivo FASTA. La salida es todas las secuencias precursoras potenciales en formato FASTA.
mod-miRDP.pl necesita dos archivos de entrada, archivo de firma y archivo de estructura, que se modifica desde el algoritmo de miRDeep-P principal cambiando el sistema de puntuación con parámetros específicos de la planta. Los archivos de entrada son un archivo de estructura precursor de corchete de punto y lee el archivo de firma de distribución.
mod-rm_redundant_meet_plant.pl necesita tres archivos de entrada: chromosome_length, precursores y original_prediction generados por mod-miRDP.pl. Genera dos archivos de salida, el archivo predicho no redundante y el archivo predicho filtrado por los criterios de miRNA de planta recién actualizados. Los detalles sobre el formato del archivo de salida se describen en la sección 1.4.
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Protocol
1. Instalación y pruebas
- Descargue las dependencias requeridas: Bowtie222 y RNAfold23. Se recomiendan los paquetes compilados.
- Descarga Bowtie2, una herramienta de mapeo de lectura, desde su sitio de origen (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml).
- Descargar RNAfold, una herramienta del paquete de Viena utilizada para predecir la estructura secundaria del ARN, desde http://www.tbi.univie.ac.at/~ivo/RNA/.
- Antes de instalar miRDP2, asegúrese de que estas dos dependencias están correctamente instaladas y personalice el archivo de entorno bash (por ejemplo, .bashrc) para establecer una ruta de acceso correcta para estas dos dependencias.
NOTA: Otras herramientas de mapeo como Bowtie24 también son adecuadas para miRDP2; Bowtie o Bowtie2 se pueden utilizar después de la versión 1.1.3.
- Para descargar el paquete miRDP2, vaya a https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/latest_version/ y obtenga los archivos tarball.
- Antes de instalar miRDP2, asegúrese de que Perl está en PATH. Para instalar miRDP2, extraiga todo el contenido del archivo tarball descargado en una carpeta (líneas de comandos como en 1.4.2) y, a continuación, establezca la ruta de la carpeta en PATH.
NOTA: Se recomienda un ordenador o nodo informático con al menos 8 GB de RAM y 100 GB de almacenamiento para ejecutar miRDP2. - Pruebe la canalización MiRDP2.
- Para comprobar si miRDP2 se ha instalado correctamente, utilice los datos de prueba y la salida esperada que se encuentra en https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/TestData/. Los datos de prueba contienen un archivo de secuenciación GSM con formato y un archivo de genoma de Arabidopsis thaliana.
- Mueva todos los archivos descargados al directorio de trabajo actual:
mv miRDP2-v*.tar.gz TestData.tar.gz ncRNA_rfam.tar.gz
cd - Extraiga los archivos de tarball comprimidos:
tar –xvzf miRDP2-v*.tar.gz
tar –xvzf TestData.tar.gz
tar –xvzf ncRNA_rfam.tar.gz - Construir el índice de referencia del genoma de Arabidopsis:
bowtie2-build -f ./TestData/TAIR10_genome.fa ./TestData/TAIR10_genome - Cree el índice de referencia ncRNA:
bowtie2-build -f ./ncRNA_rfam.fa ./1.1.3/script/index/rfam_index - Ejecute la canalización miRDP2:
bash ./1.1.3/miRDP2-v1.1.3_pipeline.bash –g ./TestData/TAIR10_genome.fa -i ./ TestData/TAIR 10_genome –f ./TestData/GSM2094927.fa –o .
NOTA: Los comandos de Linux utilizados están en negrita y cursiva, con opciones de línea de comandos en cursiva. *indica la versión de miRDP2 (la versión actual es 1.1.3). El comando bowtie2-build debe tardar aproximadamente 10 minutos, y la canalización miRDP2 debe terminar en cuestión de minutos
- Compruebe las salidas de prueba.
- Tenga en cuenta que una carpeta denominada 'GSM2094927-15-0-10' se genera automáticamente en
, que contiene todos los archivos y resultados intermedios. - Compruebe que el archivo de salida delimitado por tabulaciones GSM2094927-15-0-10_filter_P_prediction, la salida final de los miRNAs pronosticados, contiene columnas que indican el identificador del cromosoma, la dirección del hilo, las lecturas representativas id, precursor id, ubicación madura del miRNA, precursor ubicación, secuencia madura y secuencia precursora. Tenga en cuenta el archivo de cama adicional derivado de este archivo para facilitar el análisis posterior.
- Compruebe el archivo "progress_log", que proporciona información sobre los pasos terminados, y los archivos "script_log" y "script_err", que contienen la salida del programa y las advertencias.
NOTA: Actualmente, hemos probado miRDP2 en dos plataformas Linux, incluyendo CentOS versión 6.5 en un servidor de clúster, y Cygwin 2.6.0 en el sistema PC Windows, y miRDP2 debe funcionar en sistemas similares que admitan Perl.
- Tenga en cuenta que una carpeta denominada 'GSM2094927-15-0-10' se genera automáticamente en
2. Identificación de nuevos miRNAs
- Antes de ejecutar la canalización, asegúrese de que las lecturas de entrada se preprocesan en el formato adecuado.
NOTA: La nueva versión 1.1.3 de miRDP2 puede aceptar archivos de formato FASTQ originales como entradas, aunque el proceso de formateo de lecturas se lleva a cabo como en versiones anteriores.- En primer lugar, retire los adaptadores de los extremos de 5' y 3' de las lecturas de secuenciación profunda (si están presentes).
- En segundo lugar, analice las lecturas de secuenciación profunda en formato FASTA.
- En tercer lugar, quite la redundancia tal que las lecturas con la secuencia idéntica se representen con una entrada FASTA única y única.
- Por último, asegúrese de que todos los identificadores FASTA son únicos. Cada identificador de secuencia debe terminar con un '_x' y un entero, que indica el número de copia de la secuencia exacta que se recuperó en los conjuntos de datos de secuenciación profunda. Una manera de garantizar un identificador FASTA único es incluir un número en ejecución en el identificador. Para obtener referencia, consulte el archivo GSM2094927.fa en los datos de prueba (https://sourceforge.net/projects/mirdp2/files/TestData/).
- Consulte los siguientes ejemplos de lecturas con formato correcto:
>read0_x29909
TTTGGGATTGAAGGGAGCTCTA
>read1_x36974
TTCCACAGCTTCTTGAACTG
>read2_x32635
TTCCACAGCTTCTTGAACTT
- Cree índices de referencia.
- Para la referencia del genoma, para ahorrar tiempo, descargue los archivos de índice Bowtie2 desde el sitio web de iGenomes (https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html) si se han indexado las secuencias del genoma de la especie de interés. De lo contrario, los usuarios indexan secuencias de referencia y mantienen el archivo de índice durante un tiempo hasta que el proyecto haya terminado, ya que es posible que sea necesario volver a indizar la secuencia del genoma. Los detalles sobre cómo indexar una referencia del genoma se incluyen en el manual bowtie2 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml).
- También se necesita otro índice ncRNA no miRNA para filtrar las secuencias ruidosos de otros fragmentos de ARN que no codifican. El archivo es una colección de secuencias ncRNA principales de Rfam, incluyendo rRNA, tRNA, snRNA y snoRNA. Para crear este índice, consulte la parte 1.4, ya que el índice debe colocarse y nombrarse correctamente, es decir,
/script/index/rfam_index.
- Ejecute miRDP2.
- Para utilizar miRDP2 para detectar nuevos miRNAs a partir de datos de secuenciación profunda, ejecute el script bash en el paquete para iniciar la canalización de análisis (se puede encontrar un ejemplo en el paso 1.4):
/miRDP2-v*.*_pipeline.bash –g -i -f -o
donde * indica la versión del script bash de canalización. Hay tres parámetros que se pueden modificar: 1) el número de ubicaciones diferentes a las que se podría asignar una lectura, 2) el número de discordancia para ejecutar bowtie2 y 3) el umbral de RPM (lecturas por millón). Modifique estas opciones mediante las opciones –L, -M y –R, respectivamente. Una explicación detallada se encuentra en la sección 3.1.
- Para utilizar miRDP2 para detectar nuevos miRNAs a partir de datos de secuenciación profunda, ejecute el script bash en el paquete para iniciar la canalización de análisis (se puede encontrar un ejemplo en el paso 1.4):
- Compruebe las salidas miRDP2.
- Tenga en cuenta que la carpeta de salida se generará automáticamente en
y se denominará ' -15-0-10'; los últimos 3 números indican los valores (predeterminado en este caso) para los parámetros 1, 2 y 3, respectivamente. El archivo _filter_P_prediction contiene información de los miRNAs finales predichos que satisfacen los criterios de anotación de miRNA de planta recién actualizados. Los detalles sobre el formato del archivo de salida se describen en la parte 1.4.
- Tenga en cuenta que la carpeta de salida se generará automáticamente en
3. Modificaciones y precaución usando miRDP2
- Parámetros que se pueden modificar
- Utilice la opción '-L' para establecer el límite de cuántas ubicaciones podría asignarse una lectura (parámetro 1). La asignación de lectura a demasiados sitios posiblemente están asociadas con secuencias de repetición y no es probable que los miRNAs. El valor predeterminado es 15. Para especies específicas, si hay familias de miRNA con muchos miembros, el primer parámetro puede aumentarse manualmente para adaptarse al paisaje del genoma.
- Utilice la opción '-M' para establecer las discrepancias permitidas para bowtie (parámetro 2). El valor predeterminado es 0.
- Utilice la opción '-R' para establecer el umbral para las lecturas potencialmente correspondientes a los miRNAs maduros (parámetro 3). Para reducir el consumo de tiempo y los falsos positivos, filtre las lecturas por RPM. Sólo las lecturas que superen un determinado umbral de RPM pueden representar secuencias maduras de miRNAs en lugar de ruido de fondo, y se conservarían para un análisis posterior. El valor predeterminado es 10 RPM.
- Tenga en cuenta que cambiar estos parámetros puede afectar potencialmente al rendimiento y al consumo de tiempo. En general, un aumento de los parámetros 1 y 2 y una disminución del parámetro 3 generarían un resultado menos estricto y un tiempo de ejecución más largo y viceversa.
- Redundancia y miRNA*
- Tenga en cuenta que los miRNAs de salida de miRDP2 pueden diferir de los miRNAs conocidos. Encontramos que esto se debe principalmente a una de dos razones: heterogeneidad de los miRNAs maduros o la abundancia relativa de miRNA y miRNA*. Encontramos que esto no afecta a la selección de longitud óptima de los precursores y el perfilado de genes miRNA conocidos.
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Representative Results
El oleoducto de anotación miRNA, miRDP2, descrito en el presente documento se aplica a 10 bibliotecas públicas de SRNA-seq de 5 especies de plantas con aumento gradual de la longitud del genoma, incluyendo Arabidopsis thaliana, Oryza sativa (arroz), Solanum lycopersicum (tomate), Zea mays (maíz) y Triticum aestivum (trigo)(Figura 1A). En general, para cada especie, 2 bibliotecas de ARNs representativos de diferentes tejidos (colapsados en lecturas únicas, detalles en la sección de protocolo) y sus secuencias genógenas indexadas se procesan como dos entradas(Tabla 1). Se seleccionaron cinco herramientas de predicción computacional miRNA (miRDeep-P13, miRPlant25, miR-PREFeR26, miRA27, miReNA28)para realizar la comparación.
Prueba de tiempo de ejecución
Para comparar el tiempo de ejecución y el rendimiento de miRDP2 y otras cinco herramientas, instalamos cinco herramientas (miRDP2, miRDeep-P, miR-PREFeR, miRA y miReNA) en un servidor de clúster con el sistema Cent OS versión 6.5. Estos programas se ejecutaron con los mismos archivos de entrada, hardware y recursos (detalles en archivo complementario 1). Especialmente, miRPlant se controla desde una GUI escrita en Java y no pudo ejecutarse en el servidor. En su lugar, probamos miRPlant en un PC con Windows 10 mientras que también hemos probado miRDP2 y miRDeep-P en este PC (detalles en el archivo suplementario 1).
Para especies genógenas pequeñas como Arabidopsis thaliana, Oryza sativa,y Solanum lycopersium, todos los programas funcionaron correctamente. Sin embargo, para grandes genomas especies como Zea mays y Triticum aestivum (incluyendo Solanum lycopersium for miRA), algunos de los programas agotaron todos los recursos informáticos y se rompieron a mitad de camino. Por ejemplo, miReNA, miRA y miR-PREFeR no generaron resultados, probablemente debido a la deficiencia de memoria al tratar con archivos sam grandes o archivos intermedios. En particular, los archivos temporales miRPlant consumían demasiado espacio, y el resultado no pudo ejecutarse en el PC cuando se trata de grandes especies de genomas. miRDP2 terminó estos procesos de predicción en muy poco tiempo, de minutos a horas(Figura 1B). Por lo tanto, en comparación con su versión antigua y otras herramientas, el tiempo de ejecución de miRDP2 se acortó notablemente.
Prueba de sensibilidad y precisión
Dado que los miRNAs en Arabidopsis se estudian intensivamente, hicimos uso de miRNAs conocidos en Arabidopsis en miRBase21 (versión 22.1) para evaluar miRDP2, e hicimos la comparación con otras herramientas. Como se informó anteriormente19,26, se emplean las siguientes fórmulas para calcular la sensibilidad y la precisión:
Los miRNAs conocidos son los anotados en miRBase. Un miRNA se designa como expresado si las secuencias maduras tienen más de 5 RPM, y el 75% lee en el precursor asignado a secuencias de miRNA maduras y estelares. Para realizar la prueba se utilizaron dos bibliotecas de ARNS secuenciadas de Arabidopsis(Tabla 1). miRDP2(Figura 1C,D)funciona mejor tanto en sensibilidad como en precisión en comparación con otras herramientas.
En conjunto, estos resultados demuestran que miRDP2 es una herramienta rápida y precisa para analizar el transcriptoma de miRNA en plantas.
Figura 1: Rendimiento de miRDP2. (A) Tamaño del genoma (en Gb) de Arabidopsis thaliana (Ath), Oryza sativa (Osa), Solanum lycopersicum (Sly), Zea mays (Zma), Triticum aestivum (Tae). (B-D) Comparación de tiempo de ejecución, sensibilidad y precisión de miRDP2 y otras cinco herramientas. Dos puntos correspondientes a cada herramienta indican que cada herramienta realizó dos pruebas. Esta figura ha sido adaptada de Kuang et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Especies (abb.) | Versión del genoma | bibliotecas sRNA | ||||
| ID de biblioteca | Tamaño del archivo | Total de lecturas | Lecturas únicas | Tejido | ||
| Arabidopsis thaliana (Ath) | versión 10 | GSM2094927 | 24.9 Mb | 40,5M | 9.7M | Hoja de adulto |
| GSM2412287 | 29,5 Mb | 45.1M | 11.1M | Hoja | ||
| Oryza sativa (Osa) | versión 7 | GSM2883136 | 44.2 Mb | 54,9M | 16,3M | Plántula |
| GSM3030848 | 34.7 Mb | 49.1M | 13.0M | Flagleaf | ||
| Solanum lycopersicum (Sly) | versión 3 | GSM1213985 | 205.4 Mb | 161,5M | 58,0M | Hoja |
| GSM1976413 | 118.5 Mb | 139.3M | 46.2M | Raíz | ||
| Zea mays (Zma) | versión 4 | GSM1277437 | 158.4 Mb | 266.1M | 60,5M | Plántula |
| GSM1428531 | 144.1 Mb | 172,5M | 56,3M | Semilla | ||
| Triticum aestivum (Tae) | iwgsc 1 | GSM1294660 | 76.1 Mb | 59,2M | 29,6M | Disparar |
| GSM1294661 | 113.6 Mb | 84.0M | 44,0M | Hoja | ||
Tabla 1: Genomas y bibliotecas de ARNS utilizados para probar miRDP2 y otras herramientas. Esta tabla ha sido adaptada de Kuang et al.16.
Archivo complementario 1: Comparación del tiempo de ejecución, sensibilidad y precisión de miRDP2 y otras cinco herramientas. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo suplementario 2: Ejemplos de miRNAs auténticos con estructura de bifurcación en bucles. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo suplementario 3: Criterios actualizados para la anotación de miRNA de planta y criterios para miRNAs de 23 y 24 nt. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo complementario 4: Diagrama del flujo de trabajo de miRDP2. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Con la llegada de NGS, se ha identificado un gran número de loci de miRNA a partir de una cantidad cada vez mayor de datos de secuenciación de ARNS en diversas especies29,30. En la base de datos de la comunidad centralizada miRBase21, los elementos de miRNA depositados han aumentado casi 100 veces en la última década. Sin embargo, en comparación con los miRNAs en animales, los miRNAs vegetales tienen muchas características únicas que hacen que la identificación /anotación sea más complicada13,14.
En primer lugar, los precursores de los miRNAs de plantas son más variables en longitud y estructura (Archivo Suplementario 2)16. No como la longitud relativamente uniforme de los precursores de miRNA animal alrededor de 70-90 nt, la longitud de los precursores de plantas varían según varios pliegues y podría alcanzar varios cientos de nts13,31. Esta diferencia introduce mucha incertidumbre al predecir la estructura secundaria de los precursores de miRNA, aunque un límite de longitud de precursor se establezca generalmente arbitrariamente, como no superar los 300 nt19 (este parámetro estaba incrustado en miRDP2, y los usuarios experimentados de miRDP2 podrían ajustar esto por sí mismos). Además, las familias de miRNA de plantas conservadas tienden a tener más miembros, y la variación de longitud de estos miembros también es a menudo significativa13. Esta es la razón por la cual miRDP2 tiene el parámetro –L, que indica las familias de miRNA más grandes potenciales en tamaño de miembro. Juntos, la heterogeneidad de los precursores de miRNA vegetal plantea muchas dificultades para su anotación precisa.
En segundo lugar, el ruido o falsos positivos introducidos por siRNAs es difícil de eliminar. Junto con los miRNAs, los métodos NGS también producen un diluvio de siRNAs en las bibliotecas de ARN sRNA secuenciadas. A pesar de que los siRNAs podrían ser separados de los miRNAs por su biogénesis y funciones32,33, es extremadamente difícil distinguirlos basados en datos de secuenciación y herramientas mineras. Las bases de datos públicas como miRBase, argumentadas por muchos investigadores, se han deteriorado bruscamente por el gran número de falsos positivos siRNAs, que se anotan erróneamente como miRNAs20,31. Por lo tanto, las herramientas refinadas con un nuevo y estricto conjunto de criterios para la anotación de miRNA de planta como los criterios recién actualizados25 (Archivo complementario 3) son muy deseadas en la canalización/proceso de anotación de miRNA.
Por último, pero no menos importante, el tiempo computacional para analizar las bibliotecas de ARNS ha aumentado exponencialmente cuando se trasplanta el mismo método de una especie genógena de pequeño tamaño a una de gran tamaño. Las herramientas computacionales como miRDeep-P13 y miR-PREFeR26, mediante la captura y cuantificación de la distribución de firmas de las lecturas de ARNS a lo largo de los precursores de miRNA, se han convertido en dos métodos populares y se utilizan ampliamente para anotar miRNAs. La estrategia de mapeo, el proceso de excising a los candidatos precursores y la posterior predicción de la estructura secundaria exigen un tiempo de computación considerable16. Cuando estas herramientas se emplean para analizar los datos de genomas de pequeño tamaño como Arabidopsis a otros grandes como el maíz, el tiempo de procesamiento de datos aumenta de horas a días incluso semanas(Figura 1B),lo que resulta en un colapso frecuente del proceso. Por lo tanto, se necesita urgentemente una innovación sobre las limitaciones anteriores.
Nuestro nuevo programa miRDP216, actualizado desde miRDeep-P13,está diseñado para superar los desafíos mencionados anteriormente(Archivo Suplementario 4). En este programa, empleamos una nueva estrategia de filtrado, optimizamos el algoritmo de puntuación e incorporamos criterios de anotación de miRNA de planta recién actualizados. Como resultado de estas nuevas características, el tiempo de ejecución se acortó notablemente cuando se probó utilizando diez bibliotecas de ARN sRNA de cinco especies de plantas con el tamaño del genoma creciente. Además, en comparación con otras herramientas, miRDP2 mostró un rendimiento superior tanto en sensibilidad como en precisión(Figura 1). En conjunto, estos resultados demuestran que miRDP2 es una herramienta rápida y precisa para analizar los transcriptomes de miRNA en plantas.
Debe tenerse en cuenta que la comprensión actual sobre las características de miRNA podría limitar el rendimiento de cualquier herramienta computacional. Incluso los criterios de anotación de miRNA recién actualizados se basan en un conjunto limitado de ejemplos bien estudiados. Por lo tanto, la información deducida es sólo empírica. De hecho, se ha demostrado que existen características únicas de los miRNAs en diferentes especies de plantas o linajes3. Además, características como las estructuras de las regiones aguas arriba y aguas abajo del dúplex miRNA/miRNA* también desempeñan un papel crítico en la biogénesis de miRNA34,35, que no se tienen en cuenta en las herramientas de anotación actuales. Con la acumulación de ejemplos bien estudiados en más especies de plantas, es probable que en el futuro se desarrollen herramientas de anotación aún más avanzadas que puedan capturar distinciones más sutiles y clasificar los miRNAs con un mayor grado de precisión que los métodos actuales. Una nueva y prometedora dirección de anotación de miRNA es incorporar enfoques de aprendizaje automático36 a medida que la calidad de los conjuntos de datos de entrenamiento y los criterios de anotación evolucionan continuamente.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo ha sido apoyado por beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences (KJCX201917, KJCX20180425 y KJCX20180204) a XY y National Natural Science Foundation of China (31621001) a LL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer/computing node | N/A | N/A | Perl is required; at least 8 GB RAM and 100 GB storage are recommended |
References
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