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Immunology and Infection

TNBS के विकास में मशीनी इनसाइट-मध्यस्थ आंत्र फाइब्रोसिस और Rapamycin के अवरोधक प्रभाव का मूल्यांकन

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/60067
Automatic Translation
1,2,3, 4, 4, 4, 1,2
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2The IBD Center, Division of Gastroenterology, Department of Medicine, Albany Medical College, 3Department of Geriatrics, School of Medicine and Health Science, University of North Dakota, 4Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

Summary

इस अध्ययन में, हम TNBS मध्यस्थता आंत्र फाइब्रोसिस की एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन है, जो क्रोहन फाइब्रोसिस के लिए तुलनीय pathophysiology दर्शाती है. हम भी rapamycin के प्रकाश में इस दृष्टिकोण पर चर्चा आंतों फाइब्रोसिस पर निरोधात्मक प्रभाव में मदद की.

Abstract

आंतों की फाइब्रोसिस के प्रभावी प्रबंधन को समझने के लिए महत्वपूर्ण अध्ययन किए गए हैं। हालांकि, फाइब्रोसिस के बेहतर ज्ञान की कमी ने निवारक दवा के विकास में बाधा डाल दी है। मुख्य रूप से, एक उपयुक्त पशु मॉडल खोजने क्रोहन के संबद्ध आंत्र फाइब्रोसिस विकृति के तंत्र को समझने में चुनौतीपूर्ण है। यहाँ, हम एक प्रभावी तरीका अपनाया जहां चूहों मलाशय के लिए TNBS रासायनिक जोखिम काफी गहरी अल्सरेशन और पुरानी सूजन का उत्पादन, और चूहों तो लंबे समय से आंतों फाइब्रोसिस का विकास. इसके अलावा, हम एक तकनीक का वर्णन जहां एक rapamycin इंजेक्शन माउस मॉडल में TNBS-मध्यस्थ फाइब्रोसिस पर निरोधात्मक प्रभाव से पता चलता है. फाइब्रोसिस के अंतर्निहित तंत्र का आकलन करने के लिए, हम विधिपूर्वक TNBS उपचार और नियंत्रण चूहों की लेमिना प्रोपरिया से Cx3Cr1 + कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए एक प्रक्रिया पर चर्चा. यह विस्तृत प्रोटोकॉल उन शोधकर्ताओं के लिए सहायक होगा जो फाइब्रोसिस के तंत्र की जांच कर रहे हैं और क्रोहन-संबद्ध आंत्र फाइब्रोसिस के लिए एक बेहतर चिकित्सीय आविष्कार खोजने का मार्ग प्रशस्त करते हैं।

Introduction

आंत में प्रतिरक्षा होरोस्टेसिस के रोगनियंत्रण से रोगजनक सूजन होती है और यह सूजन आंत्र रोग (आईबीडी)1,2केकारण व्यापक रूप से जाना जाता है। आंत्र फाइब्रोसिस सूजन आंत्र रोगों (आईबीडी) का एक पुराना परिणाम है, जैसे क्रोहन रोग (सीडी)3। सीडी के अपरिवर्तनीय pathophysiology आंत्र stricture या फाइब्रोसिस के एक प्रकार का रोग भी शामिल है, जो उपचार के विकल्प को सीमित करता है, और कोई दवा वर्तमान में उपलब्ध के साथ, केवल उपचार सर्जरी है. अंततः, अनुचित सूजन का मुकाबला करने के लिए प्रभावी उपचार के विकास के लिए बहुत सीडी के तंत्र का अध्ययन करने की जरूरत है, और यह हमें एक कदम है कि करीब का नेतृत्व करेंगे.

आईबीडी का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रकार के आनुवंशिक माउस मॉडल उपलब्ध हैं जिनमें आईएल10 केओ, एसएएमपी/वाईट और दत्तक सीडी 45+एससीआईडी चूहों में आरबी उच्च कोशिका हस्तांतरण4,5,6शामिल हैं । यहाँ, हम सीडी के माउस मॉडल में TNBS मध्यस्थता फाइब्रोसिस के लिए प्रक्रिया है, जो मानव Crohn फाइब्रोसिस की विकृति के बराबर है दिखा. TNBS प्रेरित मॉडल कुछ फायदे हैं. इस मॉडल तकनीकी रूप से सरल है; रोग की शुरुआत तेजी से, सस्ती है, और व्यापक रूप से विभिन्न जानवरों में इस्तेमाल किया जा सकता है (उदा., माउस, चूहे और गिनी पिग7). इथेनॉल और टीएनबीएस (2,4,6-ट्रिनिट्रोबेन सल्फोनिक एसिड) का सह-प्रशासन अचानक आंतों के अवरोध को नुकसान पहुंचाता है और टीएनबीएस को कोलन टिशू प्रोटीन को उजागर करता है और पर्याप्त इम्यूनोलॉजिक प्रतिक्रियाएं8,9प्राप्त करता है। TNBS के बार-बार जोखिम सूजन और चोट का जवाब देने के लिए एक अति सक्रिय मरम्मत प्रक्रिया की ओर जाता है, और पेट में एक फाइब्रोटिक प्रतिक्रिया विकसित करता है। इस प्रकार, TNBS प्रेरित फाइब्रोसिस मॉडल Crohn के संबद्ध आंत्र फाइब्रोसिस का अध्ययन करने के लिए एक बहुत सम्मोहक मॉडल होने के लिए कार्य करता है।

इसके अलावा , मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स प्राथमिक कोशिकाएं हैं जो पेट10,11,12,13में रोगजनन और चोट के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मध्यस्थता करती हैं . सेलुलर तंत्र को स्पष्ट करने के लिए और TNBS फाइब्रोसिस मॉडल में Cx3Cr1+ मोनोन्यूक्लियर phagocytes की भूमिका स्थापित करने के लिए, हम मोनोन्यूक्लियर phagocytes शुद्ध करने की प्रक्रिया दिखाते हैं। Cx3Cr1+ कोशिकाओं का विश्लेषण सूजन मार्करों का आकलन करने और आंतों फाइब्रोसिस के लिए सहवर्ती तंत्र निर्धारित करने के लिए एक आवश्यक कदम है। सामूहिक रूप से, TNBS फाइब्रोसिस के लिए यह विस्तृत प्रक्रिया आंतों फाइब्रोसिस के सेलुलर तंत्र की व्याख्या करने में सहायक होगी।

Protocol

इस पांडुलिपि के लिए, सभी मानव नमूनों संस्थान की समीक्षा बोर्ड (IRB) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार और Albany मेडिकल कॉलेज में मानव अनुसंधान पर समिति द्वारा खरीद रहे थे. जानवरों से जुड़े सभी अनुसंधान सख्ती से Albany मेडिकल कॉलेज में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार पालन किया गया के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों .

1. मानव आंतों के नमूनों का संग्रह

  1. संस्था की अनुसंधान समिति के प्रोटोकॉल के अनुसार मानव ऊतक के नमूने एकत्र करें।
  2. फाइब्रोसिस के साथ का निदान एक सीडी रोगी के आंतों के ऊतक (इलियोकोलोनिक) की खरीद और IBDs का कोई इतिहास के साथ रोगियों से नमूने को नियंत्रित.
  3. इम्यूनोहिस्टोलॉजी के लिए आंतों के ऊतकों के हिस्से का उपयोग करें, एमआरएनए का विश्लेषण करने के लिए ऊतक का एक और हिस्सा, और फाइब्रोटिक और साइटोकिन जीन/मार्कर के प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए अंतिम भाग।
  4. इम्यूनोहिस्टोलॉजी विश्लेषण के लिए, पहले मानव ऊतक के नमूने को कम से कम 48 एच के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में ठीक करें और फिर इसे कम से कम 16 ज के लिए 70% इथेनॉल युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक पैराफिन-एम्बेडेड ब्लॉक बनाने के लिए इस निश्चित ऊतक का उपयोग करें और 5 मीटर मोटी ऊतक को काट ें। ऊतक-माइक्रोटोम का उपयोग करके खंड.
  5. एक ब्रश का उपयोग करना, धीरे धुंधला के लिए एक गिलास स्लाइड पर प्रत्येक कट अनुभाग बाहर फैला.
  6. कोलेजन जमाव का पता लगाने के लिए ट्राइक्रोम दाग के साथ दाग ऊतक अनुभाग स्लाइड, और myofibroblasts का पता लगाने के लिए $SMA दाग के साथ (त्रिक्रोम और जेडएसएमए धुंधला के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए अनुभाग 3 देखें)। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत दाग वर्गों की जांच.
  7. प्राप्त मानव ऊतक नमूने का एक और हिस्सा प्रक्रिया प्रोटीन lysate बनाने के लिए पश्चिमी धब्बा के माध्यम से $SMA का पता लगाने के लिए (पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए अनुभाग 7 देखें).
  8. मानव ऊतक नमूने के अंतिम भाग से आरएनए प्राप्त करें एक निष्कर्षण अभिकर्मक का उपयोग कर (सामग्री की तालिका) और आरटी-पीसीआर के माध्यम से सीडीएनए में परिवर्तित करें।
  9. QPCR द्वारा फाइब्रोटिक और साइटोकिन जीन का विश्लेषण करें (MRNA तैयारी के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए अनुभाग 6 देखें)।

2. चूहों में टीएनबीएस फाइब्रोसिस और रैपामाइसिन उपचार का प्रेरण

  1. संस्था द्वारा अनुमोदित पशु अनुसंधान प्रोटोकॉल के अनुसार पशु अनुसंधान करना।
  2. त्वचा जोखिम के माध्यम से TNBS के लिए पूर्व संवेदनशील करने के क्रम में गर्दन क्षेत्र के आसपास वयस्क चूहों दाढ़ी. एक कपास झाड़ू में TNBS भिगो और फिर माउस गर्दन के मुंडा क्षेत्र के लिए TNBS लागू होते हैं.
    नोट: पूर्व संवेदनशीलता एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है क्योंकि यह TNBS मध्यस्थता सूजन आरंभ करने के लिए देरी अतिसंवेदनशीलता प्रतिक्रिया में सुधार.
  3. आठ दिन पूर्व संवेदनशीलता के बाद, छह सप्ताह के लिए एक सप्ताह में एक बार इंट्रा-रेक्टल प्रशासन द्वारा कोलाइटिस प्रेरित। एक 1 एमएल सीरिंज के माध्यम से एक 100 एमएल एनीमा का उपयोग कर TNBS के चार मिलीग्राम लागू करें 3.5 फ्रेंच polyurethane कैथेटर से जुड़ी और नियंत्रण चूहों 100 $L 25% इथेनॉल के केवल दे.
    1. पेंटोबार्बिटल (25 मिलीग्राम/किलोग्राम इंट्रापेरिटोनल) के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें या टीएनबीएस प्रशासन के दौरान ऑक्सीजन के 1 एल/मिन के साथ उन्हें 2.5% आइसोफ्लुरेन के साथ बेनकाब करें। धीरे से उंगलियों pinching और पलटा की अनुपस्थिति के लिए देख द्वारा एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें।
  4. सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सा मरहम का प्रयोग करें, जबकि चूहों संज्ञाहरण के तहत कर रहे हैं।
  5. 3-6 सप्ताह के लिए हर हफ्ते के दिन 2 मिलीग्राम/किग्रा/दिन या वाहन (5% ट्वीन-20 और 4% इथेनॉल) पर रैपामाइसिन इंजेक्शन, नियंत्रण और TNBS-उपचारित चूहों दोनों के लिए।
  6. ऊतक विज्ञान, प्रवाह साइटोमेट्री, पश्चिमी सोख्ता और आरएनए निष्कर्षण सहित extracellular assays का विश्लेषण करने के लिए 6 सप्ताह TNBS के बाद इलाज चूहों आंत का प्रयोग करें। अंगों फसल के लिए, सीओ2 साँस लेना का उपयोग कर चूहों euthanize और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ इच्छामृत्यु की पुष्टि करें।
    1. अंगों फसल के लिए, सीओ2 साँस लेना का उपयोग कर चूहों euthanize और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ इच्छामृत्यु की पुष्टि करें। इच्छामृत्यु के बाद, लंबे समय तक सर्जिकल ग्रेड कैंची और बलप्स का उपयोग करके अपने अधर पक्ष पर माउस को खोलें। मलाशय से टर्मिनल ilium क्षेत्र के लिए पूरे बृहदान्त्र निकालें. जल्दी से बर्फ ठंडा 1x HBSS करने के लिए बृहदान्त्र हस्तांतरण और एक ही बफर का उपयोग कर बृहदान्त्र धो.
    2. उपाय और नियंत्रण और TNBS इलाज चूहों के बृहदान्त्र लंबाई की तुलना करें. सेल मौतों से बचने के लिए बृहदान्त्रों से बाहर सुखाने से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके इस कदम को करें।
    3. बृहदान्त्र को छोटे टुकड़ों में काटें और भविष्य के प्रयोजनों के लिए भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें (RNA/पश्चिमी धब्बा विश्लेषण)। FACS विश्लेषण के लिए बृहदान्त्र का एक और टुकड़ा का प्रयोग करें.
    4. कटौती और दोनों नियंत्रण और TNBS इलाज जानवरों के बृहदान्त्र के समान क्षेत्रों से औपनिवेशिक ऊतक के नमूने इकट्ठा करने के लिए सुनिश्चित करें.
      नोट: एक 10%-20% मृत्यु दर TNBS टीका के साथ हालांकि अनुभव के साथ की उम्मीद है, मृत्यु दर काफी कम किया जा सकता है.

3. आंत फाइब्रोसिस के इम्यूनो-हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन

  1. 48 एच के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में मानव और/या चूहों के ऊतकों को ठीक करें, और फिर 16 ज के लिए 70% इथेनॉल को स्थानांतरित करें।
    नोट: Paraformaldehyde एक neurotoxic रासायनिक तो साँस लेने से बचने के लिए है; यह प्रयोग करते समय एक चेहरा मुखौटा का उपयोग करें.
  2. पराफिन निश्चित बृहदान्त्र ऊतकों एम्बेड, एक 5 डिग्री मोटाई के लिए टुकड़ा, और सीधे ऊतक विज्ञान के लिए कांच की स्लाइड पर ऊतकों डाल दिया.
  3. कोलेजन का पता लगाने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार एच एंड ई और Trichrome ब्लू धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
    1. संक्षेप में, पहले प्रत्येक कक्ष में 5 मिनट के लिए xylene के दो कक्षों में वर्गों युक्त स्लाइड submerging द्वारा वर्गों deparaffinize.
    2. 1 मिनट के लिए 100% शराब के साथ स्लाइड कुल्ला; इस चरण को तीन बार दोहराएँ. 1 मिनट के लिए नल के पानी के साथ फिर से कुल्ला.
    3. उसके बाद, 60 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर प्रीहीट बूइन के समाधान में स्लाइड विसर्जित करें। बूइन का समाधान दिखने में पीला होता है; 3 मिनट के लिए नल के पानी में Bouin समाधान से बाहर ले जाने के बाद या स्लाइड बेरंग बन गया.
    4. कमरे के तापमान पर 7 मिनट के लिए संशोधित मेयर Hematoxylin समाधान में स्लाइड विसर्जित कर दिया।
    5. 5-8 मिनट के लिए Trichrome दाग में डूब द्वारा दाग स्लाइड, तुरंत, अतिरिक्त Trichrome दाग को दूर करने के लिए 5-10 s के लिए चल रहे पानी में स्लाइड कुल्ला.
    6. 1 मिनट के लिए 100% शराब के साथ निर्जलीकरण स्लाइड. इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं।
    7. 1 मिनट के लिए xylene के साथ स्लाइड साफ़ करें और चरण 3x दोहराएँ.
    8. बढ़ते मीडिया के साथ स्लाइड माउंट (सामग्री की तालिका)
  4. सावधानी से संदंश के साथ एक छोर पर कवरस्लिप पकड़ और यह किसी भी बुलबुले के बिना पूरे अनुभाग को कवर करते हैं। कुछ बुलबुले हैं, तो जल्दी से कवरस्लिप दोहन से बुलबुले को हटा दें।
  5. $SMA का पता लगाने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करें।
    1. बफर अवरुद्ध में ब्लॉक बृहदान्त्र वर्गों (0.2% Triton एक्स-100 और 5% सामान्य बकरी सीरम 1x PBS में) कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए.
    2. स्लाइड समाधान पर $SMA (सामग्री की तालिका) के लिए पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 $L के साथ इनक्यूबेट (0.2% ट्राइटन एक्स-100 और 1x पीबीएस में 3% सामान्य बकरी सीरम; एंटी-एसएमए 1:200) रात 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    3. 1x पीबीएस के साथ तीन बार वर्गों धो लें.
    4. कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए एक माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में एलेक्सा फ्लोर 488 (सामग्री की तालिका)के साथ समंजक बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल) का उपयोग करें।
    5. 1x पीबीएस के साथ तीन बार वर्गों धो लें.
    6. 5 मिनट के लिए नाभिक का मुकाबला करने के लिए DAPI का प्रयोग करें।
    7. 1x पीबीएस के साथ तीन बार वर्गों धो लें.
    8. फ्लोरोसेंट बढ़ते मीडिया के साथ स्लाइड माउंट (सामग्री की मेज),और नेल पॉलिश का उपयोग कर एक कवरस्लिप के साथ सील।
  6. LSM 880 confocal माइक्रोस्कोप और प्रक्रिया छवियों माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियों को प्राप्त.
  7. ImageJ के साथ एक ही अनुभाग में कई चयनित क्षेत्रों के एक औसत लेने के द्वारा छवियों Quantify.

4. आंतों के पटल प्रोटेरिया का अलगाव और Cx3Cr1+ मोनोन्यूक्लियर phagocytes की शुद्धि

  1. लंबे समय तक बर्फ ठंडा हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS में बृहदान्त्र खोलें; सामग्री की तालिका) और एक ही बफर के साथ बृहदान्त्र धो लो.
  2. एचबीएसएस में बाँझ कैंची का उपयोग कर बृहदान्त्र ऊतकों के लगभग 5 सेमी छोटे टुकड़े काटें।
  3. एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में छोटे बृहदान्त्र ऊतक टुकड़े हस्तांतरण पूर्व पाचन बफर के 10 एमएल युक्त (1x HBSS 5% FBS, 5 एम एम EDTA और 1 एम एम डीटीके के साथ), और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर11में 100 मिनट पर 20 मिनट के लिए हिला.
    नोट: 100 आरपीएम मिलाते हुए हालत में 37 डिग्री सेल्सियस में कोलोनिक ऊतक के इनक्यूबेशन कुशल collagenase ऊतक पाचन और व्यवहार्य कोशिकाओं की उच्च उपज के लिए अनुमति देता है।
  4. 40 डिग्री मीटर कोशिका छलनी से होकर अलग-अलग कोलोनिक उपकला को त्यागें।
  5. छलनी से शेष ऊतक लीजिए और आगे उन्हें पाचन बफर में पचाने के लिए Collagenase प्रकार IV और DNase मैं (सामग्री की तालिका) 1x HBSS में 5% FBS के साथ 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 100 आर.एम.पी.
  6. लगभग 20 s के लिए पचा ऊतकों भंवर और एक 40 डिग्री कोशिका छलनी के माध्यम से पारित करने के लिए lamina प्रोपरिया भिन्न प्राप्त.
  7. 4 डिग्री सेल्सियस में 700 x g पर कोशिकाओं को गोली करने के लिए lamina propria भिन्नों सेंट्रीफ्यूज
  8. मृत कोशिकाओं को पटल से बाहर करने के लिए एक घनत्व ढाल का उपयोग करें (सामग्री की तालिका)।
    नोट: यहाँ प्रयुक्त घनत्व प्रवणता मीडिया (सामग्री की तालिका) मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की हानि का कारण बन सकता है; हालांकि, यह तैयारी से मृत कोशिकाओं को बहुत हटा देता है, जो समग्र शुद्धता को बढ़ाता है।
    1. 30% और 70% घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया समाधानों में से प्रत्येक 100 एमएल बनाएं। प्राप्त कोशिकाओं को 10 एमएल में 30% विलयन के 10 एमएल में पुन: स्फूंदी करें तथा 15 एमएल ट्यूब में 70% विलयन के 5 एमएल के शीर्ष पर ओवरले।
    2. 1,000 x ग्राम और कमरे के तापमान पर ब्रेक-मुक्त स्थिति में ढाल को सेंट्रीफ्यूज करें। सफेद अंगूठी चरण ले लीजिए जिसमें लेमिना प्रोप्रिया लिम्फोसाइटें शामिल हैं, जो 30% और 70% ढाल परतों के बीच होगी।
  9. बर्फ-ठंडा HBSS में फिर से निलंबित करके प्राप्त कोशिकाओं को धो एंटरफैंस और 500 x ग्रामपर सेंट्रीफ्यूज, 20 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए. FACS में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (प्रवाह-सक्रिय सेल छँटाई) बफर (पीबीएस, पीएच 7.4, 1% बीएसए और 2 एम एम ए डी ए) के साथ।
  10. चुंबकीय मोती का उपयोग कर एकत्र कोशिकाओं शुद्धि से मोनोन्यूक्लियर phagocytes शुद्ध और /
    1. चुंबकीय शुद्धि
      1. एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने से पहले, बर्फ पर 15 मिनट के लिए एंटी-माउस CD16/CD32 एफसी अवरोधक के साथ इनक्यूबेट करके लेमिना प्रोपरिया कोशिकाओं की पहली ब्लॉक सेल सतह।
      2. बर्फ पर 30 मिनट के लिए एंटी-Cx3Cr1-पीई (phycoerythrin) एंटीबॉडी के साथ-साथ बर्फ पर 30 मिनट के लिए, सीमा कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए, एंटी-पीई माइक्रोबीड्स(सामग्री की तालिका)के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं। FACS बफर के साथ कोशिकाओं को धो लें।
      3. अनबाउंड कोशिकाओं को हटाने के लिए एक चुंबकीय क्षेत्र में एक चुंबकीय सक्रिय सेल-सॉर्टिंग कॉलम के माध्यम से एंटीबॉडी/बीड बाउंड कोशिकाओं को पास करें। FACS बफर के साथ तीन बार धो लें. चुंबकीय क्षेत्र से स्तंभ निकालें और मनका बाध्य कोशिकाओं उपज के लिए स्तंभ में प्लंजर धक्का.
    2. FACS छँटाई
      नोट: FACS छँटाई चुंबकीय शुद्धि के बदले में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि चुंबकीय शुद्धि एक आसान और लागत प्रभावी तरीका है, यह केवल शुद्ध एकल कोशिकाओं तक ही सीमित है, कोशिकाओं के subpopulations के लिए नहीं. इसलिए, कोशिकाओं के subpopulations को अलग करने के लिए, FACS छँटाई विधि एकल कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से कोशिकाओं के subpopulations छँटाई का एक प्रभावी तरीका है.
      1. एंटी-माउस CD16/CD32 Fc अवरोधक(सामग्री की तालिका) केसाथ ब्लॉक पटल प्रोपरिया कोशिकाओं।
      2. विरोधी CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C, और MHCII एंटीबॉडी के साथ incubating द्वारा दाग कोशिकाओं.
      3. एक FACS प्रवाह cytometer का उपयोग कर सॉर्ट करें, CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C के लिए gating- कोशिकाओं CX3Cr1 (P3 + P4) जनसंख्या को शुद्ध करने के लिए।
  11. Lyse कुल आरएनए तैयारी के लिए कोशिकाओं को हल और cytokine और फाइब्रोटिक मार्करों का पता लगाने (आरएनए और cDNA तैयारी के लिए अनुभाग 6 देखें).
  12. चुंबकीय शुद्धि से अलग एकल सेल निलंबन से फाइब्रोटिक मार्करों और भड़काऊ साइटोकिन विश्लेषण के MRNA अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें।
  13. FACS विश्लेषण के लिए, विरोधी माउस CD16/CD32 एफसी अवरोधक के साथ ब्लॉक कोशिकाओं (सामग्री की तालिका)सतह या intracellular मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ धुंधला करने से पहले.

5. प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण

  1. कोशिका-सतही अभिरंजन और विश्लेषण
    1. 5-10 - 105 अलग लेमिना प्रोपरिया कोशिकाओं को 50 एमएल में एफएसीएस बफर (1% बीएसए, पीबीएस में 2 एमएम एड्टा, पीएच 7.4) को पुन: निलंबित करें।
    2. 10 मिनट के लिए बर्फ पर एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉक करने के लिए एक 1:50 कमजोर पड़ने पर विरोधी माउस CD16/CD32 (सामग्री की तालिका)के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    3. सेल-सतह धुंधला करने से पहले असीमित एंटी-CD16/CD32 को हटाने के लिए बर्फ-ठंडा FACS बफर के 500 डिग्री एल के साथ कोशिकाओं को धोएं।
    4. सतह दाग कोलनिक एकल सेल निलंबन (106 कोशिकाओं /50 एमएल) फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी के साथ 1:100 पर बर्फ पर कमजोर पड़ने 30 मिनट के लिए colonic lamina propria का मूल्यांकन करने के लिए.
    5. बिना सीमा एंटीबॉडी को दूर करने के लिए बर्फ-ठंडा FACS बफर के 500 डिग्री एल के साथ लेबल कोशिकाओं को धो लें।
    6. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा लेबल मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं का विश्लेषण करें। लाइव के लिए गेट, तो FSC के लिए+एसएससी+ CD11b+ Cx3Cr1+द्वारा पीछा किया, और फिर MHCII, CD80, CD86 और CD40 सहित अन्य मैक्रोफेज सक्रियण मार्करों का विश्लेषण.
  2. अंत:कोशिकीय साइटोकीन अभिरंजन और विश्लेषण
    1. इंट्रासेल्यूलर साइटोकिन धुंधला करने के लिए, एक फिक्सेशन/परमेबिलाइजेशन समाधान किट(सामग्री की तालिका) का उपयोग करके सतह से सना हुआ कोशिकाओं को ठीक और परमीबिलाइज़ करें; विस्तृत चरणों के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    2. लाइव के लिए गेट लेमिना प्रोपरिया कोशिकाओं, तो FSCकेलिए + एसएससी+ CD11b+ Cx3Cr1+IL23 + आईएल23+ आईएल23 के intracellular स्तर का पता लगाने के लिए + Cx3Cr1+IL1 ]+ करने के लिए आईएल1 डिग्री साइटोकाइन के इंट्रासेल्यूलर स्तर का पता लगाएँ।
  3. $SMA अभिरंजन और विश्लेषण
    1. अतिरिक्त स्थिर बफर को दूर करने के लिए 200 x g और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूगिंग द्वारा दो बार FACS बफर के साथ कोशिकाओं को धोएं।
    2. $SMA स्तर का निर्धारण करने के लिए, एक निर्धारण/परमेबिलाइजेशन समाधान किट(सामग्री की तालिका)के साथ कोशिकाओं को स्थायी करें।
    3. 30 मिनट के लिए बर्फ पर 1:1,000 कमजोर पड़ने का उपयोग करके एंटी-एसएमए-AF488 एंटीबॉडी (सामग्री की तालिका)के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं।
    4. कोशिकाओं को दो बार धोएं और फिर FACS विश्लेषण करें। लाइव के लिए गेट, FSC+एसएससी+ उसके बाद का पता लगाने के द्वारा $SMA+ कोलोनी कोशिकाओं में कोशिकाओं.

6. आरएनए अलगाव, आरटी-पीसीआर, वास्तविक समय पीसीआर

  1. एमएसीएस या एफएसीएस शुद्ध कोशिकाओं या बृहदान्त्र उत्पादित ऊतक से आरएनए को निष्कर्षण अभिकर्मक (सामग्री की तालिका) में homogenizing द्वारा अलग करना ।
    नोट: सुरक्षा काले चश्मे और अन्य प्रयोगशाला सुरक्षात्मक गियर का प्रयोग करें जब यह एक फेफड़ों और त्वचा परेशानी है के रूप में इस अभिकर्मक के साथ काम कर रहा है. एक हुड में सुरक्षित रूप से काम करते हैं।
  2. आइसोप्रोपेनोल के साथ आरएनए को उबारने से पहले कुल आरएनए की वसूली में सुधार करने के लिए 20 ग्राम/एमएल ग्लाइकोजन स्टॉक समाधान(सामग्री की तालिका)से RNase-मुक्त ग्लाइकोजन का 0.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
  3. RNase मुक्त जल (सामग्री की तालिका) के 50 डिग्री लल में आरएनए गोली को पुन: निलंबित करें और 55 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट को 5 मिनट के लिए आरएनए तालू को पूरी तरह से भंग कर दें।
  4. 260 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर आरएनए सांद्रता पढ़ें।
  5. कुल आरएनए के 1 $g और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन संश्लेषण किट(सामग्री की तालिका) का उपयोग करके सीडीएनए को संश्लेषित करें।
  6. वास्तविक समय पीसीआर के माध्यम से टेम्पलेट्स के रूप में cDNA के 2 डिग्री एल का उपयोग जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें। एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट QPCR मास्टर मिक्स किट(सामग्री की तालिका) काप्रयोग करें। GAPDH/HPRT मानों को सामान्य करने के बाद आरएनए बहुतायत के गुना परिवर्तन की गणना करने के लिए CT मानों का उपयोग करें।

7. पश्चिमी सोख्ता

  1. आरआईपीए lysis बफर (1% NP40) का उपयोग करके Lyse बृहदान्त्र ऊतक।
  2. 80 वी की एक निरंतर वोल्टेज पर एक 8% bis-Tris जेल में प्रोटीन lysate हल करें.
  3. ठंड हस्तांतरण बफर में नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली (ओं) के लिए जेल प्रोटीन स्थानांतरण 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए 50 लेकिन की एक निरंतर धारा पर चल रहा है।
  4. टीबीएसटी (25 एमएम ट्रास-एचसीएल, पीएच 7.4, 1.5 एम नैकल, 0.05% ट्वीन-20) में कम से कम 1 एच के लिए टीबीएसटी (25 एम एम ट्रास-एचसीएल, पीएच 7.4, 0.05% ट्वीन-20) का उपयोग करके प्रोटीन ट्रांसफर झिल्ली पर गैर-विशिष्ट क्षेत्रों को ब्लॉक करें।
  5. SMA स्तर का पता लगाने के लिए, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर SMA प्राथमिक पता लगाने एंटीबॉडी के साथ झिल्ली (ओं) इनक्यूबेट करें।
  6. 15 मिनट के अंतराल में TBST का उपयोग कर 3-4 बार झिल्ली धो लें।
  7. एचआरपी-कंजुटेड सेकेंडरी एंटीबॉडी (1:10,000) के साथ टीबीएसटी में 5% गैर वसा वाले दूध के साथ इनक्यूबेट।
  8. एक ईसीएल विकासशील किट का उपयोग कर झिल्ली का विकास करना।
  9. डेन्सिटोमेट्री विश्लेषण के लिए लोडिंग नियंत्रण के रूप में जीएपीडीएच के साथ प्रोटीन सिग्नल तीव्रता को सामान्य करें।

8. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. जंगली प्रकार और KO जानवरों के बीच तुलना करके पसंद के डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण करें।
  2. के पी-मूल्य पर विचार करें ;0.05 महत्वपूर्ण होने के लिए (* P और lt; 0.05; * पी और lt; 0.01; * * * पी और lt; 0.01).
  3. दो से अधिक समूहों के बीच विश्लेषण के लिए दो समूहों और ANOVA परीक्षण के बीच अंतर का परीक्षण करने के लिए छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग करें।

Representative Results

हमने आंतों की फाइब्रोसिस8के अंतर्निहित तंत्रों का अध्ययन करने और उन्हें स्पष्ट करने के लिए टीएनबीएस कोलाइटिस माउस मॉडल को अपनाया . यहाँ, हमने टीएनबी-मध्यस्थ कोलाइटिस का एक विस्तृत समय-पाठ्यक्रम अध्ययन किया, जहां टीएनबीएस को योजनाबद्ध रूप से प्रतिनिधित्व के रूप में छह सप्ताह तक जंगली प्रकार के चूहों के लिए साप्ताहिक रूप से प्रशासित किया गया था (चित्र 1ए)। TNBS उपचार के छह सप्ताह के बाद, हमने देखा कि औपनिवेशिक लंबाई TNBS उपचार के दौरान उत्तरोत्तर छोटा, के एक औसत से 5 - 0.5 सेमी नियंत्रण समूह में 3 - 0.5 सेमी TNBS समूह में; बृहदान्त्र लंबाई का ऐसा मात्रात्मक विश्लेषण बृहदान्त्र लंबाई में बहुत स्पष्ट कमी का प्रतिनिधित्व करता है (चित्र 1ठ) यह सुनिश्चित करने के लिए कि TNBS Crohn रोग मॉडल मानव क्रोहन फाइब्रोसिस मॉडल के बराबर है और पद्धति से संबंधित एक कलाकृति नहीं थी, हमने जंगली प्रकार के लिए TNBS इंजेक्शन के लिए एक विस्तृत समय पाठ्यक्रम अध्ययन में कई स्तरों पर फाइब्रोटिक मार्करों का विश्लेषण किया . अल्फा-स्मूथ मांसपेशी actin ($SMA) सकारात्मक कोशिकाओं और submucosal परतों के भीतर कोलेजन जमा का संचय फाइब्रोसिस घटनाओं के अधिकांश में सूचित किया गया है और फाइब्रोटिक घटनाओं के लिए एक पहचान के रूप में माना जाता है14. हमने पाया कि टीएनबीएस-उपचारित चूहों के बृहदान्त्र खंडों में जो जेडएसएमए के साथ दागे गए थे, ने कॉलोनिक सबम्यूकोसा परत में 4-6 गुना वृद्धि दिखाई जो $SMA (चित्र 1ब्) के साथ सकारात्मक रूप से दागित थी। इसके अलावा, इन वर्गों के लिए Trichrome नीले दाग भी एक 2-4 गुना वृद्धि दिखाई, महत्वपूर्ण कोलेजन बयान का सुझाव है, जो गंभीर आंतों फाइब्रोसिस पुष्टि (चित्र 1डी). हमने टीएनबीएस-उपचारित चूहों बृहदान्त्र में FACS विश्लेषण द्वारा $SMA-positive cells का पता लगाकर मायोफिब्रोब्लास्ट्स के सक्रियण का और मूल्यांकन किया और पाया कि $SMA-सकारात्मक धुंधला (चित्र 1ई)। इसके अलावा, हमने टीएनबीएस-उपचारित चूहों(चित्र 1च)में ुपीसीआर विश्लेषण द्वारा मापे गए एसएमए, कोल-I और कोल-III की अभिव्यक्ति में पर्याप्त प्रेरण पाया। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण में $SMA प्रोटीन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति से पता चला कि बढ़ी हुई फाइब्रोसिस (चित्र 1G) . कुल मिलाकर, TNBS गतिज उपचार पुरानी स्थितियों में putative प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है, जो बारीकी से सीडी पुरानी चरण हालत mimics और फाइब्रोसिस विकास के लिए आवश्यक है.

Crohn संबद्ध फाइब्रोसिस के साथ TNBS फाइब्रोसिस की तुलना करने के लिए, हम सक्रिय सीडी या छूट के तहत रोगियों के ileum से ताजा ऊतक बायोप्सी में फाइब्रोसिस मार्करों और साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया। उल्लेखनीय है कि हमने सक्रिय सीडी खंडों में ट्राइक्रोम अभिरंजन द्वारा पाई गई संख्या के अनुसार$SMA-सकारात्मक परतों के गाढ़ा होने और बढ़ते कोलेजन निक्षेपकोन के तथा सक्रिय CD अनुभागों में त्रिवर्णी अभिरंजन द्वारा पाए गए प्रेरण को चिह्नित कियाहै। हमने पश्चिमी दाग विश्लेषण भी किया और सक्रिय सीडी नमूनों में $SMA अभिव्यक्ति को शामिल करने की पुष्टि की (चित्र 2ठ) . इसके अतिरिक्त, हमने फाइब्रोसिस मार्कर के महत्वपूर्ण प्रेरण का अवलोकन किया, जिसमें एसएमए, कोल1 शामिल हैं, जैसा कि ुपीसीआर विश्लेषण द्वारा पता लगाया गया है (चित्र 2ब्)।

इसके बाद, TNBS फाइब्रोसिस को सीमित करने के लिए एक तंत्र निर्धारित करने के लिए हमने rapamycin के प्रभाव का मूल्यांकन किया, mTOR गतिविधि के एक औषधीय अवरोधक15,16. तदनुसार, हमने चूहों के साथ टीएनबी और रैपामाइसिन दोनों का उपचार किया और बृहदान्त्र ऊतक विज्ञान में एसएमए और कोलेजन स्तर का विश्लेषण किया और डेन्सिटोमेट्री प्लॉट में एसएमए और कोलेजन की मात्रात्मक माप दिखाई है (चित्र 3ए)। हमारे डेटा से पता चलता है कि rapamycin submucosal परत में $SMA-सकारात्मक दाग कम कर देता है और कोलेजन जमा कम करता है. फाइब्रोटिक अनुक्रियाओं को और अधिक मान्य और परिमाणित करने के लिए, हमने यह निर्धारित किया है कि हमने ुपीसीआर द्वारा $SMA, कोलेजन और टीजीएफ- व्यंजकों को और TNBS-उपचारित बृहदान्त्रमेंप्रवाह साइटोमेट्री द्वारा $SMA व्यंजक ोंका ंह किया है । हम भी Cx3Cr1+ मोनोन्यूक्लियर phagocytes चोट9के लिए एक भड़काऊ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरित दिखाया है. इस प्रकार, हम देखना चाहते थे कि क्या TNBS-उपचार चूहों में rapamycin का प्रशासन भड़काऊ और फाइब्रोटिक प्रभाव रिवर्स कर सकता है. अतः हम चुंबकीय सूक्ष्म-बीजों का उपयोग करके कोलनिक एकल कोशिका निलंबन से कक3ब्1़़ निवासी मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स को शुद्ध करते हैं । हमने पाया कि Cx3Cr1 में p-p70 और p-S6 का स्तरबढ़ गया है + निवासी मोनोन्यूक्लियर फैगोसाइट्स द्वारा पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा TNBS-उपचारित चूहों, और इस स्तर rapamycin द्वारा अवरुद्ध किया गया था ( चित्र3ई). इसके अतिरिक्त, हमने पाया कि रैपामाइसिन उपचार टीएनबीएस-उपचारित समूह में आईएल-23 और आईएल-1 को कम कर देता है (चित्र 3च)। इसके अलावा, ये निष्कर्ष टीएनबीएस-फाइब्रोसिस के प्रेरण में शामिल प्रभावी तंत्र को स्पष्ट करते हैं और यह दिखाया गया है कि रैपामाइसिन फाइब्रोसिस के प्रेरण को कम करता है।

Figure 1
चित्रा 1: सफल TNBS प्रशासन चूहों में आंत्र फाइब्रोसिस के विकास की ओर जाता है. जंगलीप्रकार चूहों को दिया साप्ताहिक TNBS उपचार के एक Schematic आरेख प्रतिनिधित्व. बी बृहदान्त्र छवियों और TNBS से बृहदान्त्र लंबाई की माप का इलाज चूहों, सप्ताह पर काटा 0, 2, 4, और 6 के बाद TNSB उपचार. सी-डी. कोलेजन के लिए मायोफीब्रोब्लास्ट्स और ट्राइक्रोम ब्लू धुंधला के सक्रियण के लिए एंटी-एसएमए एंटीबॉडी के साथ सना हुआ बृहदान्त्र वर्गों का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण; स्केल बार 100 डिग्री मी. एफएसीएस विश्लेषण बृहदान्त्र और $SMA-सकारात्मक कोशिकाओं के परिमाणीकरण में $SMA-सकारात्मक कोशिकाओं की पहचान करने के लिए। एफ Fibrotic मार्करों और cytokines QPCR द्वारा पता चला. TNBS के बृहदान्त्र lysate से $SMA के जी पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का इलाज किया और चूहों को नियंत्रित. इस संशोधित आंकड़े को पिछले प्रकाशन9 की अनुमति से म्यूकोसल इम्यूनोलॉजी, 2019 में माथुर एट अल द्वारा पुन: उपयोग किया जा रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: TNBS फाइब्रोसिस क्रोहन-संबद्ध आंत्र फाइब्रोसिस के बराबर है। ए नियंत्रण के बृहदान्त्र बायोप्सी के प्रतिनिधि छवियों, सक्रिय सीडी trichrome नीले धुंधला की एक महत्वपूर्ण वृद्धि दिखा रहा है और submucosal परतों में $SMA सकारात्मक दाग, पैमाने बार 50 m. बी. $SMA अभिव्यक्ति और परिमाणीकरण के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण. फाइब्रोटिक मार्कर और साइटोकिन्स का सी क्यूपीसीआर विश्लेषण। इस संशोधित आंकड़े को पिछले प्रकाशन9 की अनुमति से म्यूकोसल इम्यूनोलॉजी, 2019 में माथुर एट अल द्वारा पुन: उपयोग किया जा रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: Rapamycin उपचार प्रभावी ढंग से TNBS प्रेरित फाइब्रोसिस सुधार. A. Colon हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण - एंटी-एसएमए एंटीबॉडी और ट्राइक्रोम ब्लू के साथ कोलेजन धुंधला के साथ मायोफिब्रोब्लास्ट के प्रतिनिधि छवियों, स्केल बार 100 [m. B. $SMA, कोलेजन और TGF] अभिव्यक्ति के नियंत्रण में TNBS इलाज माउस बृहदान्त्रs. C. नियंत्रण/TNBS के साथ इलाज माउस बृहदान्त्र से एकल सेल निलंबन में $SMA का FACS विश्लेषण. D. Cx3Cr1 की शुद्धि के लिए Schematic+ कोलोनिक lamina प्रोपरिया अंश और शुद्ध कोशिकाओं के FACS विश्लेषण से कोशिकाओं. ई. p-p70 और p-S6 स्तर शुद्ध Cx3Cr1 में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण + TNBS और / शुद्ध Cx3Cr1+ मोनोन्यूक्लियर phagocytes, जो आईएल-23 और आईएल-1 का उत्पादन में अभिव्यक्ति का F. PCR विश्लेषण। इस संशोधित आंकड़े को पिछले प्रकाशन9 की अनुमति से म्यूकोसल इम्यूनोलॉजी, 2019 में माथुर एट अल द्वारा पुन: उपयोग किया जा रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

घाव भरने या ऊतक की मरम्मत एक कसकर विनियमित जैविक प्रक्रिया17है . एक रासायनिक, यांत्रिक और संक्रमण की स्थिति के साथ ऊतक चोट के दौरान, एक सूजन प्रतिक्रिया ऊतक की मरम्मत की प्रक्रिया से चलाता है। हालांकि, एक disregulated और रोग भड़काऊ प्रतिक्रिया scarring या एक फाइब्रोटिक प्रतिक्रिया विकसित करने के लिए होता है, जो ऊतक की मरम्मत समारोह9,18,19ख़राब कर सकता है . यहाँ, हम TNBS प्रेरित फाइब्रोसिस पशु मॉडल है, जो काफी मानव Crohn रोग के साथ pathophysiology शेयरों के लिए प्रक्रिया दिखा. माउस उपकला को नुकसान पहुंचाने के लिए टीएनबीएस रासायनिक जोखिम का क्रमिक टीका गहरे अल्सर का कारण बनता है और फाइब्रोसिस विकास को प्रेरित करता है। एक विश्वसनीय, कम लागत, और रोग शुरुआत के तेजी से प्रेरण के साथ, इस विधि व्यापक रूप से ऊतक चोट, transmural सूजन और आंत मस्तिष्क अक्ष के लिए अध्ययन में शामिल कई अनुसंधान समूहों द्वारा स्वीकार किया जाता है.

सफलतापूर्वक TNBS फाइब्रोसिस मॉडल को लागू करने के लिए, वहाँ कई आवश्यक कदम हैं. उदाहरण के लिए, पर्याप्त खुराक और TNBS प्रशासन के समय बहुत महत्वपूर्ण हैं. एक 6-8 सप्ताह TNBS टीका गहरी ऊतक अल्सर की अनुमति देता है और अत्यधिक पुरानी फाइब्रोटिक अध्ययन के लिए सिफारिश की है. चूहों से मल बाहर निकलने और टीका TNBS के प्रतिगामी पलटा दो प्रमुख समस्याएं हैं, जो चूहों को चर खुराक के वितरण में परिणाम हो सकता है. चूहों मलाशय के पास कोमल दबाव TNBS प्रशासन से पहले मल जारी करने में मदद कर सकते हैं. नाटकीय रूप से TNBS के रिवर्स भाटा को रोकने में मदद करता है कुछ सेकंड के लिए नीचे जानवर के सिर पकड़े. एक पिंजरे में चूहों रखते हुए, एक गर्मी पैड पर पिंजरे रखने, और नापा अमृत के साथ चूहों प्रदान भी उच्च मृत्यु दर को रोकने में उपयोगी रणनीति हो सकती है.

यहाँ, हम भी TNBS फाइब्रोसिस और फाइब्रोटिक प्रतिक्रिया पर उनके प्रभाव के दौरान आंत सूजन पर चर्चा. आंतों के घर में और आईबीडी रोगजनन20,21में मोटे तौर पर जांच की गई है । हमने पहचान की है कि MTOR/autophagy संकेतन आईएल-23 से समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को मॉड्युलेट करने के लिए महत्वपूर्ण है और IL1 से IL1 ] cytokines Cx3Cr1से + मोनोन्यूक्लियर phagocytes कि समर्थक फाइब्रोटिक आईएल-23/IL-22 अक्ष को प्रभावित(चित्र 3ए)9 . इस प्रकार, इम्यूनोप्रोफाइलिंग और जीन अभिव्यक्ति के लिए एकल Cx3Cr1+ मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को शुद्ध करना मॉडल का एक महत्वपूर्ण कदम है। हम विस्तार से lamina propria अलग करने के लिए प्रोटोकॉल पर चर्चा और Cx3Cr1 के लिए शुद्धि प्रक्रिया प्रदान+ mononuclear कोशिकाओं चुंबकीय मोती का उपयोग कर.

सामूहिक रूप से, क्रोहन रोग के लिए आनुवंशिक और सहज मॉडल की उपस्थिति के बावजूद, TNBS-कोलाइटिस सीडी के इम्यूनो-रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बना हुआ है और क्रोहन फाइब्रोसिस उपचार का मूल्यांकन करने की क्षमता है। ऐसे TNBS के रूप में रासायनिक प्रेरित फाइब्रोसिस मॉडल का उपयोग करने की प्रमुख सीमा उपयोगकर्ता के लिए उपयोगकर्ता से उच्च परिवर्तनशीलता का मौका है और डेटा में outliers की संभावना है. अधिक से अधिक उपयोगकर्ता अनुभव के साथ समूह प्रति 5-8 जानवरों का एक नमूना आकार मॉडल की स्थिरता बढ़ा सकते हैं. हालांकि, सहज Crohn फाइब्रोसिस के कारण एक उपयुक्त आनुवंशिक मॉडल खोजने है और हमेशा warranted किया जाएगा.

Disclosures

प्रतिस्पर्धी हितों: लेखक कोई प्रतिस्पर्धा हितों की घोषणा.

Acknowledgments

यह काम NIH अनुदान R01NS093045 (Y.H.), NIH अनुदान K08DK088950 (X.$), R03DK099566 (X.$), और क्रोहन और कोलिटिस फाउंडेशन ऑफ अमेरिका रिसर्च फैलोशिप (CCFA) 481637 (R.M.) द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 e-bioscience 53-9760-82
Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 e-bioscience 149760-80
Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 Biolegend Inc 101226
Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 Biolegend 149006
Anti-mouse purified CD16/32 Fc block Biolegend Inc 14-9760-80
Anti-PE MicroBeads Miltenyi 130-105-639
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody e-bioscience 7074
Bovine Serum Albumin InvivoGen tlrl-isdn
Collagenase type IV Roche 1088866001
DAPI SIGMA D9542
DMEM Corning 10013-CV
DNase I from bovine pancreas Roche D263-5vl
Falcon® 40µm Cell Strainer Corning 352340
Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit BD Bioscience 555028
FlowJo FlowJo LLC www.flowjo.com
Glycogen Roche 10901393001
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate e-bioscience 5018
Graphpad Prism 7 GraphPad Software Inc www.graphpad.com
H&E kit American Mastertech Kit HXMMHPT
Image J NIH www.imagej.nih.gov/ij/
Mouse: C57BL/6J Jackson Laboratories 664
MS Columns Miltenyi 130-042-201
Percol GE Healthcare 17-0891-01
PMA/Ionomycin salt Sigma P8139
PowerUp SYBR Green Master Mix Thermofisher A25777
Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 Cell signaling 5174
Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 Cell signaling 2708
Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 Cell signaling 9208
Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E Cell signaling 4858
Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein Cell signaling 2217
Rapamycin LC LABORATORIES 1003799
TNBS Sigma 92823
Trichorme staining kit American Mastertech Kit STOSTBPT
TRIzol Life technologies 15596018
Verso cDNA Synthesis Kit Thermofisher AB1453B
Zen black 2.1 Carl Zeiss www.zeis.com
Zen blue lite 2.3 Carl Zeiss www.zeis.com

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References

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Mathur, R., Alam, M. M., Zhao, X. F., Huang, Y., Zhu, X. Mechanistic Insight into the Development of TNBS-Mediated Intestinal Fibrosis and Evaluating the Inhibitory Effects of Rapamycin. J. Vis. Exp. (151), e60067, doi:10.3791/60067 (2019).

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