Summary
Представлен метод нецелевого анализа метаболитов и липидов зерна пшеницы. Протокол включает в себя метод извлечения метаболита ацетонитрила и обратную фазовую методологию жидкой хроматографии-масс-спектрометрии, с приобретением в положительных и отрицательных режимах ионизации электроспрея.
Abstract
Понимание взаимосвязей между генами, окружающей средой и управлением в сельскохозяйственной практике может позволить более точнопрогнозировать и управить урожайность и качество продукции. Метаболомика данные обеспечивает чтение из этих взаимодействий в данный момент времени и информативным биохимического статуса организма. Кроме того, отдельные метаболиты или панели метаболитов могут быть использованы в качестве точных биомаркеров для прогнозирования и управления качеством. По прогнозам, метаболомрастение будет содержать тысячи мелких молекул с разнообразными физикохимическими свойствами, которые дают возможность биохимическому пониманию физиологических признаков и открытию биомаркеров. Чтобы использовать это, ключевой целью исследователей метаболомики является захват как можно больше физико-химического разнообразия в рамках одного анализа. Здесь мы представляем метод нецелевой метаболомики жидкой хроматографии-масс-спектрометрии для анализа пшеничного зерна, выращенного на местах. Метод использует менеджер растворителя каломатографа жидкостного хроматографа для введения третьей мобильной фазы и сочетает в себе традиционный градиент обратной фазы с липидно-податливым градиентом. Подробно описаны подготовка зерна, извлечение метаболита, инструментальный анализ и обработка данных. Наблюдалась хорошая точность массы и воспроизводимость сигнала, и метод дал около 500 биологически значимых функций в режиме ионизации. Кроме того, были определены значительно разные метаболитные и липидные сигналы между сортами пшеницы.
Introduction
Понимание взаимосвязей между генами, окружающей средой и практикой управления в сельском хозяйстве может позволить более точнопрогнозировать и управиться выходом и качеством продукции. Метаболиты растений зависят от таких факторов, как геном, окружающая среда (климат, осадки и т.д.), а в сельском хозяйстве управляется тем, как управляются сельскохозяйственные культуры (т.е. применение удобрений, фунгицидов и т.д.). В отличие от генома, метаболом находится под влиянием всех этих факторов и, следовательно, метаболомика данные обеспечивает биохимический отпечаток этих взаимодействий в определенное время. Есть, как правило, одна из двух целей для метаболомики на основе исследования: во-первых, для достижения более глубокого понимания биохимии организма и помочь объяснить механизм реагирования на возмущение (абиотических или биотических стресс) в отношении физиологии; и, во-вторых, связать биомаркеры с исследуемыми возмущениями. В обоих случаях результатом наличия этих знаний является более точная стратегия управления для достижения цели повышения размера и качества урожайности.
По прогнозам, метаболомрастение будет содержать тысячи1 малых молекул с разнообразными физикохимическими свойствами. В настоящее время никакие платформы метаболомики (преимущественно масс-спектрометрия и ядерная магнитно-резонансная спектроскопия) не могут зафиксировать весь метаболом в одном анализе. Разработка таких методов (подготовка образцов, метаболитная добыча и анализ), которые обеспечивают максимально большое покрытие метаболом, насколько это возможно в рамках одного аналитического запуска, является ключевой целью для исследователей метаболомики. Предыдущие нецелевые метаболомические анализы зерна пшеницы объединили данные из нескольких хроматографических разделений и закупочных полярностей и/или приборов для большего охвата метаболомами. Однако для этого необходимо подготовить и приобрести образцы отдельно для каждого метода. Например, Beleggia et al.2 подготовили производный образец для анализа полярных анализов GC-MS в дополнение к анализу GC-MS неполярных анализов неполярных анализов. Das et al.3 использовали как методы GC-, так и LC-MS для улучшения охвата в своих анализах; однако этот подход, как правило, требует отдельной выборочной подготовки, как описано выше, а также двух независимых аналитических платформ. Предыдущие анализы зерна пшеницы с использованием GC-MS2,,3,,4 и LC-MS3,,5 платформ дали от 50 до 412 (55 идентифицированных) особенностей для GC-MS, 409 для комбинированных GC-MS и LC-MS и несколько тысяч для анализа липидоми LC-MS5. Объединив по крайней мере два режима в единый анализ, расширенный охват метаболом может быть сохранен, увеличивая богатство биологического толкования, а также предлагая экономию как во времени, так и в стоимости.
Для обеспечения эффективного разделения широкого спектра липидных видов путем обратной фазы хроматографии, современные методологии липидоми обычно используют высокую долю изопропанола в растворителе elution6, обеспечивая удобство для липидных классов, которые в противном случае могли бы быть нерешенными хроматографии. Для эффективного разделения липидов, начиная передвижная фаза также гораздо выше в органическом составе7 чем типичные обратные методы хроматографических фаз, которые рассматривают другие типы молекул. Высокий органический состав в начале градиента делает эти методы менее подходящими для многих других классов молекул. В частности, обратная фаза жидкой хроматографии использует бинарный градиент растворителя, начиная с в основном водного состава и увеличивая органическое содержание по мере увеличения силы растворения хроматографии. С этой целью мы стремились объединить два подхода для достижения разделения как липидных, так и нелипидных классов метаболитов в рамках одного анализа.
Здесь мы представляем хроматографический метод, который использует третью мобильную фазу и позволяет комбинированную традиционную обратную фазу и соответствующий липидомике метод хроматографии с использованием одного образца подготовки и одной аналитической колонки. Мы приняли многие из мер по контролю качества и шагов фильтрации данных, которые ранее были реализованы в преимущественно клинических метаболомических исследованиях. Эти подходы полезны для определения надежных объектов с высокой технической воспроизводимостью и биологической репродукцией и исключают те, которые не отвечают этим критериям. Например, мы описываем повторный анализ объединенной выборки8, коррекции КК9, фильтрации данных9,,10 и вычисления отсутствующих функций11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот метод подходит для 30 образцов (примерно 150 семян на образец). Здесь были использованы три биологических репликата десяти различных сортов пшеницы, выращенных на местах.
1. Приготовление зерновых
- Извлекать образцы (целые зерна) из -80 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание сушки семян рекомендуется вскоре после сбора урожая, если образцы собираются из нескольких сезонов. Это сводит к минимуму любые изменения в концентрации метаболита, которые могут произойти после различных периодов хранения. Для этого перенесите семена в пластиковую центрифугу мощностью 15 мл (примерно 300 семян заполнит трубку) и накройте алюминиевой фольгой. Проколите фольгу два-три раза, используя булавку и заморозьте целые зерна за одну ночь (примерно 24 ч). Образцы могут быть возвращены в морозильную камеру -80 градусов на данном этапе или следующий шаг может быть выполнен. - Измельчить семена с помощью лабораторного блендера для двух работает на высоком режиме в течение 20 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блендер, используемый для этого протокола требует как минимум около 150 семян, чтобы заполнить блендер до высоты лезвия и дать относительно однородно молотый образец зерна. - Снимите блендер с основания и коснитесь стороны блендера, чтобы вывести на поверхность образца любое грубое молотое зерно. Грубый материал можно отбросить или хранить.
- Передача порошкообразного мелкомолотого материала из блендера в пластиковую микроцентрифугную трубку 2 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вымойте блендер с деионизированной водой и промойте С LC-MS-класса MeOH между образцами. Убедитесь, что блендер полностью высохнет, прежде чем перейти к следующему образцу. - Вернуть мелко молотые образцы зерна в морозильную камеру или перейти к следующему шагу (добыча метаболита).
2. Подготовка растворителя добычи
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка извлечения растворителя в тот же день, как выполнение извлечений.
- Приготовьте не менее 2 мл по 1 мг/мл каждого стандарта. Используйте ацетонитрил (ACN) для приготовления 2-аминоантрацена,6миконазола и d 6-трансциннамической кислоты. Используйте воду, чтобы подготовить 13C6-sorbitol.
- Возьмите 2 мл каждого стандарта 1 мг/мл и добавьте в объемную колбу объемом 100 мл.
- Заполните объемную колбу на линию ацетонитрилом. Убедитесь, что 100 мл ацетонитрила содержит 20 мкг/мл каждого из внутренних стандартов: 2-аминоантрацена, миконазола, 13С6-сорбитол, d6-трансциннамная кислота.
3. Добыча метаболита
- Взвесить 200 мг мелко молотого зерна в микроцентрифуге 2 мл.
- Добавьте 500 л растворителя экстракции к 200 мг мелко молотого образца зерна.
- Смешайте с помощью гомогенизатора для 2 трасс по 20 с при 6500 об/мин.
- Центрифуга при 4 градусах по Цельсию в течение 5 мин при 16100 х г.
- Перенесите супернатант в пластиковую трубку 2 мл.
- Повторите эту процедуру со ступеней 3,1 до 3,5 в два раза больше, чтобы дать общий супернатант объем примерно 1,5 мл.
- Вихрь смешать супернатант.
- Перенесите равный объем (55 л) каждого экстракта в отдельную трубку объемом 2 мл, чтобы сделать объединенный образец экстракта зерна.
- Перенесите 50 qL aliquot экстракта на стеклянный флакон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракты могут быть заморожены (-80 градусов по Цельсию) в этот момент или перейти к следующему шагу и перейти к анализу LC-MS.
4. Подготовка решений для анализа LC-MS
ВНИМАНИЕ: Для концентрированной кислоты, всегда добавляйте кислоту в воду / растворитель.
- Приготовьте 50 мл из 1 М аммония для спаривания бульонного раствора. Взвесить 3,153 г аммония и перевести на объемную колбу объемом 50 мл. Заполните объемную колбу на линию с LC-MS класса H2O.
- Подготовьте 1 л передвижной фазы А, состоящей из 10 мМ аммония для мата, 0,1% для кислоты. Для этого добавьте около 500 мл воды класса LC-MS в объемную колбу объемом 1 л. Добавьте 10 мл 1 М аммония для спаривания и 1 мл formic кислоты. Заполните объемную колбу на линию с LC-MS класса H2O. Передача в бутылку 1 л и sonicate в течение 15 минут дега.
- Подготовка 1 l мобильной фазы B, состоящей из 10 мм аммония formate в 79:20:1 ацетонитрил:изопропиловый спирт: вода, 0,1% для соотношения кислоты. Добавьте 200 мл изопропанола в колбу объемом 1 л. Добавьте 10 мл 1 М аммония для спаривания и 1 мл formic кислоты. Заполните объемную колбу до линии ацетонитрилом. Трансфер в бутылку 1 л и sonicate в течение 15 минут до дега.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавить 1 M аммония formate в изопропиловый спирт (IPA) перед добавлением ACN. Аммоний formate нерастворяется в CAN. - Подготовьте 1 л передвижной фазы С, состоящей из 10 мМ аммония длямата в соотношении 89:10:1 изопропиловый спирт:ацетонитрил:вода. Для этого добавьте около 500 мл изопропанола, 10 мл 1 м аммония для мата и 100 мл ацетонитрила к 1 l объемной колбе. Заполните линию с изопропанол. Трансфер в бутылку 1 л и sonicate в течение 15 минут до дега.
- Приготовление растворителей системы LC-MS
- Замените раствор для мытья насоса на свежий раствор. Используйте 50% метанола, 10% изопропилового спирта или другого, как это рекомендовано производителем.
- Подготовьте сильные и слабые растворы для мытья иглы для мытья инъекционной жидкости до и после инъекций. Для сильной стирки добавьте равные объемы ACN и IPA. Для слабой стирки, подготовить решение 10% ACN (требующих примерно 500 мл и 1 л каждого из сильных и слабых моет соответственно для этого протокола и количество образцов) в отдельных бутылках.
- Установите объемы мытья иглы до 600 л и 1800 л для сильных и слабых стирков, соответственно.
5. Подготовка образцов для анализа LC-MS
- В соответствии со стандартной процедурой эксплуатации для изготовления 400 нг /Л лейцина энкефалина, пипетка 7,5 мл воды в 12 мл лейцина-энкефалина флакон, содержащий 3 мг лейцина-энкефалина. Заморозить при -80 градусов по Цельсию в 50 айкотах.
- Приготовьте 100 мл 5% ACN, содержащий 200 нг/мл лейцина-энкефалин (50 л из 400 нг/Л лейцина энкефалина). Подготовка в тот же день, что и анализ LC-MS.
- Добавьте 950 л 5% ацетонитрила, содержащего инъекционный стандартный лейцин-энкефалин, к 50-ю выборке aliquot, подготовленному со ступени 3.
- Вихрь смешать подготовленный образец.
6. Установка LC-MS
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробное описание установки инструмента и метода приобретения описано в руководстве пользователя производителя. Ниже приводится общее руководство и подробные сведения, конкретные для этого протокола. Следующие шаги могут быть выполнены в любое время до получения данных.
- Откройте аппаратный профиль LC-MS.
- Настройка хроматографического метода, изложенного в таблице 1. Убедитесь, что система LC оснащена четырехъядерный менеджер растворителя для настройки этого градиента.
ПРИМЕЧАНИЕ: IPA является вязким растворителем. Он должен быть введен с низкой скоростью потока и достаточное время равновесия должны быть использованы до увеличения состава до 98,0%. Эти шаги предотвратят передавление и остановку системы LC. - Настройка методов приобретения масс-спектрометра для каждого из положительных и отрицательных режимов ToF-MS над диапазоном м/з 50-1300.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструмент, используемый для работы, представленной здесь, требует откалиброванных и отрицательных методов и работать индивидуально (т.е. переключение полярности в рамках метода невозможно). - Если столбец LC является новым, условие столбец в соответствии с рекомендацией производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть завершены непосредственно перед получением данных. - В аппаратном профиле «только MS» откалибруйте масс-спектрометр в соответствии с рекомендациями производителя. Выполните этот шаг до каждого способа приобретения, гарантируя, что система стабилизировалась в каждом данном режиме перед калибровкой.
- Очистка и промывка системы жидкости LC с использованием растворителей класса LC-MS, в том числе мобильных фазовых и растворителей для мытья.
- Равновесие системы LC с использованием исходных условий метода LC, гарантируя, что давление колонны стабилизировалось.
- Вводят натрий formate (0,5 мМ в 90% IPA) в начале последовательности выборки (описано ниже), чтобы проверить калибровку инструмента.
- Настроили таблицу последовательности приборов таким образом, чтобы сначала анализировались растворители и готовые (экстракции) пробелы; затем объединенные образцы КК (6-10) для системного кондиционирования; затем рандомизированный список выборки с образцами КК проходят через регулярные промежутки времени (например, каждая пятая инъекция) в качестве технической репликации. Выполнить два образца КК в конце последовательности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно включить дату и заказ на инъекцию/приобретение в имя файла образца, а также идентификатор образца. Например: YYYy MMDD_Injection number_Variety_Biological реплицировать. Перед нажатием на запуск убедитесь, что давление колонки LC является стабильным и что LC подключен к MS.
7. Обработка данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий рабочий процесс обработки данных представлен на рисунке 1.
- Проверьте качество данных (внутренняя стандартная точность массы (расчет ниже) и воспроизводимость сигнала) во время выполнения последовательности. Для проверки воспроизводимости сигнала должно быть достаточно визуального осмотра наложенных спектров.
ПРИМЕЧАНИЕ: Массовая ошибка (ppm) ( (Теоретическая масса - измеренная масса) / теоретическая масса) x 106 - Создайте выровненную матрицу пиковой интенсивности, содержащую образцы x внутренние стандарты (выровненные временем удержания и значениями м/з).
- Откройте программное обеспечение для обработки данных (см. Таблицу Материалов). В рамках Главная йgt; Открыть, нажмите данные. Перейдите к соответствующему местоположению файла и откройте все файлы данных.
- В рамках Главная йgt; Последовательность (ru) и тип обработки,выберите квантитацию из выпадающего меню.
- В рамках Главная йgt; Метод Calibration Components Заполните каждое поле, используя детали,приведенные в таблице 2 . Нажмите OK.
- На левой панели в столбцах рядом с файлами данных, заполнить тип образца, нажав на ячейку и выбрав Неизвестный. Заполните уровень как n/a.
- Под главная йgt; Обработка, выберите последовательность. Выберите место, чтобы сохранить последовательность, а затем нажмите Процесс.
- В рамках Главная йgt; Результаты, выберите Цюань. От кванского зрителя выберите Экспорт работает на матрицу анализатор.
- От результатов матрицы анализатора, нажмите Экспорт csv. Сохранить файл в виде файла электронной таблицы.
- В программном обеспечении для электронных таблиц вычислите среднее, стандартное отклонение и относительное стандартное отклонение интенсивности (пиковой зоны) каждого внутреннего стандарта.
- Создайте выровненную матрицу пиковой интенсивности, содержащую образцы x нецелевые объекты (выровненные временем удержания и значениями м/з).
- Откройте небольшой молекулы открытия анализа программного обеспечения New (см. Таблица материалов) и выберите файла Назовите эксперимент и выберите место для сохранения и хранения файлов экспериментов. Нажмите далее.
- Выберите тип используемого инструмента (масс-спектрометр высокого разрешения), формат данных (профиль) и полярность (положительная или отрицательная). Нажмите далее. Выберите все аддукты, доступные в библиотеке, и по мере необходимости отредактите библиотеку аддуктов. Нажмите Создать Эксперимент. Новая страница будет загружена там, где остальная часть обработки данных будет продолжена/происходить.
- Импортные файлы данных. Выберите формат файла, а затем выберите импорт. Просмотр местоположения данных и выбор файлов данных, которые будут импортироваться. Прогресс будет отображаться для каждого файла на левой панели страницы.
- После импорта файлов данных выберите Start Automatic Processing. Выберите метод выбора ссылки на выравнивание. Либо пусть программное обеспечение оценить все работает для пригодности, дать список подходящих образцов (т.е., КК образцы) или выбрать ссылку наиболее подходящий т.е. середине последовательности КК образца. Выберите Next Да, автоматически выровнять мои работает
- Выберите Далее на странице проектирования эксперимента (это может быть настроено позже).
- Выберите Выполнить Пик Выбор, а затем установить параметры. Под вкладкой Peak Picking Limits выберите Абсолютную интенсивность и введите 100. Выберите применить минимальную ширину пика и введите 0,01 мин. Выберите OK Когда обработка завершена, выберите Закрыть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пределы пикового выбора могут быть оптимизированы для других типов файлов данных по мере необходимости. - В правом нижнем углу экрана выберите раздел Complete. Просмотрите выровненные трассы и убедитесь, что каждый образец приведен в соответствие со ссылкой. Оценки выравнивания были «gt;90% для данных, представленных здесь. Выберите раздел Полный.
- На следующей странице выберите между дизайном объекта. Назовите дизайн. Выберите группу работает вручную и создать дизайн. Добавить условие, нажмите на условие 1 и назовите группу соответствующим образом. Нажмите раздел Полный.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте добавлять условия по мере необходимости использовать статистику в программном обеспечении. Так как мы использовали программное обеспечение только для создания нецелевой матрицы, мы использовали одно условие с пометкой "все". - На следующей странице выберите раздел Полный. Не переделайте пиковый сбор.
- Просмотрите деконволюцию, а затем нажмите раздел Полный.
- Перейти к файлу (ru) и экспорту подошвы измерений. Отберите все свойства, не требуемые в выходе. Нажмите OK. Выберите место для сохранения файла .csv. Нажмите Сохранить (Sgt; Открытый файл) Close
- Фильтруйте данные с помощью пробелов для удаления артефактов (программное обеспечение для электронных таблиц).
- Для каждой функции RT x m/z в новом столбце вычислите средний ответ в пробелах извлечения.
- Для каждой функции RT x m/z вычислите средний ответ во всех других образцах (включая образцы КК).
- Рассчитайте% пиковой интенсивности заготовок в образцах (средний ответ в пустых/средних ответах в образцах x 100).
- Сортируйте столбец вклада процентов от самых низких значений до самых высоких значений.
- Удалите функции, которые имеют вклад интенсивности от заготовок.
- Фильтр недостающие значения и исправить функцию сигналов сигналов в объединенных образцов КК.
- Откройте программное обеспечение для обработки данных(Таблица материалов). Нажмите кнопку View MatrixAnalyzer. Нажмите кнопку "Открытый файл данных".
- Перейдите к местоположению файла .csv, содержащему пиковую интенсивность объектов RT x m/z для каждого образца (нецелевая матрица). Выберите Открытый.
- Под вкладкой образцов КК, заполните каждый параметр по мере необходимости. Для набора данных, описанных здесь, используйте категорию КК, игнорируйте категории ,пустой, вставить type'none, порог покрытия 80, масштабирование, используя, не проверяйте преобразование журнала, правильное использование сглаживания сплайинга, сглаживание 0,25.
- В правом верхнем правом отмазании матричной панели нажмите кнопку воспроизведения коррекции КК.
- После того, как коррекция была выполнена в правом верхнем виде матричной панели, нажмите Сохранить Результаты. Перейдите в нужное место и сохраните файл результатов .csv.
- Фильтр уданные данные, чтобы удалить функции, которые имеют RSD в образцах КК.
- Упорядочить данные так, чтобы образцы были в строках, а функции в столбцах.
- В новом столбце вычислите среднюю пиковую интенсивность для образцов КК.
- В новой колонке вычислите стандартное отклонение пиковой интенсивности для образцов КК.
- Рассчитайте относительное стандартное отклонение пиковой интенсивности для образцов КК: (стандартное отклонение КК/среднее значение КК) x 100.
- Сортировать функции от самого низкого до самого высокого %RSD и удалить функции, которые имеют КК RSD
- Фильтруйте данные, чтобы удалить объекты с низкими соотношениямиRSD/RSDкК (например, злт;1).
- В новом столбце вычислите среднюю пиковую интенсивность для образцов.
- В новой колонке рассчитайте стандартное отклонение пиковой интенсивности для образцов.
- Рассчитайте относительное стандартное отклонение пиковой интенсивности образцов: (средний образец стандартного отклонения/образца) x 100.
- В новой колонке разделите образцы RSD на КК RSD.
- Сортировать значения(rsD образец/RSDкК отношения) от самого высокого к самому низкому и удалить объекты с соотношением злт;1.
- Impute недостающие значения (несколько методов, доступных в Интернете).
- Формат электронной таблицы так, чтобы образцы были в строках и функции в столбцах. Первая колонка должна быть именем файла образцов. Создайте дополнительный столбец рядом с именами файлов и введите группы образцов. В этом случае образцы были сгруппированы по разновидности.
- Сохранить электронную таблицу в виде файла .csv.
- Перейти на главную страницу для веб-аналитического конвейера для высокой пропускной столметамии (см. Таблица материалов) и нажмите Нажмите здесь, чтобы начать.
- Нажмите Статистический анализ. Под upload Your Dataвыберите тип данных: таблица пиковой интенсивности, Формат: Образцы в строках (неспаренные), а затем выберите файл.
- Перейдите к файлу .csv, выберите Открытый, а затем выберите Отправить.
- На следующей странице выберите недостающие оценки значения. Uncheck шаг 1 (это было выполнено в AnalyzerPro XD). На шаг 2 выберите метод оценки недостающих значений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для данных, представленных здесь - "оценка недостающих значений" с "KNN" был выбран. - На этом этапе матрицу данных можно загрузить (выберите Скачать с левой панели веб-страницы) или приступить к дальнейшему статистическому анализу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Метаболом растений влияет сочетание его генома и окружающей среды, а также в сельскохозяйственных условиях, режим управления сельскохозяйственными культурами. Мы демонстрируем, что генетические различия между сортами пшеницы можно наблюдать на уровне метаболита, здесь, с более чем 500 измеренных соединений, показывающих значительно различные концентрации между сортами в зерне только. Хорошая точность массы (ошибка 10 ppm) и воспроизводимость сигнала (Злт;20% RSD) внутренних стандартов(рисунок 2) наблюдались как для отрицательных, так и для положительных режимов ионизации (таблица 3). Описанный отбор образцов и жидкая хроматография-масс-спектрометрии на основе анализа дали йgt;900 deconvoluted функции в режиме отрицательной ионизации и йgt;1300 deconvoluted функции в режиме положительной ионизации. Для определения того,Figure 3вводили ли методы подготовки и анализа образцов, и, таким образом, все небиологические воздействия, исключенные из матрицы данных, были включены в методы подготовки и анализа образцов. Выяснилось, что 421 сигнал в отрицательном режиме и 835 сигналов в положительном режиме имели интенсивность сигнала, равную или превышающее 5% от средней интенсивности сигнала в образцах зерна. Эти функции были удалены и после дальнейших шагов фильтрации данных (шаг 7 и рисунок 1),отрицательный режим вернул 483 функций и положительный режим вернулся 523 функций, образуя метаболический снимок. Метод был успешным в обнаружении особенностей, которые имели значительно разные интенсивности между сортами пшеницы (Рисунок 4) с йgt;500 значительные особенности в обоих режимах ионизации. В режиме отрицательной ионизации, большинство существенных особенностей были в обратном градиентфазе фазы и в режиме положительной ионизации, большинство существенных особенностей были в градиенте липидов(рисунок 4).
Рисунок 1: Рабочий процесс, используемый в этом анализе для проверки, обработки и фильтрации данных. Шаг 1 проводится с использованием программного обеспечения для сбора данных/просмотра на инструменте, с тем чтобы можно было проводить оценки «на лету». Это включает в себя расчет массовой ошибки (ppm) внутренних стандартов и наложение внутренних стандартных пиков для визуальной оценки воспроизводимости данных. Шаги 2-7 описывают процедуру обработки данных, изложенную в протоколе, шаг 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Извлеченные ионные хроматограммы. Извлеченные ионные хроматограммы 13С6-сорбитол (темно-синий), лейцин-энкефалин (розовый), d 6-транс-циннамическая кислота (оранжевый), 2-аминоантрасен (зеленый) и миконазол (светло-синий) внутренние стандарты в положительных (сверху) и отрицательных (нижних) электроспрейи ионизации (ESI) режимах.6 Отображаются внутреннее стандартное время хранения и интенсивность. ESI и ESI - Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Общая ионная хроматограмма (TIC) наложения подготовительные пробелы, показывающие отрицательный режим (розовый) и положительный режим (синий) приобретения. Один внутренний стандарт, миконазол, показан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Общая ионная хроматограмма (TIC) наложения, показывая отрицательный режим (розовый) и положительный режим (синий) приобретения и количество функций значительно отличается между разновидностью пшеницы через хроматографический градиент. В отрицательном режиме наибольшее количество значимых особенностей было обнаружено при высокой композиции мобильной фазы В. В положительном режиме наибольшее количество значимых особенностей было обнаружено при высокой композиции мобильной фазы С. Один внутренний стандарт, миконазол, показан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Сегмента | Время | Расход | %A | %B | %C | Кривой |
| (мин) | (мЛ/мин) | |||||
| 1 | Первоначального | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 2 | 1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 3 | 7 | 0.8 | 2 | 98 | 0 | 6 |
| 4 | 7.1 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 5 | 10 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 6 | 18 | 0.4 | 0 | 10 | 90 | 6 |
| 7 | 21 | 0.4 | 0 | 2 | 98 | 6 |
| 8 | 21.1 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 9 | 24 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 10 | 24.1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 11 | 25 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
Таблица 1: Ликвидная хроматография приурочена программа мобильных фазовых композиций.
| Параметр | Внутренний стандарт | ||||
| 13 Год C6-сорбитол | Лейцин-энкефалин | d6-трансциннамная кислота | 2-амино-антрацена | Миконазол | |
| Цюань м/з | 211.09 (187.09) | 556.28 (554.26) | 155.097 (153.08) | 194.1 | 414.99 |
| Массовая толерантность (аму) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 | 0.01 |
| Время удержания | 1.2 | 4.6 | 5.1 | 6.5 | 7 |
| Время удержания окна | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 | 0.1 |
| Тип обнаружения | Высокий | Высокий | Высокий | Высокий | Высокий |
| Тип ответа | Области | Области | Области | Области | Области |
| Порог области | 10 | 10 (50) | 10 (50) | 10 | 10 |
| Порог ширины | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| Порог высоты | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Соотношение сигнала к шуму | 5 | 5 | 3 (5) | 5 | 5 |
| Сглаживания | 5 | 5 (3) | 5 (3) | 5 | 5 |
Таблица 2: Параметры обнаружения пиков для внутренних стандартов в положительных (и отрицательных) режимах приобретения.
| Точность массы (ppm) | %RSD До коррекции КК | %RSD После коррекции КК | ||
| Отрицательный режим | 13 Год C6-сорбитол | 4.59 | 6.12 | 7.08 |
| D6-трансциннамная кислота | 7.94 | 3.93 | 5.99 | |
| Лейцин-энкефалин | 0.91 | 1.8 | 1.96 | |
| Положительный режим | 13 Год C6-сорбитол | 5.65 | 14.1 | 15.3 |
| Лейцин-энкефалин | 3 | 3.24 | 5 | |
| D6-трансциннамная кислота | 8.03 | 5.41 | 9.81 | |
| 2-аминоантране | 3.99 | 7.97 | 5.45 | |
| Миконазол | 1.8 | 3.01 | 5.72 | |
Таблица 3: Образец(nNo30) внутренней стандартной точности массы (ppm) и воспроизводимости сигнала до и после коррекции КК, выраженной как относительное стандартное отклонение (%).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем метод нецелевой метаболомики на основе LC-MS для анализа зерна пшеницы. Метод сочетает в себе четыре режима приобретения (обратная фаза и липидно-подливающая обратная фаза с положительной и отрицательной ионизации) в два режима путем введения третьей мобильной фазы в реверсивный градиент фазы. Комбинированный подход дал приблизительно 500 биологически значимых особенностей на ионную полярность, причем примерно половина из них существенно отличалась по интенсивности между сортами пшеницы. Значительные изменения концентрации метаболита в зерне различных сортов пшеницы указывают на измененную биохимию, которая может быть связана с устойчивостью к болезням, стрессоустойчивостью и другими фенотипическими чертами, которые важны для качества и урожайности зерна. Например, метаболомика подходы были использованы для описания новых механизмов обороны12 и предложить роль метаболитов в засухоустойчивости13. Будущие применения этого протокола могут привести к дальнейшей увязке биохимических профилей конкретных сортов с генетическими чертами, которые являются желательными для определенных сред и методов управления. В свою очередь, это позволило бы обеспечить производство оптимального качества зерна и урожайности для отдельных генотипов.
Включение внутренних стандартов имеет решающее значение для этого протокола, чтобы пользователь может определить изменения в сигнале, сдвиги времени удержания и как индикаторы точности массы. Изменения в сигнале могут указывать, например, на субоптимальную экстракции, впрыски (включая блоки жидкости системы) или производительность детектора. Сдвиг времени удержания может свидетельствовать о плохой производительности насоса, ненадлежащем перекалибровке подвижного градиента фазы или о том, что неподвижная фаза столбца LC ухудшилась. Низкая точность массы может свидетельствовать о задрифированной калибровке и о том, что система требует перекалибровки. Во всех вышеуказанных случаях система должна быть остановлена, и выполнено соответствующее техническое обслуживание/замена деталей. Мы включили четыре стандарта в раствор экстракции, используемый для приготовления зерна, и стандарт в окончательном образце, добавленном до инъекции. Была принята меры по обеспечению того, чтобы стандарты поддались каждому режиму ионизации и охватывали целый ряд периодов удержания; однако мы признаем, что этот массив стандартов можно было бы улучшить с включением стандарта липидов с маркировкой. Было показано, что пшеничное зерно содержит сотни триацилглицерола (TAGs)5, любой из которых будет подходящим дополнением к этому протоколу. Включение готовых заготовок и объединенных образцов КК8 также являются важнейшими шагами в этом протоколе. Тысячи ионных объектов обнаруживаются в нецелевых методах масс-спектрометрии, и важно исключить те, которые присутствуют только в пустых образцах, а также те, которые не воспроизводимы (т.е. высокий %RSD) на протяжении всего анализа.
Хотя нынешний метод экономит значительное время и ресурсы, если четырехместный менеджер растворителя не доступен, стандартные обратные фазы и методы липидов могут быть использованы для достижения тех же результатов. Объем добычи, используемый в этом протоколе, будет достаточным для анализа дополнительных режимов приобретения. Этот протокол описывает извлечение ацетонитрила. В то время как успешно, альтернативный растворитель извлечения, или сочетание растворителей, обеспечит различные метаболитов покрытия, которые, в свою очередь, может доставить больше возможностей и / или дать лучшую (или меньшую) эффективность извлечения некоторых соединений. Мы не пытались установить метаболитную идентичность статистически значимых измерений, разрешенных в этом протоколе; однако, масс-спектральные базы данных для метаболитов и липидов растений доступны и развиваются55,14,,15. Для выявления метаболитов необходимо собрать тандемные масс-спектры (MS/MS) в дополнение к данным полного сканирования. Они могут быть собраны во время первоначального запуска с использованием объединенных образцов и соответствующего метода MS/MS или на зарезервированном экстракте (хранящемся при -80 градусах Цельсия) после определения метаболитов, представляющих интерес. Мы наблюдали большие изменения раз соединений между разновидностями поэтому мы порекомендовали бы сделать и в и в втором экземпляре, используя разнообразие известное для того чтобы содержать высокую концентрацию соединения интереса для того чтобы получить высочайшее спектр MS/MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить программу стипендий премьер-министра Западной Австралии по сельскому хозяйству и продовольствию (Департамент рабочих мест, туризма, науки и инноваций, правительство Западной Австралии) и стипендиат премьер-министра, профессор Саймон Кук (Центр Цифровое сельское хозяйство, Университет Кертина и Университет Мердока). Полевые испытания и сбор образцов зерна были поддержаны правительством Программы роялти для регионов Западной Австралии. Мы признаем Грантли Стейнера и Роберта Френша за их вклад в полевые испытания. NCRIS финансируемых Bioplatforms Австралии признан для финансирования оборудования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
