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Biochemistry

이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

Published: July 26, 2019 doi: 10.3791/59865
Automatic Translation
1
1Institute of Parasitology, McGill University

Summary

이 프로토콜은 이노 시 톨 인산 염 또는 인산 염에 바인딩하는 단백질의 식별에 초점을 맞추고. 그것은 아가로스 또는 자기 구슬에 streptavidin을 통해 고정되는 생물이노시톨 인산염 또는 인산화물과 친화성 크로마토그래피를 사용합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화결합 단백질은 서양 블로팅 또는 질량 분석법에 의해 확인된다.

Abstract

이노시톨 인산염과 인산화효소는 진핵생물의 여러 세포 과정을 조절하며, 유전자 발현, 소포 인신매매, 신호 전염, 대사 및 발달을 포함합니다. 이 대사 산물은 단백질에 결합하여 이 규정하는 활동을 능력을 발휘합니다, 그로 단백질 형태, 촉매 활동 및/또는 상호 작용을 변경합니다. 여기에서 기술한 방법은 질량 분광법 또는 서쪽 blotting에 결합된 친화성 크로마토그래피를 사용하여 이노시톨 인산염 또는 인산화물과 상호 작용하는 단백질을 확인합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화물은 화학적으로 비오틴으로 태그가 지정되어 있으며, 이 제품은 아가로오스 또는 자기 구슬에 결합된 스트렙타비딘을 통해 포획됩니다. 단백질은 대사 산물에 결합하는 그들의 친화력에 의해 단리되고, 그 후 질량 분석법 또는 서쪽 얼룩에 의해 용출되고 확인됩니다. 이 방법은 민감하고 비방사성, 리포솜이 없고 사용자 정의 할 수있는 간단한 워크플로우를 가지고 있으며 단백질 및 대사 산물 상호 작용의 정밀도 분석을 지원합니다. 이 접근법은 복잡한 생물학적 샘플에서 단백질 대사 산물 상호 작용을 식별하거나 정제 된 단백질을 사용하는 아미노산 라벨이 붙은 정량질량 분석법에서 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 Trypanosoma brucei에서단백질의 분석을 위해 최적화되어 있지만, 관련 원생 동물 기생충, 효모 또는 포유류 세포에 적응될 수 있다.

Introduction

이노시톨 인산염(IP) 및 인산염(PIs)은 유전자 발현 1,2,3,소포 인신매매 등의 세포 과정의 조절을 통해 진핵생물 생물학에 중심적인 역할을 한다. 4, 신호 변환5,6, 신진 대사7,8,9, 개발8,10. 이 대사 산물의 규정 하는 기능은 단백질과 상호 작용 하 고 따라서 단백질 기능을 조절 하는 그들의 능력에서 발생. 단백질에 의해 결합하는 경우에, IP 및 PIs는 단백질 형태11,촉매 활동12,또는 상호 작용13를 바꿀 수 있고 그러므로 세포 기능에 영향을 미칩니다. IP 및 P는 핵 2,3,14,15,벤아증망상 16,17,플라즈마와 같은 다중 세포 내 구획에 분포됩니다. 막1 및 시토졸18,단백질과 관련된3,19 또는 RNAs20.

인지질 C에 의한 막 관련 PI(4,5)P2의 절단은 INS(1,4,5)P3의 방출을 초래하며, 이는 각각 IP 키나아제 및 인산아제에 의해 인산화 또는 탈인될 수 있다. IP는 단백질에 결합하고 규제 기능을 발휘할 수 있는 가용성 분자입니다. 예를 들어, 메타조안에서의 Ins(1,4,5)P3는 IP3 수용체에 결합함으로써 제2 메신저로서 작용할 수 있으며, 이는 수용체 형태 변화를 유도하고 따라서 세포내저장소(11)로부터Ca2+의 방출을 유도한다. Ins(1,3,4,5)P4는 히스톤 데아세틸라제 복합체에 결합하고 단백질 복합체 조립 및 활성을 조절한다13. IP 조절 기능의 다른 예로는 염색질 조직21,RNA 수송22,23,RNA 편집24,및 전사 1,2,3의 제어가 포함됩니다. . 대조적으로, PIs는 종종 혈장 막 또는 세포막(25)에 단백질의 모집과 연관된다. 그러나, PIs의 새로운 특성은 비 membranous 환경에서 단백질과 연관하는 능력3,15,19,26. 이는 핵수용체 스테로이드성 인자, 이는 전사 조절 기능이 PI(3,4,5)P319에의해 조절되고, 효소 활성이 핵 PI(4,5)P226에의해 조절되는 폴리-A 폴리머라제이다. IP 및 PIs에 대한 조절 역할은 효모22,27,포유류 세포19,23, 초파리10 및 웜28을포함하는 많은 유기체에서 나타났다. 중요한 것은 진핵 혈통에서 일찍 발산한 trypanosomes에 있는 이 대사 산물의 역할입니다. 이러한 대사산물은 트리파노소마 브루시 전사 대조군1,3,발달8,세포생체발생 및 단백질 트래픽29,30에서 필수적인 역할을 한다. , 31세 , 도 32,병원체 T. 크루시33,34,35,톡소플라즈마36 및 플라스모듐의 발달 및 감염 조절에도 관여하고 있다. 5개 , 37. 따라서, trypanosomes에 있는 IP 그리고 P의 역할을 이해하는 것은 이 분자를 위한 새로운 생물학 기능을 해명하고 새로운 약 표적을 확인하는 것을 도울 수 있습니다.

단백질 및 IP 또는 PI 결합의 특이성은 이노시톨(13,38)의단백질 상호작용 도메인 및 인산화 상태에 의존하지만, PI의 지질 부분과의 상호작용도19로발생한다. 다양한 IP 및 PIs 및 이들의 변형 키나아제 및 인산염은 대사 산물 가용성 및 풍부, 이노시톨의 인산화 상태 및 단백질에 의해 영향을 받는 단백질 기능을 제어하기 위한 유연한 세포 메커니즘을 제공합니다. 상호 작용의친화성 1,3,13,38. 일부 단백질 도메인은39,40,41,예를 들어, 플렉스트린 상모도메인(42 및SPX)(S YG1/P ho81/X PR1) 도메인43을 잘 특성화하지만 ,44,45, 일부 단백질은 알 수없는 남아있는 메커니즘에 의해 IP 또는 PIs와 상호 작용합니다. 예를 들어, T. brucei의 억압자-활성제 단백질 1(RAP1)은 정식 PI 결합 도메인이 부족하지만 PI(3,4,5)P3 및 항원 변이에 관여하는유전자의 전사 를 제어하기 위해 상호작용한다 3. 친화성 크로마토그래피 및 IP 또는 PI 상호 작용 단백질의 친화성 크로마토그래피 및 질량 분석 분석trypanosome, 효모,또는 포유류 세포로부터 알려진 IP-또는 PI 결합 도메인 없이 여러 단백질을 확인8,46, 47. 데이터는 이러한 대사 산물에 결합하는 추가의 특성화되지 않은 단백질 도메인을 제안합니다. 그러므로, IP 또는 PIs와 상호 작용하는 단백질의 확인은 이 작은 분자를 위한 단백질 대사 산물 상호 작용 그리고 새로운 세포 조절 기능의 새로운 기계장치를 제시할 수 있습니다.

여기에서 기술한 방법은 IP 또는 PIs에 결합하는 단백질을 확인하기 위하여 서쪽 blotting 또는 질량 분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피를 채택합니다. 그것은 아가로즈 구슬에 공액 된 스트렙타비딘에 가교 또는 대안으로, 스트렙 타비딘 - 공액 자기 구슬을 통해 캡처 중하나 생체 생물 IP 또는 PI를 사용합니다 (그림 1). 이 방법은 민감하고 비방사성, 리포솜이 없는 간단한 워크플로우를 제공하며 세포 용해물 또는 정제된 단백질로부터 단백질의 결합을 검출하는데 적합하다(도 2). 이 방법은 복잡한 생물학적 샘플로부터 IP 또는 PI 결합 단백질을 식별하기 위해 아미노산 표지된 정량 질량 분석법47에 라벨이 없는8,46 또는 결합된 것으로 사용될 수 있다. 따라서, 이 방법은 세포 단백질과 IP 또는 PA의 상호 작용을 연구하기 위해 사용할 수있는 몇 가지 방법에 대한 대안이며, trypanosomes 아마도 다른 진핵생물에서 이러한 대사 산물의 조절 기능을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

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Protocol

1. 친화성 크로마토그래피 및 웨스턴 블로팅에 의한 IP- 또는 PI 결합 단백질 분석

  1. 세포 성장, 포해 및 친화성 크로마토그래피
    1. T. 브루시 세포를 중간 로그 단계로 성장시키고 세포 생존 가능성과 밀도를 모니터링합니다. 총 5.0 x 107 세포는 하나의 결합 분석에 충분하다.
      1. 혈류 형태를 위해, HMI-9 매체에 있는 세포를 37°C 및 5% CO2에서 10% 태아소 혈청 (FBS)로 보충합니다. 셀 밀도를 8.0 x 105 ~ 1.6 x 106 셀/mL 사이로 유지합니다.
        참고: 1.8 x 106 셀/mL보다 높은 밀도는 세포 생존에 영향을 줄 수 있습니다. 시험관 내에서 성장된 T. brucei 427 균주의 두 배 시간은 5.5 및 6.5 시간 사이입니다.
      2. procyclic 형태의 경우, 27 °C에서 10 % FBS로 보충 된 SDM-79 배지에서 세포를 성장시키고 세포 밀도를 1.0 x 107 및 3.0 x 107 세포 / mL 사이로 유지하십시오.
      3. 정제 된 단백질 (예를 들어, 재조합 단백질)의 경우 0.5 ~ 1 μg의 단백질을 복용하고 결합 완충액 450 μL에서 희석하십시오 (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.2 % 4 % 4 - 논닐 폴리에틸렌 글리콜, pH 7.4). 서양 얼룩 분석을 위해 희석 된 단백질 (입력)의 5 %를 유지하십시오. 1.1.7 단계로 진행합니다.
    2. 실온(RT)에서 10분 동안 1,600 x g의 원심분리전지 세포. 상급제는 버리십시오.
      참고: 큰 배양 볼륨의 원심분리에 대한 자세한 내용은 2.1.2 단계를 참조하십시오.
    3. 인산완충식염수 pH 7.4의 10 mL에서 펠릿을 6 mM포도당(PBS-G)으로 보충하고 37°C에서 예열하여 세포를 세척한다. 그런 다음 RT에서 5 분 동안 1,600 x g에서 세포를 원심 분리합니다.
    4. PBS-G의 1 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 그런 다음 부피를 1.5 mL 튜브및 원심분리기로 5분 동안 1,600 x g으로 옮긴다.
      참고 : 세포 펠릿은 액체 질소에서 플래시 냉동 및 -80 ° C 또는 액체 질소에 저장 될 수있다.
    5. 용해 완충액 (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol, pH 7.4)에 1.5 배 프로테아제 억제제 칵테일과 1 x 인산 효소 억제제 칵테일(재료의표)에 미리 차가운 얼음에 펠릿을 다시 일시 중단 세포를 lyse. 4 °C에서 50 rpm에서 10 분 동안 용해됩니다.
      참고: 표시된 대로 취급하지 않으면 단백질이 저하될 수 있기 때문에 이것은 중요한 단계입니다. 필요한 경우 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (SDS/PAGE)에 의한 단백질 용해의 무결성을 확인하십시오.
      주의: T-옥틸피옥시폴리에톡시에탄올은 독성이 있으며 피부와 눈의 자극을 유발할 수 있습니다. 장갑, 아이쉴드 및 페이스 쉴드 보호 기능을 사용하십시오.
    6. 4°C에서 10분 동안 14,000 x g에서 용해액을 원심분리한다. 결합 성 애조사를 위한 새로운 1.5 mL 관으로 상급체를 수집합니다. 웨스턴 블로팅 해석을 위해 총 용해량(입력)의 5%를 유지합니다. 상급체는 용해 완충제로 추출된 기생충 단백질을 함유하고 있습니다.
    7. 아가로즈 비드(즉, 50 μL의 슬러리) 또는 아가로즈 비드 50 μL에 공액된 IP 또는 PI 의 50 μL을 수집하고, 1,000 x g에서1분 동안 원심분리기를 수집한다. 상급을 폐기하고 비드를 평형화하기 위해 50 μL의 결합 버퍼에서 다시 일시 중단합니다. 컨쥬게이트가 없는 비드를 컨트롤로 사용합니다. 비인산 형태를 포함한 다양한 인산염 구성을 가진 IP/PI-비드를 사용하여 비특이적 상호 작용을 제어합니다.
    8. 50 μL의 IP- 또는 PI-비드를 세포 용해 또는 정제 된 단백질에 추가하십시오 (각 1 mL의 구슬에는 공액 IP 또는 PI의 10 nmol이 포함되어 있습니다). IP-또는 PI-비드의 부피를 총 용해물의 10% 이내로 유지하고 필요한 경우 바인딩 버퍼를 통해 결합 반응 볼륨을 조정합니다.
      1. 경쟁 검매의 경우, 결합 반응에 비 공액 IP 또는 PI의 다양한 농도를 추가합니다(예를 들어, IP-또는 PI-비드에 비해 1-, 10-, 100배 어금니 과잉).
    9. 4°C에서 1시간 또는 하룻밤 동안 반응을 배양하고 50 rpm에서 회전시.
      참고: 정제된 단백질과의 결합 반응은 단백질의 안정성에 따라 RT에서 수행될 수 있습니다. 비오틴에 컨쥬게이징된 IP 또는 IP를 사용하는 경우 1.1.9.1단계로만 진행되며, 그렇지 않으면 1.1.10단계로 진행한다.
      1. 50 μL의 스트렙타비딘-결합 반응에 자기 구슬에 접합하고 50 rpm에서 4°C 회전에서 1시간 동안 배양한다.
    10. 4°C에서 1,000 x g에서 1분 동안 혼합을 원심분리기. 상층 (흐름을 통해)를 제거하고 펠릿을 유지합니다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 상급물의 5%를 유지합니다.
      참고 : 자기 구슬을 사용하는 경우, 상각제를 제거하고 자기 스탠드를 사용하여 후속 세차를 수행 (원심 분리는 필요하지 않습니다).
    11. 세척 버퍼 1 mL (25 mM HEPES, 300 mM NaCl, 0.2 % 4 % 4 - 노닐 페닐 폴리에틸렌 글리콜, pH 7.4)를 추가하고 튜브를 두드리거나 소용돌이치면서 수지 (비드가 파이펫 팁에 부착 할 수 있기 때문에 파이펫을 사용하지 마십시오). 4°C에서 1,000 x g에서 1분 동안 반응을 원심분리하고 상한액을 버린다. 총 5번의 세면에 대한 절차를 반복합니다.
      주의: 4-노닐 페닐-폴리에틸렌 글리콜은 독성이 있으며 피부와 눈의 자극을 유발할 수 있습니다. 장갑, 아이쉴드 및 페이스 쉴드 보호 기능을 사용하십시오.
    12. 구슬에 710 mM 2-메르카포에탄올을 보충한 2x Laemmli 완충액 50 μL을 넣고 단백질을 용출하기 위해 도청하거나 소용돌이를 섞습니다. 95 °C에서 5 분 동안 가열 한 다음 1 0,000 x g의 원심 분리기를 1 분 동안 가열하고 상황제 (용출 단백질 포함)를 수집합니다. 또는 SDS 사용을 피하기 위해 8 M 우레아/100 mM 글리신 pH 2.9를 가진 단백질을 용해시다. 용수액을 -80 °C에서 동결하고, 그렇지 않으면 서양 얼룩 분석을 진행합니다.
      주의: 2-메르카포에탄올은 독성이 있으며 피부, 눈 및 호흡기 자극을 일으킬 수 있습니다. 장갑을 사용하고 화학 후드에서 작업하십시오.
  2. 웨스턴 블로팅 분석
    1. 입력 15 μL(단계 1.1.6에서) 또는 플로우스루(단계 1.1.10) 샘플을 5 μL의 4x Laemmli 버퍼와 혼합합니다. 95°C에서 5분 동안 가열 및 유동 관통 시료. 8 M 우레아/100 mM 글리신 pH 2.9로 용출된 시료의 경우, 15 μL의 엘루아테를 4x Laemmli 완충액5 μL과 혼합하고 95°C에서 5분 동안 가열합니다.
      참고: 이 단계는 2x Laemmli 버퍼에서 용출된 샘플에는 필요하지 않습니다.
    2. 4-20% SDS/PAGE 젤을 2.5 μL의 입력, 2.5 μL 플로우스루, 용출 시료 20μL로 적재하고 제조업체의 권고에 따라 단백질 사다리를 로드합니다.
      참고: 관심 있는 단백질의 분자량에 따라 젤%를 선택하십시오.
    3. 실행 버퍼에서 30-45 분 동안 150V에서 SDS / PAGE를 실행하거나 Laemmli 버퍼의 파란색 염료가 젤의 끝에 올 때까지 실행합니다.
      참고: 실행 시간은 실험실 장비에 따라 다를 수 있습니다.
    4. 유리(또는 플라스틱) 플레이트에서 젤을 제거하고 15분 동안 전사 완충제에 담가 둡니다.
    5. 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인 또는 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮니다. 멤브레인과 3mm 필터 페이퍼를 전사 버퍼에 담그십시오. 필터 용지 3장, 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인, 젤, 그리고 추가로 3장의 여과지로 샌드위치를 조립합니다. 샌드위치에 기포가 끼어 있지 않은지 확인하십시오. 필요한 경우 롤러를 사용하여 거품을 제거합니다. 캐소트의 양극 쪽에 음극과 젤에 멤브레인을 설정합니다.
      참고: 멤브레인 활성화 또는 얼룩 준비에 대한 정보는 멤브레인 제조업체의 지침을 확인하십시오.
    6. 샌드위치가 들어 있는 카세트를 전사 버퍼가 있는 전사 탱크에 놓습니다. 탱크를 얼음 양동이 또는 4 °C (예 : 냉장실에)에 놓습니다. 1시간 동안 100V에서 단백질을 전달합니다(현재 는 200-400 mA 사이다). 대안적으로, 4°C에서 15 mA의 일정한 전류에서 하룻밤 동안 전사한다.
    7. 카세트에서 멤브레인을 제거합니다. PBS에서 희석된 6% 무지방 건조 우유에 멤브레인을 0.05%의 폴리소르베이트 20(PBS-T) 또는 호환 차단 용액으로 인큐베이션하여 RT에서 1시간 동안 멤브레인을 차단합니다.
      참고 : 멤브레인을 차단하기 전에 Ponceau S 얼룩을 사용하여 전달 품질을 확인할 수 있습니다. Ponceau S의 15 mL에서 1 분 동안 멤브레인을 배양하고 물로 헹구고 밴드를 시각화하십시오.
    8. 차단 용액을 제거하고 PBS-T에서 희석 된 6 % 무지방 건조 우유에서 희석 된 1 차 항체에서 50 rpm 회전으로 RT에서 1 시간 동안 멤브레인을 배양하십시오. 대안적으로, 50 rpm 회전으로 4°C에서 밤새 멤브레인을 배양한다.
      참고 : 배양 시간은 항체의 품질에 따라 다를 수 있습니다. 그러나 대부분의 항체는 RT에서 1-3 시간의 인큐베이션으로 작동합니다.
    9. RT에서 50 rpm 회전으로 5 분 동안 PBS-T에서 멤브레인을 배양하여 블롯을 씻어 3-5 번 절차를 반복하십시오. 항체의 질에 따라서 더 많은 세스가 필요할 수 있습니다.
    10. 고추냉이 과산화아제 (HRP)에서 막을 배양하여 50 rpm 회전으로 PBS-T에서 희석 된 6 % 무지방 건조 우유에서 RT에서 1 시간 동안 이차 항체를 배양합니다.
      참고: 항체 농도 또는 희석에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.
    11. 1.2.9단계에 표시된 대로 얼룩을 씻으세요.
    12. 멤브레인을 덮기 위해 화학 발광 기판을 추가합니다. 기판의 과잉을 제거하고 어둠 속에서 RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
      참고: 화학 발광 시약에 대한 권장 사항은 제조업체의 지침을 확인하십시오.
    13. 카메라 기반 이미저를 사용하여 화학 발광 신호를 캡처합니다. 또는 X선 필름을 사용하여 화학 발광 신호를 캡처합니다.

2. 친화성 크로마토그래피 및 질량 분석법에 의한 IP/PI 결합 단백질 분석

  1. 세포 성장, 포해 및 친화성 크로마토그래피
    1. T. 브루시 세포를 중간 로그 단계로 성장시키고 세포 생존 가능성과 밀도를 모니터링합니다.
      참고: 총 1.0 x 1010 세포는 2개의 결합 성 세포에 충분합니다. 여기에 표시된 것보다 적은 세포를 사용하면 질량 분석법에 의한 낮은 풍부 단백질의 검출에 영향을 미칠 수 있습니다.
      1. T. brucei 혈류 양식의 경우, HMI-9 미디어에서 중간 로그 단계 (8.0 x 105-1.6 x 106 세포 /mL)에서 세포를 성장시키고 37 °C에서 10 % FBS를 보충하고 5 % CO2로. 427 균주에 대해, 배양5 L은 0.5-1.0 x 1010 세포를 산출할 것이다. 세포 생존에 영향을 미칠 수 있는 1.8 x 106 세포/mL 보다 높은 밀도 피하기 위해 세포 성장을 모니터링 합니다. 플라스크 부피의 1/10까지 세포 배양량을 유지; 그렇지 않으면, 세포의 성장 속도 가난한 폭기 때문에 영향을 받을 것 이다.
        참고 : 427 스트레인은 5.5-6.5 시간의 두 배의 시간을 가지고있다.
      2. procyclic 형태의 경우, 27 °C에서 10 % FBS로 보충 된 SDM-79 배지에서 세포를 성장시키고 세포 밀도를 1.0 x 107 및 3.0 x 107 세포 / mL 사이로 유지하십시오. 배양 500 mL은 0.5-1.5 x 1010 세포를 산출할 것이다.
    2. RT에서 1,600 x g에서 15 분 동안 세포를 원심 분리하고 상급체를 버리고 37 °C에서 예열 된 PBS-G의 200 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. T. brucei 혈류 형태펠릿은 고정각 원심 분리기 로터를 사용할 때 쉽게 방해되기 때문에 둥근 바닥 원심분리 튜브 (재료 표)를 사용하십시오. RT에서 5 분 동안 1,600 x g에서 다시 세포를 원심 분리합니다.
    3. 상급체를 제거하고 PBS-G의 10 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. RT에서 5 분 동안 1,600 x g의 세포를 원심 분리하고 절차를 반복하고 최종 세척 후 상한제를 폐기하십시오.
      참고: 펠릿은 액체 질소에서 플래시 냉동및 -80°C 또는 액체 질소에 보관될 수 있다.
    4. 5 mL의 용해 완충액에서 세포 펠릿을 얼음에 미리 냉각시키고 1.5 배 프로테아제 억제제 칵테일과 1 x 인산 효소 억제제 칵테일 (재료표)로보충하십시오. 50 rpm에서 4 °C 회전에서 10 분 동안 용해를 배양하십시오.
    5. 4°C에서 10분 동안 10,000 x g에서 용해액을 원심분리한다. 상열체 (용해 성 단백질)를 수집하고 결합 완충액 20 mL에서 희석하십시오.
    6. 아가로즈 비드(즉, 슬러리의 400 μL) 또는 400 μL의 제어 구슬에 공액된 IP 또는 PI의 400 μL을 수집하고, RT에서 1,000 x g에서 1분 동안 원심분리기를 폐기하고 400 μL의 결합 버퍼를 평정화합니다. agarose 비드를 음성 대조군으로 사용하여 비특이적 상호작용(예를 들어, 비특이적 구슬에 비특이적으로 결합하는 단백질)에 비해 단백질-대사산물 상호작용의 특정 농축을 결정한다. 인산염 전하 또는 비오틴에 결합하여 비특이적 상호 작용을 제어하기 위해 비 인산염 형태를 포함한 다른 인산염 구성을 가진 IP 또는 PI를 사용하십시오.
    7. 400 μL의 IP/PI-비드 또는 제어 구슬을 10 mL의 용해에 넣고 50 rpm에서 4 °C 회전에서 1 시간 또는 하룻밤 동안 배양하십시오. 비오틴만으로 응축된 IP 또는 PI를 사용하는 경우(비드 제외) 2.1.7.1단계로 진행, 그렇지 않으면 2.1.8단계로 진행한다.
      1. 자기 비드에 100 μL의 스트렙타비딘 컨쥬게이션을 넣고 50 rpm에서 4 °C 회전에서 1 시간 동안 배양하십시오.
    8. 4°C에서 1,000 x g에서 1분 동안 결합 반응을 원심분리기. 상층 (흐름을 통해)를 제거하고 펠릿을 유지합니다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 상급물의 5%를 유지합니다.
    9. 펠릿에 5 mL의 세척 버퍼를 넣고 튜브를 소용돌이치면서 부드럽게 섞은 다음 4 °C에서 1,000 x g에서 1 분 동안 원심 분리합니다. 상급제는 버리십시오. 세척을 5번 반복합니다. 자기 구슬을 사용하는 경우, 상각제를 수집하고 자기 스탠드를 사용하여 세차를 수행 (원심 분리가 필요하지 않습니다).
    10. 50 μL의 2x Laemmli 버퍼 (또는 8 M 요소 / 100 mM 글리신 pH 2.9, SDS사용을 피하기 위해) 구슬을 두드리거나 소용돌이 (비드가 파이펫 팁에 부착 할 수 있기 때문에 파이펫팅을 피하십시오)에 혼합 한 다음 95 °C에서 5 분 동안 10,000 x 10,000 x 의 Centrifuge10,000 x 상급체 (용출 단백질)를 수집합니다. 절차를 두 번 반복하여 총 3개의 분수를 수집합니다.
    11. 용루를 -80 °C에서 동결시키고, 그렇지 않으면 SDS/PAGE에서 단백질을 분리하거나 트립시네화 및 질량 분석 분석을 위한 용액에 보관하십시오.
  2. 질량 분석법을 위한 단백질의 트립신 소화
    참고: 이 절차의 2개의 변이는 단백질의 섹션 2.2.1 (젤) 또는 섹션 2.2.2 (용액) 소화를 위해 표시됩니다. 단백질 저결합 튜브는 시료 손실을 방지하기 위해 권장됩니다. 프로테오믹스 시설의 분석 화학자와 상담하여 사용 가능한 시료 및 질량 분석기 계측기에 대한 프로토콜의 적합성을 확인하십시오.
    1. 단백질의 인젤 트립시니화
      1. SDS/PAGE에서 단백질을 분리한 후, 젤을 고순도 물로 간략하게 헹구세요. 젤을 깨끗한 유리 판에 옮김을 옮김. 깨끗한 블레이드로 단백질 밴드를 소비하고 밴드 외부의 여분의 젤을 절단하지 마십시오. 젤 조각을 작은 조각(예: 약 1mm 정사각형)으로 자르고 1mL 튜브로 옮니다. 필요한 경우 파이펫 팁을 사용하지만 사용하기 전에 파이펫 팁을 에탄올로 헹구는지 확인하십시오.
        참고: 젤 오염을 방지하기 위해 장갑을 사용하십시오. 겔 조각은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.
      2. 튜브에 고순도 또는 고성능 액체 크로마토그래피 등급의 물 100 μL을 첨가하여 젤 조각을 헹구십시오. 물을 버리십시오.
        1. 쿠마시 또는 루테늄 계 형광 염색 젤 조각의 경우, 1 시간 동안 탈취 액 (25 mM NH4HCO3 in 50% 아세토니트릴)에 젤 조각을 인큐베이션한 다음 용액을 폐기하십시오. 얼룩이 보이지 않을 때까지 절차를 반복합니다.
          참고 : 100 mM NH 4 HCO3,pH 7.8에서 재고 용액에서 희석하여 NH4HCO3을 포함하는 솔루션을 준비하십시오.
          주의: 아세토니트릴은 휘발성 용매, 인화성 및 독성 물질입니다. NH4HCO3은 피부 나 눈 자극을 일으킬 수 있습니다. 장갑을 착용하고 화학 후드 아래에서 작업하십시오.
        2. 실버 스테인드 젤 조각의 경우, 은 얼룩용 탈점 용액 50 μL의 인큐베이트 젤 조각 (15mM K3[Fe (CN) 6], 50 mM Na2S2O3)30 분 동안 물에 담그고 200 μL로 젤 조각을 씻어 내십시오. 물을 젤 노란색이 보이지 않을 때까지 5번 반복 세탁하십시오.
          주의:K3[Fe(CN)6]피부 나 눈 자극을 일으킬 수 있습니다. 장갑을 사용하십시오.
      3. RT에서 10 분 동안 아세토니트릴 200 μL을 사용하여 젤 조각을 탈수합니다. 그런 다음 솔루션을 폐기합니다.
        참고: 탈수 된 젤 조각은 부피, 불투명 및 끈적 끈적한 크기로 작습니다. 여러 조각의 젤이 한 튜브에 결합되면 젤 조각을 효율적으로 탈수하는 절차를 반복하십시오.
      4. 환원 용액 (10mMdiiothreitol [DTT]에서 100 mM NH4HCO 3)의 50μL (또는 젤 조각을 덮을 수있는 충분한 부피)을 추가하고 1 시간 동안 56 °C에서 인큐베이션한 후 튜브를 RT로 냉각시키고 과량의 환원 용액을 폐기하십시오.
      5. 알킬화 용액(100 mM NH4HCO 3에서 50 mM 요오도아세타미드)의 50μL(또는 젤 조각을 덮을 만큼 충분한 부피)을 넣고 어두운 상황에서 RT에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 알킬화 용액의 과잉을 폐기하십시오.
      6. RT에서 200 μL의 아세토니트릴로 젤 조각을 탈수하고 RT에서 10분 동안 아세토니트릴을 제거하고 RT에서 10분 동안 100 mM NH4HCO3로 젤 조각을 수화합니다.
      7. RT에서 10 분 동안 아세토니트릴 200 μL로 젤 조각을 다시 탈수하고 용액의 과잉을 버립니다.
      8. 50 mM NH4HCO3 완충액으로 희석된 15 μL의 질량 분석 등급 트립신을 추가하거나, 수화 젤 조각을 덮을 만큼 충분한 부피를 넣고 37°C에서 4시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 총 트립신 양을 100-500 ng(또는 단백질 20 ng 트립신/μg) 사이로 유지하십시오.
      9. 샘플을 RT로 냉각시키고, 미세 원심분리기에서 2,000 x g에서 1분간 원심분리기를 식힙니다. 물에 희석된 5% 포믹산 10-20 μL을 넣고 RT에서 10분 동안 배양합니다.
        주의: 포믹산은 인화성, 부식성 및 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고 화학 후드 아래에서 작업하십시오.
      10. 2.2.1.9단계에서 나타난 바와 같이 원심분리기를, 상상(추출된 펩티드 함유)을 상수관으로 수집한다. 튜브에 50-60 % 아세토니트릴로 희석 된 5 % 포믹 산 20 μL을 넣고 RT에서 10 분 동안 배양하십시오.
      11. 진공 농축기에서 시료를 건조시키고 질량 분석 분석을 위해 0.5% 아세트산과 2% 아세토니트릴의 10 μL로 재구성합니다. 원심분리기 및 튜브의 바닥에 용액을 수집; -20 °C 또는 -80 °C에서 용액을 저장하십시오.
    2. 단백질의 용액 트립시니화에서
      1. 단백질을 침전하여 시료 부피, 탈염 및 완충 교환을 줄입니다. 시료에 6부(-20°C) 아세톤을 첨가합니다(예: 600 μL의 아세톤 을 시료의 100 μL) 소용돌이 및 -20°C에서 15분 내지 1시간 동안 배양한다. 솔루션은 흐리게 변하거나 침전지를 형성합니다.
        주의: 아세톤은 독성이 있고 인화성입니다. 장갑을 착용하고 화학 후드 아래에서 작업하십시오.
      2. 원심분리기 샘플을 4°C에서 30분 동안. 아세톤을 데산트하고 펠릿을 15분 동안 공기 건조시켰다.
      3. 50 mM NH4HCO3에 6-8 M 요소 또는 1% SDS 10 μL을 첨가하여 펠릿과 와류를 혼합합니다. 더 많은 양의 단백질(> 10 μg)의 경우, 최대 20 μL의 용해 완충액을 사용하십시오.
      4. 5 μL의 환원 용액과 와류를 추가합니다. 미세 원심 분리기를 사용하여 볼륨을 줄입니다. 샘플이 요소로 희석되면 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오. 샘플을 SDS에서 희석한 다음 56°C에서 1시간 동안 배양합니다.
      5. 미세 원심 분리기를 사용하여 볼륨을 줄입니다. 알킬화 용액과 소용돌이 3 μL을 첨가합니다. 그런 다음 볼륨을 아래로 회전시키고 RT에서 30 분 동안 어둠 속에서 배양합니다.
      6. 3 μL의 환원 액을 추가하여 반응을 중화시킵니다. 50 mM NH4HCO 3를 사용하여 샘플을 1 M 요소 또는0.05 % SDS로 천천히 희석합니다.
        참고: 트립신 소화 버퍼에는 세제 또는 데너티트가 있어야 합니다. 변성제에 대한 농도 제한은 : 0.05 % SDS; 0.1% 옥틸 B-D-글루카피라노사이드; 0.1% 4-논일페닐-폴리에틸렌 글리콜; 0.1% t-옥틸피녹시폴리에티에탄올; 0.1% 폴리소르베이트 20; 0.1% 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸람모니오]-1-프로판설포네이트; < 1 M 우레아 또는 티우레아.
      7. 50 mM NH4HCO3 완충액에서 희석된 질량 분석 등급 트립신 5 μL을 추가하고 37°C에서 4시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 총 트립신 양을 100-500 ng(또는 단백질 20 ng 트립신/μg) 사이로 유지하십시오.
      8. 샘플을 RT로 냉각하고 미세 원심 분리기를 사용하여 볼륨을 줄입니다. 반응을 담금질하기 위해 5 % 아세트산 (또는 5 % 아세토니트릴에서 5 % 포르믹 산)을 추가하십시오.
      9. 2.2.1.11 단계에서 표시된 대로 진공 농축기에서 샘플을 건조시면 됩니다. 샘플을 -80°C에서 보관합니다. C18 zip-tip과 같은 역상 컬럼을 사용하여 탈염 및 농축 펩티드를 질량 분석법으로 분석합니다.

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Representative Results

RAP1 및 PI 분석 (3,4,5)친화성 크로마토그래피 및 웨스턴 블로팅에 의한 P3 상호 작용
이 예는 T. brucei 용해또는 재조합 T. brucei RAP1 단백질에 의해 RAP1에 의한 PI의 결합을 분석하기 위한 이 방법의 적용을 예시한다. Hemagglutinin (HA)태그 RAP1를 발현하는 T. brucei 혈류 량 형태의 Lysates 결합 검정에서 사용 되었다. RAP1은 변이체 표면 당단백질(VSG) 유전자의 전사조절에 관여하는 단백질로,48,이는 항원 변이에 의한 기생충 면역 회피에 관여하는 표면 단백질을 인코딩하는49. RAP1은 포스파티딜리노시톨 5-포스파타제(PIP5Pase) 효소3과텔로메릭 단백질 복합체 내에서 상호 작용하며, 이는 VSG 유전자 전사1,3의조절에도 기능한다. RAP1은 N말기 유방암 1카르복실말단(BRCT) 도메인을 가지며, 그 다음에골모세포증(myb) DNA 결합 도메인 및 C말단 마이브형 도메인 3,48도메인을구비한다. 그러나 표준 PI 바인딩 도메인이 없습니다. 결합 성 세포는 이노시톨 링의 상이한 위치에서 인산화되거나 인산화되는 비-공액아가로즈 비드와 함께 수행되었다. 서양 분석에 따르면 RAP1은 PI(3,4,5)P3 비드(그림3A)에 우선적으로 결합하지만 PI(4,5)P2 비드에 비해 낮은 범위에 결합합니다. 그러나, 그것은 다른 PC 또는 아가로즈 구슬에 바인딩하지 않았다. RAP1은 다단원 복합체3의 일부이기 때문에 일부 PI와의 상호 작용은 직접적이지 않을 수 있으므로 RAP1-HA와 다른 세포 단백질과의 상호 작용으로 인해 PI에 결합합니다.

따라서, RAP1이 PIs에 직접 결합하는지 여부를 테스트하기 위해, C-말단 태그가 6x-그의 재조합 RAP1(rRAP1) 단백질을 E. coli3로부터 균질성으로 발현 및 정제하였다. 단백질은 PI(3,4,5)P3 또는 PI(4,5)P2의 경쟁 농도가 존재하는 PI(3,4,5)P3-비드와 결합하는 공아를 사용하였다. 서양 블로팅은 PI(3,4,5)P3의 농도가 증가하지만 PI(4,5)P2는 PI(3,4,5)P3(도3B)와rRAP1의 상호작용을 억제한다는 것을 보여준다. 더욱이, T. brucei 정제 PIP5Pase 효소를 반응 복원된 PI(3,4,5)P3-에 의해 p3 결합을 첨가한 것은, 이는 자유 PI(3,4,5)P3의 PIP5Pase 탈인에 기인하고 이에 대한 인산화 패턴을 나타낸다. 대사 산물은 rRAP1 결합에 필수적입니다. 따라서 rRAP1은 T. brucei에서 RAP1-HA가 용해하는 것처럼 PI (3,4,5)P3와 상호 작용합니다. 더욱이, 데이터는 LYSATE에서 PI(4,5)P2로RAP1-HA의 결합이 복합체(예를 들어, PIP5Pase)에서 다른 단백질과의RAP1 상호작용으로부터 발생할 가능성이 높다는 것을 보여준다 3. 데이터는 세포 리세이트 및 재조합 단백질을 가진 결합 분석의 상보성을 보여줍니다. 그것은 또한 단백질과 PIs 사이 상호 작용의 특이성을 결정하기 위하여 경쟁적인 결합 성 assays의 유용성을 보여줍니다.

Ins(1,4,5)친화성 크로마토그래피 및 질량 분석법에 의한 P3 결합 단백질 의 식별
이 예에서, 질량 분석뒤에 친화성 크로마토그래피는 Ins(1,4,5)P3에 결합하는 T. brucei 단백질을 확인하기 위하여 이용되었습니다; 따라서, 실험 조사 잠재적인 Ins (1,4,5)P3 결합 단백질 T. brucei 혈 류 형태에서. T. 브루시 리세이트는 Ins(1,4,5)P3를 아가로즈 비드 또는 비공액 구슬(대조군으로 사용됨)으로 공액화하고, 결합된 단백질을 Laemmli 샘플 버퍼로 용출하였다. SDS/PAGE 분석은 대조군 아가로즈 비드로부터 용출된 단백질에 비해 Ins(1,4,5)P3-비드로부터 용출된 단백질의 농축을 나타낸다(도4A). 250개 이상의 단백질을 측정한 용출 단백질의 질량 분석 분석, 그 중 84개는 대조군 구슬에 비해 Ins(1,4,5)P3 비드로 농축되었다(그림4B, 접이식 변화 [FC] ≥ 2, p< 0.05). Ins (1,4,5)P3에 결합된 단백질의 농축은 대조군 구슬과 비교하여 SDS/PAGE에 의해 검출된 단백질 신호와 상관관계가 있습니다. 상기 데이터는 Ins(1,4,5)P3를 결합하는 것으로 검증된 단백질과 Ins(1,4,5)P3에 결합하는 메커니즘이 알려지지 않은단백질8을 포함한다. 더욱이, Ins(1,4,5)P3 결합 프로테오메는 Ins(1,3,4,5)P4 및 기타PIs 8의 그것과 크게 달랐으며, 이는 이들 단백질 중 일부는 Ins(1,4,5)P3의 특정 인산염 구성을 인식한다는 것을 시사한다. 따라서, 비오틴 태그Ins(1,4,5)P3는 Ins(1,4,5)P3에 결합하는 단백질을 확인하기 위해 질량 분석법에 결합된 친화도 크로마토그래피에 사용될 수 있다. 접근법은 다른 IP 또는 P3, 8,46,47에결합하는 단백질을 확인하기 위하여 탐구될 수 있다.

Figure 1
그림 1 : 결합 성 시약 결합 시약. (A) PI(3,4,5)P3(위)와 Ins(1,4,5)P3(하단)은 이노시톨의 sn1 위치에서 비오틴에 컨쥬게이징된다. PI(3,4,5)P3에서, 비오틴은 이노시톨의 sn1 위치에서 지질 사슬에 공액화되고, 반면 Ins(1,4,5)P3에서는 비오틴이 위치 sn1에서 인산염에 공액된다. (B) Ins (1,4,5)P3는 비오틴과 공액화되고 비드(예를 들어, 아가로즈 또는 자기 비드)에 공액된 스트렙타비딘에 결합을 통해 포획된다. 비오틴을 대체하는 맞춤형 합성 링커를 이용한 이들 시약의 변형도46일가능하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2 : 프로토콜의 워크플로는 T. brucei의 단백질과의 IP 또는 PI 친화성 상호 작용의 분석 및 (A) 웨스턴 블로팅 또는 (B) 질량 분석법에 의한 검출에 대한 단계를 설명합니다. AC-WB, 친화성 크로마토그래피 및 웨스턴 블로팅; AC-MS, 친화성 크로마토그래피 및 질량 분석법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3 : T. 브루시 RAP1을 인산염에 결합합니다. (A) HA 태그RAP1을 발현하는 T. 브루시(5.0 x 107 기생충)의 용해액을 4°C에서 2시간 동안 배양하고 50 μL의 PI(각 1 mL의 아가로즈 비드 10nmol을 함유하는 아가로즈 비드) 또는 아가로즈(Ag) 구슬을 배양하였다. 결합 반응을 2 x Laemmli 샘플 버퍼로 세척하고 용출하고 95°C에서 5분 동안 가열하였다. 단백질을 4-20% SDS/PAGE로 분리하고, PVDF 멤브레인으로 옮기고, 단일클론 항체 항체 항체항HA(1:5,000, 6% PBS-우유로 희석)로 조사하였다. 반대로 마우스 IgG-HRP (1:5,000, 6% PBS-우유에 희석), 화학 발광에 의해 검출. (B) rRAP1의 1 μg는 50 μL의 PI(3,4,5)P3-아가로즈 비드가 5~50μM 의 존재 또는 부재 시에 RT에서 1시간 동안 배양되었다(diC8) PI(3,4,5)P3, 20 ~ 50 μM diC8 PI (4,5)P2, 또는 50 μM diC8 PI (3,4,5)P3 및 250 ng PIP5Pase 정제 T. 브루시 혈류 양식에서3. 결합은 마우스 항-그의 HRP 단클론 항체 (1:2,000, 6% PBS-우유에 희석)로 서양 블로팅에 의해 분석되고 화학 발광에 의해 개발되었다. 이 그림은 Cestari 외에서 수정되었습니다.3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4 : Ins (1,4,5)P3에 결합하는 T. brucei 단백질의 친화성 크로마토그래피 및 질량 분석 분석. (A) Ins (1,4,5)P3 비드 또는 아가로즈 비드에 결합하는 T. brucei 단백질의 10 % SDS / PAGE 분석. 5.0 x 10 9개의 기생충을 4°C에서 4°C에서 배양하고 400 μL의 Ins(1,4,5)P3를 아가로즈 비드또는 Ins 없이 아가로즈 비드(1,4,5)P3와 함께 공액(1,4,5)P3[1mL의 구슬10 nmol을 함유하는 컨쥬게이트 Ins(1,4]4]를 배양하였다. 결합 반응을 세척하고, 2 x Laemmli 샘플 버퍼에서 용출하고 95°C에서 5분 동안 끓였습니다. 단백질을 10% SDS/PAGE로 분리하고 쿠마시 염색(재료 표)으로 염색하였다. 화살촉은 Ins (1,4,5)P3-비드에서 농축된 단백질을 아가로즈 비즈에 비해 보여줍니다. 원은 Ins (1,4,5)P3 비드 및 아가로즈 비드 모두에 존재하는 단백질을 나타내며, 브래킷은 둘 다에 존재하지만 Ins (1,4,5)P3 비드에 농축된 단백질을 나타냅니다. (B) 도트 플롯은 Agarose 비드에 비해 Ins (1,4,5)P3 비드에서 농축되는 질량 분석법에 의해 확인된 단백질을 나타낸다. FC > 2 및 p-값& 0.05에 의해 정의된 농축. 4개의 생물학적 복제물은 아가로오스-비드 AC-MS에 사용되었고, IP3-비드 AC-MS에 대한 3개의 생물학적 복제물은 IP3-비드 대 아가로즈-비드에서 확인된 단백질의 접이식-변화MSstat50을사용하여 펩티드 스펙트럼 세기를 사용하여 계산되었다. 자세한 결과 와 펩티드의 목록은사용할수 있습니다 8. 질량 분석 원시 데이터는 PRIDE 파트너 리포지토리를 통해 ProteomeXchange 컨소시엄을 통해 식별자 PXD005907에서도 사용할 수 있습니다. 이 그림은 Cestari 외 8에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

IP 또는 PIs에 결합하는 단백질의 확인은 이 대사 산물의 세포 기능을 이해하는 것이 중요합니다. 서양 얼룩 또는 질량 분석법에 결합된 친화성 크로마토그래피는 IP 또는 PI 상호 작용 단백질을 식별하고 따라서 그들의 규제 기능에 대한 통찰력을 얻을 수있는 기회를 제공합니다. IP 또는 IP는 화학적으로 태그 [예를 들어, Ins (1,4,5)P3는 화학적으로 비오틴에 연결] 스트렙타비딘을 통해 아가로즈 구슬에 가교 또는 스트렙타비딘 자기 비드에 의해 캡처 된 다음 질량으로 식별 할 수있는 상호 작용 단백질의 분리를 허용 분광법 또는 서부 얼룩. 여기에서 기술된 프로토콜은 이 대사산물에 묶는 T. brucei3,8 및 포유류 세포47에서 단백질을 확인하기 위하여 이용되었습니다. 맞춤형 태그(비오틴 제외)를 사용하는 접근법의 변형도 효모46에사용되어 왔다. 이 접근 방식의 중요한 고려 사항은 비특정 상호 작용과 특정을 구별하기 위해 컨트롤을 사용하는 것입니다. 비-공액 비드는 필수적인 대조군이지만, 추가의 제어는 비드3에 공액된 비인광성 인광성인광 또는 이노시톨을 포함할 수 있다. 상이한 인산염 조합을 가진 IP또는 PIs 3,8은 또한 이대사산물에 단백질 결합이 이노시톨(38)의 인산염 구성을 구별하는 도메인을 포함할 수 있기 때문에 사용될 수있다. 39,40,41. 추가적으로, 견본 복잡성은 접근의 감도에 영향을 미칠 수 있고, 그러므로 견본 분획에 의하여 견본 복잡성을 감소시키는 것은 세포에 있는 낮은 풍부한 단백질의 검출을 도울 수 있습니다. 미토콘드리아51,핵52,글리코솜53,및 편모54,55의 세포 분획 및 분리를 위한 잘 확립된 프로토콜이 있다. 세포외 분획에 사용되는 버퍼 및 시약은 이 프로토콜에 사용되는 버퍼 및 시약과의 호환성을 위해 조정해야 할 수도 있습니다. 특히, 여기에 표시된 바와 같이 친화성 크로마토그래피에 의해 IP 또는 PI에 결합하는 단백질의 동정은 상호작용의 단백질 및 대사산물 친화도에 의존하며, 따라서 IP 또는 PI에 대한 친화도가 약한 단백질은 쉽게 검출되지 않을 수 있다.

세포 lysate에서 단백질과 IP 또는 PI 상호 작용의 분석은 또한 이 대사 산물에 직접 결합하지 않는 단백질의 확인귀착될 수 있습니다, 그러나 어떤 상호 작용은 IP에 묶는 그밖 단백질과 복잡한에서 단백질 협회에서 유래합니다 또는 PI. 이 특징은 도 3A에서 예시로, T. brucei lysate에서 RAP1-HA는 PI(3,4,5)P3-비드 및 PI(4,5)P2 비드에 결합하는 것으로 나타난다. 그러나, 그의 태그가 있는 rRAP1을 가진 결합 성 교수는 이 단백질이 PI (3,4,5)P3에결합하고 PI (4,5)P2 3이 아니라는 것을 보여줍니다. 이는 도 3B에 도시되어 있는데, 경쟁적인 공해는 무료 PI(3,4,5)P3이지만 무료 PI(4,5)P2는 PI(3,4,5)P3 비드와의 상호 작용을 위해 rRAP1-P3-비드를 위해 경쟁한다는 것을 보여준다. PI(4,5)P2-비드와의 상호작용으로 보이는 RAP1은 PI(4,5)P2(예를 들어, PIP5Pase)를 결합하는 단백질과 복합체 내의 RAP1 연관에 기인한다3. 그러므로, 세포 lysates에서 결합 한 세포 는 IP 또는 PIs에 직접 또는 간접적으로 묶는 단백질을 확인할 수 있습니다. 특히, 간접적인 상호 작용은 전이 대사 산물 결합에 의해 영향을 받거나 영향을 받는 생물학적 기능(단백질 복합체의 맥락에서)을 가질 수 있기 때문에 비특이적 상호작용과 구별된다. 예를 들어, Ins(1,4,5,6)P4는 다중 서브유닛 공동 압제기 deacetylase 복합체에결합하고 복잡한 조립체 및 활성(13)을 제어한다. 따라서, 단백질과 IP/PI 상호 작용을 확인 하는 것이 필수적이다. 상호 작용의 검증은 IPs 또는 PI의 과잉을 가진 경쟁 적인 검문 (그림 3B에서와같이)3,8,잠재적인 단백질 도메인의 돌연변이56,또는 정제된 단백질의 사용을 포함할 수 있다. 직접 상호 작용을 결정 (그림3A,B)3.

단백질 및 IP 또는 PI 상호 작용을 연구하기 위한 다른 방법은 방사성 표지된 IP 또는 PI에 단백질의 결합, 단백질 포획을 위한 매트릭스로 소수성 막에 결합된 IP 또는 Pi를 사용하거나, 리포솜에 통합된 PI에 단백질의 결합을 포함합니다 42세 , 57세 , 58.중요한 것은, PIs와의 단백질 상호작용이 막 구조38을필요로 하는 경우, 리포솜 계 세포는 상보적인 접근법으로 사용될 수 있다. 이러한 접근법의 한계는 낮은 처리량, 낮은 감도, 매트릭스58에대한 IP 또는 PI 연관의 알려지지 않은 화학적 배향, 또는 방사성물질(42)의사용을 포함한다. 여기에 설명된 방법은 민감하고, 리포솜이 없고, 비방사성이며, IP/PI-비드는 시판되고, 따라서 그들은 맞춤형 화학 합성을 필요로 하지 않는다. 더욱이, IP 또는 PI에 연결된 비오틴의 위치는 잘 정의되고, 또한 단백질과 대사 산물 상호작용의 정확한 분석을 허용하는46,58을수정할 수 있다. 여기에 설명된 방법은 세포 배양(SILAC)47에서아미노산의 안정동위원소 라벨링과 같은 정량적 질량 분석 접근법과 결합될 수 있으며, 이는 다른 세포 하에서 동적 상호 작용을 식별하는 데 사용될 수 있습니다. 치료 또는 조건. 서양 얼룩 또는 질량 분석법에 결합된 친화성 크로마토그래피는 T. brucei, 포유류 세포 및 효모 3,8,46에서수많은 IP- 또는 PI 결합 단백질을 식별하는 데 도움이되었습니다. 도 47은IP-또는 PI 결합 도메인을 특징으로 하지 않는 단백질을 포함하고, 또한 신규한 결합 도메인, 예를 들어, PI(3,4,5)P3 결합 도메인(47)의 식별을 도왔다.

전반적으로, 여기에서 기술된 프로토콜은 T. brucei에서잠재적인 IP 또는 PI 상호 작용하는 단백질을 조사하고, 이 대사 산물과 단백질의 분자 상호 작용을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 단세포 기생충 또는 포유류세포(47 및 효모 46)와 같은 다른 유기체로부터IP-또는 PI 결합 단백질을 식별하기 위해 쉽게 적응될 수 있으며, IP의 생물학적 기능을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 것이며, 진핵생물의 피.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회에 의해 지원되었다 (NSERC, RGPIN-2019-04658); 초기 경력 연구원을위한 NSERC 디스커버리 출시 보충 (DGECR-2019-00081) 및 맥길 대학에 의해.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 650501 Ketone
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004 Solvent 
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich A6141 Inorganic salt
Centrifuge Avanti J6-MI Beckman Coulter Avanti J6-MI Centrifuge for large volumes (e.g., 1L)
Centrifuge botles Sigma-Aldrich B1408 Bottles for centrifugation of 1L of culture
Control Beads Echelon P-B000-1ml Affinity chromatography reagent - control
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Sugar, Added in PBS to keep cells viable
Dithiothreitol (DTT)  Bio-Rad 1610610 Reducing agent
Dynabeads M-270 Streptavidin ThermoFisher Scientific 65305 Streptavidin beads for binding to biotin ligands
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001 Protease inhibitors
Electrophoresis running buffer Bio-Rad 1610732 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Corning Life Sciences 430052 To centrifuge 10 mL cultures
Formic acid Sigma-Aldrich 106526 Acid
Glycine Sigma-Aldrich G7126 Amino acid
HMI-9 cell culture medium ThermoFisher Scientific ME110145P1 Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms
Imperial Protein Stain ThermoFisher Scientific 24615 Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE
Ins(1,4,5)P3 Beads Echelon Q-B0145-1ml Affinity chromatography reagent 
Instant Nonfat Dry Milk Thomas Scientific C837M64 Blocking reagent for Western blotting
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I6125 Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides
Lab Rotator Thomas Scientific 1159Z92 For binding assays
LoBind Microcentrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 13-698-793 Low protein binding tubes for mass spectrometry
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) Sigma-Aldrich 21-3277 Detergent
PBS, pH 7.4 ThermoFisher Scientific 10010031 Physiological buffer
Peroxidase substrate for chemiluminescence ThermoFisher Scientific 32106 Substrate for Western bloting detection of proteins
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche 4906845001 Phosphatase inhibitors
PI(3)P PIP Beads Echelon P-B003a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4)P2 PIP Beads Echelon P-B034a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 diC8 Echelon P-3908-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(3,4,5)P3 PIP Beads Echelon P-B345a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(3,5)P2 PIP Beads Echelon P-B035a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4)P PIP Beads Echelon P-B004a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 diC8 Echelon P-4508-1mg Affinity chromatography reagent 
PI(4,5)P2 PIP Beads Echelon P-B045a-1ml Affinity chromatography reagent 
PI(5)P PIP Beads Echelon P-B005a-1ml Affinity chromatography reagent 
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170 Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid)
Potassium hexacyanoferrate(III) Sigma-Aldrich 702587 Potassium salt 
PtdIns PIP Beads Echelon P-B001-1ml Affinity chromatography reagent 
PVDF Membrane Bio-Rad 1620177 For Western blotting 
Refrigerated centrifuge Eppendorf 5910 R Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL)
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 862010 Detergent
Sodium thiosulfate Sigma-Aldrich 72049 Chemical 
SpeedVac Vacuum Concentrators ThermoFisher Scientific SPD120-115 Sample concentration (e.g., for mass spectrometry)
T175 flasks for cell culture  ThermoFisher Scientific 159910 To grow 50 mL T. brucei culture
Trypsin, Mass Spectrometry Grade Promega V5280 Trypsin for protein digestion
Urea Sigma-Aldrich U5128 Denaturing reagent
Vortex Fisher Scientific 02-215-418 For mixing reactions
Western blotting transfer buffer Bio-Rad 1610734 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol
Whatman 3 mm paper Sigma-Aldrich WHA3030861 Paper for Wester transfer
2-mercaptoethanol (14.2 M) Bio-Rad 1610710 Reducing agent
2x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0737 Protein loading buffer
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561094 Gel for protein electrophoresis
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Protein loading buffer

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References

  1. Cestari, I., Stuart, K. Inositol phosphate pathway controls transcription of telomeric expression sites in trypanosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2803-2812 (2015).
  2. Odom, A. R., Stahlberg, A., Wente, S. R., York, J. D. A role for nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate kinase in transcriptional control. Science. 287 (5460), 2026-2029 (2000).
  3. Cestari, I., McLeland-Wieser, H., Stuart, K. Nuclear Phosphatidylinositol 5-Phosphatase Is Essential for Allelic Exclusion of Variant Surface Glycoprotein Genes in Trypanosomes. Molecular and Cellular Biology. 39 (3), (2019).
  4. Billcliff, P. G., et al. OCRL1 engages with the F-BAR protein pacsin 2 to promote biogenesis of membrane-trafficking intermediates. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 90-107 (2016).
  5. Brochet, M., et al. Phosphoinositide metabolism links cGMP-dependent protein kinase G to essential Ca(2)(+) signals at key decision points in the life cycle of malaria parasites. PLoS Biology. 12 (3), 1001806 (2014).
  6. Azevedo, C., Szijgyarto, Z., Saiardi, A. The signaling role of inositol hexakisphosphate kinases (IP6Ks). Advances in Enzyme Regulation. 51 (1), 74-82 (2011).
  7. Szijgyarto, Z., Garedew, A., Azevedo, C., Saiardi, A. Influence of inositol pyrophosphates on cellular energy dynamics. Science. 334 (6057), 802-805 (2011).
  8. Cestari, I., Anupama, A., Stuart, K. Inositol polyphosphate multikinase regulation of Trypanosoma brucei life stage development. Molecular Biology of the Cell. 29 (9), 1137-1152 (2018).
  9. Bang, S., et al. AMP-activated protein kinase is physiologically regulated by inositol polyphosphate multikinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (2), 616-620 (2012).
  10. Seeds, A. M., Tsui, M. M., Sunu, C., Spana, E. P., York, J. D. Inositol phosphate kinase 2 is required for imaginal disc development in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (51), 15660-15665 (2015).
  11. Hamada, K., Miyatake, H., Terauchi, A., Mikoshiba, K. IP3-mediated gating mechanism of the IP3 receptor revealed by mutagenesis and X-ray crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4661-4666 (2017).
  12. Watson, P. J., et al. Insights into the activation mechanism of class I HDAC complexes by inositol phosphates. Nature Communications. 7, 11262 (2016).
  13. Watson, P. J., Fairall, L., Santos, G. M., Schwabe, J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate. Nature. 481 (7381), 335-340 (2012).
  14. Irvine, R. F. Nuclear lipid signalling. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (5), 349-360 (2003).
  15. Sobol, M., et al. UBF complexes with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in nucleolar organizer regions regardless of ongoing RNA polymerase I activity. Nucleus. 4 (6), 478-486 (2013).
  16. Nascimbeni, A. C., et al. ER-plasma membrane contact sites contribute to autophagosome biogenesis by regulation of local PI3P synthesis. EMBO Journal. 36 (14), 2018-2033 (2017).
  17. Martin, K. L., Smith, T. K. The myo-inositol-1-phosphate synthase gene is essential in Trypanosoma brucei. Biochemical Society Transactions. 33, Pt 5 983-985 (2005).
  18. Matsu-ura, T., et al. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. Journal of Cell Biology. 173 (5), 755-765 (2006).
  19. Blind, R. D., et al. The signaling phospholipid PIP3 creates a new interaction surface on the nuclear receptor SF-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (42), 15054-15059 (2014).
  20. Lin, A., et al. The LINK-A lncRNA interacts with PtdIns(3,4,5)P3 to hyperactivate AKT and confer resistance to AKT inhibitors. Nature Cell Biology. 19 (3), 238-251 (2017).
  21. Steger, D. J., Haswell, E. S., Miller, A. L., Wente, S. R., O'Shea, E. K. Regulation of chromatin remodeling by inositol polyphosphates. Science. 299 (5603), 114-116 (2003).
  22. York, J. D., Odom, A. R., Murphy, R., Ives, E. B., Wente, S. R. A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science. 285 (5424), 96-100 (1999).
  23. Adams, R. L., Mason, A. C., Glass, L., Aditi,, Wente, S. R. Nup42 and IP6 coordinate Gle1 stimulation of Dbp5/DDX19B for mRNA export in yeast and human cells. Traffic. 18 (12), 776-790 (2017).
  24. Macbeth, M. R., et al. Inositol hexakisphosphate is bound in the ADAR2 core and required for RNA editing. Science. 309 (5740), 1534-1539 (2005).
  25. Dickson, E. J., Hille, B. Understanding phosphoinositides: rare, dynamic, and essential membrane phospholipids. Biochemical Journal. 476 (1), 1-23 (2019).
  26. Mellman, D. L., et al. A PtdIns4,5P2-regulated nuclear poly(A) polymerase controls expression of select mRNAs. Nature. 451 (7181), 1013-1017 (2008).
  27. Lee, Y. S., Mulugu, S., York, J. D., O'Shea, E. K. Regulation of a cyclin-CDK-CDK inhibitor complex by inositol pyrophosphates. Science. 316 (5821), 109-112 (2007).
  28. Nagy, A. I., et al. IP3 signalling regulates exogenous RNAi in Caenorhabditis elegans. EMBO Reports. 16 (3), 341-350 (2015).
  29. Hall, B. S., et al. TbVps34, the trypanosome orthologue of Vps34, is required for Golgi complex segregation. Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27600-27612 (2006).
  30. Rodgers, M. J., Albanesi, J. P., Phillips, M. A. Phosphatidylinositol 4-kinase III-beta is required for Golgi maintenance and cytokinesis in Trypanosoma brucei. Eukaryotic Cell. 6 (7), 1108-1118 (2007).
  31. Gilden, J. K., et al. The role of the PI(3,5)P2 kinase TbFab1 in endo/lysosomal trafficking in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 214, 52-61 (2017).
  32. Demmel, L., et al. The endocytic activity of the flagellar pocket in Trypanosoma brucei is regulated by an adjacent phosphatidylinositol phosphate kinase. Journal of Cell Science. 129 (11), 2285 (2016).
  33. Gimenez, A. M., et al. Phosphatidylinositol kinase activities in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology. 203 (1-2), 14-24 (2015).
  34. Hashimoto, M., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates replication, differentiation, infectivity and virulence of the parasitic protist Trypanosoma cruzi. Molecular Microbiology. 87 (6), 1133-1150 (2013).
  35. Cestari, I., Haas, P., Moretti, N. S., Schenkman, S., Stuart, K. Chemogenetic Characterization of Inositol Phosphate Metabolic Pathway Reveals Druggable Enzymes for Targeting Kinetoplastid Parasites. Cell Chemical Biology. 23 (5), 608-617 (2016).
  36. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. Journal of Biological Chemistry. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  37. McNamara, C. W., et al. Targeting Plasmodium PI(4)K to eliminate malaria. Nature. 504 (7479), 248-253 (2013).
  38. Tresaugues, L., et al. Structural basis for phosphoinositide substrate recognition, catalysis, and membrane interactions in human inositol polyphosphate 5-phosphatases. Structure. 22 (5), 744-755 (2014).
  39. Varnai, P., et al. Quantifying lipid changes in various membrane compartments using lipid binding protein domains. Cell Calcium. 64, 72-82 (2017).
  40. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Letters. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  41. Cullen, P. J., Cozier, G. E., Banting, G., Mellor, H. Modular phosphoinositide-binding domains--their role in signalling and membrane trafficking. Current Biology. 11 (21), 882-893 (2001).
  42. Klarlund, J. K., et al. Signaling by phosphoinositide-3,4,5-trisphosphate through proteins containing pleckstrin and Sec7 homology domains. Science. 275 (5308), 1927-1930 (1997).
  43. Wild, R., et al. Control of eukaryotic phosphate homeostasis by inositol polyphosphate sensor domains. Science. 352 (6288), 986-990 (2016).
  44. Gerasimaite, R., et al. Inositol Pyrophosphate Specificity of the SPX-Dependent Polyphosphate Polymerase VTC. ACS Chemical Biology. 12 (3), 648-653 (2017).
  45. Potapenko, E., et al. 5-Diphosphoinositol pentakisphosphate (5-IP7) regulates phosphate release from acidocalcisomes and yeast vacuoles. Journal of Biological Chemistry. 293 (49), 19101-19112 (2018).
  46. Wu, M., Chong, L. S., Perlman, D. H., Resnick, A. C., Fiedler, D. Inositol polyphosphates intersect with signaling and metabolic networks via two distinct mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6757-6765 (2016).
  47. Jungmichel, S., et al. Specificity and commonality of the phosphoinositide-binding proteome analyzed by quantitative mass spectrometry. Cell Reports. 6 (3), 578-591 (2014).
  48. Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei. Cell. 137 (1), 99-109 (2009).
  49. Cestari, I., Stuart, K. Transcriptional Regulation of Telomeric Expression Sites and Antigenic Variation in Trypanosomes. Current Genomics. 19 (2), 119-132 (2018).
  50. Clough, T., Thaminy, S., Ragg, S., Aebersold, R., Vitek, O. Statistical protein quantification and significance analysis in label-free LC-MS experiments with complex designs. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16 6 (2012).
  51. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  52. DeGrasse, J. A., Chait, B. T., Field, M. C., Rout, M. P. High-yield isolation and subcellular proteomic characterization of nuclear and subnuclear structures from trypanosomes. Methods in Molecular Biology. 463, 77-92 (2008).
  53. Opperdoes, F. R. A rapid method for the isolation of intact glycosomes from Trypanosoma brucei by Percoll -gradient centrifugation in a vertical rotor. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (3), 181-186 (1981).
  54. Pereira, N. M., de Souza, W., Machado, R. D., de Castro, F. T. Isolation and properties of flagella of trypanosomatids. The Journal of protozoology. 24 (4), 511-514 (1977).
  55. Subota, I., et al. Proteomic analysis of intact flagella of procyclic Trypanosoma brucei cells identifies novel flagellar proteins with unique sub-localization and dynamics. Molecular and Cellular Proteomics. 13 (7), 1769-1786 (2014).
  56. Fukuda, M., Kojima, T., Kabayama, H., Mikoshiba, K. Mutation of the pleckstrin homology domain of Bruton's tyrosine kinase in immunodeficiency impaired inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate binding capacity. Journal of Biological Chemistry. 271 (48), 30303-30306 (1996).
  57. Knodler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. BioTechniques. 38 (6), (2005).
  58. Best, M. D. Global approaches for the elucidation of phosphoinositide-binding proteins. Chemistry and Physics of Lipids. 182, 19-28 (2014).

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Cestari, I. Identification of… More

Cestari, I. Identification of Inositol Phosphate or Phosphoinositide Interacting Proteins by Affinity Chromatography Coupled to Western Blot or Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (149), e59865, doi:10.3791/59865 (2019).

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