Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

बायोमार्कर विश्लेषण के लिए नैदानिक परीक्षण स्थलों पर एक एकल रक्त ड्रा से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल छर्रों और प्लाज्मा की तैयारी

Published: March 20, 2021 doi: 10.3791/60776
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 3, 1
1Translational Medicine, R&D Oncology, AstraZeneca, 2Acerta Pharma, AstraZeneca Group, 3Translational Medicine, R&D Oncology, AstraZeneca

Summary

यह प्रोटोकॉल नैदानिक परीक्षण स्थल पर उच्च गुणवत्ता वाले पीएमसी और प्लाज्मा बायोसैंपलों की नैदानिक रूप से कार्यान्वयन योग्य तैयारी का विवरण देता है जिसका उपयोग ट्रांसलेशनल बायोमार्कर विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

Abstract

परिधीय रक्त में बायोमार्कर का विश्लेषण नैदानिक परीक्षणों में तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है ताकि उपचार के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए तंत्र का प्रमाण स्थापित किया जा सके, और चिकित्सा विज्ञान की खुराक और अनुसूची सेटिंग में मदद मिल सके। एक रक्त ड्रा से, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है और प्रोटीन मार्कर का विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करने के लिए संसाधित किया जा सकता है, और प्लाज्मा नमूनों का उपयोग ट्यूमर डीएनए, साइटोकिन्स और प्लाज्मा मेटाबोलोमिक्स परिसंचारी के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। उपचार से देशांतर नमूने किसी दिए गए प्रोटीन मार्कर के विकास, उत्परिवर्तनीय स्थिति और रोगी के प्रतिरक्षा परिदृश्य के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। यह तभी प्राप्त किया जा सकता है जब परिधीय रक्त का प्रसंस्करण नैदानिक साइटों में प्रभावी ढंग से किया जाता है और नमूनों को बिस्तर से बेंच तक ठीक से संरक्षित किया जाता है। यहां, हम एक अनुकूलित सामान्य उद्देश्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसे बहु-केंद्र नैदानिक परीक्षणों में पीबीएमसी छर्रों और प्लाज्मा नमूनों को प्राप्त करने के लिए नैदानिक साइटों पर लागू किया जा सकता है, जो अस्पताल प्रयोगशालाओं में नैदानिक पेशेवरों को तकनीकी विशेषज्ञता के अपने स्तर की परवाह किए बिना उच्च गुणवत्ता वाले नमूने सफलतापूर्वक प्रदान करने में सक्षम बनाएगा। वैकल्पिक प्रोटोकॉल विविधताएं भी प्रस्तुत की जाती हैं जो अधिक विशिष्ट डाउनस्ट्रीम विश्लेषणात्मक तरीकों के लिए अनुकूलित होती हैं। हम एक्स-रे विकिरणित रक्त पर डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) के खिलाफ प्रोटीन बायोमार्कर का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू करते हैं ताकि ऑन्कोलॉजी सेटिंग्स में दृष्टिकोण की उपयुक्तता को प्रदर्शित किया जा सके जहां डीडीआर दवाओं और/या रेडियोथेरेपी का अभ्यास किया गया है और साथ ही प्रीक्लिनिकल चरणों में जहां मशीनी परिकल्पना परीक्षण की आवश्यकता है ।

Introduction

दवा विकास का उद्देश्य अपूरित चिकित्सा जरूरतों और अधिक लक्षित, व्यक्तिगत चिकित्सा को संबोधित करते हुए नए चिकित्सीय प्रदान करना है । कई दवा तंत्र सक्रिय जांच के अधीन हैं, जिनमें किनेज़1,प्रोटीज2,या पॉली (एडीपी-रिबोज) पॉलीमरेज (एआरपी) अवरोधक3,प्रोटीन विक्टर्स4,चिकित्सीय एंटीबॉडी5,और एंटीबॉडी-कंजूस्ड दवाएं (एडीसी)6,कई अन्य लोगों के बीच शामिल हैं। ऑन्कोलॉजी में बेहतर उपचार प्राप्त करने के प्रयासों का एक उदाहरण कैंसर कोशिकाओं को1,7तक पहुंचाने वाले सिग्नलिंग कैस्केड को रोकने के लक्ष्य के साथ काइनेज अवरोधकों का उपयोग है । उन किनास के लिए विशिष्ट सब्सट्रेट फॉस्फोरिलेशन के स्तर को मापना सबसे अच्छा फार्माकोडायनामिक बायोमार्कर है जो इन अवरोधकों की कार्रवाई के तंत्र की मात्रा निर्धारित करता है8. अन्य दवाएं किसी दिए गए प्रोटीन की अभिव्यक्ति को संशोधित कर सकती हैं, और उस मामले में उपचार के दौरान देशांतर में अपने लक्ष्य प्रोटीन की एकाग्रता में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम होने के नाते सर्वोपरि है। इसलिए, दवा या विकृति की विशेषताओं से स्वतंत्र, दवा जोखिम और लक्ष्य मॉड्यूलेशन के बीच फार्माकोकाइनेटिक्स (पीके)/फार्माकोडायनामिक्स (पीडी) संबंध स्थापित करने के लिए बायोमार्कर का मूल्यांकन प्रारंभिक नैदानिक विकास में सबसे अच्छा अभ्यास है और एक सुरक्षित और सहन की गई औषधीय रूप से सक्रिय खुराक/अनुसूची9के निर्धारण में सक्षम बनाता है ।

जबकि ऑन्कोलॉजी नैदानिक विकास में, बायोप्सी में बायोमार्कर विश्लेषण दवा के तंत्र का प्रमाण स्थापित करने के लिए सबसे अच्छी सेटिंग हो सकती है, परीक्षण में उपलब्ध बायोप्सी की संख्या आमतौर पर10,11तक सीमित होती है। वैकल्पिक रूप से, परिधीय रक्त के नमूने नैदानिक परीक्षणों के लिए अत्यधिक मूल्यवान हैं क्योंकि उनमें न्यूनतम आक्रामक प्रक्रिया शामिल है, अनुदैर्ध्य विश्लेषण को सुविधाजनक रूप से प्राप्त करने में त्वरित और आसान हैं, बायोप्सी की तुलना में कम महंगे हैं और उपचार के परिणाम की वास्तविक समय निगरानी के लिए विशाल जानकारी प्रदान करते हैं। परिधीय रक्त में पीडी बायोमार्कर का आकलन करने के लिए एक अतिरिक्त लाभ बायोसैंपल का उपयोग करने की क्षमता है ताकि पीके/पीडी मात्रात्मक संबंधों और बाद में पीके/पीडी मॉडलिंग12,13का निर्धारण करने में सटीकता की अनुमति देने के लिए भी पीके की मात्रा निर्धारित की जा सके । पूरे रक्त से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को प्रोटीन मार्कर का अध्ययन करने के लिए अलग किया जा सकता है, जो या तो उनके अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन या उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों में अनुभव करते हैं। इसके अलावा, पीबीएमसी का उपयोग इम्यूनोफेनोटाइपिंग उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है14,15,प्रतिरक्षा कार्यक्षमता के बारे में जैसे एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिटी (एडीसीसी)16 और आरएनए अलगाव के माध्यम से एपिजेनेटिक विश्लेषण का आकलन करना। इसी तरह, पूरे रक्त से प्लाज्मा का उपयोग एक रोगी की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की विशेषता के लिए साइटोकिन्स को निर्धारित करने, मेटाबोलिक अध्ययन करने के लिए, और चिकित्सीय एजेंट से चयन के तहत रोग के क्लोनल विकास की निगरानी के लिए ट्यूमर डीएनए (सीटीडीएनए) को अलग और अनुक्रमित करने के लिए किया जा सकता है, अक्सर उपचार प्रतिरोध के लिए एक यंत्रवादी आधार प्रदान करता है17,18,19 चिकित्सीय20की बाद की पीढ़ियों के विकास को सक्षम करता है। अंत में, परिधीय रक्त से परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) के अलगाव देशांतर गणना, डीएनए/आरएनए अनुक्रमण और प्रोटीन-बायोमार्कर विश्लेषण21द्वारा रोग प्रगति के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । यद्यपि यह अलगाव22में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुकूल है , लेकिन कैंसर के कई प्रकारों और रोग के शुरुआती चरणों में सीटीसी की कम बहुतायत सीटीसी के क्षरण को कम करने के लिए विशेष ट्यूबों का उपयोग अधिक उपयुक्त बनाती है23.

हाल के वर्षों में, तरल बायोप्सी के उपयोग ने नैदानिक परीक्षणों में प्राप्त जानकारी में सुधार किया है और पीबीएमसी संग्रह को कई अध्ययनों में शामिल किया गया है ताकि कुछ प्रकार के हेमेटोलॉजिकल घातक के लिए ट्यूमर कोशिकाओं में सीधे लक्ष्य सगाई और तंत्र के प्रमाण की निगरानी की जा सके, या पीबीएमसी पर खुद को ट्यूमर कोशिकाओं के पीडी सरोगेट्स के रूप में24,25, 26। उच्च गुणवत्ता वाले नमूनों की तैयारी सकारात्मक प्रभावों को किसी दिए गए विकृति के लिए सबसे सुरक्षित और सबसे प्रभावोत्पादक उपचार का निर्धारण करती है लेकिन हमारे अनुभव में, विभिन्न नैदानिक साइटों से प्राप्त पीबीएमसी तैयारियों की गुणवत्ता गुणवत्ता में व्यापक परिवर्तनशीलता के अधीन रही है जिसके परिणामस्वरूप नमूने नीचे विश्लेषण के उद्देश्य के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इससे उन अध्ययनों से एकत्र किए जा सकें पीडी डेटा की मात्रा प्रभावित हुई है ।

यहां हम विस्तार से प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए एक आसान वर्णन करते हैं जो दिखाता है कि नैदानिक सेटिंग में एक ही रक्त ड्रा से पीबीएमसी और प्लाज्मा दोनों नमूनों को कुशलतापूर्वक अलग किया जाए। प्रोटोकॉल मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों के निर्माता द्वारा प्रदान किए गए निर्देशों पर आधारित है, जिसमें संशोधनों को शामिल किया गया है जहां वास्तविक दुनिया के अनुभव ने नैदानिक साइटों द्वारा रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल निष्पादन में कठिनाइयों को उजागर किया है, जैसे कि अपकेंद्री मुद्दों, प्रसंस्करण में देरी और क्रायोविल्स को नमूना हस्तांतरण। पॉलीसैकराइड समाधानों के साथ या बिना किसी बाधा के उपयोग के घनत्व ढाल पृथक्करण के आधार पर मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों के उपयोग के लिए वैकल्पिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तरीके हैं जो समाधान को रक्तसेअलग करते हैं । यदि प्रासंगिक नैदानिक साइट पहले से ही इन वैकल्पिक पद्धतियों में अच्छी तरह से अनुभवी है, तो इस प्रोटोकॉल को इन के साथ स्वीकार्य रूप से प्रतिस्थापित किया जा सकता है। ऐसे मामलों में, दो कारकों पर विचार किया जा सकता है: कुछ वैकल्पिक तरीकों को एक संग्रह ट्यूब से एक अलग तैयारी ट्यूब में पूरे रक्त के हस्तांतरण की आवश्यकता होती है जहां मानव प्राथमिक जैविक सामग्री का एक अतिरिक्त हस्तांतरण थोड़ा बढ़ा हुआ सुरक्षा जोखिम पेश कर सकता है, और पॉलीसैकराइड समाधान से रक्त को अलग करने वाली बाधाओं के बिना तरीकों की सफलता महत्वपूर्ण कदमों पर निर्भर करती है जैसे कि घनत्व ढाल माध्यम पर रक्त को लेयरिंग करना, जिसमें तकनीकी विशेषज्ञता के परिष्कृत स्तर के विकास की आवश्यकता होती है। उपरोक्त बिंदुओं के बावजूद, समग्र व्यवहार्यता और सेल रिकवरी इन तकनीकों15,28केबीच तुलनीय है। इसलिए, कार्यप्रणाली का विकल्प कुछ हद तक पूर्व तकनीकी अनुभव पर निर्भर है, लेकिन हमारे हाथों में, मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों का व्यापक नैदानिक संदर्भ में सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है और हमारी, अन्यथा, सिफारिश है।

जबकि इस प्रोटोकॉल का एक अंत बिंदु lysates में आगे प्रसंस्करण के लिए पीएमसी छर्रों का उत्पादन करना है, पीबीएमसी संग्रह के अन्य अंतिम अनुप्रयोगों को लागू किया जा सकता है, जैसे न्यूक्लिक एसिड का अलगाव, या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) विधियों के लिए उपयुक्त पीबीएमसी स्मीयरों या पीबीएमसी ब्लॉकों का उत्पादन। महत्वपूर्ण बात यह है कि चूंकि रोगियों से लिया गया प्रत्येक बायोसैंपल कम से कम कुछ स्तर पर एक आक्रामक प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है, इसलिए यह प्रोटोकॉल प्लाज्मा को अलग करके प्रत्येक नमूने से उपयोगी सामग्री को अधिकतम करता है जिसका उपयोग साइटोकिन विश्लेषण, मेटाबोलॉमिक अध्ययन या सीटीडीएनए अनुक्रमण के लिए किया जा सकता है।

ऑन्कोलॉजी परीक्षणों में परिधीय बायोमार्कर का विश्लेषण पीबीएमसी के कई अनुप्रयोगों में से एक है। इसका एक उदाहरण कीमोथेरेपी, रेडियोथेरेपी या डीडीआर में शामिल एंजाइमों के अवरोधकों जैसे फॉस्फेटिडिलिनोसिटॉल-3 किनेस से संबंधित किनेसिस (पीआईकेके)7 और PARPs3, 13जैसे उपचारों में डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) का मूल्यांकन है। इन उपचारों का उद्देश्य कोशिकाओं के प्रसार में डीएनए क्षति को बढ़ाना है, जो बिगड़ा डीडीआर तंत्र और कोशिका चक्र चौकियों, जैसे कैंसर कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं में उच्च विषाक्तता उत्पन्न करता है । यहां हम एक्स-रे के अधीन परिधीय रक्त में डीडीआर बायोमार्कर के अध्ययन के साथ एक उदाहरण प्रस्तुत करते हैं।

Protocol

सूचित रोगी सहमति और प्रत्येक क्षेत्राधिकार में प्रासंगिक राष्ट्रीय नैतिकता आवश्यकताओं के साथ पूर्ण अनुपालन जैसे, मानव ऊतक अधिनियम (एचटीए - यूनाइटेड किंगडम, 2004) और स्वास्थ्य बीमा पोर्टेबिलिटी एंड जवाबदेही अधिनियम (HIPAA - संयुक्त राज्य अमेरिका, 1996) अनिवार्य हैं। मानव-व्युत्पन्न सामग्रियों पर किसी भी काम को शुरू करने से पहले पूरी तरह से प्रलेखित नैतिकता अनुमोदन के लिए निश्चित रहें। इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन में उपयोग किए जाने वाले रक्त को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (एनआईएचआर) कैंब्रिज बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर के साथ मानव जैविक नमूने आपूर्ति समझौते के तहत एनआईएचआर कैंब्रिज क्लीनिकल रिसर्च फैसिलिटी, कैंब्रिज, यूनाइटेड किंगडम द्वारा संचालित वॉलंटियर्स एंडिंग मेडिसिन पैनल (VAMP) (एथिक्स रेफरेंस 16/EE/0459, अध्ययन CRF494, उप अध्ययन 001) से उचित सहमति के साथ प्रदान किया गया था । ब्रिटेन में एस्ट्राजेनेका बायोबैंक मानव ऊतक प्राधिकरण (लाइसेंस नंबर 12109) द्वारा लाइसेंस प्राप्त है और एक अनुसंधान ऊतक बैंक (RTB) (आरईसी नहीं 17/NW/0207) के रूप में राष्ट्रीय अनुसंधान नैतिकता सेवा समिति (एनआरईसी) अनुमोदन किया है।

1. सामान्य तैयारी मार्गदर्शन

नोट: इस प्रोटोकॉल में रक्त, प्लाज्मा और पीबीएमसी जैसे अनियत मानव सामग्री के साथ सभी काम इस धारणा के तहत काम करना चाहिए कि इन सामग्रियों को संभावित संक्रामक एजेंटों को ले जा सकते हैं और इसलिए उपयुक्त जैव सुरक्षा सावधानियों के तहत किया जाना चाहिए । रोगियों के लिए है कि ज्ञात रोगजनकों के लिए नकारात्मक के रूप में परीक्षण किया गया है के लिए, नहीं मान नमूने गैर संक्रामक है और इसलिए उपयुक्त सुरक्षा सावधानियों अभी भी लागू किया जाना चाहिए । इन सामग्रियों से उत्पन्न अपशिष्ट उत्पादों को एक ही जैव सुरक्षा सावधानियों के साथ इलाज किया जाना चाहिए और स्थानीय नियमों के अनुसार निपटाया जाना चाहिए।

  1. दो प्रकार के मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों के बीच चुनें जो सोडियम साइट्रेट या सोडियम हेपरिन को एंटीकोगुलेंट्स के रूप में उपयोग करते हैं। कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए इन दो एंटीकोगुलेंट का उपयोग एक दूसरे से किया जा सकता है लेकिन परीक्षण के लिए एक का चयन करने से पहले दोनों एंटी-स्कंदन का परीक्षण किया जाना चाहिए।
  2. रोगी की कोडित आईडी के साथ रक्त संग्रह के लिए उपयोग की जाने वाली एक 8 एमएल मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूब लेबल करें। ट्यूबों को कमरे के तापमान (18-25 डिग्री सेल्सियस) पर रखें।
  3. कमरे के तापमान (18-25 डिग्री सेल्सियस) पर 1x पीबीएस स्टोर करें। तैयारी के अनुसार 30 एमएल का उपयोग करें।
  4. सुनिश्चित करें कि अलग प्लाज्मा नमूनों के लिए ट्यूब और पीबीएमसी नमूने के लिए क्रायोवियल को अद्वितीय पहचानकर्ताओं के साथ सटीक रूप से लेबल किया जाता है, जैसा कि प्रयोगशाला मैनुअल के उपयुक्त अनुभाग में निर्दिष्ट है।
  5. यदि पीबीएमसी का उपयोग फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन की निगरानी के लिए किया जा रहा है, तो फॉस्फेट अवरोधकों के साथ पूरक पीबीएस तैयार करें: फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल के 50 माइक्रोन के साथ पीबीएस के 5 एमएल मिलाएं 2 + 50 μL फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल 3। ताजा तैयार करें और उपयोग होने तक बर्फ पर रखें।
  6. यदि पीबीएमसी क्रायोप्रेवित होने जा रहे हैं, तो 90% एफबीएस + 10% डीएमएसओ को मिलाकर प्रति सैंपल 1 मिलील फ्रीजिंग मिश्रण तैयार करें।

2. पीबीएमसी संग्रह(चित्रा 1A)

  1. निर्माता द्वारा वर्णित मानक तकनीक का उपयोग करके मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूब में 8 एमएल रक्त ड्रा करें। एंटीकोगुलैंट योजक को रक्त के साथ मिलाने के लिए ट्यूब को धीरे-धीरे 8 से 10 बार उलटें। हीमोलिसिस से बचने के लिए हिलाएं नहीं। उस समय को रिकॉर्ड करें जिस पर खून खींचा गया था।
  2. संग्रह के बाद, अपकेंद्रित्र होने तक कमरे के तापमान पर ट्यूब को सीधा स्टोर करें। जितनी जल्दी हो सके नमूनों की प्रक्रिया, आदर्श रूप से इस रक्त संग्रह के एक घंटे के भीतर लेकिन बाद में 4 घंटे के बाद संग्रह नहीं। रक्त की प्रसंस्करण शुरू करते समय समय रिकॉर्ड करें।
  3. अपकेंद्रित्र से तुरंत पहले ट्यूब को धीरे-धीरे उलटा करके रक्त के नमूने को रीमिक्स करें 8 से 10 बार।
  4. 1,500 - 1,800 x ग्राम पर कमरे के तापमान (18-25 डिग्री सेल्सियस) पर 30 मिनट के लिए एक क्षैतिज रोटर (स्विंग-आउट हेड) में ट्यूब/रक्त नमूना ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें। सुनिश्चित करें कि सभी ट्यूब ठीक से संतुलित हैं।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल और अपकेंद्रित्र के प्रतिनिधि छवियों का सामान्य अवलोकन। {पीबीएमसीसी और प्लाज्मा तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध सिंहावलोकन। * यदि समय की कमी है, तो चरण 2.4 को 20 मिनट तक छोटा किया जा सकता है और चरण 3.3 से 3.6 को हटाया जा सकता है। ** यदि आवश्यक हो तो कोशिकाओं की गणना करने के लिए एक एलिकोट लें। 2 अतिरिक्त अपकेंद्रित्र कदम सीटीडीएनए विश्लेषण/मेटाबोलोमिक्स(बी)के लिए आवश्यक एक स्विंग-आउट सिर रोटर अपकेंद्रित्र चरण के लिए सेट की छवि २.४ । (ग)रोटर की छवि, जिसमें मोनोन्यूक्लियर सेल तैयार करने वाली ट्यूबों को स्पिन करने के लिए एडाप्टर युक्त दो बाल्टी शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नोट: एक्स जी (जिसे आरसीएफ, सापेक्ष अपकेंद्रित्र इकाइयों के रूप में भी जाना जाता है) और आरपीएम (प्रति मिनट क्रांतियां) अलग-अलग इकाइयां हैं। एक्स जी (आरसीएफ) के लिए अपकेंद्रित्र सेट करना सुनिश्चित करें। रूपांतरण के लिए ऑनलाइन कैलकुलेटर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें। यदि केवल निश्चित कोण रोटर उपलब्ध है, तो 1,500 - 1,800 x ग्रामपर 10 मिनट के लिए इस चरण को करें।

  1. अपकेंद्रित्र के बाद, बाधा के नीचे एक गहरे लाल परत की उपस्थिति (ज्यादातर लाल रक्त कोशिकाओं युक्त) और बाधा के ऊपर 2 परतों की जांच करें। शीर्ष परत प्लाज्मा (भूसे रंग) है और नीचे सफेद परत पीबीएमसी युक्त बफी कोट है। इन परतों को आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है जब एक अंधेरे के खिलाफ ट्यूब देखने/

Figure 2
चित्रा 2: पीबीएमसी को अलग करने के लिए ट्यूब। (A)अपकेंद्रित्र से पहले ट्यूबों की छवि (चरण 2.4), या तो खाली (बाएं) या रक्त युक्त (दाएं)। (ख)सेंट्रलाइजेशन के बाद पीबीएमसी लेयर का सफल पृथक्करण (चरण 2.5)। (ग)अपकेंद्रित्र के बाद पीबीएमसी परत की छवि और यह सुनिश्चित करने के लिए छोड़े गए प्लाज्मा का एक सा (चरण 2.7) एकत्र किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नोट: यदि ये परतें दिखाई नहीं देती हैं, तो यह शायद अपकेंद्रित्र इकाइयों को स्थापित करने में त्रुटि को इंगित करता है। सुनिश्चित करें कि सही अपकेंद्रित्र एडाप्टर का उपयोग किया जाता है और सही "एक्स जी" सेट किया जाता है। दोहराएं चरण 2.4।

  1. अपकेंद्रित्र के तुरंत बाद, प्लाज्मा के लगभग आधे हिस्से को कैप के साथ लेबल 15 एमएल आकार शंकुल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें, जबकि पीबीएमसी परत (लगभग 4-5 एमएल) को परेशान नहीं करने के लिए सावधान रहें। इस ट्यूब को अस्थायी रूप से गीली बर्फ पर प्लाज्मा के साथ स्टोर करें जिसे बाद में चरण 4 में इस्तेमाल किया जाएगा। अभी के लिए अलग सेट करें ।
  2. कोशिकाओं की परत के भीतर पिपेट रखकर एक पाश्चर पिपेट के साथ पूरे पीबीएमसी परत को इकट्ठा करें और कैप के साथ एक अलग 15 एमएल आकार शंकुकेंद्रित अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। यह भी प्लाज्मा की एक छोटी राशि लेने के लिए स्वीकार्य है, यदि आवश्यक हो, पूरी तरह से सभी PBMC परत प्राप्त करने के लिए । मात्रा आमतौर पर 1-2 एमएल है। तुरंत नीचे दिए गए चरण 3 के साथ जारी रखें।

3. पीबीएमसी वाशिंग कदम

नोट: धोने के चरणों का उद्देश्य पीबीएमसी गोली से अवशिष्ट प्लेटलेट्स और प्लाज्मा को पतला करना और हटाना है। सभी अपकेंद्रित्र चरण कमरे के तापमान (18-25 डिग्री सेल्सियस) पर किए जाने चाहिए।

  1. वॉल्यूम को 15 एमएल तक लाने के लिए पीबीएमसी ट्यूब में रूम टेम्परेचर पीबीएस जोड़ें। ट्यूब को कैप करें। धीरे-धीरे ट्यूब को 5 बार उलटा करके कोशिकाओं को मिलाएं।
  2. 300 x ग्रामपर 15 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। ध्यान दें कि यह प्रारंभिक अपकेंद्रित्र की तुलना में एक बहुत ही जेंटलर अपकेंद्रित्र है।
  3. एक अंधेरे/काले रंग की पृष्ठभूमि के खिलाफ ट्यूब को देखकर गोली की कल्पना करें । वैक्यूम आकांक्षा द्वारा या एक पिपेट(चित्र 3 ए)के साथ सुपरनेट निकालें। सफ़ेद रंग पीबीएमसी गोली के ऊपर लगभग 500 माइक्रोन की मात्रा छोड़ने वाले सुपरनैंट को त्यागें।

Figure 3
चित्रा 3: पीबीएमसी छर्रों। (A)पहले वॉश स्टेप 3.3 में प्राप्त गोली। (ख)गोली दूसरे धोने में अलग (चरण ३.७) । (ग)रक्त से बाद में संसाधित रक्त से प्राप्त हीमोलिसिस के उच्च स्तर के साथ गोली दूसरे धोने (चरण 3.6) में अलग आकर्षित रक्त से 4 घंटे से अधिक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. अवशिष्ट सुपरनेट में धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
  2. वॉल्यूम को 10 एमएल में लाने के लिए अतिरिक्त 1x पीबीएस जोड़ें। ट्यूब को कैप करें। ट्यूब को धीरे-धीरे 5x उलटा करके कोशिकाओं को मिलाएं। यदि अध्ययन प्रोटोकॉल में सेल गिनती की आवश्यकता है तो 3.5.1 चरण में जाएं, यदि आवश्यक नहीं है तो सीधे चरण 3.6 पर जाएं।
    1. पुनः निलंबित कोशिकाओं का 40 μL aliquot लें और ट्राइपैन नीले रंग के 40 माइक्रोन के साथ मिलाएं। हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें।
  3. 300 x ग्रामपर 10 मिनट के लिए चरण 3.5 से निलंबन को सेंट्रलाइज करें। सेल गोली को परेशान किए बिना जितना सुपरनेटेंट संभव है, उतना हटा दें।
  4. सेल पेलेट को परेशान किए बिना एक ठीक टिप पाश्चर पिपेट या माइक्रोपिपेट का उपयोग करके सेल पेलेट के ऊपर किसी भी शेष सुपरनेट को सावधानीपूर्वक हटा दें और त्यागें। इस चरण को पूरा करने के बाद गोली के ऊपर कोई तरल करने के लिए थोड़ा छोड़ दें। यदि इस प्रोटोकॉल का अंतिम बिंदु 3.8 चरण के लिए पीबीएमसी गोली चाल है; यदि अंतिम बिंदु क्रायोप्रीवित पीबीएमसी है तो 3.10 चरण पर जाएं।
  5. नए पीबीएस के 50 μL जोड़ें (या चरण 1.5 में तैयार पूरक PBS यदि आपके अंत्वाक बिंदु पर लागू होता है) को गोली और पिपेट धीरे-धीरे एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके सभी कोशिकाओं को फिर से रीसस्ट करने के लिए पिपेट करें। पूरे सेल निलंबन को लेबल 1.5 एमएल क्रायोवियल में स्थानांतरित करें और नमूनों को ठंडा होने तक तुरंत गीली बर्फ पर रखें।
  6. लेबल वाले नमूनों को तरल नाइट्रोजन में या सीधे सूखी बर्फ में रखकर फ्रीज करें। कोशिकाओं को सेल फ्रीजिंग बॉक्स का उपयोग करके -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर पर भी फ्रीज किया जा सकता है। इस मामले में, सेल ट्यूब जोड़ने से पहले बक्से को पूरी तरह से -80 डिग्री सेल्सियस में प्रीकहिल करें। उस समय को रिकॉर्ड करें जिस पर सेल छर्रों को फ्रीज किया गया था। एक बार कोशिकाओं को फ्रीज, -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, सूखी बर्फ पर जमे हुए जहाज।
  7. वैकल्पिक रूप से, पीबीएमसी को फ्रीजिंग मिश्रण (चरण 1.6) के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करने और लेबल वाले क्रायोवियल में स्थानांतरित करने के लिए। चरण 3.9 में वर्णित जारी रखें, लेकिन, इस मामले में, नमूनों को फ्रीज करने के लिए सेल फ्रीजिंग बॉक्स का उपयोग करना ही स्वीकार्य है। न्यूनतम 24 घंटे के लिए फ्रीजिंग बॉक्स में होने के बाद शिपिंग और स्टोरेज के लिए लिक्विड नाइट्रोजन में ट्रांसफर करें।

4. प्लाज्मा तैयारी कदम(चित्रा 1A)

  1. पीबीएमसी छर्रों के -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण के बाद, अब प्लाज्मा एलिकोट तैयार करें जिसे अस्थायी रूप से चरण 2.6 में गीली बर्फ पर संग्रहीत किया गया था। प्लाज्मा को स्पष्ट करने के लिए निम्नलिखित अपकेंद्रित्र चरणों का प्रदर्शन करें यदि नमूने का उद्देश्य सीटीडीएनए विश्लेषण है, अन्यथा सीधे चरण 4.2 पर जाएं।
    1. 1,600 पर 10 मिनट के लिए प्लाज्मा अपकेंद्रित्र - 2,000 x ग्राम पर 4 - 8 डिग्री सेल्सियस पर एक निश्चित कोण रोटर में (या स्विंग-आउट रोटर में 15 मिनट)।
    2. ध्यान से प्लाज्मा सुपरनेट बंद पिपेट, ध्यान रखने के लिए किसी भी गोली परेशान नहीं है और एक नई 15 एमएल ट्यूब के लिए हस्तांतरण । पैलेट्ड सामग्री वाली ट्यूब को छोड़ दें।
    3. 1,600 पर 10 मिनट के लिए प्लाज्मा अपकेंद्रित्र - 2,000 x ग्राम पर 4 - 8 डिग्री सेल्सियस पर एक निश्चित कोण रोटर में (या स्विंग-आउट रोटर में 15 मिनट)।
    4. ध्यान से प्लाज्मा सुपरनेट को एक नई 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित किया जा रहा है कि किसी भी पेल्ड सामग्री को परेशान न किया जाए। पैलेट्ड सामग्री वाली ट्यूब को छोड़ दें।
      नोट: यदि एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र उपलब्ध नहीं है, तो प्रत्येक स्पिन, या एक ठंडे कमरे में अपकेंद्रित्र नमूनों के बीच 5 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को रखें ।
  2. 1 एमएल एलिकॉट में प्लाज्मा को 5 फ्रेश 2 एमएल माइक्रोट्यूब में ट्रांसफर करें। 5 शीशियों से कम का उपयोग करें यदि 1 एमएल एलिकोट के साथ 5 शीशियों को भरने के लिए पर्याप्त प्लाज्मा नहीं है और यह उम्मीद है कि अंतिम शीशी में 1 एमएल प्लाज्मा से कम होगा। यदि 5 एमएल प्लाज्मा से अधिक है, तो शेष को त्याग दें। प्रत्येक ट्यूब में प्लाज्मा की कुल मात्रा रिकॉर्ड करें।
  3. तुरंत प्लाज्मा aliquots सीधे फ्रीज, उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण करके।

5. नमूना शिपमेंट

  1. सूखी बर्फ पर पीबीएमसी छर्रों और प्लाज्मा नमूनों दोनों जहाज।
  2. सुनिश्चित करें कि नमूना शिपमेंट से पहले और दौरान गल न जाए। नमूनों के साथ पर्याप्त सूखी बर्फ पैक सुनिश्चित करने के लिए वे शिपिंग प्रक्रिया की संपूर्णता के लिए जमे हुए रहते हैं, संभव देरी है कि पारगमन में हो सकता है पर विचार ।

6. डीडीआर बायोमार्कर के पूरे रक्त विकिरण और पश्चिमी दाग विश्लेषण(चित्रा 4A)

नोट: यह एक पूर्व वीवो उपचार है जो क्लिनिक में ज्यादातर मामलों में आवश्यक नहीं होगा, लेकिन ये प्रयोग उपयुक्त नैदानिक बायोमार्कर खोजने के लिए एक मूल्यवान अन्वेषणात्मक रणनीति हैं। सर्वोत्तम परिणाम सुनिश्चित करने के लिए संग्रह पर जितनी जल्दी हो सके रक्त नमूनों का इलाज किया जाना चाहिए।

  1. एक्स-रे कैबिनेट को गर्म करें। लेबल तीन 15 एमएल ट्यूब क्रमशः 0, 0.2 और 7 जीवाई के रूप में।
  2. एक व्यक्ति से हौसले से तैयार रक्त युक्त तीन मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूब लें और धीरे-धीरे ट्यूबों को 8 से 10 बार बदलने के बाद रक्त को तीन 15 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  3. एक्स-रे कैबिनेट में 0.2 Gy ट्यूब रखें, दरवाजा बंद करें और शेल्फ नंबर और खुराक का चयन करके ट्यूब पर 0.2 Gy खुराक लागू करें। कैबिनेट में चयनित डोज को एडजस्ट कर 7 जीवाई ट्यूब पर 7 जीवाई रेडिएशन डोज लगाएं।
  4. तीनों ट्यूबों को एक घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. रक्त को मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों में वापस स्थानांतरित करें और पीबीएमसी तैयारी प्रोटोकॉल को चरण 2.4 से चरण 3.8 तक नैदानिक सेटिंग के लिए पूरा करें।
  6. सेल पैलेट वॉल्यूम (इस मामले में रिपा बफर के 70 माइक्रोन) के बराबर प्रोटीज़ और फॉस्फेटे अवरोधकों के साथ पूरक लाइसिस बफर की मात्रा को प्रत्येक सेल छर्रों में जोड़ें, ऊपर और नीचे पिपेट करें और 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। यदि एक सोनिकेटर उपलब्ध है तो नमूनों को सोनिकेट करें (3 चक्र, 30 एस ऑन/30 एस ऑफ, 4 डिग्री सेल्सियस), वैकल्पिक रूप से नमूने में चिपचिपाहट को खत्म करने के लिए न्यूक्लिक एसिड को तोड़ने के लिए नमूनों को सिरिंज करें।
  7. 15,000 एक्स ग्राम≥ 10 मिनट के लिए नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज करें। प्रत्येक सुपरनेट को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, गुणात्मक रूप से हीमोलिसिस (दृश्य निरीक्षण) के स्तर का आकलन करें और किसी भी पसंदीदा विधि द्वारा प्रोटीन एकाग्रता को मापें।
  8. एसडीएस और सैंपल कम करने वाले एजेंट वाले सैंपल लोडिंग बफर के साथ टोटल लसटिंग का 40 माइक्रोन मिक्स करें। हीट ब्लॉक में 5 मिनट के लिए नमूने उबालें।
  9. 4-12% बीआईएस-ट्राइस प्रोटीन जेल में डुप्लिकेट में प्रति लेन प्रत्येक नमूने के 20 माइक्रोन लोड करें और एक एसडीएस-पेज चलाएं।
  10. जुदाई के बाद, प्रोटीन को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली (20 वी, 10 मिनट) का उपयोग करके नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली में स्थानांतरित करें और टीबीएसटी में 5% दूध के साथ ब्लॉक करें।
  11. प्रासंगिक आणविक आकारों में झिल्ली को काटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें (एंटीबॉडी और कमजोर पड़ने के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
  12. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए टीबीएसटी के साथ झिल्ली को 3 बार धोएं। कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट।
  13. 5 मिनट के लिए टीबीस्ट के साथ 3 बार धोएं।
  14. ईसीएल रिएजेंट लागू करें और एचआरपी सिग्नल के सापेक्ष प्राप्त छवियों का विश्लेषण करें।

Representative Results

हमारे नैदानिक परीक्षणों में पीबीएमसी तैयारियों की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, हमने संक्षिप्त, स्पष्ट कदमों के साथ एक प्रोटोकॉल तैयार किया है जिसका पालन अस्पताल प्रयोगशाला पेशेवरों द्वारा किया जा सकता है, जो उनके आणविक जीव विज्ञान पृष्ठभूमि और प्रयोगशाला कौशल से स्वतंत्र हैं। हमने निर्माता के प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है जिसमें उन चरणों पर संशोधन शामिल किए गए हैं जहां निष्पादन मुद्दों की पहचान की गई है या विभिन्न बहु-केंद्र नैदानिक परीक्षणों में शामिल नैदानिक साइटों से रिपोर्ट की गई है। हालांकि, प्रोटोकॉल को विशिष्ट आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए आगे अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे नैदानिक साइट में समय की कमी या डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के प्रकार (पूरक फ़ाइलदेखें)। हम प्रदर्शित करते हैं कि विकिरण द्वारा उत्पन्न डीएनए क्षति पर विशिष्ट बायोमार्कर को देखकर पीबीएमसी में डीडीआर का विश्लेषण किया जा सकता है।

नैदानिक साइटों से हमें प्राप्त सबसे आम प्रश्न अपकेंद्रित्र चरणों से संबंधित हैं, जो सीधे पीबीएमसी को सफलतापूर्वक अलग करने और अंतिम पीबीएमसी गोली प्राप्त करने में सक्षम होने का सीधा प्रभाव डालते हैं। उचित प्रकार के स्विंग-आउट हेड रोटर सेंट्रलाइज(चित्रा 1बी, सी)का उपयोग करना प्रोटोकॉल की सफलता की कुंजी है। हालांकि, जब नैदानिक साइट पर केवल एक निश्चित कोण रोटर अपकेंद्रित्र उपलब्ध है, तो हम एक ही आरसीएफ में एक निश्चित कोण रोटर में चरण 2.4 को ले जाने का सुझाव देते हैं, क्योंकि स्विंग-आउट हेड रोटर के लिए लेकिन केवल 10 मिनट के लिए। यह सुनिश्चित करता है कि एक पीबीएमसी परत प्लाज्मा से अलग है, (चित्रा 2बी, सीदेखें) । जबकि घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम पर रक्त को लेयर करने के लिए ब्रेक-ऑफ अपकेंद्रित्र की आवश्यकता होती है, मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों में रक्त को ट्यूब में जेल बाधा की उपस्थिति के कारण ब्रेक के साथ अपकेंद्री किया जा सकता है जो डेंजर रक्त घटकों27, 28से अलग पीबीएमसी परत के संरक्षण को सुनिश्चित करता है।

8 एमएल ट्यूब प्रारूप में रक्त के अपकेंद्रित्र से कम से कम 4 एमएल, गैर-पतला प्लाज्मा प्राप्त किया गया था, जिसे सीटीडीएनए अनुक्रमण या मेटाबोलोमिक्स अध्ययन29,30 (वैकल्पिक चरण 4.1.1-4.1.4) जैसे विशेष विश्लेषणों में इसके उपयोग के लिए आगे स्पष्ट किया जा सकता है। अलग पीबीएमसी की मात्रा, छर्रों और हीमोलिसिस या लाल रक्त कोशिका संदूषण के आकार के अन्य नैदानिक साइटों से आ रही चिंताओं और नमूनों का विश्लेषण अनुभव किया गया है । 8 एमएल रक्त से प्राप्त कोशिकाओं की संख्या रोगी और रोग सेटिंग के आधार पर परिवर्तनीय थी, लेकिन सामान्य रूप से प्राप्त गोली आकार में छोटी है, और एक पारदर्शी/सफेद रंगाई(चित्रा 3ए, बी)की। इन विशेषताओं के कारण, धोने के चरणों (2.5 और 3.3) के दौरान इसकी आकस्मिक आकांक्षा से बचने के लिए अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ गोली की कल्पना करना महत्वपूर्ण है। कभी-कभी छर्रों में लाल रक्त कोशिका संदूषण(चित्रा 3सी)के कारण कुछ लाल रंग हो सकता है, और इससे तैयारी की गुणवत्ता पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है। चित्रा 3में दिखाए गए छोटे छर्रों को खोने से बचने के लिए, पीबीएमसी गोली को क्रायोवियल में स्थानांतरित करने की सुविधा चरण 3.7 से है जहां पीबीएमसी गोली को पीबीएस के 50 माइक्रोल में फिर से निलंबित कर दिया जाता है।

इन ट्यूबों और स्वस्थ व्यक्तियों से रक्त का उपयोग करते समय विशिष्ट उपज 8 मिलील के लिए 7 से 21 x10 6 कोशिकाओं के बीच होती है, और 70 और 80% के बीच सेल रिकवरी होती है क्योंकि यह हमारा अनुभव है और जैसा कि पहले27,28दिखाया गया है। यह व्यक्तिगत कोशिका की गिनती और ऑपरेटर दोनों पर निर्भर करता है और यह घनत्व ढाल (पृथक्करण बाधा के साथ ट्यूबों का उपयोग करने वाली प्रणालियों सहित) का उपयोग करके अन्य तरीकों द्वारा प्राप्त सेल संख्या और सेल रिकवरी मूल्यों के बराबर है)15,27,28। रोग सेटिंग के आधार पर इस विधि के साथ अलग पीबीएमसी की संख्या पर भिन्नता का एक उदाहरण उदाहरण क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया (सीएलएल) रोगियों में पीबीएमसी मार्कर का विश्लेषण है। इस प्रोटोकॉल को लागू करते समय 8 एमएल मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूब से बरामद कोशिकाओं की संख्या 1.62 x 10 से 1.99 x 109 अध्ययन एनसीटी03328273(तालिका 1)में 7 रोगियों से प्राप्त45 नमूनों में भिन्न थी। एक संबंधित पैरामीटर इस विधि द्वारा प्राप्त पीबीएमसी lysates की प्रोटीन एकाग्रता है, और यह अलग कोशिकाओं की संख्या और प्रोटीन निष्कर्षण की दक्षता पर निर्भर करता है। धारा 6 में सेल छर्रों को रिपा बफर और सोनिकेशन (चरण 6.6) के साथ उत्पन्न किया गया था। लाइसिस बफर की एक ही मात्रा में सेल छर्रों का पुनःपंपन आमतौर पर 3 से 10 मिलीग्राम/एमएल तक सांद्रता की एक श्रृंखला में परिणाम देता है, और इस विशेष उदाहरण में लाइसेट सांद्रता क्रमशः 0, 0.2 और 7 जीवाई के लिए 6.8, 8.3 और 8.6 मिलीग्राम/एमएल थी। हालांकि, यह नैदानिक साइटों से नमूने प्राप्त करते समय एक उच्च परिवर्तनशीलता के अधीन होता है जो बेहतर रूप से तैयार नहीं किए गए हैं, रोगी की बीमारी, और लाल रक्त कोशिका संदूषण से हीमोग्लोबिन की उपस्थिति। उदाहरण के लिए, बहुत छोटे छर्रों को कोशिका गोली की मात्रा से बड़े लाइसिस बफर की मात्रा में फिर से निलंबित करने की आवश्यकता होती है ताकि प्रोटीन एकाग्रता माप और डाउनस्ट्रीम बायोमार्कर विश्लेषण दोनों के लिए अनुमति दी जा सके, जिसके परिणामस्वरूप अधिक पतला नमूने होते हैं। ऐसे मामले में, यदि एक नमूना एकाग्रता 1 मिलीग्राम/एमएल से नीचे है तो यह इस उच्च कमजोर पड़ने वाले कारक के कारण पश्चिमी दाग की तरह परख करने के लिए एक चुनौती पैदा कर सकता है । इसके विपरीत, सीएलएल नमूनों में पहले उल्लेख किया गया था, कोशिका छर्रों को फिर से खर्च करने के लिए जोड़ा गया लाइसिस बफर की मात्रा 50 से 500 माइक्रोन तक भिन्न होती है, और प्रोटीन एकाग्रता 1.62 से 19.77 मिलीग्राम/एमएल(तालिका 1)तक फैली हुई है।

जब नमूने लाल रक्त कोशिका संदूषण या हीमोलिसिस(चित्रा 3 सी)प्रस्तुत करते हैं, तो एरिथ्रोसाइट्स से हीमोग्लोबिन को शामिल करने के कारण पीबीएमसी लाइसेट की प्रोटीन एकाग्रता अधिक अनुमानित हो जाती है। यही कारण है कि किसी को प्रोटोकॉल के चरण 6.7 में वर्णित ऐसे नमूनों का दृश्य निरीक्षण और एनोटेशन करना चाहिए। अतिरिक्त में नमूना लोड करना हीमोग्लोबिन की उपस्थिति की भरपाई कर सकता है जहां तक लोडिंग नियंत्रण परख में शामिल है, बायोमार्कर विश्लेषण करते समय हीमोग्लोबिन की उपस्थिति की भरपाई कर सकते हैं। हीमोलिसिस को मापने के लिए अन्य अधिक मात्रात्मक तरीकों को लागू किया जा सकता है, जैसे कि 414 एनएम32पर अवशोषण को मापना।

इस नैदानिक प्रोटोकॉल के बाद प्राप्त पीबीएमसी में डीडीआर का विश्लेषण किया गया था। एक ऐसी स्थिति है कि इस तरह के रेडियोथेरेपी या कीमोथेरेपी के रूप में डीएनए हानिकारक नैदानिक उपचार की नकल वर्णन करने के लिए, स्वस्थ स्वयंसेवकों से पूरे रक्त एक्स-रे विकिरण(चित्रा 4A)के अधीन पूर्व वीवो था । आयनीकरण विकिरण (आईआर) जैसे एक्स-रे डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) सहित विभिन्न प्रकार के डीएनए क्षति को प्रेरित करते हैं। इन घावों के डीएनए क्षति संवेदन Ataxia-telangiectasia उत्परिवर्तित (एटीएम), एटीएम और Rad3 से संबंधित (एटीआर) और डीएनए पर निर्भर प्रोटीन kinase (डीएनए-पीके), जो समरूप पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) या गैर-अनुरूप अंत में शामिल होने (NHEJ) की तरह डीएनए मरम्मत तंत्र संलग्न के रूप में PIKKs सक्रिय करता है । डीएसबी की उपस्थिति से एटीएम की सक्रियता एमआरएन (एमआरएन-आरए50-एनबीएस1) परिसर द्वारा नुकसान की साइटों पर इसकी भर्ती द्वारा होती है, जिससे Ser1981 सहित कई अवशेषों पर एटीएम ऑटोफोस्फोरिलेशन होता है। इसके बदले में, सक्रिय एटीएम फॉस्फोरिलेट एमआरएन कॉम्प्लेक्स के घटकों और अन्य प्रोटीन जैसे सेर139 (जहां PSer139-H2AX को γH2AX के रूप में भी जाना जाता है) डीएसबी से फैले क्रोमेटिन में संरचनात्मक परिवर्तन को बढ़ावा देने के लिए जो अन्य डीडीआर कारकों की भर्ती की सुविधा प्रदान करता है33। पीबीएमसी अपनी कम प्रसार दर और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विधियों के बावजूद आयनीकरण विकिरण के लिए उत्तरदायी हैं, एटीएम द्वारा RAD50 पर फॉस्फोरिलेटेड सेर635 के अपरेगुलेशन के मात्राकरण की अनुमति दी है। एटीएम अवरोधकों की उपस्थिति में इस फॉस्फोरिलेशन को कम कर दिया जाता है और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री8द्वारा ट्यूमर में नैदानिक एटीएम अवरोधक उपचार के लिए एक फार्माकोडायनामिक बायोमार्कर के रूप में आगे मान्य किया गया है। विकिरण के लिए पीबीएमसीसी की प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए, स्वस्थ स्वयंसेवकों से रक्त को विभिन्न आईआर खुराकों के अधीन किया गया था और 37 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 4A)पर 1 घंटे इनक्यूबेशन के बाद नमूने एकत्र किए गए थे। इस उद्देश्य के लिए, रक्त को प्लास्टिक ट्यूबों में स्थानांतरित कर दिया गया ताकि उच्च तापमान (चरण 6.2) के कारण पीबीएमसी अलगाव की उपज को कम करने से बचा जा सके। हमने विश्लेषण किया कि कैसे एटीएम न केवल पहले रिपोर्ट RAD50 pS635 को देखकर सक्रिय किया गया था, लेकिन यह भी एटीएम pS1981 और γH2AX । तीन मामलों में इन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों में वृद्धि की जांच की उच्च आईआर खुराक(चित्रा 4B)पर देखी गई । दिलचस्प बात यह है कि एटीएम और RAD50 का फॉस्फोरिलेशन 0.2 Gy की कम खुराक पर पर्याप्त था, जिससे पता चलता है कि इन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों को एक अच्छी गतिशील सीमा के साथ डीएनए डीएसबी की पीढ़ी से जुड़े उपचारों के लिए पीडी बायोमार्कर के रूप में व्यवहार्य रूप से पूछताछ की जा सकती है, न केवल ट्यूमर के नमूनों में बल्कि परिधीय रक्त में। यह उपचार के पाठ्यक्रम के माध्यम से देशांतर नमूने प्राप्त करके उपचार के लिए पीडी प्रतिक्रिया की निगरानी की अनुमति देता है। रक्त ड्रा से नमूनों के प्रसंस्करण के लिए समय यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि ये सिग्नलिंग कैस्केड अभी भी सक्रिय हैं क्योंकि प्रसंस्करण में देरी ऐसे झरने के काइनेटिक्स पर प्रभाव डालेगी और कोई फॉस्फोरमार्कर के रूप में उपयोग की जाने वाली फॉस्फोरिलेशन घटनाओं को याद कर सकता है।

Figure 4
चित्रा 4: वर्तमान नैदानिक प्रोटोकॉल प्रदर्शन बायोमार्कर के बाद पूर्व वीवो विकिरणित रक्त से अलग पीबीएमसी उपचार के कारण डीएनए क्षति की सीमा के बारे में सूचित करने के लिए । (ए)पीबीएमसी की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध सिंहावलोकन और पूरे रक्त विकिरण पर डीडीआर का विश्लेषण । * सीटीडीएनए विश्लेषण/मेटाबोलोमिक्स के लिए आवश्यक 2 अतिरिक्त अपकेंद्रित्र कदम। (ख)पीबीएमसीसी में डीडीआर फॉस्फो-बायोमार्कर की खुराक पर निर्भर अप्रेलेशन दिखाते हुए वेस्टर्न ब्लॉट । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

नमूना पीबीएमसी/8 एमएल ब्लड की संख्या पूरक रिपा बफर वॉल्यूम (μL) अंतिम एकाग्रता (मिलीग्राम/एमएल)
A.1 39100000 70 12.16
A.2 97400000 100 4.54
A.3 233000000 150 7.63
A.4 316000000 150 16.87
A.5 387000000 150 12.60
A.6 459000000 150 12.71
A.7 414000000 200 15.67
A.8 253000000 150 14.56
A.9 509000000 300 10.67
बी.1 15200000 70 2.96
बी.2 10500000 50 4.59
बी.3 13200000 50 3.99
बी.4 34800000 100 10.41
बी.5 1620000 70 7.11
बी.6 70200000 100 9.26
बी.7 65400000 100 12.10
बी.8 91100000 150 11.82
C.1 6330000 70 4.04
C.2 4400000 150 19.77
C.3 68000000 100 8.96
C.4 35100000 50 9.30
C.5 35400000 70 10.55
C.6 99200000 100 16.19
D.1 402000000 70 7.23
D.2 826000000 300 16.95
D.3 1990000000 300 14.87
D.4 1000000000 300 18.34
D.5 1160000000 400 16.13
D.6 806000000 400 19.40
ई.1 302000000 300 13.86
ई.2 990000000 500 19.04
ई.3 1200000000 400 17.13
एफ.1 4010000 50 1.62
F.2 5170000 50 2.84
एफ.3 2810000 50 3.69
एफ.4 3700000 75 3.62
एफ.5 3460000 70 4.03
एफ.6 7060000 50 3.32
जी.1 60700000 70 6.57
जी.2 82100000 150 7.78
जी.3 30500000 70 8.28
जी.4 134000000 100 15.14
जी.5 91900000 100 8.61
जी.6 372000000 150 15.88
जी.7 574000000 200 15.01
7 रोगियों के अनुरूप देशांतर पीबीएमसी नमूने

तालिका 1: पुरानी लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया रोगियों (सीएलएल) से पीबीएमसी छर्रों की सेल संख्या और प्रोटीन एकाग्रता। इस तालिका में प्रस्तुत किए गए आंकड़े मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों में एकत्र किए गए अध्ययन एनसीटी03328273 में भाग लेने वाले 7 सीएलएल रोगियों से 45 पीबीएमसी नमूनों के अनुरूप हैं। ये मूल आंकड़े हैं जो उद्धृत अध्ययन31के नमूनों का उपयोग करके उत्पन्न किए गए हैं ।

अनुपूरक फाइल: वैकल्पिक प्रोटोकॉल विकल्प। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

पीबीएमसी और प्लाज्मा की उच्च गुणवत्ता वाली तैयारी जो नैदानिक परीक्षण स्थलों पर मजबूती और पुन: तैयार की जा सकती है, नैदानिक परीक्षण परिधीय भविष्य कहनेवाला और फार्माकोडायनामिक ट्रांसलेशनल बायोमार्कर एंडपॉइंट्स को सूचित करने के लिए अमूल्य हैं। यहां हमने एक छोटा, स्पष्ट प्रोटोकॉल प्रदान किया है जो आम तौर पर समस्याग्रस्त कदमों को संबोधित करता है जो नैदानिक परीक्षण सेटिंग में निष्पादन त्रुटियों के लिए असुरक्षित हैं। हालांकि, प्रोटोकॉल को विशिष्ट आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए आगे अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे नैदानिक साइट पर समय की कमी या डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के प्रकार (पूरक फ़ाइलदेखें)।

इस उद्देश्य के लिए, हमने दिखाया है कि कैसे पूरे रक्त से पीबीएमसी और प्लाज्मा दोनों को अलग करने के लिए मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों का उपयोग करने के लिए जमे हुए PBMC छर्रों और जमे हुए प्लाज्मा का उत्पादन करने के लिए डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की एक किस्म के लिए उपयुक्त है । हमने विशेष रूप से महत्वपूर्ण प्रोटोकॉल चरणों की ओर ध्यान आकृष्ट किया है जिसमें कदम 2.5 में पीबीएमसी परत की अपकेंद्रण और पहचान और पीएमसी छर्रों को 3.3 और 3.6 चरणों में शामिल किया गया है। ऐतिहासिक रूप से, जहां नैदानिक साइटें अक्सर गलत हो जाती हैं, सही इकाइयों (आरपीएम मूल्य के साथ आरसीएफ या एक्स जी मूल्य को भ्रमित करना), रक्त नमूनों, तापमान और जमे हुए सेल पैलेट के ऊपर पीबीएस की बड़ी मात्रा की उपस्थिति के प्रसंस्करण में देरी करना सही इकाइयों (आरसीएफ या एक्स जी मूल्य को भ्रमित करना) के लिए अपकेंद्रित्र स्थापित करना है। अधिकांश अपकेंद्रित्र रोटरों में गलती से एक आरपीएम सेटिंग के रूप में एक्स जी मूल्य में प्रवेश करने से महत्वपूर्ण अंडर-अपकेंद्रित्र होगा जिसके परिणामस्वरूप खराब परिभाषित या अनुपस्थित पीबीएमसी परत, और संभावित अनजाने पीबीएमसी अक्षम सेप्यूटिंग के कारण धोने के कदम के दौरान त्यागने के परिणामस्वरूप। हालांकि, इस बात की संभावना है कि अगर रोगी ने ल्यूकोपेनिया विकसित किया है तो सही अपकेंद्रित्र सेटिंग्स और रोटर एडाप्टर का उपयोग करने के बावजूद पीएमसी की परत दिखाई नहीं देती है। यह स्थिति कीमोथेरेपी या विकिरण चिकित्सा के कारण ऑन्कोलॉजी परीक्षणों में नामांकित रोगियों को प्रभावित कर सकती है और इस पर विचार किया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल में स्पष्ट किया गया एक और महत्वपूर्ण बिंदु यह है कि नमूनों को रक्त आकर्षित से 1-2 घंटे के भीतर संसाधित किया जाना चाहिए ताकि प्रोटोकॉल को नकारात्मक रूप से प्रभावित करने की संभावना को कम किया जा सके। इसके अलावा, रक्त ड्रा के पहले घंटे के दौरान नमूनों को संसाधित करने का लक्ष्य पूर्व वीवो परिवर्तनशीलता को कम करता है, जिसका फार्माकोकाइनेटिक्स रीडआउट में और रक्त संरक्षण या सक्रिय सिग्नलिंग मार्गों से प्रभावित बायोमार्कर पर बहुत प्रभाव पड़ सकता है,जैसे कि चित्र 4 में दिखाया गया मामला। यदि कोशिकाएं क्रायोप्रेप्रेवरी34होने जा रही हैं तो नमूना प्रसंस्करण में देरी का कोशिका व्यवहार्यता में भी हानिकारक प्रभाव पड़ सकता है . एक अन्य कारक जो उपज और लाल रक्त कोशिका संदूषण दोनों को प्रभावित कर सकता है वह भंडारण और अपकेंद्रित्र तापमान है, जिसे कमरे के तापमान (18-25 डिग्री सेल्सियस) पर रखा जाना चाहिए। कम तापमान घनत्व ढाल माध्यम के घनत्व को बढ़ाता है, जिसके परिणामस्वरूप लाल रक्त कोशिका और ग्रैनुलोसिट संदूषण की उच्च डिग्री होती है क्योंकि ये कोशिकाएं भी कुल नहीं होती हैं। दूसरी ओर, उच्च तापमान के कारण पीबीएमसी एकत्रित एरिथ्रोसाइट्स के बीच फंस जाते हैं, इसलिए तैयारी15,27,28की उपज कम हो जाती है। और अंत में, यह महत्वपूर्ण है कि क्रायोवियल में सेल पेलेट के साथ 50-100 माइक्रोन से अधिक तरल मौजूद नहीं है, क्योंकि यह इन पीबीएमसी तैयारियों के डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण में प्राप्त किसी भी प्रोटीन lysates की एकाग्रता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है। तरल की अधिकता नमूनों को अधिक बढ़ा देगी, जिससे बायोमार्कर विश्लेषण के लिए बहुत कम प्रोटीन एकाग्रता के साथ lysates होता है। इसके अलावा, अनुवाद के बाद के किसी भी संशोधनों का संरक्षण बिगड़ा होगा, और लाइसिस की दक्षता भी बहुत कम हो जाएगी।

मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों को चुना गया क्योंकि वे हमारे अनुभव, उत्कृष्ट प्रजनन क्षमता के साथ नैदानिक परीक्षणों के लिए एक ही रक्त ड्रा में पीबीएमसी और प्लाज्मा दोनों को अलग करने का सबसे सीधा तरीका प्रदान करते हैं। रक्त प्रसंस्करण के लिए अत्यधिक प्रशिक्षित ऑपरेटरों की आवश्यकता नहीं होती है, और एक ट्यूब का उपयोग रक्त को पतला करने और इसके हस्तांतरण को एक अलग ट्यूब में स्थानांतरित करने की आवश्यकता को हटा देता है, जिससे जोखिम कम हो जाता है; ब्रेक के साथ अपकेंद्रित्र कदम प्रदर्शन करने के कारण प्रोटोकॉल को छोटा करता है; और सभी अभिकर् प ट्यूब में होते हैं, जो परिवर्तनशीलता को कम करते हैं। हमारे अनुभव में, ये लाभ इन ट्यूबों की उच्च लागत से अधिक हैं, जब अन्य शास्त्रीय तरीकों की तुलना में केवल घनत्व ढाल पृथक्करण माध्यम27,28 (£ 410 प्रति 60 इकाइयों का उपयोग शामिल है जबकि लिम्फोप्रेप माध्यम 66 50-एमएल तैयारी के लिए £ 215 है)। वे दो प्रकार के एंटीकोगुलेंट, हेपरिन और साइट्रेट में उपलब्ध हैं, जिनमें से दोनों अलग पीबीएमसी35की कार्यक्षमता को बनाए रखने में तुलनीय हैं, इसलिए, दूसरे पर एक एंटीकोगुलेंट का चुनाव डाउनस्ट्रीम बायोमार्कर अध्ययनों में हेपरिन या साइट्रेट के संभावित प्रभाव पर आधारित होगा। हालांकि यह दिखाया गया है कि EDTA ट्यूब हेपरिन या साइट्रेट13की तुलना में उच्चतम पीबीएमसी अलगाव उपज प्रदान करते हैं, एक ट्यूब-केवल हेरफेर के उपयोग में आसानी का लाभ इस विचार को प्रतिसंतुलित करता है। यदि साइटोकिन्स का विश्लेषण किया जा रहा है तो एंटी-स्कंदन प्लाज्मा में पाए गए स्तरों का प्रभाव हो सकता है, इसलिए नैदानिक परीक्षण36के लिए एक का चयन करने से पहले दोनों एंटीकोगुलेंट्स का परीक्षण किया जाना चाहिए। यदि प्लाज्मा का उपयोग मेटाबोलोमिक्स अध्ययन के लिए किया जा रहा है, तो एंटीकोगुलैंट के रूप में हेपरिन का उपयोगकरना 37पसंद किया जाएगा। इसलिए, अंतिम उपयोगकर्ता या नैदानिक परीक्षण अनुवाद वैज्ञानिक के लिए छोड़ दिया एकमात्र बिंदु यह है कि क्या लागत का आकलन किए जाने के बाद साइट्रेट या हेपरिन अपने उद्देश्यों के लिए अधिक उपयुक्त होगा।

जबकि सेल तैयार करने वाली ट्यूबों का उपयोग करने के लाभ उन सीमाओं की तुलना में कई हैं जो वे मुद्रा (उच्च लागत और एंटीकोगुलेंट्स की प्रतिबंधित रेंज की उपलब्धता), नैदानिक परीक्षणों में पीडी बायोमार्कर प्राप्त करने के लिए पीबीएमसी या प्लाज्मा के उपयोग की मुख्य सीमा, विशेष रूप से ऑन्कोलॉजी में, अलगाव विधि से असंबंधित हो सकती है। हेमेटोलॉजिकल कैंसर को छोड़कर, जहां ट्यूमर सीधे परिधीय रक्त से नमूना है, अन्य कैंसर संकेत प्लाज्मा और पीबीएमसी के लिए सरोगेट ऊतक हैं जो जरूरी प्राथमिक ट्यूमर की नकल नहीं करते हैं। परिधीय ऊतक प्राथमिक ट्यूमर के साथ जीनोम और एपिजेनोम साझा नहीं कर सकते हैं, इसलिए, एक विशिष्ट ट्यूमर उत्परिवर्तन पर निर्भर बायोमार्कर का परिधीय विश्लेषण मुख्य रूप से सीटीडीएनए विश्लेषण (प्लाज्मा से) या सीटीसी (पीबीएमसी परत के बाद छंटाई द्वारा) तक सीमित है। इसके अलावा, सिग्नलिंग कैस्केड ड्राइविंग या ट्यूमर प्रसार में योगदान परिधीय रक्त में उतना सक्रिय नहीं हो सकता है। इस चुनौती को बायोमार्कर खोज दृष्टिकोण लागू करके दूर किया जा सकता है जो वैकल्पिक बायोमार्कर की पहचान करने के लिए रक्त8 को लक्षित करता है या प्लाज्मा38 और पीबीएमसी तैयारी26के अलगाव के लिए पूर्व वीवो उपचारों को युग्मन करता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में जमे हुए पीबीएमसी छर्रों को आसानी से नैदानिक साइट से संसाधित किया जा सकता है ताकि प्रोटीन lysates दिया जा सके जिसका मूल्यांकन पश्चिमी ब्लॉटिंग या एलिसा तकनीकों द्वारा किया जा सकता है। आईएचसी विधियों को सक्षम बनाने के लिए पीबीएमसी का उपयोग करने के वैकल्पिक तरीके भी प्रस्तुत किए गए हैं(अनुपूरक फाइल)। इसके अलावा, हमने प्रतिरक्षा कोशिका निगरानी के लिए पीबीएमएमसी (अनुपूरक फ़ाइलदेखें) क्रायोप्रेरेर्विंग की संभावना को भी विस्तृत किया है, ऑन्कोलॉजी में एक प्रासंगिक आवेदन, प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अवरोधकों और एडीसी के साथ नैदानिक परीक्षणों में तेजी से परीक्षण किया गया है। एडीसीसी16 और इम्यूनोफेनोटाइपिंग जैसे प्रतिरक्षा कार्यों का मूल्यांकन मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूब15से अलग क्रायोप्रीवरी पीबीएमसी के साथ संगत अनुप्रयोग हैं। क्रायोप्रिजर्वेशन पर एक चेतावनी है, क्योंकि यह कुछ सतह और आंतरिक मार्कर के डाउन-रेगुलेशन को बढ़ावा दे सकता है और कुछ सेल कार्यों को ख़राब कर सकता है, हालांकि पीबीएमसी क्रायोप्रिजर्वेशन बाहरी प्रयोगशालाओं14, 15में प्रसंस्करण के लिए कई नैदानिक साइटों से नमूनों को संभालने के समय की कमी के कारण इन परखों को करने का एकमात्र व्यवहार्य तरीका है, और इन हानिकारक प्रभावों को अच्छे विगलन विधियों और विश्राम अवधि39से बहुत दूर किया जा सकता है।

अंत में, यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल से किसी भी नैदानिक संस्थान में पीबीएमसी और प्लाज्मा नमूनों की भरोसेमंद तैयारी की अनुमति मिलेगी, जिसमें सामान्य उपकरण और सामग्री होगी ताकि परिधीय रक्त से अनुवादात्मक अंत बिंदुओं को वैश्विक नैदानिक परीक्षणों में मजबूती से सक्षम किया जा सके ।

अंत में, हम प्रदर्शित करते हैं कि पीबीएमसी के विश्लेषण से प्रमुख डीडीआर कारकों के खुराक-निर्भर पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन दिखाकर डीएनए-हानिकारक एजेंटों की प्रतिक्रिया को कैसे सूचित किया जा सकता है, जिसका उपयोग नैदानिक विकास को आकार देने में मदद करने के लिए किया जा सकता है। आगे की तलाश, उन तरीकों का कार्यान्वयन जो पश्चिमी ब्लॉटिंग (जैसे, मास स्पेक्ट्रोमेट्री40)की तुलना में अधिक मात्रात्मक हैं और कम इनपुट सामग्री (जैसे केशिका पश्चिमी ब्लॉटिंग और एलिसा) की आवश्यकता होती है, इन प्रीक्लिनिकल परिणामों को पीबीएमसी रोगी नमूनों के अधिक मजबूत, व्यवस्थित मूल्यांकन की ओर ले जाने में मदद करेगा।

Disclosures

सभी लेखक हैं या एस्ट्राजेनेका के कर्मचारी और हितधारक थे। वीएम Acerta फार्मा के एक कर्मचारी है, AstraZeneca और गिलाद विज्ञान में शेयर का मालिक है ।

Acknowledgments

हम प्रोटोकॉल पर उनकी प्रतिक्रिया के लिए एस्ट्राजेनेका ऑन्कोलॉजी रिसर्च एंड अर्ली डेवलपमेंट में ट्रांसलेशनल मेडिसिन के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं, विशेष रूप से हेडली कैर, टैमी ये और नाथन स्टैंडीफर सीटीडीएनए विश्लेषण के लिए प्लाज्मा तैयारी पर सलाह के लिए, पीबीएमसी अलगाव पर, और पीबीएमसी क्रायोप्रिजर्वेशन और इम्यूनोफेनोटाइपिंग, क्रमशः।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL cryovial Nalgene, ThermoFisher 5000-1020 To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs
1.5 mL microcentrifuge tubes VWR 525-0990 This is an example, use your preferred provider
15 mL conical sterile propylene centrifuge tube Nunc, ThermoFisher 339651 Other brands can be used
2 mL screw cap tube sterile, with attached cap ThermoFisher 3463 For plasma aliquoting
20X TBS Buffer ThermoFisher Scientific 28358 Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider
20X TBS Tween 20 Buffer ThermoFisher Scientific 28360 Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer
Automated cell counter or haemocytometer ThermoScientific AMQAX1000 We use Countess device and slides but could be other methods.
Adjustable micropipette allowing 50 µL measurements To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)
BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL BD 362761, 362753 There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw
Cell-freezing box ThermoFisher Scientific 5100-0001 This is an example, use your preferred provider.
Centrifugation unit converter LabTools http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/
DMSO Sigma-Aldrich, MERK D2438 Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation
ECL horseradish peroxidase substrate ThermoFisher 34075 Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems.
Faxitron MultiFocus X-ray cabinet Faxitron Bioptics To irradiate blood. Other models/makers are available
Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated ThermoScientific 102706 Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation
Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes VWR 414004-018 Optional
Fixed-angle rotor centrifuge Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics
Gel doc imaging system SYNGENE For imaging HRP developed membranes
Heat block To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors
Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge Thermoscientific Heraeus Megafuge 40R This is an example
Liquid nitrogen/dry ice To flash-freeze samples
Marvel dried skimmed milk Premier Foods This is an example, use your preferred provider
Micropipette tips for range 1-200 µL To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)
NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells ThermoFisher Scientific NP0321BOX This is an example, cast your own or use your preferred provider
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) ThermoFisher Scientific NP0007 For imaging HRP developed membranes
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) ThermoFisher Scientific NP0009 This is an example.
PBS, no calcium, no magnesium Gibco, ThermoFisher 14190-144 This is usually provided in the clinical kit.
Phosphatase inhibitor cocktail 2 Sigma-Aldrich, MERK P5726-1ML Optional for step 3.7
Phosphatase inhibitor cocktail 3 Sigma-Aldrich, MERK P0044-1ML Optional for step 3.7
Rabbit anti GAPDH Cell Signaling Technology CST 2128 1:1000 dilution in 5% milk TBST
Rabbit anti γH2AX Cell Signaling Technology CST 2577, lot 11 1:2000 dilution in 5 % milk TBST
Rabbit anti pS1981 ATM Abcam ab81292 1:2000 dilution in 5 % milk TBST
Rabbit anti pS635 RAD50 Cell Signaling Technology CST 14223 1:1000 dilution in 5 % milk TBST
Rabbit anti total ATM Abcam ab32420 1:1000 dilution in 5 % milk TBST
Rabbit anti total RAD50 Cell Signaling Technology CST 3427, lot 2 1:1000 dilution in 5 % milk TBST
RIPA buffer Sigma-Aldrich, MERK R0278-50ML For cell lysis. This is an example, use your preferred provider
Sonicator Diagenode B01060010 Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator.
Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes VWR 414004-030 This is an example, use your preferred provider
Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume) Costar 4101, 4051 This is an example, use your preferred provider
Trypan blue ThermoScientific T10282 This is for the automated cell counter listed above.
Wet ice To keep plasma samples and lysates cold

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoelder, S., Clarke, P. A., Workman, P. Discovery of small molecule cancer drugs: successes, challenges. and opportunities. Molecular Oncology. 6, 155-176 (2012).
  2. Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 57-77 (2018).
  3. Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA repair in cancer: beyond PARP inhibitors. Cancer Discovery. 1, 20-37 (2017).
  4. Pettersson, M., Crews, C. M. PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs)-Past, present and future. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 15-27 (2019).
  5. Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nature Reviews Cancer. 12, 278-287 (2012).
  6. Thomas, A., Teicher, B. A., Hassan, R. Antibody-drug conjugates for cancer therapy. The Lancet Oncology. 17 (6), 254 (2016).
  7. Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
  8. Jones, G. N., et al. pRAD50: a novel and clinically applicable pharmacodynamic biomarker of both ATM and ATR inhibition identified using mass spectrometry and immunohistochemistry. British Journal of Cancer. 119 (10), 1233-1243 (2018).
  9. Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 419-431 (2014).
  10. Overman, M. J., et al. Use of research biopsies in clinical trials: are risks and benefits adequately discussed. Journal of Clinical Oncology. 31 (1), 17-22 (2012).
  11. Olson, E. M., Lin, N. U., Krop, I. E., Winer, E. P. The ethical use of mandatory research biopsies. Nature reviews Clinical Oncology. 8, 620-625 (2011).
  12. O'Donnell, A., et al. Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of the oral mammalian target of rapamycin inhibitor Everolimus in patients with advanced solid tumors. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1588-1595 (2008).
  13. Fong, P. C., et al. Inhibition of Poly(ADP-Ribose) polymerase in tumors from BRCA mutation carriers. The New England Journal of Medicine. 361 (2), 123-134 (2009).
  14. Verschoor, C. P., Kohli, V., Balion, C. A comprehensive assessment of immunophenotyping performed in cryopreserved peripheral whole blood. Cytometry B Clinical Cytometry. 94 (5), 662-670 (2018).
  15. Ruitenberg, J. J., et al. VACUTAINER®CPT™ and Ficoll density gradient separation perform equivalently in maintaining the quality and function of PBMC from HIV seropositive blood samples. BMC Immunology. 7 (11), (2006).
  16. Yamashita, M., et al. A novel method for evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by flowcytometry using cryopreserved human peripheral blood mononuclear cells. Scientific Reports. 6 (19772), 1-10 (2016).
  17. Schiavon, G., et al. Analysis of ESR1 mutation in circulating tumor DNA demonstrates evolution during therapy for metastatic breast cancer. Science Translational Medicine. 7 (313), 182 (2015).
  18. Lee, J., et al. Tumor genomic profiling guides metastatic gastric cancer patients to targeted treatment: the VIKTORY umbrella trial. Cancer Discovery. , (2019).
  19. Abbosh, C., et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution. Nature. 545, 545 (2017).
  20. Thress, K. S., et al. Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Nature Medicine. 21 (6), 560-562 (2015).
  21. Rossi, G., Ignatiadis, M. Promises and pitfalls of using liquid biopsy for precision medicine. Cancer Research. 79 (11), 2798-2804 (2019).
  22. Balasubramanian, P., et al. Isolation and characterisation of circulating tumor cells (CTCs) from peripheral blood specimens of patients with advanced solid tumor malignancies (using ApoStream® instrumentation) [abstract 3062]. Proceedings of the Annual meeting of the American Association for Cancer Research. , San Diego, CA. (2014).
  23. Qin, J., Alt, J. R., Hunsley, B. A., Williams, T. L., Fernando, M. R. Stabilization of circulating tumor cells in blood using a collection device with a preservative reagent. Cancer Cell International. 14 (13), 1-6 (2014).
  24. Biomarkers definitions working group. Biomarkers and surrogate endpoints: preferred definitions and conceptual framework. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 69 (3), 89-95 (2001).
  25. Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 472-484 (2013).
  26. Bundred, N., et al. Evaluation of the pharmacodynamics of the PARP inhibitor olaparib: a phase I multicentre trial in patients scheduled for elective breast cancer surgery. Investigational New Drugs. 31, 949-958 (2013).
  27. Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Advances in Clinical Chemistry. 92, 141-199 (2019).
  28. Grievink, H. W., et al. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: cell recovery and viability, population composition and cell functionality. Biopreservation and Biobanking. 14 (5), 410-415 (2016).
  29. Khadka, M., et al. The effect of anticoagulants, temperature, and time on the human plasma metabolome and lipidome from healthy donors as determined by liquid chromatography-mass spectrometry. Biomolecules. 9 (5), 1-15 (2019).
  30. Hellmann, M. D., et al. Circulating tumor DNA analysis to assess risk of progression after long-term response to PD-(L)1 blockade in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (12), 2849-2858 (2020).
  31. ClinicalTrials.gov [Internet}. Identifier NCT03328273, A study of AZD6738 and Acalabrutinib in subjects with relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL). National Library of Medicine (US). , Bethesda (MD). Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03328273 (2017).
  32. Kirschner, M. B., et al. The impact of hemolysis on cell-free microRNA biomarkers. Frontiers in Genetics. 4 (94), 1-13 (2013).
  33. Blackford, A. N., Jackson, S. P. ATM, ATR, and DNA-PK: The Trinity at the Heart of the DNA Damage Response. Molecular Cell. 66, 801-817 (2017).
  34. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral Blood Mononuclear Cells: Isolation, Freezing, Thawing, and Culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
  35. Basavaraj, M. G., Østerud, B., Hansen, J. B. Influence of different anticoagulants on monocyte procoagulant functions and monocyte-platelet aggregates formation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1673-1676 (2011).
  36. Biancotto, A., Feng, X., Langweiler, M., Young, N. S., McCoy, J. P. Effect of anticoagulants on multiplexed measurements of cytokine/chemokines in healthy subjects. Cytokine. 60, 438-446 (2012).
  37. Wawrzyniak, R., et al. New plasma preparation approach to enrich metabolome coverage in untargeted metabolomics: plasma protein bound hydrophobic metabolite release with proteinase K. Scientific Reports. 8, 1-10 (2018).
  38. Duffy, D., et al. Standardized whole blood stimulation improves immunomonitoring of induced immune responses in multi-center study. Clinical Immunology. 183, 325-335 (2017).
  39. Wang, L., et al. Standardization of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells through a resting process for clinical immunomonitoring- development of an algorithm. Cytometry A Clinical Cytometry. 89, 246-258 (2016).
  40. Whiteaker, J. R., et al. Targeted mass spectrometry enables robust quantification of FANCD2 mono-ubiquitination in response to DNA damage. DNA Repair. 65, 47-53 (2018).
  41. Lam, N. Y., Rainer, T. H., Chiu, R. W., Lo, Y. M. EDTA is a better anticoagulant than heparin or citrate for delayed blood processing for plasma DNA analysis. Clinical Chemistry. 50, 256-257 (2004).
  42. Parpart-Li, S., et al. The effect of preservative and temperature on the analysis of circulating tumor DNA. Clinical Cancer Research. 23 (10), 2471-2477 (2017).

Tags

मेडिसिन अंक 169 परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल पीबीएमसी प्लाज्मा नैदानिक परीक्षण बायोमार्कर मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूब फार्माकोडायनामिक्स ट्रांसलेशनल साइंस डीएनए क्षति प्रतिक्रिया डीडीआर
बायोमार्कर विश्लेषण के लिए नैदानिक परीक्षण स्थलों पर एक एकल रक्त ड्रा से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल छर्रों और प्लाज्मा की तैयारी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marco-Casanova, P., Lukashchuk, N.,… More

Marco-Casanova, P., Lukashchuk, N., Lombardi, B., Munugalavadla, V., Frigault, M. M., Harrington, E. A., Barrett, J. C., Pierce, A. J. Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis. J. Vis. Exp. (169), e60776, doi:10.3791/60776 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter