Summary
Мы представляем куриную модель хориоаллантоической мембраны в качестве альтернативной, трансплантируемой модели in vivo для прививок гинекологических и урологических раковых клеток и опухолей, полученных пациентом.
Abstract
Мыши модели являются эталоном испытаний для исследования рака in vivo. Тем не менее, стоимость, время и этические соображения привели к призывам к альтернативным моделям рака in vivo. Модель куриной хориоаллантоической мембраны (CAM) обеспечивает недорогую, быструю альтернативу, которая позволяет прямую визуализацию развития опухоли и подходит для визуализации in vivo. Таким образом, мы стремились разработать оптимизированный протокол для привить гинекологических и урологических опухолей в эту модель, которую мы представляем здесь. Примерно через 7 дней послеоплодное, воздушная клетка перемещается в васкуляризованную сторону яйцеклетки, где отверстие создается в скорлупе. Опухоли из мурин и клеточных линий человека и первичных тканей могут быть привиты. Они, как правило, семенами в смеси внеклеточной матрицы и среды, чтобы избежать клеточного рассеивательства и обеспечить поддержку питательных веществ, пока клетки набирать сосудистой питания. Опухоли могут расти еще до 14 дней до вылупления яйцеклеток. Путем имплантации клеток, стабилизируемых светлячков ойлиферазой, биолюминесценция может быть использована для чувствительного обнаружения роста опухоли на мембране и раковой клетки распространяются по всему эмбриону. Эта модель потенциально может быть использована для изучения опухоли, вторжения, метастази и терапевтической эффективности. Модель chicken CAM требует значительно меньше времени и финансовых ресурсов по сравнению с традиционными моделями мурина. Поскольку яйца иммунокомпромиссны и невосприимчивы, ткани любого организма потенциально могут быть имплантированы без дорогостоящих трансгенных животных (например, мышей), необходимых для имплантации тканей человека. Тем не менее, многие из преимуществ этой модели потенциально могут быть ограничения, в том числе короткое время генерации опухоли и иммунокомпромисс / иммунный толерантный статус. Кроме того, хотя все типы опухолей, представленные здесь, прививаются в модели куриной хориоаллантоической мембраны, они делают это с различной степенью роста опухоли.
Introduction
Мыши служили классическим образцовым организмом для изучения заболеваний человека, в том числе злокачественных новообразований. Как млекопитающие, они имеют много общего с людьми. Их высокая степень генетического сходства позволила трансгенных манипуляций генома мыши, чтобы обеспечить огромное понимание генетического контроля заболеваний человека1. Обширный опыт в обработке и экспериментировать с мышами привел к тому, что они являются моделью выбора для биомедицинских исследований. Однако, в дополнение к этическим и научным проблемам, касающимся моделей мурин, они также могут быть довольно дорогостоящими и трудоемкими2,3. Развитие опухолей может занять недели или даже месяцы. Корпус в типичном учреждении в одиночку может работать в сотни до тысячи долларов в то время как опухоли развиваются. Рак яичников является примером этого недостатка, потому что его рост в моделях мурина может легко занять месяцы. Задержки в исследованиях прогресс потенциально влияние рака яичников пациентов постоянно низкий 5-летний показатель выживаемости только 47% (т.е., увеличение выживаемости только 10% в течение 30 лет)4. Аналогичным образом, урологические раковые заболевания (рак почек, простаты и мочевого пузыря) составляют 19% всех случаев рака в Соединенных Штатах и 11% случаев смерти, связанных с раком4. Таким образом, новый подход in vivo к изучению гинекологического и урологического рака может сэкономить лаборатории значительное время, труд и деньги, даже если эта модель применяется только для первоначальных экспериментов скрининга. Кроме того, в результате ускорения результатов исследований может значительно повлиять на 177000 лиц с диагнозом этих видов рака ежегодно.
Модель chicken CAM предлагает множество преимуществ, которые решают вышеупомянутые проблемы. Популярная модель для изучения ангиогенеза5,6, вторжение опухолевых клеток7,8,и метастазирование7,9, модель cam эмбриона цыпленка уже был использован для изучения многих форм рака, в том числе глиомы10,12,12, головы и шеи плоскоклеточной карциномы13,14, лейкемия15,16, рак от рака от утротротроя колоректальный рак18. Кроме того, CAM модели были созданы для нейробластомы19, Лимфома Буркитт20, меланома21, и кошачьей фибросаркомы22. Предыдущие исследования также представили прививки рака мочевого пузыря23 и рак предстательной железы клетоклиний 24, но с ограниченным и с ограниченным протоколом детали. Не только яйца гораздо дешевле, чем мыши, но они также производят высоко воспроизводимые результаты25,26. Они показывают быстрое развитие сосуды, и прививок опухоли может произойти в так быстро, как несколько дней и быть визуализированы продольно через открытое окно. С 21-дневный промежуток времени между оплодотворением яйцеклеток и штриховки, эксперименты могут быть завершены в течение нескольких недель. Кроме того, низкая стоимость, ограниченные потребности в жилье и небольшие размеры легко позволяют крупномасштабные эксперименты, которые были бы запретительными для изучения мышей.
Поэтому мы стремились оптимизировать модель CAM для прививок гинекологического и урологического рака. Из-за иммунокомпромиссного статуса раннего куриного эмбриона27,как мыши, так и человеческие клетки могут быть легко имплантированы. Таким образом, мы успешно привили рака яичников, почек, простаты и мочевого пузыря. Для каждого из этих типов опухоли, CAM легко принимает установленные линии морин и / или человеческих опухолевых клеток. Важно отметить, что свежесобранные первичные ткани опухоли человека могут также привить либо из переваренных клеток или кусочков твердой ткани с высоким уровнем успеха. Каждый из этих типов рака и источников клеток требует оптимизации, которую мы разделяем здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты, представленные в настоящем проекте, были рассмотрены и одобрены соответствующими этическими комитетами Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA). Использование деидентифицированных первичных опухолей человека было одобрено Советом ucla Institutional Review Board (Протокол номера 17-000037, 17-001169, и 11-001363). В Калифорнийском университете в Калифорнийском университете обзор Комитета по исследованиям животных не требуется для экспериментов с использованием куриных эмбрионов; протокол утверждения требуется только тогда, когда яйца будут вылупляются. Тем не менее, лучшие практики, такие как Руководящие принципы AVMA для эвтаназии животных, были использованы для обработки куриных эмбрионов этически и, чтобы избежать боли как можно больше. Исследователям настоятельно рекомендуется проверить требования надзора в их учреждении до начала исследований с использованием моделей CAM.
1. Приготовление яиц
- Перед получением яиц соберите и уравновесите яичный инкубатор до 37,8 градусов по Цельсию (100 градусов по Фаренгейту) с 60-70% влажности в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для минимизации рисков загрязнения, автоклавированная вода может быть использована для контроля влажности. - После получения оплодотворенной, Род-Айленд Красные куриные яйца от сертифицированного поставщика лабораторных яиц, сухие протрите поверхность скорлупы бумажными полотенцами. Слегка смоченное бумажное полотенце может быть использовано для удаления прилипчитого материала. Высушите немедленно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смачивание оболочки с жидкостью ниже 43,3 градуса по Цельсию может ввести бактерии в яйцо. Если высажено или дезинфицировать яйца, температура жидкости должна быть между 43,3-48,9 градусов по Цельсию. Более высокие температуры могут варить яйца. Выбор дезинфицирующего средства должен быть сделан на основе микроорганизмов, вызывающих озабоченность. - Используйте карандаш или маркер, чтобы пометить дату на яйцо. Это считается днем развития 0.
- Поместите яйца в яйцо инкубатор и инкубировать, по крайней мере 7 дней с вращением, чтобы позволить CAM развития. Автоматический ротатор может быть использован, или яйца могут быть повернуты 180 "2-3x в день.
2. Открытие яиц
ПРИМЕЧАНИЕ: Открытие яиц должно быть сделано, когда CAM полностью разработан. Это, как правило, на развитие день 7 или 8.
- Дезинфицировать шкаф биобезопасности с 70% этанола. Аналогичным образом дезинфицировать и место в биобезопасности шкаф яйцо стойку, яйцо свечи, маркер, беспроводной поворотный инструмент с кремния карбид шлифовальный камень и круговой резки колесо, 18 G иглы, трубчатый контроллер с четверть дюйма вакуумных труб, упаковка ленты, офис ножницы, изогнутые ножницы, semken (или аналогичные) щипцы, ватные шарики, и 6 х 7 см прозрачной пленки соусом. По возможности используйте стерильные, одноразовые или аутоклавированные инструменты.
- Выключите яичный ротатор. Поместите примерно 1-3 яйца в шкаф биобезопасности на яичной стойке. В то время как в темноте, поместите яйцо свечи против яичной скорлупы, чтобы определить воздушную ячейку. Отметьте местоположение воздушной ячейки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность освещения от яичного свечи имеет решающее значение для визуализации интерьера яйца. Если виолончельное элементосы или сосуды постоянно трудно увидеть, попробуйте заменить яйцо свечи батареи. - Переместите яйцо свечник над оболочкой, чтобы найти большую сеть кровеносных сосудов. При необходимости поверните яйцо. Идеальная сосуда будет ветвления вблизи середины яйца. Используйте маркер, чтобы нарисовать сваску, которая будет использоваться для имплантации.
- Включите свет в капюшоне. Используя беспроводной роторный инструмент, оснащенный кремниевым карбидным шлифовальным камнем, просверлите небольшое отверстие в оболочке непосредственно над центром воздушной ячейки. Просверлите до тех пор, пока большая часть оболочки не будет удалена, но белая внутренняя мембрана не повреждена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бурение над воздушной клеткой перед ориентацией на сосуд ы позволяет определить толщину этой конкретной яичной скорлупы над воздушной клеткой, а не над CAM и сосудами. Если CAM или сосуд ы нарушается, то яйцо не используется для имплантации. - Пробурите и откройте еще одно небольшое отверстие, где будет открыто сосудистое окно, как это было сделано для воздушной клетки (шаг 2.4).
- Используя 18 G иглу, аккуратно пробить через белый, внутреннюю мембрану над воздушной клеткой и сосуды. Если не удается проникнуть в оболочку, то тщательно просверлите немного больше. Убедитесь, что белая внутренняя мембрана (но не CAM) нарушается на протяжении всей пробуренной области. Удаление части мембраны не требуется.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если CAM или сосуд нарушается во время этого шага, отбросить яйцо. Повреждение очевидно, если есть кровь или альбумин утечки из пробуренного отверстия. - Выключите капот света. Используя яичный свечник, убедитесь, что воздушная ячейка была перенесена из конца яйца в область над сосудой. При необходимости поместите вакуумную трубку, вставленную в контроллер трубы вокруг отверстия над исходной воздушной ячейкой, и аккуратно нанесите всасывание короткими очередями для перемещения воздушной ячейки.
- Используйте маркер, чтобы наметить новое местоположение воздушной ячейки примерно 0,5 см внутри границы воздушного кама. Прикрепите кусок упаковочной ленты чуть более новой воздушной ячейки. При необходимости используйте стандартные офисные ножницы, чтобы обрезать ленту до соответствующего размера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лента может нарушить поток воздуха через оболочку и не должна быть больше, чем необходимо, чтобы полностью покрыть воздушную ячейку. - Вернуть яйца в инкубатор, чтобы согреться без вращения с новой воздушной ячейки вверх. Повторите шаги 2.2-2.9 для открытия оставшихся яиц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь. Если не уверены в качестве развития CAM, небольшое количество яиц должны пройти через шаг 2.16 до открытия оставшихся яиц. - Поместите примерно 1-3 яйца с перемещенными клетками воздуха на яичную стойку в шкафу для биобезопасности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует позаботиться о том, чтобы избежать загрязнения в открытом яйце. Поэтому всегда открывайте яйца внутри шкафа для биобезопасности и, когда это возможно, используйте стерильные инструменты и оборудование. - Используя беспроводной вращающийся инструмент, оснащенный круглым режущим колесом, вырежьте небольшую линию над границей воздушной ячейки, нарисованной в шаге 2.8. Убедитесь, что это примерно 0,5 см внутри фактической границы воздушного CAM, чтобы избежать нарушения CAM или сосуды. Вырезать полностью через оболочку, но будьте осторожны, чтобы не проникнуть достаточно глубоко, чтобы нарушить CAM или сосуды.
- Используя изогнутые ножницы, разрежьте оставшуюся воздушную ячейку, чтобы создать окно в оболочке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если кровь или мембрана присутствует на удаленной оболочке, то яйцо не подходит для имплантации. Если высокая доля яиц не чисто открыты, рассмотреть вопрос о ожидании по крайней мере 1 дополнительный день, чтобы открыть оставшиеся яйца, чтобы лучше CAM формирования. Если оболочки оставшихся яиц не были проколоты, вращение яиц в инкубаторе должно быть возобновлено. - Проверьте жизнеспособность эмбриона. Жизнеспособные эмбрионы будут отображать обширную сосуду, прозрачный альбумин, движение эмбриона или видимое сердцебиение.
- Используя щипточки Semken, вытащите маленькие кусочки хлопка из стерильного ватного шарика. Аккуратно профолите поверхность CAM, чтобы удалить оболочку пыли и мусора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление мусора должно быть выполнено в тот же день, когда яйца открыты. - Обложка оболочки открытия с одной четверти кусок 6 х 7 см прозрачной пленки соусом.
- Верните яйца в инкубатор. Убедитесь, что яйцо сидит надежно с открытым окном вверх и CAM не касаясь прозрачной заправки пленки. Используйте кусок яичной стойки, край яичного ротатора, или другой подходящий элемент для поддержки любых яиц, которые продолжают катиться.
- Повторите шаги 2.10-2.16 для всех оставшихся яиц, которые будут открыты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Открытие яйцеклеток не обязательно должно быть завершено в тот же день, что и имплантация. Ожидание по крайней мере 1 день может помочь устранить яйца, жизнеспособность которых была скомпрометирована, открыв скорлупу.
3. Подготовка суспензии раковых клеток к трансплантации (вариант 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть завершено непосредственно перед имплантацией, которая в идеале должна проходить между днями 7 и 10. Пожалуйста, ознакомьтесь с примечаниями в начале шага 5 или 6 для получения дополнительной информации о дате имплантации. Этот подход был использован для всех клеточных линий и культивированных переварок опухоли почки.
- Оттепель внеклеточного матричного раствора на льду.
- Используя механическое и/или ферментативное пищеварение, получите одноклеточное суспензию с помощью метода, подходящего для имплантированного типа клеток.
- Приостановить общее количество клеток, которые будут имплантированы в соответствующую среду для имплантации. Имплантаты 1-2 х 106 6 клеток на яйцо являются типичными.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда, используемая для имплантации клеточных линий, как правило, является полной средой, используемой для культивирования клеток, содержащей FBS или замену сыворотки. Имплантация опухолевых дайджестов обычно использует полную среду, используемую для культивирования клеточных линий одного и того же типа рака. Однако при необходимости в экспериментальном порядке могут быть внесены коррективы в среднюю формулировку. Влияние на развитие опухоли и рост необходимо эмпирически определить. - Пеллет клетки, используя скорость центрифуги и время, подходящее для используемых клеток. Типичные скорости 250-300 х г,а время 5-10 мин.
- Удалите супернатант из гранулированных клеток путем пипетки. Механически resuspend клетки в остаточной среде через щелкая или pipetting. Место на льду, чтобы охладиться. Измерьте объем ячеек и средних с помощью трубажа соответствующего размера.
- Рассчитайте объемы имплантации таким образом, что 1-2 х 106 клеток имплантируются в объеме 20-100 л на яйцо с окончательной внеклеточной матричной концентрацией 2,7-4 мг/мл белка. Добавьте средний, любые желаемые факторы роста или добавки, и внеклеточное матричного решения в соответствии с этим расчетом. Держите на льду до готовности к имплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчетов в шагах 3.3 и 3.6, дополнительный том по крайней мере половины яичного имплантата должны быть включены для обеспечения адекватного объема для всех яиц в группе. Для имплантации линий раковых клеток яичников (т.е. SKOV3 и ID8) было имплантировано 106 клеток на яйцо. Для имплантации линии клеток карциномы почек RENCA были имплантированы культивированные клетки, полученные из переваренной первичной карциномы почек человека, линии раковых клеток предстательной железы (т.е. CWR, CWR, C4-2 и MyC-CaP) и линии раковых клеток мочевого пузыря (т.е. HT-1376 и T24), 2 x 106 клеток.
4. Подготовка опухолевых частей для имплантации (вариант 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть завершено непосредственно перед имплантацией, которая в идеале должна проходить между днями 7 и 10. Пожалуйста, ознакомьтесь с примечаниями в начале шага 5 или 6 для получения дополнительной информации о дате имплантации. Первичный рак яичников и мочевого пузыря были имплантированы в виде опухолевых кусочков.
- Оттепель внеклеточного матричного раствора на льду. Разбавить до конечной концентрации белка 2,7-4 мг/мл в соответствующей среде, содержащей любые желаемые факторы роста или добавки. Продолжайте на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Имплантация опухолевых частей обычно использует полную среду, используемую для культивирования клеточных линий того же типа рака. Однако при необходимости экспериментально могут быть внесены коррективы в среднюю формулировку. Влияние на привлёки опухоли и рост должны быть эмпирически определены. - Использование скальпеля или ножниц, акцизных штук от свежей опухоли. Идеальные размеры варьируются от 2-5 мм с каждой стороны. Держите ткани погружены в среду до готовности к имплантации.
5. Имплантация с использованием антипригарного кольца (вариант 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть имплантированы, начиная с 7-го дня развития, если CAM полностью развит. Имплантация может произойти в любое время до вылупления, что позволяет достаточно времени для развития опухоли и желаемого эксперимента, но обратите внимание, что иммунные клетки эмбриона начинают присутствовать около дня 10 постферттилизации27. Темпы роста опухоли значительно различаются в зависимости от типа клеток и должны быть эмпирически определены для типа клеток интереса. Рак яичников и раковые клетки простаты были имплантированы с помощью антипригарного кольца метод. Обратите внимание, что, когда антипригарным кольцом не доступно, наконечник трубы может быть сокращен до аналогичного размера и используется.
- Используйте 70% этанола для дезинфекции шкафа биобезопасности и всех необходимых инструментов: яичная стойка, изогнутые щипцы радужной оболочки глаза, антипригарные кольца (1/4 дюйма внутреннего диаметра), стеклостер, соответствующий объем pipets и советы, 6 х 7 см прозрачная пленка соусом, офисные ножницы, и маркер или карандаш. По возможности следует использовать стерильные, одноразовые или аутоклавированные инструменты.
- Поместите яйца для имплантации на яйцестойкую стойку в шкаф для биобезопасности. Выберите управляемое количество яиц. Типично до шести лет. Избегайте позволяя яйца значительно остыть во время работы с ними.
- Удалите прозрачную пленку соусом из оболочки, прокатки края к открытому окну, чтобы избежать вытягивая куски оболочки. Убедитесь, что яйца являются жизнеспособными и здоровыми. Идеальные яйца будут иметь большой сосуд в центре открытой области с небольшими сосудами, разветвляющимися от него.
- Используя изогнутые щипцы радужной оболочки, поместите стерильное, антипригарным кольцом на CAM над сосудом, в идеале над точкой ветви. Используйте стерильный стеклянный стержень, чтобы мягко абрадировать CAM.
- Pipet подвески клетки от шага 3.6 в центр антипригарного кольца. Кроме того, используйте щипцы, чтобы поместить часть опухоли со ступени 4.2 в центр антипригарного кольца и покрыть 20-50 зл внеклеточного матричного раствора, генерируемого в шаге 4.1.
- Запечатайте отверстие одной четвертью прозрачной пленки 6 х 7 см. Пометьте яйца соответствующим обозначением имплантата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нумеринг яиц в группе облегчает продольные наблюдения. - Верните яйцо в инкубатор. Убедитесь, что отверстие оболочки сидит в вертикальном положении и что яйцо является безопасным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца могут быть возвращены в яичный инкубатор без вращения. Кроме того, высокая жизнеспособность постимплантов может быть получена с помощью инкубатора 37-38 градусов по Цельсию с деактивированным CO2 и гигрометром для мониторинга влажности, которая должна составить 50%-80%.
6. Имплантация без антипригарного кольца (вариант 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть имплантированы, начиная с 7-го дня развития, если CAM полностью развит. Имплантация может произойти в любое время до вылупления, что позволяет достаточно времени для развития опухоли и желаемого эксперимента, но обратите внимание, что иммунные клетки эмбриона начинают присутствовать около дня 10 постферттилизации27. Этот метод был использован для имплантации клеток карциномы почек и раковых клеток мочевого пузыря.
- Используйте 70% этанола для дезинфекции шкафа биобезопасности и всех необходимых инструментов: соответствующего объема pipets и советы, стерильные 10-см ткани культуры блюда, яичная стойка, 6 х 7 см прозрачной пленки соусом, офисные ножницы, и маркер.
- Привить прививочный объем клеточной подвески, генерируемой в шаге 3.6 в подходящий типный наконечник трубача (200 Л. Удерживая верхнюю часть кончика, аккуратно выбрасывайте кончик трубы и поместите горизонтально в стерильное, 10-сантиметровое блюдо культуры ткани.
- Повторите шаг 6.2 для всех образцов в группе с одним блюдом для каждой группы.
- Поместите советы в инкубатор 37 градусов по Цельсию в течение 15-30 мин, чтобы внеклеточная матрица частично полимеризировалась.
- После 15 мин инкубации, начать проверку на полимеризацию. Небольшое количество жидкости обычно вытекает из кончика при размещении на блюдо. Полимеризация этой жидкости может быть использована для оценки степени полимеризации жидкости в наконечнике.
- Поместите яйца, которые будут имплантированы на яйцеклетки стойку в шкаф биобезопасности. Выберите управляемое количество яиц. Типично до шести лет. Избегайте позволяя яйца значительно остыть во время работы с ними.
- Удалите прозрачную пленку соусом из оболочки, прокатки края к открытому окну. Это позволяет избежать вытягивания кусочков оболочки.
- Убедитесь, что яйца являются жизнеспособными и здоровыми. Идеальные яйца будут иметь большой сосуд в центре открытой области с небольшими сосудами, разветвляющимися от него.
- Поместите один наконечник трубы на соответствующий размер пайпета. Угнетаете поршень, чтобы заставить частично полимеризованную подвеску клеток на CAM над большим, хорошо развитым сосудом, в идеале над точкой ветки.
- Запечатайте отверстие одной четвертью прозрачной пленки 6 х 7 см.
- Пометьте яйцо соответствующим обозначением имплантата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нумеринг яиц в группе облегчает продольные наблюдения. - Верните яйцо в инкубатор. Убедитесь, что отверстие оболочки сидит в вертикальном положении и что яйцо является безопасным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца могут быть возвращены в специализированный инкубатор без вращения. Кроме того, высокая жизнеспособность постимплантов может быть получена с помощью инкубатора 37-38 градусов по Цельсию с деактивированным CO2 и гигрометром для мониторинга влажности, которая должна составить 50%-80%.
7. Биолюминесценция изображения светлячок luciferase отмеченных опухолей
ПРИМЕЧАНИЕ: Если имплантированные клетки были стабилизированы с геном, кодируя светлячок люциферазы или другие факторы изображения, то в результате опухоли могут быть визуализированы с помощью биолюминесценции изображений. Флуоресценция изображения не рекомендуется на нетронутых яиц из-за высокого фона из яичной скорлупы. Это анализ конечной точки, так как открытие оболочки резко снижает выживаемость. Опухоли могут быть изображены в любое время, которое подходит для экспериментальных потребностей и скорость роста опухоли. Однако, в среднем, яйца люк 21 дней послеоплодизации. Таким образом, день развития 18 является подходящей точкой, чтобы избежать нежелательных штриховок.
- При необходимости транспортировать яйца в оборудование для визуализации. Залито яйца на 10-сантиметровые ткани культуры блюда. Верните их в яичный инкубатор 37.8 градуса по Цельсию (100 градусов по Фаренгейту) с механизмом вращения, удаленным или деактивированным. Влажность не имеет решающего значение для транспорта и визуализации.
- Используя изогнутые щипчинки радужной оболочки, осторожно нажмите CAM от оболочки, пока CAM заподлицо с альбумином и эмбрионом. Используя широко опрокинутые щипкания образца, оторвайте части оболочки, чтобы расширить отверстие оболочки адекватно для визуализации опухоли.
- Вводят в яичный альбумин не менее 50 л 30 мг/мл D-люциферина. Аналогичный объем D-люциферина также может быть пипнетвечен в антипригарным кольцом или на поверхность CAM в области, содержащей имплантированные клетки. Это обеспечивает оптимальную биолюминесценцию при отсутствии идеального сосудистого питания. Инкубировать в течение 8 мин.
- Введите 20-50 л изофлюран в альбумин яйца, чтобы обезопадать яйцо. Инкубировать еще 2 мин. Кроме того, яйцо может быть помещено в индукционную камеру, содержащую 2-2,5% испаряется изофлуран. При прекращении эмбрионального движения получена достаточная глубина анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большие объемы изофлуран (100 л) могут быть использованы для эвтаназии яйца. - Поместите яйца в устройство биолюминесценции и изображение с использованием соответствующих настроек, как это определено инструкциями производителя. Для этого исследования использовалось время экспозиции в 1 мин.
- Чтобы сизображение мейк-кии и эмбриона, откройте яйцо в 10-сантиметровую ткань культуры блюдо.
- Возьмите яйцо пальцами обеих рук на нижней стороне яйца всередине яйца и большие пальцы по обе стороны от открытия скорлупы.
- Аккуратно потяните друг от друга две половинки яйца с большими пальцами, а осторожно нажав на яйцо пальцами.
- Когда оболочка примерно наполовину отделена от CAM и эмбриона, переверните яйцо вверх дном над 10-сантиметровой культурой.
- Продолжайте отделять половинки оболочки. Если CAM прилипает к внутренней части оболочки, осторожно используйте пальцы, чтобы отодвинуть CAM от оболочки.
- При желании эмбрион может быть перевернут в другое блюдо.
- При необходимости, дополнительный изофлуран может быть введен как в шаге 7.4.
8. Уборка опухолей
ПРИМЕЧАНИЕ: Опухоли могут быть собраны в любое время, что подходит для экспериментальных потребностей и скорость роста опухоли. Однако, в среднем, яйца люк 21 дней послеоплодизации. Таким образом, день развития 18 является подходящей точкой, чтобы избежать нежелательных штриховок.
- Возьмите опухоль с помощью щипков. Использование ножниц (весенние ножницы радужной оболочки хорошо работать) или скальпель, тщательно акцизной опухоли от CAM.
- Если опухоль была трансумционной с светлячок luciferase гена, reimaging может быть выполнена для проверки успешного удаления трудновизутки опухолей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вырезанные опухоли могут быть проанализированы любым методом, подходящим для конкретного эксперимента. Опухоли также могут быть реимплантированы в CAM или мышей. Для подтверждения опухолевой идентичности, опухоли могут быть исправлены, парафин встроенных, и рассматривается с гематоксилин и эозин или иммуногистохимических окрашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
До сих пор мы обнаружили, что этот метод имплантации, чтобы быть успешным для рака яичников, почек, простаты и мочевого пузыря. Каждый из них был оптимизирован для определения конкретных условий имплантации, хотя может быть гибкость. Из проверенных типов опухоли, рост рака яичников был гораздо менее выраженным и, как правило, не видимых без помощи биолюминесценции изображения (Рисунок 1). Тем не менее, ужесточение CAM может ощущаться с щипками в области имплантации. Это может помочь определить возможный рост опухоли в отсутствие биолюминесценции изображения, хотя дальнейшая проверка потребуется с помощью гистологии или другого подходящего метода. Мы добились успешного прививки как человеческих, так и мориновых клеточных линий, которые показывают морфологии в соответствии с теми, которые наблюдаются в других моделях in vivo(рисунок 1А и 1B). Кроме того, возможно имплантация опухолевых частей(рисунок 1С,синяя стрелка указывает на опухоль). Имплантированная опухоль в этом случае поступила от пациента с высокосортной, метастатической, серозовой карциномой яичников. Полученные опухоли морфологически напоминали их опухоли происхождения и выражали специфические для человека белки, такие как цитокератин 8/18, которые легко позволяют их дифференциацию от CAM и куриных эмбриональных тканей.
При оптимизации опухолевого прививок и роста, соответствующие факторы роста или гормоны могут быть добавлены во время имплантации. Например, тонкое, незначительное увеличение размера опухоли (измеренное общим потоком сияния) наблюдалось в клетках ID8 при дополнении тремя единицами (U) гормона стимуляции фолликула человека (ФСГ) во время имплантации(рисунок 1D). Выбор ФСГ для роста рака яичников вытекает из выражения рецептора ФСГ в клетках ID8 и высокий уровень ФСГ обычно встречаются в постменопаузе женщин, которые составляют большинство случаев рака яичников. Аналогичные подходы могут быть приняты для других трудноподдавных типов рака для повышения полезности модели CAM. Кроме того, ФСГ была добавлена только во время имплантации клеток. Пополнение фактора роста или гормона может быть достигнуто путем pipetting соответствующее количество добавки в среде в антипригарным кольцом с соответствующими интервалами, которые могли бы усилить эффект.
Для рака почек, имплантация 2 х 106 ясных клеток почечной карциномы клеток клеток из установленных клеточных линий, таких как RENCA, производится быстрое, надежное образование опухоли, хотя более низкие дозы клеток также могут быть использованы(Рисунок 2A, 10 дней послеимплантации). В результате опухоли морфологически напоминали те, которые получены через стандартную мышь in vivo модели28. Имплантация клеток RENCA с изображением светлячка с пелиферазы разрешается биолюминесценция. Первичные опухоли человека также могут быть имплантированы. Куски опухоли сохранились и набрали сосуды, не показывая значительного роста. Имплантация переваренных клеток, происходящих из первичной, ясной клеточной почечной клеточной карциномы, которые были расширены в пробирке, однако, вырос аналогично установленных клеточных линий (Рисунок 2B). Клетки карциномы почек могут быть посеяны с помощью либо антипригарным кольцом метод или метод без антипригарным кольцом.
Несколько человеческих и морин раковых клеток рака линии были протестированы для CAM прививок(Рисунок 3). Каждый из них вырос хорошо, когда 2 х 106 клеток были имплантированы с помощью антипригарным кольцом. Гистологическая оценка полученных опухолей соответствовала ожиданиям каждой клеточной линии. Кроме того, имплантация клеток, зядных люциферазы, позволяет идентифицировать опухоль с биолюминесценцией(рисунок 3А).
Рак мочевого пузыря был установлен в модели CAM из установленных клеточных линий и кусочков первичной ткани человека(рисунок 4). Клеточные линии росли хорошо, когда имплантировали с 2 х 106 клеток без антипригарным кольцом(Рисунок 4A и 4B), хотя имплантация с кольцом была успешной. Первичная человеческая опухоль может быть имплантирована из кусочков ткани(рисунок 4C). Представленный случай произошел от пациента с высокосортной, немышечно-инвазивной, уротелиальной карциномой. Имплантация переваренных клеток еще не была предпринята из-за продолжающейся оптимизации пищеварения опухоли. Раковые клетки результирующих опухолей CAM сохранили морфологию исходной опухоли, но с измененным стромальным компонентом. Рост опухоли был меньше, чем при почечно-клеточной карциномы и рака предстательной железы, хотя все еще легко видны.
Для обеспечения большого количества жизнеспособных, поддающихся проверке яиц в конечной точке необходимо проявлять осторожность при инкубации и открытии яиц. Если условия инкубатора являются неоптимальными либо до, либо после имплантации, то жизнеспособность эмбриона может быть нарушена. При значительной эмбриональной смерти происходит устранение условий инкубатора в соответствии с инструкциями производителя. По нашему опыту, стабильность температуры и влажности, как представляется, более важны, чем их точные значения. Таким образом, мы обнаружили, что инкубирование привитых яиц в модифицированной, клеточной культуры, CO2 инкубатор достигнут превосходной жизнеспособности по сохранению яйца в небольших, посвященных яичных инкубаторов, которые требуют более частого открытия для пополнения воды, которая контролирует влажность. Минимизация частоты, с которой привитые яйца удаляются для исследования опухоли, может также повысить жизнеспособность эмбриона.
Дополнительной проблемой имплантации CAM является целостность CAM при прививке. Если CAM не поврежден после открытия оболочки, то антипригарным кольцом и имплантированными клетками погрузится в альбумин эмбриона (см. примечание после шага 2.12). Это приводит к рассеиванию раковых клеток. Некоторые опухоли все еще могут образовываться, но раки, которые получают значительный рост и выживаемость сигнализации от соседних раковых клеток, таких как рак яичников, не будет надежно образовывать опухоли в таких условиях. Если антипригарные кольца используются для имплантации, отказ CAM может быть идентифицирован путем погружения кольца в альбумин. Это следует отличать от случаев, когда кольцо и имплантированные клетки были перемещены на дно яйцеклетки эмбриональным движением. В этих случаях кольцо будет найдено между CAM и нижней стороной оболочки. Эмбриональное движение невозможно контролировать. Тем не менее, размещение кольца может сделать его более трудным для эмбриона, чтобы нарушить имплантированных клеток. Кольца, расположенные по краям воздушного кармана, генерируемые в шаге 2.7, с большей вероятностью будут перемещены эмбрионом, чем кольца, расположенные в центре поля.
Рисунок 1: Представитель развития опухоли от рака яичников. Раковые клетки яичников успешно имплантированы включают: (A) человека SKOV3 клеточной линии, (B) линии клеток murine ID8, и (C) первичных опухолей. Представитель гематоксилин и эозина окрашивания представлена вместе с биолюминесценции изображения, по мере необходимости. Для опухоли CAM в результате имплантации первичной части опухоли (C) гематоксилин и эозиновые окрашивания как ОПУХОЛи CAM и первичной опухоли включены, наряду с цитокератин 8/18 (CK 8/18) окрашивание результирующей опухоли CAM. Синяя стрелка в первой панели указывает на опухоль. (D) Размер опухоли имплантатов ID8 с и без 3U FSH, рассчитанный как общий поток в результате биолюминесценции изображения (n No 3 для необработанных и n No 4 для FSH-дополнены). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представитель развития опухоли от четкой клеточной почечной карциномы клеток. Опухоли в результате имплантации (A) линии клеток карциномы мочиней, RENCA, или (B) культивируемых клеток, полученных из переваренной первичной опухоли человека. Шкала измерения, прилегающая к урезающей опухоли в (B) показывает 1 мм маркировки. Соответствующая гистология в (A) и (B) показывает гематоксилин и эозина окрашивания. В (A), также показано репрезентативное биолюминесценционное изображение светлячков-люциферазы,отмеченных ренка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Представитель развития опухоли от линий раковых клеток простаты. Представитель опухолей и гематоксилин и эозиновые окрашивания в результате имплантации человека раковых клеток простаты линий (A) CWR и (B) C4-2 вместе с линией морин клеток (C) MyC-CaP. Биолюминесценция изображения результирующих опухолей из светлячков ыцлице отмечены CWR клетки показаны в (A). Шкала измерения, прилегающая к урезанных опухолям, показывает 1 мм маркировку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Представитель развития опухоли от рака мочевого пузыря. Представитель опухолей в результате имплантации установленных человеческих линий раковых клеток мочевого пузыря (A) HT-1376, (B) T24, и (C) первичной опухоли мочевого пузыря человека. В (C), гематоксилин и эозиновые окрашивания результирующей опухоли CAM и первичной опухоли показаны. Шкала измерения, прилегающая к урезанных опухолям, показывает 1 мм маркировку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Расширение опухоли и прививок с помощью модели CAM позволяет более быстрый и непосредственно наблюдаемый рост опухоли, чем существующие модели животных in vivo. Кроме того, затраты значительно ниже, как только первоначальная покупка оборудования завершена, особенно по сравнению со стоимостью иммунокомпромиссных мышей. Начальное, ослабленное иммунитетом состояние куриных эмбрионов легко позволяет привить ткани человека и мурин. Даже с этими преимуществами, модель CAM имеет ограничения. Короткое время, которое может быть преимуществом также может быть ущерб, если долгосрочные исследования лечения оправданы. Иммунокомпромиссный/иммунный толерантный статус модели CAM может осложнить исследования опухолево-иммунных взаимодействий. Для этих исследований, коимплантация иммунных клеток, представляющих интерес может быть необходимо, возможно, с пополнением иммунного отсека. Кроме того, хотя все типы опухолей, которые мы представили, вмоделированы в модель CAM, они делают это с различной степенью роста. Например, почечно-клеточная карцинома быстро образует большие опухоли, но раковые опухоли яичников трудно визуализировать без помощи биолюминесценции изображения. Рост опухоли и скорость должны быть оценены для конкретного типа опухоли, чтобы определить, если CAM будет подходящей экспериментальной модели.
Успешное прививочтой опухоли требует тщательного завершения конкретных этапов протокола. Во-первых, яйца должны быть инкубированы в идеальных условиях, чтобы иметь оптимальное выживание эмбриона и CAM формирования до трансплантации. В связи с естественной изменчивостью партий, мы предлагаем получить избыток яиц от конкретного поставщика яиц. Мы также обнаружили, что прохладнее, дождливая погода может привести к грибковому росту в яйцах. Во время влажной погоды, больше яиц, возможно, потребуется привить, чтобы получить адекватные урожаи в конечном пункте. Это сезонное изменение, вероятно, будет специфическим для региона. Адекватное формирование CAM имеет важное значение для успешного прививки опухоли. Любые признаки CAM, оставшегося прикрепленным к оболочке при открытии, не должны быть проигнорированы. Если несколько яиц не имеют нетронутыми CAM при открытии первой партии, то мы рекомендуем отложить открытие оставшихся яиц, по крайней мере 1 дополнительный день.
Если будет получена плохая жизнеспособность или взяточничество, то в этом могут быть виноваты несколько шагов. Во-первых, жизнеспособность эмбриона от поставщика может быть плохой. Отсутствие воздушной клетки и видимой сосуды указывает на нежизнеспособное яйцо. Иногда, движение эмбриона может быть визуализировано, чтобы подтвердить жизнеспособность. Во-первых, однако, убедитесь, что свежие батареи находятся в яйцеклетки свечи, потому что сильный свет необходим для визуализации. Тест поплавка также может быть сделан для оценки жизнеспособности (различные инструкции и видео доступны в Интернете). Другим возможным объяснением плохой жизнеспособности является инкубатор. Используя независимый гигрометр и термометр, убедитесь, что настройки являются точными и стабильными. Инструкции производителя для инкубатора должны содержать подробные инструкции по устранению неполадок для оценки надлежащих настроек. Неправильные настройки инкубатора также могут поставить под угрозу развитие CAM. Используя ленту и / или маркер, определить, если яйцеклетка ротатор на самом деле спиннинг яйца. Если антипригарные кольца погружаются в альбумин в высокой доле привязатых яиц, то CAM не развивался должным образом. Наконец, мы обнаружили, что частая проверка привяженного яйцеклетки, что приводит к колебаниям температуры и влажности, может снизить жизнеспособность постимплантов. Если имплантированные яйца изначально жизнеспособны, но жизнеспособность уменьшается на протяжении всего периода прививок, яйца должны проверяться реже. Это снижение жизнеспособности также может быть связано с неточными или неподходящими настройками инкубатора после имплантации.
При оптимизации этого метода для нового типа клеток можно контролировать несколько факторов. Во-первых, это номер ячейки. Мы обычно имплантируем 5 х 105-2 х 106 клеток из клеточных линий. Имплантированные опухолевые части, как правило, 2-5 мм с каждой стороны. Эти суммы могут быть скорректированы для улучшения прививки или размера. Тем не менее, мы обнаружили, что рост опухоли уменьшается выше определенного порога, который зависит от типа клеток. Дополнительные параметры прививок включают наличие или отсутствие антипригарного кольца. Этот выбор, как правило, сделаны на основе того, кольцо будет препятствовать анализу конечных точек, хотя это также может повлиять на успешное прививование. Наличие антипригарного кольца может также позволить покрытие зарождающейся трансплантата со средой в желаемые интервалы для улучшения выживания до сосудистой вербовки, если это необходимо. Выбор внеклеточного типа матрицы, концентрации и среды, в которой матрица разбавляется, также может повлиять на прививку. Добавление факторов роста или гормонов может еще больше улучшить скорость опухоли принять скорость или размер. Выбор добавок и концентраций должен осуществляться на основе того, что будет подходить для конкретного типа клеток, а не вмешиваться в эксперимент. Они также будут иметь потенциал для пополнения с интервалами, если антипригарным кольцом используется.
Будущие приложения этой модели системы зависят от гипотезы, которая будет проверена. Например, эти опухолевые трансплантаты могут быть использованы для тестирования новых терапевтических подходов для уменьшения размера опухоли или истощения субпопуляции опухоли. Совместное имплантация с клетками из микроокружения опухоли хозяина может позволить исследования влияния этих клеток на различные параметры, включая рост опухоли и устойчивость к лечению. Эта модель может также служить в качестве возможности для постепенного расширения первичных опухолей человека до создания ксенотрансплантатов в иммунокомпромиссных моделей животных. Первоначальная адаптация к CAM прививании, возможно, может облегчить частоту опухоли в моделях мурин. Эти приложения еще предстоит проверить, но требуют дальнейшего изучения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Фуюхико Таманои и Бинь Ву за начальную подготовку по этому методу. Обсуждения с д-ром Евой Козиолек сыграли важную роль в оптимизации этого подхода и были высоко оценены. Эта работа была бы невозможна без финансирования из следующих источников: Программа исследований заболеваний, связанных с табаком, Постдокторская стипендия (27FT-0023, в ACS), Министерство обороны (МО) Программы исследований рака яичников (W81XWH-17-1-0160), NCI/NIH (1R21CA216770), Программа исследований заболеваний, связанных с табаком, High Impact Pilot Award (27IR-0016) и институциональная поддержка UCLA, включая грант семян JCCC (NCI/NIH P30CA016042) и грант 3R от офиса вице-канцлера по исследованиям в LW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
| C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
| CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
| Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
| Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
| Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
| HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
| ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
| Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
| Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
| Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
| MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
| Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
| RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
| Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
| Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
| Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
| T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
| Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |
References
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Jackson, S. J., Thomas, G. J. Human tissue models in cancer research: looking beyond the mouse. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 939-942 (2017).
- Cheon, D. J., Orsulic, S.
- Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2016. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. https://seer.cancer.gov/csr/1975_2016/ (2018).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Molecular Biology. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Lokman, N. A., Elder, A. S., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Science. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Xiao, X., et al. Chick Chorioallantoic Membrane Assay: A 3D Animal Model for Study of Human Nasopharyngeal Carcinoma. PLoS ONE. 10 (6), e0130935 (2015).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1119-1130 (2008).
- Shoin, K., et al. Chick Embryo Assay as Chemosensitivity Test for Malignant Glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Kavaliauskaitė, D., et al. The Effect of Sodium Valproate on the Glioblastoma U87 Cell Line Tumor Development on the Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane and on EZH2 and p53 Expression. BioMed Research International. 2017, 12 (2017).
- Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Rudy, S. F., et al. In vivo Wnt pathway inhibition of human squamous cell carcinoma growth and metastasis in the chick chorioallantoic model. Journal of Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 45 (1), 26 (2016).
- Canale, S., et al. Interleukin-27 inhibits pediatric B-acute lymphoblastic leukemia cell spreading in a preclinical model. Leukemia. 25, 1815 (2011).
- Loos, C., et al. Amino-functionalized nanoparticles as inhibitors of mTOR and inducers of cell cycle arrest in leukemia cells. Biomaterials. 35 (6), 1944-1953 (2014).
- Rovithi, M., et al. Development of bioluminescent chick chorioallantoic membrane (CAM) models for primary pancreatic cancer cells: a platform for drug testing. Scientific Reports. 7, 44686 (2017).
- Majerník, M., et al. Novel Insights into the Effect of Hyperforin and Photodynamic Therapy with Hypericin on Chosen Angiogenic Factors in Colorectal Micro-Tumors Created on Chorioallantoic Membrane. International Journal of Molecular Science. 20 (12), 3004 (2019).
- Swadi, R., et al. Optimising the chick chorioallantoic membrane xenograft model of neuroblastoma for drug delivery. BMC Cancer. 18 (1), 28 (2018).
- Klingenberg, M., Becker, J., Eberth, S., Kube, D., Wilting, J. The chick chorioallantoic membrane as an in vivo xenograft model for Burkitt lymphoma. BMC Cancer. 14 (1), 339 (2014).
- Avram, S., et al. Standardization of A375 human melanoma models on chicken embryo chorioallantoic membrane and Balb/c nude mice. Oncology Reports. 38 (1), 89-99 (2017).
- Zabielska-Koczywas, K., et al. 3D chick embryo chorioallantoic membrane model as an in vivo model to study morphological and histopathological features of feline fibrosarcomas. BMC Veterinary Research. 13 (1), 201 (2017).
- Skowron, M. A., et al. Applying the chicken embryo chorioallantoic membrane assay to study treatment approaches in urothelial carcinoma. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 35 (9), e511-e523 (2017).
- Jefferies, B., et al. Non-invasive imaging of engineered human tumors in the living chicken embryo. Scientific Reports. 7 (1), 4991 (2017).
- Taizi, M., Deutsch, V. R., Leitner, A., Ohana, A., Goldstein, R. S. A novel and rapid in vivo system for testing therapeutics on human leukemias. Experimental Hematology. 34 (12), 1698-1708 (2006).
- Strojnik, T., Kavalar, R., Barone, T. A., Plunkett, R. J. Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains. Anticancer Research. 30 (12), 4851-4860 (2010).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
