Summary
このプロトコルは、クローン病の完全に検証されたTNBS誘導マウスモデルと、パラフィンに埋め込まれたホルマリン固定結腸切片の免疫蛍光を用いた免疫体化学によるエストロゲン受容体の視覚化方法を提示する。
Abstract
クローン病は炎症性腸疾患の最も診断されたタイプです。腸内で発症する慢性炎症は、蠕動障害および腸粘膜の損傷を引き起こし、結腸新生物の変態のリスクの増加に関連していると思われる。蓄積された証拠は、エストロゲンとエストロゲン受容体がホルモン感受性組織だけでなく、肺や結腸などのエストロゲンに直接関係しない他の組織にも影響を与えることを示しています。ここでは、TNBS誘発クローン病のマウスモデルから得られた結腸におけるエストロゲン受容体の免疫蛍光染色に成功するためのプロトコルについて説明する。マウスおよび腸の準備におけるクローン病の誘導のための詳細なプロトコルと、ホルマリン固定パラフィン埋め込み腸切片を用いたステップバイステップの免疫ヒストリカル手順が提供される。記載された方法は、生体内でのエストロゲン受容体検出およびエストロゲンシグナル伝達の調査に有用であるだけでなく、大腸炎の発症に関与する可能性のある他のタンパク質にも適用することができる。
Introduction
クローン病(CD)は、慢性腸炎として現れる炎症性腸疾患(IBD)である。CDの病因は十分に理解されていないが、腸内微生物叢、食事やストレスなどの遺伝的および環境的要因を含むCDの発達を担っているように見えるいくつかの主要な要因がある1。クローン病の病因をよりよく理解するために、腸の炎症のいくつかのモデルが22、3、4、5、6、73,4,5,6を7使用されています。本稿では、CDの2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)誘導型マウスモデルから得られた結果を提示する。
エストロゲンは慢性腸炎88、9、10、11、129,10,11を調節できることが12文書化されている。エストロゲンの生物学的活性は、コグネイト受容体によって媒介され、その中でも核エストロゲン受容体(ER)、すなわち、ERα(遺伝子ESR1)およびERβ(遺伝子ESR2)、ならびにGタンパク質結合エストロゲン受容体、すなわちG.GPER(遺伝子GPER1)と呼13,ばれる。エストロゲン受容体のレベルを決定するためのいくつかの方法がありますが、腸内でそれらを視覚化するために使用できるのはごくわずかです。
免疫組織化学(IHC)は、フルオロクロム共役抗体を用いた細胞または組織における特定の抗原の検出に関する臨床および基礎研究で広く使用されている方法です。IHCは、組織構造の可視化や特定のタンパク質の同定と局在化において重要な方法であると考えられるため、大腸炎の発症を理解する上で重要な場合があります。ここでは、免疫蛍光を用いた腸内のエストロゲン受容体の免疫物質化学的可視化のための完全かつ検証されたプロトコルを提示する。
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Protocol
動物研究は、欧州議会および2010年9月22日の理事会の指令2010/63/EUに従って、地方倫理委員会(28/ŁB29/2016)の同意を得て実施されました。
1. クローン病のTNBS誘導マウスモデル
注:このプロトコルは、25〜28 gの雄BALB / Cマウスを使用しています。動物は一定の温度(22〜24°C)で収容され、相対湿度55±5%で収容され、標準的なチャウペレットと水道水アドリビタムへの自由なアクセスを持つ12時間の明暗サイクルで維持されます。
- 誘導室にマウスを置き、蓋をしっかりと閉じます。イソフルラン(1.5-2 L/分でO2流量で25%O2)でマウスを短時間麻酔します。
注意:呼吸数は通常よりもリズミカルで遅く、有害な刺激に反応して変化してはならない。 - カテーテルを介して遠位結腸に車体制御として0.9%NaClまたは0.9%NaClの0.1mLの30%エタノールで0.1mLの30%エタノールの4mgを植え付ける。
注:カテーテルは約3cmのアヌスに慎重に導入する必要があります。 - 体重、直腸出血、便の一貫性および死亡率を含む臨床パラメータのために2日目から8日目まで毎日マウスを監視する。
- 8日目に、頸部脱臼でマウスを安楽死させる。
図1:クローン病のTNBS誘発ネズミモデルのタイムラインこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
2. 結腸の分離と巨視的評価
注:結腸分離の1日前に、1mLのリン酸緩衝塩水(PBS)で抗生物質100μLを希釈し、一晩4°Cで放置します。
- 75%エタノールと滅菌ガーゼを使用して腹部の上に皮膚をきれいにします。
- 無菌はさみとピンセットを使用して、胸骨からアヌスに腹壁を切断します。
- 結腸をできるだけ近くに切り取り、盲腸に近づけます。
- ペトリ皿の上にコロンを置きます。アヌスからセカムの端に沿って結腸をカットします。冷たい抗生物質-PBS溶液で2〜4回、結腸をきれいに洗浄し洗浄します。
- 表1に記載のキャリパーを用いて巨視的評価を行う。
注:組織接着*および紅斑/出血#、便血#および下痢#は視覚的評価の対象となります。*組織接着は3点スケール(0:組織接着なしの結腸、1:中等度の組織接着を伴う結腸、2:広範な組織接着を有する結腸)を用いて評価する。#紅斑/出血、便血および下痢の欠欠席(0)または存在(1)に基づく。
| 接着* | 紅斑/出血# | 胎児の血# | 下痢# | 潰瘍の長さ | コロンの厚さ | コロンの長さ |
| ポイント (0 ~ 2) | ポイント (0 ~ 1) | ポイント (0 ~ 1) | ポイント (0 ~ 1) | cm/ポイント | mm/ポイント | cm/ポイント |
| 0 – 不在 | 0 – 不在 | 0 – 不在 | 0 – 不在 | 0.5 cm = 0.5 ポイント | n mm = nポイント | 0 – <コントロールより 10% 短い |
| 1 – 中程度 | 1 – 現在 | 1 – 現在 | 0.5 – わずかな/緩い便 | 1 – コントロールよりも10~20%短い | ||
| 2 – 現在 | 1 – 現在 | 2 – コントロールよりも20%以上短い |
表1:クローン病のTNBS誘発モデルを用いたマウスの腸管のマクロスコピックスコアリング。
- 0.5cmの潰瘍を0.5ポイントとしてカウントされる、センチメートル単位の潰瘍の長さを1センチメートルに変換し、すなわち、0.5cmの潰瘍毎に数える。コロンの厚みをミリメートル単位でポイントスケールに変換します。すなわち、nmmごとにn点nに相当します。
- コロンの長さをセンチメートル単位で 3 ポイントスケールで変換します。TNBS誘発クローン病を有する各マウスから得られた結腸の長さは、対照群の平均結腸長に関連して評価される(0:<10%コントロールより短く、1:コントロールより10〜20%短く、2:20%以上短いコントロール)。
- 合計巨視スコア=接着(ポイント)+紅斑/出血(ポイント)+便の血液(ポイント)+下痢(ポイント)+潰瘍の長さ(ポイント)+結腸厚(ポイント)+コロン長(ポイント)に従って合計巨視スコアを計算します。
3. コロンサンプル調製
- コロンを1〜2cmの断片に切り、適切にラベル付けされた組織学的カセットにスポンジの上にそれぞれを置きます。
注:組織学的カセット用スポンジは、脱水中の結腸折りたたみを防ぎ、液体パラフィン中のインキュベーションを防ぎます。 - 4%ホルムアルデヒドにコロン断片を入れ、4°Cで少なくとも24時間インキュベートする。
- 50%、70%、90%、95%、100%エタノール、キシレン/100%エタノール(1:1;v/v)、キシレンのみ、および液体パラフィン中のインキュベーションの少なくとも3時間のために、1時間のインキュベーションのためのティッシュプロセッサを準備し、プログラムします。
注:脱水はエタノールとキシレンの濃度を上げる上で行う必要がありますが、エタノールの濃度は変更することができます。キシレン/エタノール混合物は推奨されるが、必須ではない。 - 大腸片を組織学的ボックスに移し、事前にプログラムされた組織プロセッサに入れる。
- ティッシュプロセッサを実行します。
- インキュベーションステップの後、コロンの両端が直立した位置になるように、コロンフラグメントを金属鋳型に入れ、金型の3分の1を液体パラフィンで満たします。
- 金型を冷却領域(-5°C)に数秒間置き、金型を加温領域(70°C)に移動させます。組織学的な箱の下部に置き、液体パラフィンで全体のコロン断片をカバー.
- 金属のカビをパラフィンに入れて、冷却区域に数分間放置します。パラフィンブロックから金属モールドを取り出し、4°Cで少なくとも24時間インキュベートします。
- ブロックから余分なパラフィンを取り除き、完全に自動化されたロータリーミクロトームに挿入します。
注:パラフィンブロックは、このステップの前に数分-20 °Cで保存することができます。 - コロンフラグメントを5μmのセクションに切ります。
- コロン部を40°Cに予熱した水浴に移す。
- ラベル付きガラススライドを使用して、水浴からコロンセクションを取り除きます。
注:コロンセクションは水の上に浮かびます。ラベル付きのガラススライドをコロンセクションの下の水に入れ、慎重にガラススライドを引き出します。 - ガラススライドを室温で24時間放置します。長期保存の場合は、室温で24時間インキュベーションした後、ガラススライドを4°Cに保ちます。
4. 免疫蛍光染色による免疫染色
メモ:手順中にコロンセクションを乾燥させないでください。
- ガラススライドをキシレンで5分間インキュベートしてパラフィンを取り除き、このステップを3回繰り返します。
- ガラススライドをキシレン/100%エタノール(1:1;v/v)に5分間置き、このステップを3回繰り返します。
- 一連の減少エタノール濃度で結腸部を水分補給し、すなわち、70%、50%、30%および10%エタノールを5分間、各ステップを3回繰り返す。
- ガラススライドを流水の下で5分間すすります。
- 抗原検索バッファー(10 mM クエン酸ナトリウム;0.05% Tween 20, pH 6.0)を 95~98 °C に予熱し、10 分間沸騰抗原検索液でガラススライドを加熱します。
注: 抗原検索の手順はオプションですが、推奨されます。マスキング解除液は、実験で使用される抗体に応じて最適化する必要があります。 - 疎水性ペンを使ってコロン部分の周りに円を描きます。
注: この手順はオプションですが、推奨されます。疎水性ペンは、液体を円とマークした内部の小さな体積にプールし続けることで、試薬の無駄を防ぎます。 - ペルオキシダーゼの水溶液を3%で10分間インキュベートします。
- 洗浄液(50 mM Tris-HCl、pH 7.4;150 mM NaCl;0.05%トゥイーン20)で5分間洗浄します。
- インキュベートインキュベート溶液(5%正常ヤギ血清;50 mM Tris-HCl、pH 7.4;150 mM NaCl;0.05%トリトンX-100)を室温で1時間培養する。
注:ブロッキング溶液では、正常血清は二次抗体と同じ種からでなければなりません。インキュベーションが必要な段階では、ガラススライドを湿度室に入れて過度の蒸発を防ぎます。 - ブロッキング溶液を除去し、50 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、0.05%トリトンX-100を用いて1%ウシ血清アルブミンで希釈したERα、ERβまたはGPERに対して20〜50μLの一次抗体を添加する。
注: 一次抗体の推奨希釈を表 2に示します。
| 抗体タイプ | に対する抗体 | クローン性 | 宿主種 | 種反応性 | 希釈 |
| プライマリ | ERα | ポリクローナル | ウサギ | 人間 | 1:100 |
| マウス | |||||
| カメ | |||||
| カピバラ | |||||
| ERβ | ポリクローナル | ウサギ | 人間 | ||
| 猿 | |||||
| ラット | |||||
| マウス | |||||
| 羊 | |||||
| 豚 | |||||
| グッパー | ポリクローナル | ウサギ | 人間 | ||
| ラット | |||||
| マウス | |||||
| セカンダリ | ダイライト 650 | ポリクローナル | ヤギ | ウサギ | 1:250 |
表2:抗体の特性。
- 一次抗体を暗闇の中で4°Cで一晩インキュベートする。
- 抗体溶液を取り除き、洗浄液(50 mM Tris-HCl、pH 7.4;150 mM NaCl;0.05%Tween 20)で5分間洗浄し、このステップを3回繰り返します。
- 1%のウシ血清アルブミンで希釈されたDyLight 650二次抗体の20-50 μLを加える(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、0.05%トリトンX-100を含む)。暗い温度で1時間色素と共役した二次抗体とインキュベートする。
注: 二次抗体の推奨希釈を表 2に示します。 - 抗体溶液を取り除き、洗浄液(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、0.05%Tween 20)を5分間洗浄し、このステップを3回繰り返します。
- 50 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl に希釈した2%のDiOC6(3)を加え、暗闇の中で室温で10分間インキュベートします。
- 溶液を取り除き、洗浄液(50 mM Tris-HCl、pH 7.4、150 mM NaCl、0.05%Tween 20)で5分間洗浄し、このステップを3回繰り返します。
- DAPIを直接コロンセクションに入れたグリセロール系液体を数滴加え、カバースライドで慎重に覆います。4°Cで少なくとも24時間結腸部をインキュベートする。
メモ:カバースライドでティッシュを覆うときは気泡を避けてください。 - 20xまたは63xの目的を特徴とする共焦点顕微鏡の下で結腸セクションを分析し、専用のソフトウェアを使用して油浸漬を行います。
注:表 3は、この研究で使用される蛍光色素の特性を示しています。
| フルオロホホームタイプ | 波長 (nm) | 染料 | |
| 励起 | 排出 | ||
| ダピス | 405 | 460 – 480 | 青 |
| ディオク6 (3) | 485 | 538 – 595 | 緑 |
| ダイライト 650 | 654 | 660 – 680 | 赤 |
表3:フッ素色素の特性
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Representative Results
TNBS誘発クローン病を有するマウスにおける結腸のマクロ的特徴
コントロールマウスおよびTNBS処置マウスから採取したコロンの代表的な画像を図2に示す。クローン病のTNBS誘発モデルを有するマウスでは、結腸の幅が増加する間、結腸の長さが減少する。
図2:対照マウス(対照)及びTNBS処置マウス(TNBS)から得られた代表的な結腸。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
評価された巨視的なパラメータは、表 1に示されています。マウスへのTNBSの投与は、対照マウスに対する総大腸巨視スコア(図3A)および炎症の長さ(図3B)の増加をもたらす。
図3:コントロールマウス(対照)およびTNBS処置マウス(TNBS)における結腸(A)および全大腸炎症長(B)の総巨視的スコア。グループごとに10匹のマウス。統計解析は、一方向ANOVAを用いて、ニューマン・キュース後検定を用いて行った。データは、手段±SEMとして提示されます。**p < 0.001 TNBS 対コントロール。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
エストロゲン受容体抗体の検証
研究で使用したエストロゲン受容体抗体の特異性の検証はMCF-7細胞を用いて行った。MCF-7細胞は、いくつかの独立した研究者がエストロゲン受容体がmRNAおよびタンパク質レベルで存在することを発見した以前の研究に基づいて選択された。図4に示すように、研究で用いられる抗体は、核エストロゲン受容体、すなわちERα(図4A)およびERβ(図4B)、ならびに膜結合エストロゲン受容体、すなわちGPER(Figure 4図4C)のMCF-7細胞の両方の検出を可能にする。核エストロゲン受容体は細胞質および核に局在し、GPER染色からのシグナルはMCF-7細胞の細胞質にのみ存在する。
図4:MCF-7細胞におけるERα(A)、ERβ(B)およびGPER(C)の免疫蛍光染色の代表的な画像。画像の上部に詳細な説明。スケールバー:10 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
陽性対照に加えて、陰性対照も行われ、二次抗体のみが使用された。図5は、DAPIを用いたフルオロクロムおよびグリセロール系液体と共役した二次抗体のみで染色されたMCF-7細胞の画像を示す。
図5:MCF-7細胞におけるDyLight650の免疫蛍光染色の代表的な画像。画像の上に追加の説明を表示できます。スケールバー:20 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
クローン病のTNBS誘導マウスモデルにおけるエストロゲン受容体の局在
TNBS誘発クローン病を有する対照マウス及びマウスから得られた大腸部にERαの強い細胞質シグナルが見つかった(図6A)。しかし、コントロールマウスから得られた腸内でのみ、ERαがゴブレット細胞質に局在していたように見える。共焦点顕微鏡法はまた、コントロールおよびTNBS処置マウスの両方の大腸セクションにおけるERβの細胞質局在化を明らかにした(図6B)。同様に、GPERの細胞質局在化は、コントロールマウスおよびTNBS処置マウスから得られた結腸部に文書化された(図6C)。
図6:コントロールマウス(対照)およびTNBS処置マウス(TNBS)から得られた結腸部におけるERα(A)、ERβ(B)およびGPER(C)の免疫蛍光染色の代表的な画像。各画像の上に追加の説明があります。スケールバー:50 μm。ズームスケールバー:25 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
IBD病態生理学検査には、遺伝的、免疫学的または自発的なモデル、ならびに化学的に誘発されたモデル15を含む多数の動物モデルがある。大腸炎のいくつかのタイプの動物モデルの中でも、このプロトコルに記載されているTNBS誘導モデルのような化学的に誘発されたモデルは、比較的安価で入手しやすい。大腸炎のTNBS誘発マウスモデルには、CDの病理学的基礎に関連するいくつかの臨床症状がある。誘発性大腸炎を有する動物は、一貫性のない便の形成、血まみれの下痢および体重の喪失によって特徴付けられる。しかし、これは、このモデルがCD病原病を排他的に研究するために使用することができることを意味するものではありません。TNBS誘導モデルは、例えば、潜在的な治療スクリーニングのために推奨され、一般的に使用される。化学的に誘発された大腸炎の場合、いくつかの重要な点を強調する必要があります。TNBSは、粘膜バリアを乱し、TNBSが腸壁を貫通し、高分子量タンパク質と相互作用することを可能にするエタノールで希釈されなければならない、細胞媒介免疫応答22、16、17。16,17TNBS用量とエタノール濃度の両方を、マウスの歪みと重量に最適化する必要があります。TNBSの用量とエタノール濃度が高すぎると、過剰な死亡率を引き起こし、さらなる分析を妨げる可能性があります。一方、TNBS用量とエタノール濃度が低すぎると、反応が悪くなり、実験が不必要に延長される可能性があります。
TNBS誘発性大腸炎を有するマウスから得られた腸は、本プロトコルに記載されているように、巨視的なレベルで検査できるだけでなく、生化学的および分子的分析にも使用され得る。発現と局在の両方を研究するための有用なアプローチの1つは、免疫蛍光を用いた免疫ヒストランス技術である。しかしながら、ホルマリン固定パラフィン埋め込みマウス結腸セクションのIHCの調製および実施には、いくつかの重要なステップが含まれなければならない。第1の重要なステップ、すなわち、結腸の調製は、結果の質を決定する。組織の厚さに依存する固定時間は最適化されなければならない。もう一つの重要な段階は脱水であり、エタノール濃度の増加において複数のインキュベーションによって穏やかに行われるべきである。最後に、金型内のコロンの正しい位置は、正しい断面を生成するために不可欠です。組織製剤は免疫組織化学における唯一の重要な問題ではない。抗原の取り出しは任意のステップであるが、ホルマリン固定パラフィン埋め込み切れ部では必要と思われる。ホルムアルデヒドによる固定の際、タンパク質間のメチレン橋梁が生成され、抗原部位18のタンパク質架橋マスクがマスクされる。熱または酵素誘発(トリプシン、ペプシンまたはプロテイナーゼK)抗原の検索に基づく2つの主要な方法があります。熱誘導抗原の検索は、クエン酸ナトリウム緩衝液、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)緩衝液またはTris-EDTA緩衝液中で行われ、細胞形態に影響を及ぼさないため、より広く使用されている。抗原取り込みの種類と条件は実験的に調整する必要があります。なお、抗原検索方法は実験で用いる抗体によって決定される場合もある。透過性は、検査対象抗原に依存する条件であり、特に細胞内タンパク質に対して必要とされる。溶剤(アセトンまたはメタノール)と過酷な(トリトンX-100またはNP-40)、および穏やかな(Tween20またはサポニン)洗剤を使用するいくつかのアプローチがあります。本プロトコルでは2つの洗剤を、ステップに応じて同時に使用した、すなわちトリトンX-100とTween20を用いた。使用する抗体に応じて透過性を最適化する必要があることを強調する必要があります。非特異的結合部位の遮断は、免疫物質化学的分析の際に特に重要である。ブロッキング溶液には、通常の血清、ウシ血清アルブミン、またはすぐに使用できるブロッキング溶液が含まれます。本プロトコルは、正常血清およびウシ血清アルブミンの両方の使用を推奨する。プロトコルで既に述べたように、ブロッキング溶液は二次抗体と同じ種からの正常な血清を含むべきである。
最後に、このプロトコルに記載されている免疫蛍光によるIHC検出は、タンパク質とタンパク質相互作用の研究において他のタンパク質を染色するように拡張することができる。選択したタンパク質の共局在化を求める場合、一定の条件を満たす必要があります。蛍光色素は励起および発光スペクトルに基づいて選択されるべきである。このステップは、スペクトルの重複を排除するために重要であり、実験の計画段階で実行する必要があります。このプロトコルでは、3つのフルオロクロム、すなわち、DyLight 650二次抗体、DAPIおよびDiOC6(3)が使用される。表3に示すように、エストロゲン受容体検出に用いられるDyLight 650は、660-680nmで654nmの励起および発光を有する赤色色素として観察される。細胞核および内膜を染色するために、DyLight 650はDAPI核マーカーおよびDiOC6(3)膜マーカーとともに使用される。DAPIは460-480 nmで405 nmの励起および放出を伴う青い染料として観察される。今度は、DiOC6(3)は538-595 nmで485 nmの励起および放出を有する緑色の染料として観察される。次のタンパク質の染色は、ブロッキングステップ(ステップ4.9.を参照)から始まるステップ4.14.の後に行われるべきである。2つのタンパク質に対しては、異なる種の染色抗体を使用することが推奨されます。このアプローチにより、染色結合二次抗体と以前染色されたタンパク質への結合を除外することができる。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作品は、ウッチ大学当局の財政支援のおかげで発表されました: 科学研究副学長, 国家と国際協力のための副学長と生物学と環境保護学部の学部長.ダミアン・ジャセニクは、ポーランド国立科学センターからの助成金(2017/24/T/NZ5/00045と2015/N/NZ5/00336)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope - TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome - RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module - EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor - TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y.
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn's disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
