Summary
Bu protokol, lazer kesim nörovasküler implantlar kullanılarak kanla temas eden cihazların kapsamlı bir hemouyumluluk değerlendirmesini açıklamaktadır. Taze, heparinize insan kanı ile bir akış döngüsü modeli kan akışını taklit etmek için uygulanır. Perfüzyon sonrası çeşitli hematolojik belirteçler analiz edilir ve test edilen cihazların hemokompatibilite değerlendirmesi için kan alındıktan sonra doğrudan elde edilen değerlerle karşılaştırılır.
Abstract
Tıbbi cihazların (örneğin, vasküler greftler, stentler ve kardiyak kateterler) vücudun dolaşım sisteminde kalan geçici veya kalıcı amaçlarla giderek artan kullanımı, bu cihazların neden olduğu olası hematolojik komplikasyonları (örn. kan bileşenlerinin aktivasyonu ve imhası) değerlendiren güvenilir ve multiparametrik bir yaklaşım gerektirir. Kanla temas eden implantların kapsamlı in vitro hemouyumluluk testi, invivo uygulamada başarılı olması nın ilk adımıdır. Bu nedenle, Klinik uygulama öncesinde Uluslararası Standardizasyon Örgütü 10993-4 'e (ISO 10993-4) göre kapsamlı analiz zorunludur. Sunulan akış döngüsü stentlerin hemostatik performansını analiz etmek için hassas bir modeli açıklar (bu durumda, nörovasküler) ve yan etkileri ortaya. Taze insan tam kan ve nazik kan örnekleme kullanımı kan preaktivasyonu önlemek için gereklidir. Kan, test numunesini içeren heparinize bir tüp ile 37 °C'de 150 mL/dk hızda 60 dakika peristaltik pompa kullanılarak geçirilir. Perfüzyon öncesi ve sonrası hematolojik belirteçler (örn. lökositlerin aktivasyonunu gösteren kan hücre sayısı, hemoglobin, hematokrit ve plazmatik belirteçler (polimorfonükleer [PMN]-elastaz), trombositler (β-tromboglobulin [β-TG]), koagülasyon sistemi (thombin-antitrombin III [TAT]) ve ardan ardeksi (SC5b-9) olarak analiz edilir. Sonuç olarak, klinik uygulama öncesinde stentlerin ve diğer kanla temas eden cihazların kapsamlı hemouyumluluk testi için gerekli ve güvenilir bir model salıyoruz.
Introduction
İmplantların ve biyomalzemelerin insan kanıyla etkileşime giren in vivo uygulaması, hemostatik sistemin çeşitli belirteçlerinin araştırılmasına odaklanan yoğun klinik öncesi testler gerektirir. Uluslararası Standardizasyon Örgütü 10993-4 (ISO 10993-4) kanla temas eden cihazların (yani stent ve vasküler greftlerin) değerlendirilmesi için temel ilkeleri belirtir ve cihaz tasarımını, klinik yararını ve gerekli malzemeleri1olarak değerlendirir.
İnsan kanı, lökositler (beyaz kan hücreleri [WBCs]), eritrositler (kırmızı kan hücreleri [RBCs]) ve trombositler gibi çeşitli plazma proteinlerive hücreleri içeren bir sıvıdır. Kan ile yabancı maddelerin doğrudan temas yan etkilere neden olabilir, bağışıklık veya koagülasyon sisteminin aktivasyonu gibi, hangi inflamasyon veya trombotik komplikasyonlara yol açabilir ve implantasyon sonrası ciddi sorunlara yol açabilir3,4,5. Bunedenle, in vitro hemouyumluluk doğrulama yabancı bir yüzey ile kan teması üzerine indüklenen olabilir herhangi bir hematolojik komplikasyonları tespit etmek ve dışlamak için implantasyon öncesinde bir fırsat sunuyor6.
Sunulan akış döngüsü modeli beyin akış koşulları ve arter çapları taklit etmek için tüp (3.2 mm çapı) 150 mL /dk akış hızı uygulanarak nörovasküler stent ve benzeri cihazların hemouyumluluğunu değerlendirmek için kurulmuştur2,7. Optimal in vitro modeli için ihtiyaç yanı sıra, kan kaynağı güvenilir ve değişmemiş sonuçlar elde önemli bir faktördürbiyomalzemehemouyumluluğu analiz 8 . Toplanan kan, uzun süreli depolamanın neden olduğu değişiklikleri önlemek için örneklemeden hemen sonra kullanılmalıdır. Genel olarak, trombositlerin ön aktivasyonunu ve kan çekimi sırasında pıhtılaşmayı en aza indirmek için 21 G iğne kullanarak durağan olmadan hafif bir kan toplanması yapılmalıdır. Ayrıca, donör dışlama kriterleri sigara içenler, hamile olanlar, sağlık kötü durumda, ya da önceki 14 gün boyunca oral kontraseptif veya ağrı kesici almış olanlar içerir.
Bu çalışmada, akış koşullarında stent implantlarının kapsamlı hemokompatibilite testi için in vitro bir model açıklanmaktadır. Fibrin-heparin kaplı stentler ile kaplamasız karşılaştırırken, kapsamlı hemouyumluluk testlerinin sonuçları fibrin-heparin kaplı stentlerin geliştirilmiş hemouyumluluğunu yansıtır9. Buna karşılık, kaplamasız stentler koagülasyon kaskad aktivasyonu neden, thombin-antitrombin III bir artış ve stent yüzeyine trombosit yapışması nedeniyle kan trombosit numaraları kaybı gösterildiği gibi. Genel olarak, bu hemouyumluluk modelinin klinik öncesi bir test olarak entegre edilmesi, cihazın neden olduğu hemostatik sistem üzerindeki herhangi bir yan etkiyi saptamak için önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kan örnekleme prosedürü Tuebingen Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (proje tanımlama kodu: 270/2010BO1). Tüm konular katılımdan önce dahil edilmesi için yazılı, bilgilendirilmiş onay verilir.
1. Heparin yüklü Monovettes hazırlanması
- Seyreltilmemiş heparini (5.000 IU/mL) sodyum klorürle karıştırın (NaCl, %0.9) 15 IU/mL heparin konsantrasyonu ile bir çözelti hazırlayın.
- Kan örneklemesi sonrası 1,5 IU/mL son heparin konsantrasyonu elde etmek için her nötr monovette (9 mL) seyreltilmiş heparin çözeltisinin 900 μL'sini ekleyin. Donör başına üç monovet ve üç yedek monovette hazırlayın ve heparin yüklü monovetteleri kan örneği alınana kadar 4 °C'de saklayın.
2. Kan Örneklemesi
- Kan örneklemeden 30 dakika önce heparin yüklü monovetteleri buzdolabından çıkarın.
- Akış döngüsü için venipuncture tarafından her sağlıklı donör (n = 5) bir 27 mL kan örneği toplamak. Sadece trombositlerin erken aktivasyonu ve kan pıhtılaşma kaskad önlemek için pürüzsüz bir turnike uygulayın.
- 900 μL heparin çözeltisi (1,5 IU/mL) içeren üç monovette kan örneği toplayın ve tüm bileşenlerin eşit olarak dağıtılmasını sağlamak için üç monovette'yi tek bir plastik kapta birleştirin.
- Birleştirilmiş heparinize kanı doğrudan EDTA (1.2 mL), sitrat (1.4 mL) veya sitrat, teofilin, adenozin ve dipiridamole (CTAD, 2.7 mL) içeren üç farklı monovette aktarın. Bölüm 5−8'de açıklandığı gibi örneklerle devam edin.
NOT: Etkilenmemiş pıhtılaşma davranışını garanti etmek için, bağışçılar son 14 gün içinde hemostaz etkileyen ilaçların (örn. asetilsalisilik asit, naproksen ve karbenicillin) yanı sıra oral kontraseptif ve sigara alımından kaçınmalıdır.
3. Akış Döngüsünün Hazırlanması
- 75 cm uzunluğunda ve iç çapı 3,2 mm olan üç heparin kaplı polivinil klorür tüpü kesin. Kontrol olarak bir küveti boş bırakmayı unutmayın.
- Tüpün bir ucunu %0,9 NaCl dolu bir rezervuara yerleştirin, tüpü pompa başına bağlayın ve diğer ucunu bir ölçüm silindirine takın.
- Ölçüm silindirindeki dolgu seviyesini kontrol ederken bir zamanlayıcı kullanarak 150 mL/dk akış hızı elde etmek için peristaltik pompanın ayarlarını ayarlayın.
4. Hemouyumluluk Testinin Performansı
- Tüpleri kanla doldurmak için 12 mL'lik bir şırınga kullanın. 6 mL'lik kanın numune veya boşaltılmış kontrol içeren her tüpe sorunsuz bir şekilde akmasına izin verin.
- Bir devre kurun ve 0,5 cm uzunluğunda silikon bağlantı borusu kullanarak tüpleri sıkıca kapatın. Tüpleri 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve perfüzyonu 60 dakika lığına başlatın.
5. Tam Kan Sayımı Analizi
- Örneklemeden sonra (bazal) veya perfüzyondan sonra EDTA içeren bir monovette 1,2 mL kan koyun ve tüpü dikkatlice 5kat ters çevirin.
- Monovette'yi kan analizörüne yerleştirin ve her örnek için kan sayımı analizi yapın. Daha sonra, bölüm 7'de açıklandığı gibi, daha fazla analiz için kan sayımı ölçümünden sonra 15−60 dk buz üzerindeki monovetteleri kuluçkaya yatırın.
6. Sitrat Plazma koleksiyonu
- Sitrat içeren monovetleri 1,4 mL kanla doldurun (taze çekilmiş veya dolaşımdan sonra) ve 5x'i dikkatlice ters çevirin.
- Tüpleri oda sıcaklığında 18 000 x g'da (RT) 18 dk santrifüj edin. Aliquot plazma fraksiyonundan üç 250 μL numuneyi 1,5 mL reaksiyon tüpüne dönüştürün ve plazma örneklerini sıvı nitrojenle dondurun. Analiz edilene kadar -20 °C'de saklayın.
7. EDTA Plazma Koleksiyonu
- Kan sayımı ölçümünden sonra monovetteleri 15−60 dk boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Daha sonra tüpleri 2500 x g ve 4 °C'de 20 dk santrifüj edin.
- Aliquot üç 250 μL plazma fraksiyonu örnekleri 1.5 mL reaksiyon tüpleri içine santrifüj sonra ve sıvı azot tüpleri dondurma. Analiz edilene kadar -80 °C'de saklayın.
8. CTAD Plazma Koleksiyonu
- CTAD karışımını içeren monovetleri 2,7 mL kanla doldurun (taze çekilmiş veya kuluçka sonrası) ve dikkatlice 5x ters çevirin. Daha sonra, 15−60 dakika boyunca buz üzerinde monovettes kuluçka. Daha sonra tüpleri 2500 x g ve 4 °C'de 20 dk santrifüj edin.
- Orta plazma fraksiyonunun 700 μL'sini 1,5 mL'lik bir reaksiyon tüpüne aktarın ve 20 dk boyunca dolu reaksiyon tüplerini 2.500 x g ve 4 °C'de santrifüj edin.
- Aliquot santrifüj sonra 1.5 mL reaksiyon tüpleri içine orta fraksiyonun iki 100 μL örnekleri ve sıvı azot tüpleri dondurmak. Analiz edilene kadar -20 °C'de saklayın.
NOT: Çalışma koşulları aynı olduğundan EDTA plazma ve CTAD plazmasının toplanması birlikte yapılabilir.
9. Sitrat Plazmasından İnsan TAT Ölçümü
- Sitrat plazmasını 37 °C'lik bir su banyosunda eritin.
- TAT enzime bağlı İmmünosorbent (ELISA) kitini üreticinin talimatlarına göre kullanın. Plazma standartlarını yeniden inşa edin ve yıkama solüsyonunu, anti-insan-TAT peroksidazını (POD) konjuge antikorve kromojen solüsyonu kontrol edin ve seyreltin. Teste başlamadan önce tüm reaktifleri ve mikrotiter plakayı RT'de (15−25 °C) 30 dakika bekletin.
- Numune tamponunun 50°L'lik kısmı mikrotifplakanın her kuyusuna eklenir ve numune tamponunun (boş), plazma standardının, plazma kontrolünün ve seyreltilmemiş plazma numunesinin 50°L'sini kuyu plakasına ilaveler halinde ekleyin. Plakayı kapatın ve 37 °C'de 15 dakika boyunca hafif çetrenle titreyerek kuluçkaya yatın. Daha sonra, 300 μL yıkama çözeltisi ile plaka3x yıkayın.
- Her kuyuya POD konjuge anti-insan-TAT antikorlarından 100 μL ekleyin. Plakayı kapatın ve 37 °C'de 15 dakika boyunca hafif çetrenle titreyerek kuluçkaya yatın. Daha sonra, 300 μL yıkama çözeltisi ile plaka3x yıkayın.
- Her kuyuya yeni hazırlanmış kromojen çözeltisinin 100 00 000'ini ekleyin. Plakayı kapatın ve RT'de 30 dk kuluçkaya yatırın.
- Sızdırmazlık filmini çıkarın ve her kuyuya 100 μL stop çözeltisi ekleyin. 490−500 nm'de bir fotometre ile optik yoğunluğu (OD) okuyun. Standart eğri verilerini bir eğilim çizgisi olarak sığdırın ve numunelerin konsantrasyonu hesaplayın.
10. Sitrat Plazmasından PMN-elastaz ölçümü
- Sitrat plazmasını 37 °C'de bir su banyosunda eritin.
- Polimorfonükleer (PMN)-elastaz ELISA kitini üreticinin talimatlarına göre kullanın: kitin seyreltme tamponu kullanarak standart bir eğri hazırlamak için PMN-elastaz kontrolü ve PMN-elastaz standardını yeniden yapılandırın.
- Yıkama çözeltisini üreticinin açıklamasına göre seyreltin. Teste başlamadan önce tüm reaktifleri ve mikrotiter plakayı RT'de 30 dakika bekletin. Sitrat plazma örneklerini seyreltme tamponu ile 1:100'e seyreltin.
- Örnek arabelleği (boş), PMN-elastaz standart eğrisi (15.6−1.000 ng/ mL), PMN-elastaz kontrolleri (yüksek ve düşük konsantrasyonlar) ve seyreltilmiş plazma örneklerini kuyu plakasına kopyalar halinde 100 μL ekleyin. Plakayı kapatın ve RT'de 60 dk boyunca hafif çetrensal titreyerek kuluçkaya yatın. Daha sonra, 300 μL yıkama çözeltisi ile plaka4x yıkayın.
- Her kuyuya enzim konjuge antikor dan 150 μL ekleyin. Plakayı kapatın ve RT'de 60 dk boyunca hafif çetrensal titreyerek kuluçkaya yatın. Daha sonra, 300 μL yıkama çözeltisi ile plaka4x yıkayın.
- Her kuyuya 3,3,5,5'-tetrametilbenzidin (TMB)-substrat çözeltisinin 200 μL'sini ekleyin. Plakayı kapatın ve RT'de karanlıkta 20 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, conta filmini çıkarın ve her kuyuya 50 μL stop çözeltisi ekleyin.
- 450 nm'de bir fotometre ile OD'yi 630 nm'de referans okuma ile okuyun. Standart eğri verilerini bir eğilim çizgisi olarak sığdırın ve numunelerin konsantrasyonu hesaplayın.
11. EDTA Plazmadan Terminal Kompleman Kompleksi (TCC) Ölçümü
- EDTA plazmasını 37 °C'de bir su banyosunda eritin ve buzları çözdükten sonra buzüzerinde saklayın.
- Tamamlayıcı sc5b-9 ELISA kitiüreticinin talimatlarına göre kullanın: üreticinin protokolünde açıklandığı gibi yıkama çözeltisi seyreltin. Teste başlamadan önce tüm reaktifleri ve mikrotiter plakayı RT'de 30 dakika bekletin. KITin seyreltme tamponu ile EDTA plazma örneklerini 1:10'a kadar seyreltin.
- Yüzeyi yeniden sulamak için her kuyuya 300 μL yıkama çözeltisi ekleyin ve 2 dk sonra aspire edin. Numune arabelleği (boş), SC5b-9 standartları, SC5b-9 kontrolleri (yüksek ve düşük konsantrasyonlar) ve seyreltilmiş plazma örneklerini kuyu plakasına kopyalar halinde ekleyin.
- Plakayı kapatın ve RT'de 60 dk kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 300 μL yıkama çözeltisi ile plaka5x yıkayın.
- Her kuyuya enzim konjuge antikor 50 μL ekleyin. Plakayı kapatın ve RT'de 30 dk kuluçkaya yatırın. Daha sonra plakayı 300 μL yıkama çözeltisi ile 5x yıkayın.
- Her kuyuya 100 μL TMB-substrat çözeltisi ekleyin. Plakayı kapatın ve RT'de karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Sızdırmazlık filmini çıkarın ve her kuyuya 100 μL stop çözeltisi ekleyin. 450 nm'de fotometre ile OD'yi okuyun. Standart eğri verilerini bir eğilim çizgisi olarak sığdırın ve numunelerin konsantrasyonu hesaplayın.
12. CTAD Plazmadan β-tromboglobulin ölçümü
- CTAD plazmasını 37 °C'de bir su banyosunda eritin.
- Β-thromboglobulin (β-TG) ELISA kitini üreticinin talimatlarına göre kullanın: β-TG kontrolünü ve β-TG standardını yeniden yapılandırın ve distile H2O. Sağlanan fosfat tamponu kullanarak POD konjuge antikor'u yeniden yapılandırarak yıkama çözeltisini seyreltin. Teste başlamadan önce tüm reaktifleri ve mikrotiter plakayı RT'de 30 dakika bekletin.
- Standart eğriyi ve kontrolü üreticinin talimatlarına göre, sağlanan fosfat tamponu ile hazırlayın. CTAD plazma örneklerini 1:21'e seyreltin.
- 200 μL fosfat tamponu (boş), β-TG standartları, β-TG kontrolleri (yüksek ve düşük konsantrasyonlar) ve seyreltilmiş plazma örneklerini kuyu plakasına kopyalar halinde ekleyin. Plakayı kapatın ve RT'de 60 dk. Daha sonra 300 μL yıkama çözeltisi ile 5x yıkayın.
- Her kuyuya enzim konjuge antikor 200 μL ekleyin. Plakayı kapatın ve RT'de 60 dk. Daha sonra 300 μL yıkama çözeltisi ile 5x yıkayın.
- Her kuyuya 200 μL TMB-substrat çözeltisi ekleyin. Plakayı kapatın ve RT'de 5 dakika karanlıkta kuluçkaya yatırın. Sızdırmazlık filmini çıkarın ve her kuyuya 50 μL 1 M sülfürik asit (H2SO4)ekleyerek reaksiyonu durdurun.
- Plakayı 15−60 dk bekletin, ardından 450 nm'de fotometre ile OD okuyun. Standart eğri verilerini bir eğilim çizgisi olarak sığdırın ve numunelerin konsantrasyonu hesaplayın.
13. Taramalı Elektron Mikroskobu Için Numune Hazırlama
- İmplantı forseps kullanarak tüpten çıkarın ve implantı %0,9 NaCl çözeltisine 3kat batırarak kısa bir süre durulayın.
- Glutaraldehit çözeltisi içinde saklayın (fosfat tamponlu salinde %2 glutaraldehit [PBS-tampon olmadan Ca2+/Mg2+]) gece leyin 4 °C'de.
- Daha sonra, 10 dakika boyunca PBS-tampon implantlar inkübül. 10 dakika her biri için artan konsantrasyon ile etanol kuluçka örnekleri dehydrate: 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, ve 100%. Kurutulmuş numuneleri ileri analize kadar %100 etanolde saklayın.
- Elektron mikroskobu (SEM) taramadan hemen önce kurutma cihazının veya literatür10'un talimatlarına göre kritik nokta kurutma gerçekleştirin.
14. Taramalı Elektron Mikroskobu
- Kurutulmuş implantları tarama mikroskobu için bir numune taşıyıcısına takın ve örnekleri altın paladyum ile püskürtün.
- Püskürtülen implantları numune odasına tanıtın. Temsili yüzey ve hücre yapışması ile alanların 100, 500, 1.000 ve 2.500 kat büyütme fotoğraf çekmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kısaca özetlenebilir, insan tam kan heparin yüklü monovettes sonra toplandı ve hücre sayımları temel düzeylerini değerlendirmek için kullanılan yanı sıra plazmatik hemouyumluluk belirteçleri.
Daha sonra nörovasküler implant örneklerini içeren tüp dolduruldu ve kan peristaltik pompa kullanılarak 150 mL/dk ve 37 °C'de 60 dk boyunca perfüzyon yapıldı. Yine tüm gruplarda hücre sayısı analiz edildi ve plazma örnekleri ELISA analizleri için hazırlandı (Şekil 1). Kan hücrelerinin ve hematokrit gibi kan parametrelerinin niceliği, kan toplanmasından hemen sonra ve tüm numune tipleri ve kontrol için akış döngüsü modelinde perfüzyon sonrası yapıldı. WBC sayısı(Şekil 2A),RBC(Şekil 2B)veya hematokrit değerleri(Şekil 2C)ile ilgili herhangi bir değişiklik saptanmadı. Ancak, akış döngüsü modelinde kanın kuluçkaya yatması sonucunda, akış döngüsü sistemindeki kanın perfüzyonuna bağlı olan bazal değerlere göre hemoglobin düzeylerinde bir azalma saptanmıştır (Şekil 2D). Ayrıca kan perfüzyonuna bağlı trombosit sayılarında azalma gözlenmiştir. Ayrıca, bu etki, trombositlerin biyomateryale yapışmasını gösteren, kaplamasız bir stent bulunduğunda artmıştır. Bununla birlikte, fibrin-heparin kaplı stentin aksine, kaplanmamış stent kanla inkübe edildiğinde trombosit kaybının önemli ölçüde daha yüksek olduğu açıkça gösterilmiştir(Şekil 2E).
Perfüzyon sonrası test gruplarında hematolojik plazma belirteçlerinde olası değişiklikler araştırıldı ve taze çekilmiş kanın temel değerleri ile karşılaştırıldı. Pıhtılaşma sisteminin aktivasyon durumunu yansıtan TAT kompleks konsantrasyonu kan perfüzyonu nedeniyle hafif bir şekilde artmıştır(Şekil 3A). Çıplak metal stent grubunda ise, pıhtılaşma sisteminin derin bir aktivasyonu gösteren, TAT önemli bir artış tespit edildi. Fibrin-heparin kaplı stent pıhtılaşma sisteminin aktivasyonunu engelledi, çünkü TAT'da bir artış saptanmadı.
Perfüzyon, SC5b-9(Şekil 3B)ölçülerek belirlenen kompleman kaskadlarının aktivasyonunun artmasına yol açmıştır. Ancak, kaplamasız veya fibrin-heparin kaplı stentlerle kuluçka sc5b-9 konsantrasyonunu daha fazla artırmadı. Benzer sonuçlar, nötrofil granülositlerin pmn-elastaz konsantrasyonlarının nicelleştirilmesi ile aktivasyonu analiz edildiğinde elde edilmiştir(Şekil 3C).
Stent yüzeyinin görüntülenmesi SEM kullanılarak yapıldı. Kan kuluçkasonrası iki stent grubu arasındaki net farklar saptandı. Kaplamasız stentin yüzeyinde yoğun bir kan hücresi ve protein ağı bulunurken, fibrin-heparin kaplı stentin yüzeyinde protein veya hücre yapışması saptanmadı (Şekil 4).
Şekil 1: Köklü bir akış döngüsü modelinde stentlerin hemouyumluluk değerlendirmesine şematik genel bakış. Taze insan tam kan antikoagülasyon için heparin içeren kan tüpleri sağlıklı donörler toplanır. Her donör için, numune malzemesi ile önceden yüklenmiş boş bir tüp ve tüpler daha sonra taze kanla doldurulur ve 37 °C'de 150 mL/dk hızda 60 dakika boyunca akış döngüsünde kuluçkaya yatırılır. Kuluçkadan sonra, numune materyalleri olan ve içermeyen test tüpünden alınan plazma örnekleri özel bir ELISA kullanılarak hazırlanır ve analiz edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Akış döngüsü modelinde farklı stent implantlarının kuluçkadan önce ve sonra farklı hücre tipleri ve kan parametrelerinin analizi. Beyaz kan hücrelerinin belirlenmesi(A),kırmızı kan hücreleri (B), hematokrit (C), hemoglobin (D), trombosit(E)yapıldı. Veriler ortalama ± SEM (n = 5, p* < 0.5, p*** < 0.001) olarak görüntülenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Nörovasküler implantlar ile kuluçka öncesi ve sonrası trombosit veya bağışıklık sistemi aktivasyon belirteçlerinin belirlenmesi. Kan pıhtılaşmasının(A)aktivasyonu ,(B) kompleman sistemi (SC5b-9) ve (C) nötrofil (PMN-elastaz) belirteçleri ELISA kullanılarak ölçüldü. Analiz, akış döngüsü modelinde farklı stentlerle kuluçkaya yatan taze çekilmiş kan veya kandan alınan plazma örnekleri üzerinde yapıldı. Veriler ortalama ± SEM (n = 5, p* < 0.5) olarak görüntülenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kan ile kuluçka sonrası stentlerin elektron mikroskobik analizinin taranması. Kaplamasız stent malzemesi üzerinde kan plazma proteinleri ve trombositlerin toplanması gözlendi. Buna karşılık, fibrin-heparin kaplamalı stent malzemeleri yüzeydeki hücrelerin veya diğer kan bileşenlerinin yapışmasını göstermedi (500-, 1.000-ve 2.500 kat büyütme). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sunulan protokol, insan kan akışını taklit eden bir kesme akışı modelinde ISO 10993-4 uyarınca kanla temas eden implantların hemouyumluluk testi için kapsamlı ve güvenilir bir yöntemi tanımlar. Bu çalışma lazer kesim nörovasküler implantların test dayanmaktadır ama çeşitli örnekler ile yapılabilir. Sonuçlar, bu yöntemin kan hücresi sayısı, çeşitli hemokompatibilite belirteçlerinin yaygınlığı ve kan teması sonrası cihaz yüzeyinin mikroskobik görselleştirmesi gibi çeşitli parametrelerin geniş analizini sağladığını göstermektedir. Bu protokol kullanılarak, farklı cihazların hemouyumluluğu ile ilgili potansiyel farklılıklar tespit edilebilir.
In vitro hemouyumluluk değerlendirmeye alternatif olarak in vivo hayvan testi oluşur, hangi çeşitli dezavantajları ile ilişkili, yüksek değişkenlik ve doku yaralanması ezici kısa vadeli etkileri nedeniyle cihaza bağlı etkilerin bozulması gibi6.
In vitro hemouyumluluk testi için üç tip model mevcuttur: (1) statik kan kuluçka modelleri, (2) ajite kan kuluçka modelleri ve (3) kesme akışı modelleri. Statik model, cihazı doğrudan kanla kuluçkaya yatırarak trombojeniteyi belirlemek için basit ve hızlı bir yöntem sağlar, ancak sadece hemokomiyolomi11ile ilgili ilkel sonuçlara yol açar. Statik modellerin ana dezavantajlarını aşmak için (yani, kan hücrelerinin sedimantasyonu ve büyük hava temas yüzeyi), ajitasyon kan kuluçka modeli kullanılabilir, hangi implantlar içeren bir test odası kan ile doldurulur ve bir sallanan platform üzerinde kuluçka12. Ancak, bu model türleri, burada sunulan akış döngüsü gibi varolan kesme akışı modellerine kıyasla hala daha düşüktür. Bu modellerin özü vasküler insan kan akımı taklit edilebilir olmasıdır; böylece, implant ve kan hücreleri arasındaki gerçek etkileşimin yakın bir tasviri13görüntülenebilir. Akış döngüsü modeline ek olarak, Chandler döngüsü veya birkaç perfüzyon akış odası gibi modeller14,15,16vardır.
Chandler döngü kısmen hava ile dolu ve dönen bir cihaz içine kenetlenmiş kapalı bir tüp sistemi, tüp yoluyla kan dolaşımı ile sonuçlanan17. Mevcut akış döngü sisteminde, tüp tamamen kan ile doldurulur, ve akış peristaltik pompa kullanılarak zorlanır. Chandler döngü modelini kullanırken, operatörler test tüpüne hava dahil etme gereksinimi nedeniyle iki büyük dezavantajla karşı karşıya kalırlar. İlk olarak, kan ve havanın sürekli etkileşiminin lökosit ve trombositlerin yanı sıra protein denatürasyonunun toplanmasına yol açtığı bilinmektedir18,19. İkinci olarak, kan dolaşımı sınırlıdır, çünkü hava her zaman döngü20'ninen yüksek noktasında kalır.
Akış döngüsü sistemi kullanılarak bu sakıncalar aşılabilir. Sistemde hava-sıvı arabirimi bulunmadığından trombosit aktivasyonu gerçekleşmez. Böylece, model trombotik olaylar için düşük bir arka plana sahiptir, böylece antikoagülanların düşük konsantrasyonu, genellikle 1 IU/mL veya 1.5 IU/mL heparin, pıhtılaşmayı önlemek için yeterli, yüksek akış oranları uygulansa bile6. Ayarlanabilir pompa tarafından düzenlenmiş kan akış hızı ve serbestçe seçilebilir tüp çapı operatör bir damar veya arter fizyolojik koşulları taklit etmek için izin, hangi test edilecek implant karşılık gelir, ve ilgili test sonuçları elde21. Ancak, bu avantaj aynı zamanda bir sınırlama, pompa yoluyla kana uygulanan mekanik stres nedeniyle, ve eritrositlerin yıkımı (yani, hemolize) oluşabilir2. Bu ortaya çıkan içsel kan hasarı yöntem hassasiyetini azaltır ve kana uzun süreli maruz kalma engeller21. Bununla birlikte, çeşitli çalışmalar hemouyumluluk değerlendirme için akış döngüsü modelinin etkili kullanımını göstermiştir22,23,24.
Ancak, tüm in vitro modelleri ve in vivo mekanizmaları arasındaki ana boşluk sitokinler, anti-trombotik bileşenler ve yapışma molekülleri ifade eksik endotel içerir; bu nedenle, bu bileşen implant etkileşimi ve kan dolaşan önemli bir rol oynar25. Sonuç olarak, akış döngüsü modeli ayarlanabilir, verimli, güvenilir ve klinik kullanımdan önce implantların hemouyumluluğunu değerlendirmek için uygun maliyetlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Taramalı elektron mikroskobu performansı için, Üniversite Hastanesi Tuebingen Tıbbi Malzeme Bilimi ve Teknolojisi bölümünden Ernst Schweizer'a teşekkür ederiz. Araştırma, Ulusal Sürdürülebilirlik Programı II (Project BIOCEV-FAR LQ1604) kapsamında Cr'nin Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı ve Çek Bilim Vakfı'nın 18-01163S projesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | - | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | - | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | - | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | - | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | - | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | - |
References
- ISO. Biological evaluation of medical devices. , ISO 10993-4 (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W.
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- JoVE. SEM Imaging of Biological Samples. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019).
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, SI-1 Track-D 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around "air bubbles" in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
