Summary
In deze studie beschrijven we een gedetailleerde procedure van TNBS-gemedieerde intestinale fibrose, die vergelijkbare pathofysiologie vertoont voor de fibrose van Crohn. We bespreken deze aanpak ook in het licht van rapamycine vergemakkelijkt remmende effecten op intestinale fibrose.
Abstract
Significante studies zijn uitgevoerd om te begrijpen van effectief beheer van intestinale fibrose. Echter, het gebrek aan betere kennis van fibrose heeft de ontwikkeling van een preventief medicijn belemmerd. In de eerste plaats is het vinden van een geschikt diermodel een uitdaging bij het begrijpen van het mechanisme van de pathologie van de ziekte van Crohn-geassocieerde intestinale fibrose. Hier hebben we een effectieve methode aangenomen waarbij TNBS chemische blootstelling aan muizen rectums produceert aanzienlijk diepe ulceratie en chronische ontsteking, en de muizen vervolgens chronisch intestinale fibrose ontwikkelen. Ook beschrijven we een techniek waarbij een rapamycine injectie remmende effecten vertoont op TNBS-gemedieerde fibrose in het muismodel. Om het onderliggende mechanisme van fibrose te beoordelen, bespreken we methodisch een procedure voor het zuiveren van Cx3Cr1 + cellen uit de lamina propria van TNBS-behandelde en controle muizen. Dit gedetailleerde protocol zal nuttig zijn voor onderzoekers die het mechanisme van fibrose onderzoeken en het pad effenen voor het vinden van een betere therapeutische uitvinding voor de ziekte van Crohn-geassocieerde intestinale fibrose.
Introduction
Disregulatie van immuun homeostase in de darm leidt tot pathogene ontsteking en is alom bekend om het veroorzaken van inflammatoire darmziekte (IBD)1,2. Intestinale fibrose is een chronisch gevolg van inflammatoire darmziekten (Ibd's), zoals de ziekte van Crohn (CD)3. De onomkeerbare pathofysiologie van CD omvat intestinale strictuur of stenose van fibrose, die de behandelingsopties beperkt, en met geen medicatie momenteel beschikbaar, de enige behandeling is chirurgie. Uiteindelijk is de ontwikkeling van effectieve therapieën om ongepaste ontstekingen tegen te gaan veel nodig om het mechanisme van CD te bestuderen, en dit zal ons een stap dichterbij brengen.
Een verscheidenheid van genetische Muismodellen zijn beschikbaar voor het bestuderen van IBD met inbegrip van IL10 ko, Samp/YIT en adoptie CD45+rb High Cell Transfer in scid muizen4,5,6. Hier tonen we de procedure voor TNBS-gemedieerde fibrose in het muismodel van CD, dat vergelijkbaar is met de pathologie van de fibrose van de menselijke ziekte van Crohn. Het TNBS-geïnduceerde model heeft bepaalde voordelen. Dit model is technisch eenvoudig; het begin van de ziekte is snel, goedkoop en kan op grote schaal worden gebruikt bij verschillende dieren (bijv. muis, rat en cavia7). Gelijktijdige toediening van ethanol en tnbs (2, 4, 6-trinitrobenzeen sulfonzuur) beschadigt abrupt de intestinale barrière en bloot aan tnbs het Colon-weefsel eiwit en ontlokken substantiële immunologische responsen8,9. Herhaalde blootstelling van TNBS leidt tot een overreactief herstelproces dat reageert op ontsteking en letsel, en ontwikkelt een fibrotische reactie in de darm. Dus, TNBS-geïnduceerde fibrose model dient om een zeer overtuigend model te bestuderen van de ziekte van Crohn-geassocieerde intestinale fibrose.
Bovendien zijn mononucleaire fagocyten de primaire cellen die de aangeboren immuunrespons op pathogenese en letsel in de darm,10,11,12,13, bearbiten. Om het cellulaire mechanisme te verhelderen en de rol van Cx3Cr1+ mononucleaire fagocyten in het TNBS-fibrose-model vast te stellen, tonen we de procedure van het zuiveren van de mononucleaire fagocyten. Analyse van Cx3Cr1+ cellen is een essentiële stap om de ontstekingsmarkers te beoordelen en het gelijktijdige mechanisme voor intestinale fibrose te bepalen. Collectief, deze gedetailleerde procedure voor TNBS fibrose zal nuttig zijn om uit te leggen van de cellulaire mechanismen van intestinale fibrose.
Protocol
Voor dit manuscript werden alle menselijke monsters aangekocht volgens het goedgekeurde Protocol van Institute Review Board (IRB) en door de Commissie onderzoek bij Albany Medical College. Alle onderzoek waarbij dieren werden betrokken, werd strikt gevolgd volgens het goedgekeurde protocol door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité bij het Albany Medical College en de National Institutes of Health Guide voor de verzorging en het gebruik van proefdieren .
1. verzameling van menselijke darm monsters
- Verzamel menselijke weefselmonsters volgens de protocollen van het onderzoekscomité van de instelling.
- Procure intestinale weefsel (ileocolonic) van een CD patiënt gediagnosticeerd met fibrose en controlemonsters van patiënten zonder geschiedenis van IBDs.
- Gebruik een deel van het darmweefsel voor immunohistologie, een ander deel van het weefsel voor het analyseren van mRNA, en een laatste deel voor eiwit expressie van fibrotische en cytokine genen/markers.
- Voor immunohistologische analyse moet het menselijk weefselmonster eerst in 4% Paraformaldehyde worden opgelost gedurende ten minste 48 uur en vervolgens in een buisje met 70% ethanol gedurende ten minste 16 uur. Gebruik dit vaste weefsel voor het maken van een paraffine-ingebed blok en snijd 5 μm dik weefsel delen met behulp van een weefsel-microtoom.
- Gebruik een borstel om elke snij sectie op een glazen glijbaan voorzichtig uit te spreiden voor vlekken.
- Vlek weefsel sectie dia met trichromen vlek voor het opsporen van collageen afzetting, en met αSMA vlek voor het opsporen van myofibroblasten (zie rubriek 3 voor gedetailleerde informatie over trichrome en αSMA kleuring). Onderzoek de bevlekte delen onder een lichte Microscoop.
- Verwerk een ander deel van het verkregen menselijk weefselmonster om eiwit lysaat te maken om αSMA via Western Blot te detecteren (zie rubriek 7 voor gedetailleerde informatie over de analyse van Western Blot).
- Verkrijg RNA van het laatste deel van het menselijk weefselmonster met behulp van een extractie reagens (tabel met materialen) en converteer mRNA naar cDNA via RT-PCR.
- Analyseer fibrotische en cytokine genen door qPCR (zie rubriek 6 voor gedetailleerde informatie over de bereiding van mRNA).
2. inductie van TNBS fibrose en rapamycine behandeling bij muizen
- Voer dierlijk onderzoek uit volgens de door de instelling goedgekeurde dierenonderzoekprotocollen.
- Scheer volwassen muizen rond het nekgedeelte om vooraf te sensibiliseren voor TNB'S via dermale blootstelling. Week TNBS in een wattenstaafje en breng TNBS aan op het geschoren gedeelte van de muis nek.
Opmerking: pre-sensibilisatie is een zeer belangrijke stap, omdat het vertraagde overgevoeligheids respons verbetert om TNBS-gemedieerde ontstekingen te initiëren. - Acht dagen na pre-sensibilisatie, induceren colitis door intra-rectale toediening eenmaal per week gedurende zes weken. Breng vier mg TNBS (in 25% ethanol) met behulp van een 100 μL klysma via een 1 mL spuit bevestigd aan een 3,5 Franse polyurethaan katheter en geef controle muizen 100 μL van 25% ethanol alleen.
- Anesthetiseer muizen met pentobarbital (25 mg/kg intraperitoneaal) of bloot ze aan 2,5% Isofluraan samen met 1 L/min van zuurstof tijdens de toediening van tnbs. Bevestig anesthetisering door zachtjes knijpen tenen en op zoek naar een afwezigheid van reflex.
- Gebruik veterinaire zalf op de ogen om droogheid te voorkomen, terwijl muizen onder anesthesie zijn.
- Injecteer rapamycine bij 2 mg/kg/dag of voertuig (5% tween-20 en 4% ethanol) elke weekdag gedurende 3-6 weken, intraperitoneaal, voor zowel controle-als TNBS-behandelde muizen.
- Gebruik 6 weken TNBS post-behandelde muizen darm voor het analyseren van de extracellulaire assays met inbegrip van histologie, flow cytometrie, Western blotting en RNA-extractie. Om organen te oogsten, te euthanasie muizen met CO2 inademing en te bevestigen euthanasisch met cervicale dislocatie.
- Om organen te oogsten, te euthanasie muizen met CO2 inademing en te bevestigen euthanasisch met cervicale dislocatie. Na euthanasie opent lengterichting de muis op zijn ventrale kant met behulp van een schaar en een tang van chirurgische kwaliteit. Verwijder de gehele dikke darm van het rectum naar de terminale darmbeen zone. Breng de dubbele punt snel over naar ijskoud 1x HBSS en was de dikke darm met dezelfde buffer.
- Meet en vergelijk de Colon lengtes van de controle-en TNBS-behandelde muizen. Doe deze stap zo snel mogelijk om uitdroging uit de dubbele punten te voorkomen om celsterfte te voorkomen.
- Snijd de dikke darm in kleine stukjes en houd bij-80 °C voor opslag voor toekomstige doeleinden (RNA/Western Blot-analyse). Gebruik een ander stukje van de dikke darm voor FACS analyse.
- Zorg ervoor dat u snijden en verzamelen van Colon weefselmonsters uit soortgelijke gebieden van de dikke darm van zowel controle en tnbs behandelde dieren.
Opmerking: een sterfte van 10%-20% wordt verwacht met TNBS-inoculatie, hoewel met ervaring, het sterftecijfer aanzienlijk kan worden verminderd.
3. Immuno-histopathologische beoordeling van darm fibrose
- Fix mens en/of muizen weefsels in 4% Paraformaldehyde voor 48 h, en vervolgens overbrengen naar 70% ethanol voor 16 uur.
Opmerking: Paraformaldehyde is een neurotoxische stof, dus vermijd inademing; Gebruik een gezichtsmasker tijdens het gebruik. - Paraffine sluit de vaste Colon weefsels, snijd op een dikte van 5 μm, en direct zet de weefsels op glasplaten voor histologie.
- Voer H & E en trichrome blauwkleuring volgens de instructies van de fabrikant om collageen te detecteren.
- Kort, eerste deparaffineze secties door het subfusie van de dia met secties in twee kamers van xyleen voor 5 minuten in elke kamer.
- Spoel dia's met 100% alcohol gedurende 1 minuut; Herhaal deze stap drie keer. Spoel opnieuw met kraanwater gedurende 1 minuut.
- Daarna, dompel dia's in voorverwarmde Bouin's oplossing bij 56 °C gedurende 60 min. de oplossing van Bouin is geel van uiterlijk; was na het uitnemen van de dia's uit de oplossing van Bouin in kraanwater gedurende 3 min of totdat de glaasjes kleurloos werden.
- Dompel dia's in gemodificeerde Mayer's Hematoxylin-oplossing gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur.
- Stain dia's door onderdompelen in trichrome vlek voor 5-8 min. onmiddellijk spoelen in stromend water voor 5-10 s om overtollige Trichromen vlek te verwijderen.
- Dehydraat dia's met 100% alcohol gedurende 1 min. Herhaal deze procedure drie keer.
- Wis dia's met xyleen gedurende 1 minuut en herhaal de stap 3x.
- Koppel dia's met bevestigingsmateriaal (Inhoudsopgave).
- Houd de afdekplaat aan de ene kant voorzichtig vast met de Tang en laat deze de hele sectie bedekken zonder bubbels. Als er enkele bubbels zijn, verwijder dan snel bubbels door op de dekslip te tikken.
- Gebruik immunokleuring om αSMA te detecteren.
- Blokkeer Colon secties in blokkerende buffer (0,2% Triton X-100 en 5% normaal geiten serum in 1x PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Inbroed met 100 μL verdund primair antilichaam voor αSMA (tabel van de materialen) op de dia oplossing (0,2% Triton X-100 en 3% normaal geiten serum in 1x PBS; anti-αsma 1:200) bij 4 °c 's nachts.
- Was de secties drie keer met 1x PBS.
- Gebruik geit anti-muis IgG (H + L) geconjugeerd met Alexa Fluor 488 (tabel van de materialen) als secundair antilichaam voor 2 uur bij kamertemperatuur.
- Was de secties drie keer met 1x PBS.
- Gebruik DAPI om de Nucleus 5 minuten tegen te gaan.
- Was de secties drie keer met 1x PBS.
- Monteer dia's met fluorescerende bevestigingsmateriaal (inhoudstafel) en sluit af met een dekslip met nagellak.
- Verkrijg afbeeldingen met behulp van de LSM 880 confocale Microscoop en proces beelden met behulp van Microscoop software.
- Kwantificeer afbeeldingen door gemiddeld meerdere geselecteerde gebieden in dezelfde sectie te nemen met ImageJ.
4. isolatie van intestinale lamina propria en zuivering van Cx3Cr1+ mononucleaire fagocyten
- Longitudinally Open de dikke darm in ijskoude Hank de uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS; Tabel met materialen) en was de dikke darm met dezelfde buffer.
- Snijd ongeveer 5 cm kleine stukjes dikke darm weefsels met behulp van steriele schaar in HBSS.
- Breng kleine stukjes Colon weefsel in een conische buis van 50 mL met 10 mL pre-digestie buffer (1x HBSS met 5% FBS, 5 mM EDTA en 1 mM DTT), en schud gedurende 20 min bij 100 rpm in een 37 °C incubator11.
Opmerking: incubatie van het Colon weefsel in 37 °C bij 100 RPM schud conditie zorgt voor een efficiënte spijsvertering van Collagenase weefsel en een hoge opbrengst van levensvatbare cellen. - Gooi vrijstaande Colon epitheel weg door het passeren van een 40 μm celzeef.
- Verzamel het overgebleven weefsel van de zeef en verover ze verder in de digestie buffer met collagenase type IV en DNase I (tabel met materialen) in 1x HBSS met 5% FBS gedurende 20 minuten bij 37 °c bij 100 rpm.
- Vortex de verteerde weefsels voor ongeveer 20 sec. en passeren een 40 μm celzeef om lamina propria fracties te verkrijgen.
- Centrifuge de lamina-propria-fracties tot pellet in de cellen bij 700 x g in 4 °c
- Om dode cellen uit de lamina propria uit te sluiten, gebruikt u een dichtheidsgradiënt (tabel met materialen).
Opmerking: de dichtheidsgradiënt media die hier worden gebruikt (tabel met materialen) kunnen leiden tot verlies van mononucleaire cellen; echter, het sterk verwijdert dode cellen uit de voorbereiding, die over het algemeen verhoogt de zuiverheid.- Maak 100 mL elk van 30% en 70% dichtheidsgradiënt media-oplossingen. Respendeer de verkregen cellen in 10 mL van de 30%-oplossing en overlay bovenop 5 mL van de 70%-oplossing in een buis van 15 mL.
- Centrifugeer het verloop in een rem-vrije toestand bij 1.000 x g en kamertemperatuur. Verzamel de witte ring fase met lamina propria lymfocyten, die zal liggen tussen de 30% en 70% gradiënt lagen.
- Was de verkregen cellen door opnieuw op te schorten in ijskoude HBSS en centrifugeer bij 500 x g, 20 °c, gedurende 10 min. resuspendeer cellen in FACS (fluorescentie-geactiveerde celsortering) buffer (PBS, pH 7,4, met 1% BSA en 2 mm EDTA).
- Purify mononucleaire fagocyten uit de verzamelde cellen zuivering met behulp van magnetische kralen en/of FACS sortering.
- Magnetische zuivering
- Voorafgaand aan kleuring met antilichamen, eerste blok celoppervlak van lamina propria cellen door inbrokkelend met anti-muis CD16/CD32 FC Blocker voor 15 min op ijs.
- Inincuberen cellen met anti-Cx3Cr1-PE (phycoerythrin) antilichamen samen met anti-PE microbeads (tabel van de materialen) voor 30 min op ijs, om de gebonden cellen vast te leggen. Spoel cellen met FACS buffer.
- Geef de antilichamen/kraal gebonden cellen door een magnetisch geactiveerde cel-sorteerkolom in een magnetisch veld om niet-afhankelijke cellen te verwijderen. Was drie keer met FACS buffer. Verwijder de kolom uit het magnetische veld en duw de zuiger in de kolom om Bead gebonden cellen te leveren.
- FACS sortering
Opmerking: FACS sorting kan worden gebruikt ter vervanging van magnetische zuivering. Hoewel magnetische zuivering een eenvoudige en kosteneffectieve methode is, is het beperkt tot alleen het zuiveren van enkelvoudige cellen, niet voor subpopulaties van cellen. Daarom, om subpopulaties van cellen te isoleren, is de FACS sorteermethode een effectieve methode voor het sorteren van afzonderlijke cellen en subpopulaties van cellen.- Blok lamina propria cellen met anti-muis CD16/CD32 FC Blocker (tabel van de materialen).
- Beits cellen door inbroed met anti-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C en MHCII antilichamen.
- Sorteer met behulp van een FACS flow cytometer, gating voor CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C- cellen om de Cx3Cr1 (P3 + P4) populatie te zuiveren.
- Magnetische zuivering
- Lyse gesorteerde cellen voor totale RNA-bereiding en Detecteer cytokine-en fibrotische markers (zie rubriek 6 voorbereiding van RNA en cDNA).
- Analyseer mRNA-expressie van fibrotische markers en inflammatoire cytokine-analyse van geïsoleerde eencellige suspensies van magnetische zuivering.
- Voor FACS analyse, Blokkeer cellen met anti-muis CD16/CD32 FC Blocker (tabel van de materialen) voorafgaand aan kleuring met antilichamen tegen oppervlak of intracellulaire markers.
5. Flowcytometrie analyse
- Celoppervlakte kleuring en-analyse
- Respenderen 5-10 × 105 geïsoleerde lamina propria cellen in 50 ml FACS buffer (1% BSA, 2 mm EDTA in PBS, pH 7,4).
- Inincuberen cellen met anti-muis CD16/CD32 (tabel van de materialen) bij een 1:50 verdunning te blokkeren FC receptoren op ijs voor 10 min.
- Spoel cellen met 500 μL ijskoude FACS-buffer om ongebonden anti-CD16/CD32 te verwijderen voordat de celoppervlakte wordt gekleurd.
- Oppervlakte vlek Colon eencellige suspensies (106 cellen/50 ml) met fluorescerend gelabeld antilichaam bij 1:100 verdunning op ijs gedurende 30 minuten om de Colon lamina propria te evalueren.
- Was gelabelde cellen tweemaal met 500 μL ijskoude FACS buffer om ongebonden antilichamen te verwijderen.
- Analyseer gelabelde mononucleaire cellen door Flowcytometrie. Gate for Live, dan voor FSC+SSC+ gevolgd door CD11b+ Cx3Cr1+, en analyseer vervolgens andere macrofaag activerings markers, waaronder mhcii, CD80, CD86 en CD40.
- Intracellulaire cytokine-kleuring en-analyse
- Voor intracellulaire cytokine kleuring, Fix en permeabilize de oppervlakte-gekleurd cellen met behulp van een fixatie/Permeabilization Solution Kit (tabel van materialen); Volg de instructies van de fabrikant voor gedetailleerde stappen.
- Gate lamina propria cellen voor Live, dan voor FSC+SSC+ gevolgd door CD11b+ Cx3Cr1+IL23+ voor het detecteren van intracellulaire niveau van IL23 cytokine en CD11b+ Cx3Cr1+IL1β+ aan Detecteer intracellulaire niveau van IL1β cytokine.
- αSMA kleuring en analyse
- Spoel cellen met FACS buffer tweemaal door centrifugeren bij 200 x g en 4 °c gedurende 5 minuten om overtollige fixatieve buffer te verwijderen.
- Om het αSMA niveau te bepalen, permeabilize cellen met een fixatie/Permeabilization Solution Kit (tabel van materialen).
- Incuberen cellen met anti-αSMA-AF488 antilichaam (Inhoudsopgave) met 1:1000 verdunning op ijs gedurende 30 minuten.
- Was de cellen twee keer en vervolgens FACS analyse. Gate for Live, FSC+SSC+ gevolgd door detectie van αsma+ cellen in Colon cellen.
6. RNA-isolatie, RT-PCR, real-time PCR
- Isoleren van RNA van MACS of FACS gezuiverde cellen of Colon weefsel door homogeniseren in extractie reagens (tabel van materialen).
Opmerking: gebruik een veiligheidsbril en andere beschermende uitrusting voor laboratoria wanneer u met dit reagens werkt, omdat het een Long-en huidirritatie is. Werk veilig in een afzuigkap. - Voeg 0,5 μL RNase-vrij glycogeen toe uit 20 μg/mL glycogeenvoorraad oplossing (tabel met materialen) om het herstel van het totale RNA te verbeteren voorafgaand aan het neerslaan van RNA met isopropanol.
- Rebreng de RNA-pellet in 50 μL RNase vrij water (tabel met materialen) en inincuberen bij 55 °c gedurende 5 minuten om het RNA-gehemelte volledig op te lossen.
- Lees RNA concentraties met behulp van een spectrofotometer bij 260 nm.
- Synthetiseren cDNA met behulp van 1 μg totaal RNA en een omgekeerde transcriptie synthese Kit (tabel van materialen).
- Analyseer genexpressie met 2 μL cDNA als templates via real-time PCR. Gebruik een 96-well PCR-plaat qPCR Master Mix Kit (tafel van materialen). Gebruik CT-waarden voor het berekenen van de vouw verandering van RNA overvloed na het normaliseren van de GAPDH/HPRT waarden.
7. Western blotting
- Lyse Colon weefsel met behulp van RIPA lysisbuffer (1% NP40).
- Los proteïne lysaat op in een 8% bis-tris gel met een constante spanning van 80 V.
- Breng gel-eiwitten over naar nitrocellulose membraan (en) in koude overdrachts buffer met een constante stroom van 50 mA gedurende 2 uur bij 4 °C.
- Blokkeer niet-specifieke gebieden op het eiwit overgedragen membraan met 5% niet-vette melk in TBST (25 mM tris-HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 0,05% Tween-20) gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur.
- Om αSMA-niveaus te detecteren, moet u het membraan (s) met het primaire detectie-antilichaam αSMA bij 4 °C 's nachts inbroed.
- Wassen membranen 3-4 keer met behulp van TBST in 15 min intervallen.
- Inincuberen met HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (1:10000) in 5% niet-vette melk in TBST.
- Ontwikkelen van membranen met behulp van een ECL ontwikkelen Kit.
- Normaliseren eiwit signaal intensiteiten met GAPDH als een laad regeling voor densitometrie analyse.
8. statistische analyse
- Analyseer de gegevens met behulp van data-analyse software naar keuze door het vergelijken van wild type en KO-dieren.
- Houd rekening met de P-waarde van < 0,05 significant (* P < 0,05; * * P < 0,01; * * * P < 0,001).
- Gebruik de t-toets van de student om de verschillen tussen twee groepen en ANOVA-test voor analyse tussen meer dan twee groepen te testen.
Representative Results
We hebben het TNBS colitis Mouse model aangenomen om de onderliggende mechanismen van intestinale fibrose8te bestuderen en te verheldoen. Hier hebben we een gedetailleerde tijds cursus studie uitgevoerd van TNBS-gemedieerde colitis, waarbij TNB'S wekelijks werd toegediend aan wild type muizen gedurende maximaal zes weken, zoals schematisch weergegeven (Figuur 1a). Na zes weken van behandeling met TNBS merkten we dat de Colon lengtes geleidelijk in de loop van de TNBS-behandeling inkorten, van gemiddeld 5 ± 0,5 cm in de controlegroep tot 3 ± 0,5 cm in de TNBS-groep; een dergelijke kwantitatieve analyse van de lengte van de dikke darm vertegenwoordigt een zeer duidelijke afname van de lengte van de dikke darm (Figuur 1B). Om ervoor te zorgen dat het model van de ziekte van Crohn met TNBS vergelijkbaar is met het fibrose-model van de humane ziekte van Crohn en geen artefact was dat verband had met de methodologie, analyseerden we de fibrotische markers op meerdere niveaus in een gedetailleerde tijds cursus studie voor de TNBS-injectie aan het wild type . Accumulatie van alpha-glad spier actine (αsma) positieve cellen en collageen depositie binnen submucosale lagen zijn gemeld in de meeste van de fibrose incidenties en wordt beschouwd als een kenmerk voor fibrotische gebeurtenissen14. We constateerden dat de Colon secties van tnbs-behandelde muizen die waren gekleurd met αsma vertoonden een 4-6-voudige toename in Colon de laag positief gekleurd met αsma (Figuur 1C). Trouwens, de trichrome blauwe kleuring voor deze secties toonde ook een 2-4-voudige toename, suggereren significante collageen afzetting, die ernstige intestinale fibrose valideert (Figuur 1D). We beoordeelden verder de activering van myofibroblasten door het opsporen van αSMA-positieve cellen door een FACS analyse in TNBS-behandelde muizen Colon en vonden een significante accumulatie van αSMA-positieve kleuring (Figuur 1E). Verder hebben we een substantiële inductie gevonden in de expressie van αSMA, Col-I en Col-III, gemeten door qPCR-analyse bij muizen die met TNBS zijn behandeld (Figuur 1F). Verhoogde expressie van αSMA-eiwit in de Western Blot-analyse toonde verhoogde fibrose (Figuur 1G). Over het algemeen biedt TNBS kinetiek-behandeling een kans om toegang te krijgen tot een putatieve immuunrespons in chronische aandoeningen, die de toestand van de CD-chronische fase nauwlettend nabootst en essentieel is voor de ontwikkeling van fibrose.
Om tnbs fibrose met de geassocieerde fibrose van Crohn te vergelijken, analyseerden we de expressie van fibrose markers en cytokinen in verse weefsel biopsie van het ileum van patiënten met actieve cd of onder remissie. Opmerkelijk, we vonden een gemarkeerde inductie van verdikking van αSMA-positieve lagen en verhoogde collageen depositie zoals gedetecteerd door trichrome kleuring in actieve CD-secties (Figuur 2A). We voerden ook westerse Blot-analyses uit en bevestigden de inductie van αSMA-expressie in actieve CD-samples (Figuur 2B). Daarnaast hebben we significante inductie van fibrose markers waargenomen, waaronder αSMA, Kol1, zoals gedetecteerd door qPCR-analyse (Figuur 2C).
Vervolgens, om te bepalen van een mechanisme voor het beperken van tnbs fibrose we geëvalueerd de effecten van rapamycine, een farmacologische remmer van mtor activiteit15,16. Dienovereenkomstig behandelden we muizen met zowel TNBS als rapamycine en analyseerden we αSMA en collageenniveau in Colon histologie en hebben ze kwantitatieve meting van αSMA en collageen aangetoond in densitometrie plot (Figuur 3A). Uit onze gegevens blijkt dat rapamycine de αSMA-positieve kleuring in de submucosale laag vermindert en de collageen depositie verkleint. Om fibrotische reacties verder te valideren en te kwantificeren, bepaalden we de αSMA-, collageen-en TGFβ-expressies door qPCR en αSMA-expressie door Flowcytometrie in TNBS-behandelde Colon (Figuur 3B, 3c). We hebben ook aangetoond Cx3Cr1+ mononucleaire fagocyten induceren een inflammatoire immuunrespons op letsel9. Zo wilden we zien of de toediening van rapamycine in met TNBS behandelde muizen de inflammatoire en fibrotische effecten kon omkeren. Daarom gezuiverde we Cx3Cr1+ Resident mononucleaire fagocyten uit Colon eencelsuspensies met behulp van magnetische microbeads (Figuur 3D). We vonden een verhoogd niveau van p-P70 en p-S6 in Cx3Cr1+ Resident mononucleaire fagocyten door Western Blot-analyse van met TNBS behandelde muizen, en dit niveau werd geblokkeerd door rapamycine (Figuur 3E). Daarnaast constateerden we dat de behandeling met rapamycine de IL-23 en IL-1β in de TNBS-behandelde groep dempt (Figuur 3F). Bovendien verhelderden deze bevindingen het effectieve mechanisme dat betrokken is bij de inductie van TNBS-fibrose en hebben aangetoond dat rapamycine de inductie van fibrose verzwakt.
Figuur 1: succesvolle toediening van TNBS leidt tot de ontwikkeling van intestinale fibrose bij muizen. A. Schematische weergave van wekelijkse TNBS-behandeling gegeven aan wild type muizen. B. Colon afbeeldingen en meting van de lengte van de dikke darm van TNBS-behandelde muizen, geoogst op week 0, 2, 4 en 6 na TNSB behandeling. C-D. Colon secties ' histologische analyse gekleurd met anti-αSMA antilichamen voor de activering van myofibroblasten en trichrome blauwe kleuring voor collageen; schaalbalk 100 μm. E. FACS analyse om αSMA-positieve cellen in de dikke darm en kwantificering van αSMA-positieve cellen te identificeren. F. fibrotische markers en cytokines gedetecteerd door qPCR. G. analyse van de Western Blot van αsma uit Colon lysaat van tnbs-behandelde en controle muizen. Dit gewijzigde cijfer wordt hergebruikt met de toestemming van vorige publicatie9 in Mucosale immunologie, 2019 door Mathur et al. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: TNBS fibrose is vergelijkbaar met de ziekte van Crohn-geassocieerde intestinale fibrose. A. representatieve afbeeldingen van Colon biopsieën van de controle, actieve cd met een significante toename van trichrome blauwe kleuring en αsma-positieve kleuring in submucosale lagen, schaalbalk 50 μm. B. Western Blot-analyse van αSMA-expressie en kwantificering. C. qPCR-analyse van fibrotische markers en cytokines. Dit gewijzigde cijfer wordt hergebruikt met de toestemming van vorige publicatie9 in Mucosale immunologie, 2019 door Mathur et al. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Rapamycine behandeling effectief uitzitten van TNBS-geïnduceerde fibrose. A. Colon histologische analyse-representatieve beelden van myofibroblast-kleuring met anti-αsma-antilichaam en collageen kleuring met trichrome Blue, schaalbalk 100 μm. B. qPCR-analyse van αsma, collageen en tgfβ-expressie in controle/ TNBS-behandelde muis dubbele punten. C. FACS analyse van αsma in eencellige suspensie van muis Colon behandeld met controle/TNBS. D. schematische voor zuivering van Cx3Cr1+ cellen uit de Colon lamina PROPRIA Fractie en FACS analyse van gezuiverde cellen. E. analyse van de Western Blot van de niveaus p-P70 en p-S6 in gezuiverde Cx3Cr1 + mononucleaire fagocyten van muizen die behandeld werden met TNBS en/of rapamycine. F. qPCR-analyse van de uitdrukking in gezuiverde Cx3Cr1 + mononucleaire fagocyten, die Il-23 en Il-1β produceert. Dit gewijzigde cijfer wordt hergebruikt met de toestemming van vorige publicatie9 in Mucosale immunologie, 2019 door Mathur et al. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Wondgenezing of weefselherstel is een strak gereguleerd biologisch proces17. Tijdens weefsel letsel met een chemische, mechanische en infectie aandoening, activeert een ontstekingsreactie het weefselherstel proces. Een disgereguleerde en pathologische ontstekingsreactie leidt echter tot het ontwikkelen van littekens of een fibrotische reactie, die de weefselherstel functie9,18,19kunnen aantasten. Hier tonen we de procedure voor het tnbs-geïnduceerde fibrose Animal-model, dat de pathofysiologie significant deelt met de ziekte van humane Crohn. Opeenvolgende inoculatie van tnbs chemische blootstelling aan beschadiging van de muis epitheel veroorzaakt diepe ulceraties en induceert fibrose ontwikkeling. Met een betrouwbare, lage kosten, en snelle inductie van het begin van de ziekte, deze methode wordt algemeen aanvaard door meerdere onderzoeksgroepen die betrokken zijn bij studies voor weefsel letsel, transmurale ontsteking en de gut-Brain-as.
Voor het succesvol implementeren van de tnbs fibrose model, er zijn een aantal essentiële stappen. Bijvoorbeeld, adequate dosering en timing van de toediening van TNBS zijn zeer belangrijk. Een 6-8 weken durende TNBS-inoculatie maakt diepe weefsel ulceratie mogelijk en wordt ten zeerste aanbevolen voor chronische fibrotische studies. Uitkomend kruk van muizen en de retrograde reflex van geënt TNBS zijn twee grote problemen, wat kan resulteren in de levering van variabele doses aan muizen. Zachte druk in de buurt van de muizen rectum kan helpen vrijgeven van ontlasting voor TNBS administratie. Het vasthouden van het hoofd van het dier voor een paar seconden drastisch helpt om te stoppen met omgekeerde reflux van TNBS. Het houden van de muizen in een kooi, het plaatsen van de kooi op een hitte pad en het verstrekken van de muizen met Napa nectar kunnen ook nuttige strategieën zijn om een hoge sterfte te voorkomen.
Hier bespreken we ook de darmontsteking tijdens de fibrose van TNBS en hun impact op fibrotische respons. mtor/autophagy rol is in grote lijnen betrokken bij intestinale homeostase en IBD pathogenese20,21. We identificeerden dat mTOR/autophagy signalering essentieel is voor het moduleren van pro-inflammatoire reacties van IL-23 en IL1β cytokines van Cx3Cr1+ mononucleaire fagocyten die de Pro-FIBROTISCHE Il-23/Il-22-as beïnvloeden (Figuur 3A)9 . Daardoor is het zuiveren van enkelvoudige Cx3Cr1+ mononucleaire cellen voor immunoprofiling en genexpressie een kritieke stap van het model. We bespreken in detail het protocol voor het isoleren van lamina propria en zorgen voor de zuiverings procedure voor Cx3Cr1+ mononucleaire cellen met behulp van magnetische kralen.
Collectief, ondanks de aanwezigheid van genetische en spontane modellen voor de ziekte van Crohn, tnbs-colitis blijft een krachtig instrument om te bestuderen van de immuno-pathogenese van cd en heeft het potentieel om te evalueren van de ziekte van Crohn fibrose behandelingen. De belangrijkste beperking van het gebruik van chemisch geïnduceerde fibrose modellen zoals TNBS is de kans op hoge variabiliteit van gebruiker tot gebruiker en de mogelijkheid van uitschieters in de gegevens. Een steekproefgrootte van 5-8 dieren per groep samen met een grotere gebruikerservaring kan de consistentie van het model vergroten. Het vinden van een geschikt genetisch model dat spontane fibrose van Crohn veroorzaakt, is en blijft echter altijd gerechtvaardigd.
Disclosures
Concurrerende belangen: de auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH Grant R01NS093045 (Y.H.), NIH Grant K08DK088950 (X.Z.), R03DK099566 (X.Z.) en de & colitis Foundation of America Research Fellowship (CCFA) 481637 (R.M.) van de ziekte van Crohn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 | e-bioscience | 53-9760-82 | |
| Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 | e-bioscience | 149760-80 | |
| Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 | Biolegend Inc | 101226 | |
| Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 | Biolegend | 149006 | |
| Anti-mouse purified CD16/32 Fc block | Biolegend Inc | 14-9760-80 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-105-639 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | e-bioscience | 7074 | |
| Bovine Serum Albumin | InvivoGen | tlrl-isdn | |
| Collagenase type IV | Roche | 1088866001 | |
| DAPI | SIGMA | D9542 | |
| DMEM | Corning | 10013-CV | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | D263-5vl | |
| Falcon® 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit | BD Bioscience | 555028 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | www.flowjo.com | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | e-bioscience | 5018 | |
| Graphpad Prism 7 | GraphPad Software Inc | www.graphpad.com | |
| H&E kit | American Mastertech Kit | HXMMHPT | |
| Image J | NIH | www.imagej.nih.gov/ij/ | |
| Mouse: C57BL/6J | Jackson Laboratories | 664 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Percol | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| PMA/Ionomycin salt | Sigma | P8139 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermofisher | A25777 | |
| Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 | Cell signaling | 5174 | |
| Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 | Cell signaling | 2708 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 | Cell signaling | 9208 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E | Cell signaling | 4858 | |
| Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein | Cell signaling | 2217 | |
| Rapamycin | LC LABORATORIES | 1003799 | |
| TNBS | Sigma | 92823 | |
| Trichorme staining kit | American Mastertech Kit | STOSTBPT | |
| TRIzol | Life technologies | 15596018 | |
| Verso cDNA Synthesis Kit | Thermofisher | AB1453B | |
| Zen black 2.1 | Carl Zeiss | www.zeis.com | |
| Zen blue lite 2.3 | Carl Zeiss | www.zeis.com |
References
- Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H.
- Park, S. G., et al. T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gammadelta T cells. Immunity. 33, 791-803 (2010).
- Speca, S., Giusti, I., Rieder, F., Latella, G. Cellular and molecular mechanisms of intestinal fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18, 3635-3661 (2012).
- Keubler, L. M., Buettner, M., Hager, C., Bleich, A. A Multihit Model: Colitis Lessons from the Interleukin-10-deficient Mouse. Inflammatory Bowel Disease. 21, 1967-1975 (2015).
- Strober, W., Nakamura, K., Kitani, A. The SAMP1/Yit mouse: another step closer to modeling human inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 107, 667-670 (2001).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology-Gastroenterology and Liver Physiology. 296, G135-G146 (2009).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery. 11, 9-15 (2016).
- Loeuillard, E., et al. 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced chronic colitis with fibrosis and modulation of TGF-beta1 signaling. World Journal of Gastroenterology. 20, 18207-18215 (2014).
- Mathur, R., et al. Induction of autophagy in Cx3cr1(+) mononuclear cells limits IL-23/IL-22 axis-mediated intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. 12, 612-623 (2019).
- Joeris, T., Muller-Luda, K., Agace, W. W., Mowat, A. M. Diversity and functions of intestinal mononuclear phagocytes. Mucosal Immunology. 10, 845-864 (2017).
- Mathur, R., et al. A mouse model of Salmonella typhi infection. Cell. 151, 590-602 (2012).
- Zhao, X., et al. Noninflammatory Changes of Microglia Are Sufficient to Cause Epilepsy. Cell Reports. 22, 2080-2093 (2018).
- Murugaiyan, G., et al. MicroRNA-21 promotes Th17 differentiation and mediates experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 125, 1069-1080 (2015).
- Hinz, B., Celetta, G., Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Chaponnier, C. Alpha-smooth muscle actin expression upregulates fibroblast contractile activity. Molecular Biology of the Cell. 12, 2730-2741 (2001).
- Yang, J., et al. Rapamycin Inhibition of mTOR Reduces Levels of the Na+/H+ Exchanger 3 in Intestines of Mice and Humans, Leading to Diarrhea. Gastroenterology. 149, 151-162 (2015).
- Mutalib, M., et al. The use of sirolimus (rapamycin) in the management of refractory inflammatory bowel disease in children. Journal of Crohns and Colitis. 8, 1730-1734 (2014).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3209-3213 (2009).
- Paul, J., et al. IL-17-driven intestinal fibrosis is inhibited by Itch-mediated ubiquitination of HIC-5. Mucosal Immunology. 11, 427-436 (2018).
- Sohail, I., Ghosh, S., Mukundan, S., Zelewski, S., Khan, M. N. Role of Inflammatory Risk Factors in the Pathogenesis of Streptococcus pneumoniae. Frontiers of Immunology. 9, 2275 (2018).
- Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149, 274-293 (2012).
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).
