Summary
في هذا البروتوكول، نقدم تصميم تجريبي باستخدام نظام الضربة القاضية المشروطة ومقايسة تشكيل الكرة المكيفة لدراسة تأثير التكتل على جذع GCSCs المشتق من المريض. يمكن تكييف البروتوكول بسهولة لدراسة كل من في المختبر وفي وظيفة الجسم الحي للجينات المرتبطة بالرباط في أنواع مختلفة من CSCs.
Abstract
وتورط الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) في بدء الورم، والتنمية وتكرار بعد العلاج، وأصبحت مركز اهتمام العديد من الدراسات في العقود الماضية. ولذلك، من المهم تطوير أساليب للتحقيق في دور الجينات الرئيسية المشاركة في الخلايا السرطانية الجذعية. سرطان المعدة (GC) هو واحد من أكثر أنواع السرطان شيوعاً وفانياً. ويعتقد أن الخلايا الجذعية سرطان المعدة (GCSCs) لتكون جذر الانتكاس سرطان المعدة, الانبثاث ومقاومة المخدرات. هناك حاجة إلى فهم علم الأحياء GCSS لدفع تطوير العلاجات المستهدفة وفي نهاية المطاف للحد من الوفيات بين المرضى. في هذا البروتوكول، نقدم تصميم تجريبي باستخدام نظام الضربة القاضية المشروطة ومقايسة تشكيل الكرة المكيفة لدراسة تأثير التكتل على جذع GCSCs المشتق من المريض. يمكن تكييف البروتوكول بسهولة لدراسة كل من في المختبر وفي وظيفة الجسم الحي للجينات المرتبطة بالرباط في أنواع مختلفة من CSCs.
Introduction
سرطان المعدة (GC) هو واحد من أكثر أنواع السرطانات شيوعاً وفانياً1. على الرغم من التقدم في الجراحة المشتركة, العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي في العلاج GC, التكهن لا يزال ضعيفا ومعدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات لا يزال منخفضا جدا2. تكرار و الانبثاث هي الأسباب الرئيسية التي تسبب وفيات ما بعد العلاج.
الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) هي مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية التي تمتلك القدرة على تجديد الذات وتوليد أنساب الخلايا المختلفة التي تعيد تشكيل الورم3. ويعتقد أن CSCs مسؤولة عن الانتكاس السرطان والنقائل بسبب قدراتها على تجديد الذات وبذر الأورام الجديدة، فضلا عن مقاومتها للعلاج الكيميائي التقليدي- والعلاجات الإشعاعية4. ولذلك، فإن استهداف مراكز خدمات الصحة وتكميل الأطفال والقضاء على الإيدز يوفران إمكانات مثيرة لتحسين العلاج والحد من وفيات مرضى السرطان.
وقد تم عزل CSCs من أنواع كثيرة من الأورام الصلبة5. في عام 2009، تم وصف الخلايا الجذعية سرطان المعدة (GCSCs) معزولة عن خطوط خلايا سرطان المعدة البشرية أصلا من قبل Takaishi وآخرون6. شين وزملاؤه أول تحديد ونقاء GCSCs من الغدة الغدة في المعدة البشرية (GAC) أنسجة الورم7. هذه النتائج لا توفر فرصة لدراسة علم الأحياء GCSS فحسب ، بل توفر أيضًا أهمية سريرية كبيرة.
ومن الخصائص الخاصة لCsSCs قدرتها على تشكيل المجال8. يتم وضع مطلي في الخلايا الفردية في ظروف غير مُضَمَّة بكثافة منخفضة، والخلايا التي تمتلكها ذاتية التجديد هي وحدها التي يمكن أن تنمو لتصبح كتلة صلبة كروية تسمى كرة. وهكذا، فإن تحليل تكوين المجال قد اعتبر معيار الذهب والتقييس وتستخدم على نطاق واسع لتقييم الخلايا الجذعية إمكانية التجديد الذاتي في المختبر.
تدخل الحمض النووي الريبي (RNAi) هو أداة بحثية قوية لدراسة وظيفة الجينات من قبل الضربة القاضية من جين محدد9. ومع ذلك ، فإن التكنولوجيات الجينية المستقرة على المدى الطويل لها بعض القيود ، مثل التحدي المتمثل في استكشاف وظيفة الجين الضروري لبقاء الخلية. يمكن أن تكون أنظمة RNAi الشرطية مفيدة في التنطي السفلي للجينات المرغوبة بطريقة زمنية و/أو خاصة خاضعة للرقابة من خلال إدارة عامل محفز. وtratecline (التيت)-نظم غير قابلة للانطلاق هي واحدة من أنظمة RNAi الشرطية الأكثر استخداما على نطاق واسع10. يمكن للأنظمة التيت غير القابلة للحث على إسكات الجينات المستهدفة من خلال التحكم في التعبير عن shRNA عند إضافة محفز خارجي (دوكسيسيكلين بشكل تفضيلي ، Dox). يمكن تقسيم أنظمة Tet-inducible إلى نوعين: أنظمة Tet-On أو Tet-Off. يمكن تشغيل التعبير عن shRNA (Tet-On) أو إيقاف تشغيله (Tet-Off) في وجود المستحث. في نظام Tet-ON بدون مستحث، يرتبط مكابر Tet (Tet) (Tet) المعبّر عنه بشكل مكوّن بسلسلة عناصر تيت مستجيبة (TRE) التي تحتوي على مروج معتمد على Pol III مستجيب للتيت للتعبير عن SHRNA، وبالتالي قمع التعبير عن shRNA. في حين أن على إضافة دوكس، يتم عزل TetR بعيدا عن المروج التي تستجيب Tet Pol III. وهذا يسهل التعبير عن shRNA ويؤدي إلى ضربة قاضية الجينات.
البروتوكول الموصوف هنا يستخدم نظام شرنا التتراسيكلين الوظيفية غير القابلة للتكريس ومقايسة تكوين المجال المتكيف لدراسة وظيفة التكتل في GCSCs المشتقة من المريض.11 نستخدم البروتوكول الموصوف لدراسة آثار التكتل في التجديد الذاتي GCSCs. هذه المنهجية تنطبق أيضا على أنواع أخرى من الخلايا الجذعية السرطانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت جميع التجارب باستخدام الخلايا الجذعية السرطان المعدية المستمدة من المريض المذكورة هنا من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية7.
1. سرطان المعدة زراعة الخلايا الجذعية
- إعداد GCSCs ثقافة كاملة المتوسطة
- إعداد GCSCs ثقافة كاملة المتوسطة عن طريق إضافة الطازجة DME / F12 المتوسطة مع المكونات الأساسية التالية: 20 نانوغرام / مل EGF، 10 نانوغرام / مل bFGF، 1٪ الأنسولين / Transferrin / الصوديوم سيلينيت، 0.2٪ الجلوكوز، 0.5٪ B27، 1٪ الجلوتاماكس، 1٪ غير الضرورية الأحماض الأمينية، 10 ميكرومتر 2-mercaptoethanol، 0.75 ملغ/ مل NaHCO3،10 ميكرومتر thioglycerol، 100 وحدة دولية/ مل بينسيلين و 100 ميكروغرام/مل ستريبتوميسين. تصفية وتعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
ملاحظة: يوصى بـ GCSC كامل الثقافة المتوسطة تخزين يفضل أن لا يزيد عن أسبوعين في 4 درجة مئوية.
- إعداد GCSCs ثقافة كاملة المتوسطة عن طريق إضافة الطازجة DME / F12 المتوسطة مع المكونات الأساسية التالية: 20 نانوغرام / مل EGF، 10 نانوغرام / مل bFGF، 1٪ الأنسولين / Transferrin / الصوديوم سيلينيت، 0.2٪ الجلوكوز، 0.5٪ B27، 1٪ الجلوتاماكس، 1٪ غير الضرورية الأحماض الأمينية، 10 ميكرومتر 2-mercaptoethanol، 0.75 ملغ/ مل NaHCO3،10 ميكرومتر thioglycerol، 100 وحدة دولية/ مل بينسيلين و 100 ميكروغرام/مل ستريبتوميسين. تصفية وتعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
- استعادة GCSCs والثقافة
ملاحظة: تم الحصول على GCSCs على النحو التالي: تعرضت عينات الورم للتفكك الميكانيكي والإنزيمي. تم الحصول على تعليق خلية واحدة عن طريق التصفية مع شبكة النايلون من التعليق المتناثرة بشكل جيد. تم استزراع الخلايا السرطانية الناتجة في GCSCs كاملة الثقافة المتوسطة، ونمت بعض الخلايا لتشكيل المجالات. ثم تعرضت هذه المجالات للانفصام الأنزيمي، ويمكن الحصول على شهادة الثانوية العامة عن طريق الفرز الخلوي لزنزانات الخلايا الملطخة بعلامات CD44/CD54. وقد تم الإبلاغ عن البروتوكول التفصيلي والتشهين الوظيفي لـ GCSCs7.- قبل دافئ GCSC إكمال ثقافة متوسطة في 37 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة.
- إزالة الجليد GCSC من تخزين النيتروجين السائل وذوبان اكوام البحر بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية. الحفاظ على دوامة قارورة حتى يذوب المحتوى بأكمله تماما.
ملاحظة: ذوبان الخلايا المجمدة بسرعة (<1 دقيقة) في حمام مائي 37 °C. - نقل محتويات كامل من cryovials إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 مل تحتوي على 10 مل من GCSCs ثقافة كاملة المتوسطة. جهاز طرد مركزي عند 800 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
- التعرق بعناية وتعليق بيليه الخلية في 10 مل من GCSCs الطازجة المتوسطة كاملة. لوحة تعليق الخلية في طبق بيتري 100 ملم. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 حاضنة وإضافة 5 مل من المتوسط الطازج الكامل في اليوم الثالث.
- ثقافة فرعية من أورام GCSCs
ملاحظة: GCSCs من مركز أورامpheres فقط لديها ما يكفي من المواد الغذائية قبل حجم المجالات تنمو تصل إلى 80-100 μm في القطر. مرة واحدة في مناطق الانكسار الظلام وانخفاض تظهر (حوالي 6 أيام من الثقافة)، فمن الضروري أن تكون زراعة فرعية في أورام.- يهز الطبق بلطف ونقل استزراع أورام الغلاف العام للأورام الوسيط (المتوسط و الـ أورام غير المنضم) إلى أنبوب طرد مركزي معقمة 15 مل. وبالنسبة للأحجام المتوسطة الأكبر، قد تكون هناك حاجة إلى أنابيب أكبر للطرد المركزي.
- جهاز طرد مركزي في 600 × ز لمدة 5 دقائق والتخلص بعناية من الفائق. بعد الطرد المركزي، ستكون بيليه بيضاء بيضاء مرئية.
- إضافة 2 مل من حل تفكك الخلية ل resuspend بيليه للتفكك الميكانيكية والإنزيمية في 37 درجة مئوية. بلطف pipet صعودا وهبوطا 10 مرات كل 2-3 دقيقة في عملية الهضم لكسر مجالات بعيدا حتى يتم تفريق أوراموسفيرس في تعليق خلية واحدة. ويوصى أن تكون عملية الانفصام الكلي هذه أقل من 15 دقيقة.
ملاحظة: قم بإجراء فحص مرئي تحت المجهر للتأكد من عدم وجود مجالات كبيرة أو مجاميع الخلايا. - إضافة 10 مل من 10 ساخنة 10 10 166 ساخنة جديدة 10 10 g ساخنة GCSCs 10 10 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000
- تجاهل السوبر و resuspend الخلايا مع 1 مل من جديد قبل تدفئة GCSCs ثقافة كاملة المتوسطة. بذور عدد مناسب من الخلايا في جديد 100 مم بتري طبق مع 10 مل من الطازجة قبل تدفئة GCSCs الثقافة المتوسطة كاملة واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
- إعادة تغذية الثقافات أورامفيرس بعد 3 أيام بإضافة 5 مل من الطازجة قبل الدافئة المتوسطة كاملة. بعد 6 أيام، الخلايا مرور عندما تنمو الأورام تصل إلى 80-100 μm في القطر.
- الحفظ بالتبريد لـ GCSCs
ملاحظة: لا cryopreserve خلايا GCSCs عن طريق إضافة متوسطة إلى أوراموسفيرس مباشرة. وينبغي هضم أورام GCSCs في خلايا واحدة بحيث يمكن أن تدخل عامل حماية الخلية كل خلية لضمان التخزين مستقرة على المدى الطويل من الخلايا. تأكد من الخلايا في وضع صحي ودون تلوث.- حصاد GCSCs أورام. جهاز طرد مركزي في 600 × ز لمدة 5 دقائق.
- تجاهل supernatant وإضافة 2 مل من حل تفكك الخلية لتفكك الأورام GCSCs في 37 درجة مئوية. إنهاء عملية الهضم عن طريق إضافة 10 مل من GCSCs ثقافة كاملة المتوسطة.
- جهاز طرد مركزي في 800 × ز لمدة 5 دقائق وجمع GCSCs واحد.
- تعليق بلطف GCSCs مع المصل خالية من المبرد المتوسط. التركيز النهائي الموصى به هو 5 × 105 - 5 × 106 خلايا / مل.
- الاستغناء عن تعليق الخلية في 1 مل aliquots في قارورة المبردة ملحوظ.
- ضع على الفور cry التي تحتوي على الخلايا في غرفة ايزوبروبانول وتخزينها في -80 درجة مئوية. نقل قارورة إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي لتخزين على المدى الطويل.
2. توليد خطوط GCSCs غير قابلة للانهيك
تنبيه: تم تعيين فيروسات العدسية المؤتلفة ككائنات من المستوى 2 من قبل المعهد الوطني للصحة ومركز مكافحة الأمراض. ويتطلب العمل الذي يشمل فيروس العدس صيانة مرفق من المستوى 2 للسلامة البيولوجية، بالنظر إلى أن المواد الفيروسية الخارقة التي تنتجها هذه النظم النتوميفيروسية يمكن أن تحتوي على فيروس مأتلف يمكن أن يكون خطرا.
- توليد جزيئات فيروس العدس
- توليف 2 ناقلات العدسي الفيروسية التي تحمل shRNA غير قابل للتكريس تستهدف التكتل البشري وناقل نقص في فيروسات العدسي غير الموجه (GV307) من GeneChem استناداً إلى تصميم الجدول 1 (يحتوي GV307 vector على: TetIIP-TurboRFP-MCS (MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycin).
- البذور 4 × 106 293T العدسي الفيروسية خلايا التعبئة والتغليف في طبق بيتري 100 مم مع 10 مل من DMEM تكملها 10٪ مصل البقرة الجنينية.
- احتضان الخلايا 293T بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. تأكد من أن كثافة الخلايا 293T حوالي 50-80٪ التقاء يوم من نقل الدم.
- جلب متوسطة المصل إلى درجة حرارة الغرفة وانخفاض إعداد أنبوب A وB أنبوب كما هو موضح في الجدول 2.
- نقل أنبوب A في أنبوب B، مزيج جيدا، واحتضان المجمعات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإعداد مجمعات الدهون والحمض النووي.
- إزالة 5 مل من المتوسطة، قبل إضافة مجمع الحمض النووي الدهون، وترك ما مجموعه 5 مل.
- إضافة 5 مل من مجمع الدهون والحمض النووي في طبق الثقافة قطرة ودوامة بلطف الطبق لتوزيع المجمع.
ملاحظة: الاستغناء بعناية السائل ضد جدار الطبق لتجنب مزعج 293T الخلايا. - احتضان طبق الثقافة لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
- بعد 24 ساعة بعد نقل، وإزالة بعناية وسيط transfection واستبدال بلطف مع 10 مل من DMEM قبل الدافئة تكملها مع 10٪ FBS. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
ملاحظة: يجب أن تعامل جميع المابير والنصائح مع 10٪ التبييض قبل التخلص منها. - ما يقرب من 48 ساعة بعد transfection، حصاد 10 مل من عظمى التي تحتوي على فيروس العدين.
ملاحظة: يجب أن تعامل جميع الأوعية ونصائح ثقافة الخلية مع 10٪ التبييض قبل التخلص منها. - تصفية عظمى العدسي الفيروسي باستخدام مرشح المسام 0.45 ميكرومتر لإزالة الحطام الخلوي.
ملاحظة: يجب أن تعامل جميع المرشحات والمحاقن مع 10٪ التبييض قبل التخلص منها. - نقل أوضح فائقة لحاوية معقمة، إضافة Concentrator Lenti-X (1/3 حجم من اضح افرنح) لخلطها عن طريق انقلاب لطيف.
- احتضان الخليط في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- عينات من أجهزة الطرد المركزي عند 1500 x غم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، وبيضاء بيليه ستكون مرئية. إزالة بعناية فائقة، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه.
ملاحظة: يجب أن تعامل جميع المابير والنصائح مع 10٪ التبييض قبل التخلص منها. - إعادة بناء بلطف بيليه في 1 مل من DMEM تكمل مع 10٪ FBS كما الأسهم الفيروس، وتخزين في -80 درجة مئوية.
- توليد خطوط الخلايا المُصابة بالعدوى المستقرة
- البذور 6 × 106 GCSC في طبق بيتري 100 مم مع 10 مل DMEM تكملها 10٪ FBS ل 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 (70-80٪ التقاء قبل العدوى).
- اضمّر المتوسطة في الطبق، أضف جزيئات النيدسفيرال المركزة المخففة بـ 4 مل من متوسطة DMEM الكاملة التي تحتوي على كاشف بوليبرين (5 ميكروغرام/مل) في الطبق. احتضان لمدة 18 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
ملاحظة: التركيز الأمثل من البوليبرين يعتمد على نوع الخلية، وقد تحتاج إلى أن تكون اختبار في تركيزات مختلفة لتحديد التركيزات الفعالة. وإلا فقد يتم تحديدها تجريبياً، وعادة ما تكون في حدود 2-10 ميكروغرام/مل. يجب أن تعامل جميع الأنابيب والنصائح مع 10٪ التبييض قبل التخلص منها. - تغيير المتوسطة، مع استبدال 10 مل من DMEM مع 10٪ FBS المتوسطة واحتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
ملاحظة: يجب أن تعامل جميع النصائح والنصائح مع 10٪ التبييض قبل التخلص منها. - اضمحلال المكبر مع حطام الخلية، مع استبدال DMEM الطازجة تكمل مع 10٪ FBS المتوسطة التي تحتوي على البوروميسين (2.5 ميكروغرام / مل) واحتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. ثم استبدال DMEM الطازجة مع 10٪ FBS المتوسطة التي تحتوي على البوسوميسين (5 ميكروغرام / مل) واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 ل 24 ساعة إضافية.
- شطف GCSC المتمسك مرتين مع 5 مل من DPBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم.
- افصل GCSC مع 1 مل من محلول تفكك الخلايا قبل تسخينها واحتضان 2-3 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- إضافة 5 مل من الطازجة قبل تدفئة GCSCs ثقافة كاملة متوسطة إلى تعليق الخلية.
- الاستغناء 3 مل في أنبوب الطرد المركزي 15 مل (أنبوب A) للتبريد تحفظ الخلايا, وغيرها 3 مل في أنبوب الطرد المركزي 15 مل (أنبوب B) لحفز من doxycycline.
- أنبوب الطرد المركزي A وB أنبوب في 800 × ز لمدة 5 دقائق.
- Resuspend بيليه من أنبوب A مع 1 مل من المصل خالية من المبرد المتوسط، ونقل القارورة إلى -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها، وإزالتها في تخزين النيتروجين السائل.
- التعرق و resuspend خلايا أنبوب B في 1 مل من جديد قبل تدفئة GCSCs الثقافة المتوسطة كاملة. بذور عدد مناسب من الخلايا في جديد 100 ملم بيتري طبق من 10 مل الطازجة قبل تدفئة GCSCs ثقافة كاملة المتوسطة مع دوكسيسسيكلين (Dox) (2.5 ميكروغرام / مل) واحتضان ل 48 ح في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
ملاحظة: قد يختلف التركيز الأمثل لـ Dox بين خطوط الخلايا. وينبغي اختبار كل خط خلية في تركيزات مختلفة دوكس لتحديد التركيزات الفعالة لKD والسمية على الخلايا. - تأكيد القمع المستقر للكسترين في GCSCs عن طريق النشاف الغربية.
3. المجال تشكيل الحسبة
- ذوبان خطوط GCSCs غير قابل للذوبان المجمدة (انظر الخطوة 1.2).
- تحديد كثافة الخلايا القابلة للتطبيق لعينة 10 ميكرولتر باستخدام عداد الخلايا الآلي.
- ضبط مستوى الصوت مع GCSCs قبل الدافئة كاملة ثقافة المتوسطة للحصول على تركيز 2 × 104 خلايا قابلة للحياة / مل.
- الاستغناء في 3 جديدة 96-جيدا فائقة منخفضة مرفق لوحة الآبار (0.1 مل / حسنا) كل مجموعة.
- احتضان الخلايا في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. يجب أن يحدث تشكيل المجال في غضون 3-10 أيام. مراقبة وتسجيل التصور من الأورام تشكيل كل 2 أيام.
ملاحظة: لا ينصح بتغيير الوسيطة في حالة حدوث أي اضطراب في تكوين أورامفير. وينبغي أن تميز هذه الـ"أورام" بسهولة عن الخلايا المفردة والمجمّعة. - تحديد نتائج تكوين أورامفير من خلال تقييم أحجام أورام الفيرات المشكلة باستخدام برامج التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم زرع الخلايا الجذعية لسرطان المعدة من غدية المعدة البشرية الأولية في وسط الثقافة الخالية من المصل. بعد 6 أيام، توسعت الخلايا من النمط الظاهري الشبيه بالخلايا المفردة(الشكل 1أ)لتشكيل مجالات كبيرة (الشكل 1B).
لتقييم وظيفة التكتل في GCSCs، تم استنساخ تسلسلات shRNA ضد التكتل والمشوش في متجه Tet-GV307-RFP-بورن بعد البروتوكول الموضح أعلاه. GCSCs مُصابة بشكل ثابت مع متتراسيكلين ينظم SHRNA-clusterin التعبير ناقلات ولدت ثم تعامل مع دوكسيسيكلين لمدة 48 ساعة(الشكل 2) (و shRNA تدافعت كتحكم). تم التحقق من مستوى التعبير من التكتل من قبل لطخة الغربية وقياسها كميا في وقت لاحق بواسطة قياس الكثافة (الشكل 3).
واستُخدمت مقايسة تكوين المجال لاختبار إمكانات التجديد الذاتي لشهادة GCSCs. افترضنا أن التكتل يعزز إمكانات التجديد الذاتي لـ GCSCs ، وبالتالي يجب ملاحظة عدد أقل من المجالات عندما يتم تنظيم التكتل لأسفل بإضافة doxycycline. لقد أثبتنا أن وجود دوكسيسكلين وsydown من التكتل في GCSCs تثبيط تشكيل أورام (الشكل 4). لم تكن أحجام الخلايا/المجال لـ GCSCs تتزايد عندما تم تقليل التكتل في GCSCs(الشكل 5). لم يلاحظ أي تثبيط للأورام تشكيل مع GCSCs مُنَجَّع مع الضوابط shRNA المشوشة، مما يشير إلى أن دوكسيسيكلين لم يكن له تأثير مثبط على تكوين أورامفير(الشكل 5). وتشير هذه النتائج إلى أنه بعد تكديس إسكات, GCSCs تنمو ببطء ولا يمكن تشكيل أورام. استنادا إلى البيانات في المختبر, التكتل يلعب دورا حاسما في تعزيز نشاط التجديد الذاتي من GCSC, مشيرا إلى أن التكتل يمكن أن يكون هدفا واعدا للأدوية في قمع CSCs في المرضى GC.
الشكل 1: الثقافات الخلية للخلايا الجذعية سرطان المعدة. تم استزراع الثقافات خلية واحدة من الخلايا الجذعية سرطان المعدة لمدة 6 أيام. تم التقاط صور مجهرية على النقيض من المرحلة لهذه الخلايا / المجالات في اليوم 0 (A) واليوم 6 (B). التكبير الأصلي: 10x. حجم الشريط: 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: KD الشرطية من التعبير التكند في الخلايا الجذعية سرطان المعدة. تم إنشاء خطوط GCSCs عن طريق إصابة التحكم في الـsrnaiviral غير القابلة للتسريب (shCtrl) أو استهداف SHRNA غير القابل للتكتل (shClu1, shClu2). وقد عولجت هذه الخطوط الخلوية بـ (Dox+) أو بدون Dox (2.5 ميكروغرام/مل) (دوكس-) لمدة 48 ساعة كما هو مذكور. تم عرض الملاحظة على النقيض من المرحلة لهذه الخلايا في اللوحة العلوية. تم عرض الملاحظة المناعية (الحمراء) من هذه الخلايا في لوحة أسفل. التكبير الأصلي: 10x. حجم الشريط: 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التعبير عن التكتل في خطوط GCSCs غير قابلة للانهزاز مع أو بدون علاج Dox. تحليل النشاف الغربية للتعبير التكداد في خطوط الخلية بشكل ثابت مع transly مع tetracycline-ينظم shRNA-clusterin (shClu1, shClu2) وتدافعت (shCtrl) ناقلات التعبير بعد 2 أيام من العلاج doxycycline. تم تحديد مستوى التعبير النسبي للكوستين قياساً كمياً بواسطة قياس الكثافة وتم تطبيعه ضد β-actin، ثم تم الإشارة إليه تحت ممرات البقع الغربية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور مجهرية على النقيض من المرحلة لخلايا/مجالات GCSCs غير قابلة للانهيك. تم احتضان خلية واحدة من خطوط GCSCs القابلة للاختناق والمعالجة بدون Dox (اللوحة العلوية) أو مع Dox (اللوحة السفلية) لمدة 6 أيام. وقد التقطت صور مجهرية على النقيض من المرحلة لهذه الخلايا/المجالات في اليوم السادس كما هو مبين. التكبير الأصلي: 10x. شريط مقياس، 20 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الضربة القاضية غير القابلة للانزهان من كلسترين تمنع GCSC القدرة على التجديد الذاتي. تم إجراء مقايسات تشكيل المجال في خطوط GCSS غير قابلة للانهيك. وقد التقطت صور مجهرية على النقيض من المرحلة لهذه الخلايا/المجالات في اليوم المشار إليه، وتم قياس أحجام الخلايا/الكرة من GCSCs. n> 30، ± خطأ قياسي من الوسط (SEM). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم جين | الانواع | معرف الجينات | تسلسل الاستهداف |
| CLU-1 | الانسان | 1191 | TGAAACAGACCTGCATGAA |
| CLU-2 | الانسان | 1191 | GGGAAGTAAGTACGTCAAT |
الجدول 1: تسلسلان يستهدفان الـ SHRNA ضد التكتل.
| مكون | حجم |
| أنبوب A | |
| متوسط المصل المخفض | 1.5 مل |
| كاشف نقل | 41 ميكرولتر |
| أنبوب B | |
| متوسط المصل المخفض | 1.5 مل |
| P3000 محسن الكاشف | 35 ميكرولتر |
| pHelper 1.0 (مكون هفوة / بول) | 9 ميكروغرام |
| pHelper 2.0 (مكون VSVG) | 6 ميكروغرام |
| shCLU 1/2 أو بلازميد التحكم | 12 ميكروغرام |
الجدول 2: حجم الإنتاج الفيروسي باستخدام العدوى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GC هو السبب الرئيسي الثالث للوفاة المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم. GCSCs حاسمة في الانتكاس سرطان المعدة, الانبثاث ومقاومة المخدرات. استخدام GCSCs من مرضى سرطان المعدة سوف تسمح لنا لاستكشاف نقطة ضعفهم وتطوير الأدوية المستهدفة لعلاج مرضى GC.
اختبار تكوين المجال هو وسيلة مفيدة لفحص السرطان الخلايا الجذعية إمكانية التجديد الذاتي في المختبر. ويمكن عرض النتائج كنسبة مئوية من المجالات التي شكلت مقسوما على العدد الأصلي من الخلايا المفردة المصنفة. قمنا بتكييف الطريقة الأصلية لحساب متوسط أحجام جميع الخلايا / المجالات في عدة نقاط زمنية لتحسين نتائج هذا الفحص وتسهيل قابليته لإعادة إنتاج أنواع أخرى من الخلايا الجذعية السرطانية. نحن شهادة أن النتيجة في هذا الفحص تعتمد اعتمادا كبيرا على عدد الخلايا المصنفة الأولية. هذه نقطة حرجة من هذا الفحص للحفاظ على عزل الخلية الأولية وإجراء قياس دقيق لعدد المستعمرات الكروية (باستثناء المجموعات الخلوية). بالإضافة إلى ذلك، من المهم تحسين وقت العد للتمييز الواضح بين المجالات من المجموعات الخلوية والخلايا المفردة.
أنظمة التيت غير قابلة للانكمز مفيدة لدراسة وظيفة الجينات التي تعتبر حاسمة لبقاء الخلية في المختبر، تماما مثل التكتل في هذا البروتوكول. كما أنها مفيدة لاستكشاف وظيفية الجينات في الجسم الحي; ويمكن القيام بذلك عن طريق إضافة دوكسيسيكلين في مياه الشرب للحيوانات. ومع ذلك ، فإن التسريبات في الحالة غير المستحثة هي مشكلة غالبا ما يتم الإبلاغ عنها من أنظمة Tet -inducible12. في التجربة المعروضة ، لوحظ أيضا انخفاض مستوى التسرب مع shClu2 ، كما هو مبين في الشكل 3. في هذه الحالة، يمكننا أن نقارن بعناية التغيرات في البروتين المستهدف في KD أو مخفوقة السيطرة الكشف في وجود وعدم وجود doxycycline لتقييم هذا التأثير. نقطة أخرى هامة هي كمية دوكسيسيكلين المطبقة في الثقافة. كما قد تختلف كمية دوكس بين خطوط الخلية, يجب اختبار كل خط الخلية مع جرعات دوإكس مختلفة لتحديد التركيزات الفعالة لKD والسمية على الخلايا.
ويوفر البروتوكول المعروض هنا تقنية فعالة لفك رموز الجينات المرتبطة بالوُبعة في مراكز خدمات الإيدز ودراسة بيولوجيا مراكز ال CSCs. ويمكن تكييف البروتوكول بسهولة لدراسة وظائف الجينات الحرجة الأخرى في الخلايا الجذعية السرطانية، مثل الجذعية والبقاء على قيد الحياة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الضربة القاضية المشروطة للتعبير الجيني في مراكز الدراسات الصحية متعددة الاختصاصات يمكن أن تدرس الوظائف البيولوجية للجينات المستهدفة ليس فقط في المختبر ولكن أيضا في الجسم الحي. ومع ذلك ، قد لا تشكل بعض CSCs فقط أورام صلبة نموذجية ، يجب تكييف هذا البروتوكول باستخدام طرق أخرى لفحص إمكانات التجديد الذاتي للخلايا الجذعية في المختبر ، على سبيل المثال ، فحص التعبير عن العلامات المرتبطة بالرساق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يُعلن عن تضارب المصالح.
Acknowledgments
وقد دعمت هذا العمل من قبل مؤسسة علوم الطبيعة في مقاطعة قوانغدونغ (2018A030310586، 2020A1515010989، مؤسسة البحوث العلمية الطبية لمقاطعة قوانغدونغ (A2019405)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81772957)، والعلوم و برنامج التكنولوجيا لمقاطعة قوانغدونغ في الصين (2017B030301016)، ومؤسسة الصناعة وتكنولوجيا المعلومات في شنتشن (20180309100135860).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 2068586 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3474 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G6152 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate | Gibco | 10569044 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Australia | Gibco | 10099141 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS -G), 100X | Gibco | 41400045 | |
| lentiviral vector | GeneChem | GV307 | |
| Lenti-X Concentrator | Takara | 631232 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | Gibco | 11140050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RB | |
| Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic Tubes | Thermo Scientific | 5000-1020 | |
| Nunc Cell Culture/Petri Dishes | Thermo Scientific | 171099 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Gibco | 15140122 | |
| pHelper 1.0 (gag/pol component) | GeneChem | pHelper 1.0 | |
| pHelper 2.0 (VSVG component) | GeneChem | pHelper 2.0 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| STEM-CELLBANKER Cryopreservation Medium | ZENOAQ | 11890 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Solution | Gibco | A1110501 | |
| UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5 | Invitrogen | 15567027 | |
| ZEISS Inverted Microscope | ZEISS | Axio Vert.A1 |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).
- Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope. Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).
- Takaishi, S., et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44. Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).
- Chen, T., et al. Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients. Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Hannon, G. J., Rossi, J. J. Unlocking the potential of the human genome with RNA interference. Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).
- Seibler, J., et al. Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system. Nucleic Acids Research. 35 (7), e54 (2007).
- Xiong, J., et al. Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function. International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).
- Ohkawa, J., Taira, K. Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter. Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).
