Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة micropatterning خالية من الطباعة الحجرية بسيطة ومتاحة لأولئك الذين يتمتعون بخلفية محدودة في الهندسة الحيوية. تستخدم هذه الطريقة الإستنسل اتّقص بالليزر حسب الطلب لبروتينات مصفوفة خارج الخلية في شكل اهتمام بتحوير الخلايا المورفولوجيا. يتم إثبات إجراء micropatterning باستخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من خلايا القلب.
Abstract
وقد استخدمت تقنيات micropatterning على نطاق واسع في بيولوجيا الخلايا لدراسة آثار السيطرة على شكل الخلية وحجمها على تحديد مصير الخلية في قرار الخلية الواحدة. تتضمن تقنيات الأنماط الدقيقة الحالية للخلية الواحدة الطباعة الحجرية اللينة والطباعة على التلامس الدقيق ، وهي تقنية قوية ، ولكنها تتطلب مهارات هندسية مدربة ودعم مرافق معينة في التصنيع الدقيق. وتتطلب هذه القيود تقنية أيسر منالا. هنا، نحن نصف طريقة بديلة بسيطة خالية من الطباعة الحجرية: الأنماط خلية واحدة على أساس الاستنسل. نحن نقدم إجراءات خطوة بخطوة بما في ذلك تصميم الاستنسل، وتصنيع الهيدروجيل البولياكريلاميد، ودمج البروتين القائم على الاستنسل، وطلاء الخلايا والثقافة. يمكن استخدام هذه الطريقة البسيطة لنمط صفيف يصل إلى 2000 خلية. نحن نظهر نقش خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hiPSC) مع أشكال خلايا متميزة ، من 1:1 مربع إلى مستطيل يشبه القلب والقلب البالغ 7:1. هذا النقش خلية واحدة الاستنسل القائم هو خالية من الطباعة الحجرية، قوية من الناحية الفنية، مريحة، غير مكلفة، والأهم من ذلك في متناول أولئك الذين يعانون من خلفية الهندسة الحيوية محدودة.
Introduction
وقد أدى ظهور hiPSCs وما يتبع ذلك من تطوير بروتوكولات للتمايز الموجه إلى أنواع مختلفة من الخلايا إلى جعل من الممكن دراسة التنمية والمرض على مستوى جزيئي وخاص بالمريض ، على وجه التحديد باستخدام خلايا القلب iPSC المشتقة من المريض (iPSC-CMs) لنموذج cardiomyopathies1،2. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية على دراسة التنمية وعلم وظائف الأعضاء باستخدام نظام iPSC ونماذج أخرى في المختبر هو عدم وجود بيئة صغيرة منظمة. في الموقع ، تخضع الخلايا لقيود المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وكذلك الخلايا المجاورة. التركيب الكيميائي الحيوي الخاص وصلابة هذه البيئات الدقيقة تملي التوزيع المكاني للخلايا وكذلك العوامل المتاحة للانخراط في التصاق الخلايا. وهذا بدوره يؤثر على مسارات الإشارات داخل الخلايا، والتعبير الجيني، وتحديد مصير الخلايا. على سبيل المثال، iPSC-CM ذات الأنماط الدقيقة في شكل قضيب يشبه البالغين لديه قدرة انكماش أفضل بكثير، وتدفق الكالسيوم، وتنظيم الميتوكوندريا، والفيزيولوجيا الكهربائية، وتشكيل أنبوب عرضي3. وبالتالي ، فإن خصائص البيئة الدقيقة هي جزء لا يتجزأ من تنظيم الوظائف الخلوية.
تقنيات micropatterning السابقة تعتمد اعتمادا كبيرا على الطباعة الضوئية(الشكل 1A). في هذه التقنية ، يتم نسج طبقة من البوليمر الحساس للضوء ، أو مقاومة للضوء ، على ركيزة مسطحة من الحل لتشكيل فيلم رقيق يبلغ سمكه حوالي 1 ميكرومتر. بعد ذلك ، يتم تطبيق الأشعة فوق البنفسجية (UV) على مقاومة الصور من خلال قناع يحتوي على النمط المطلوب. التعرض للأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) ضوء يغير كيميائيا مقاومة للضوء عن طريق تعديل ذوبانها في حل المطور الخاص بها، ونقل النمط المطلوب من القناع على الركيزة. تتضمن العديد من أساليب الأنماط الدقيقة الطباعة الضوئية ، لأنها تمنح النانومتر للتحكم على مستوى الميكرومتر في تصميم أنماط الخلية. ومع ذلك ، فإن الغزل من مقاومة الصور حساسة للغاية للشوائب ، لأن أصغر جزيئات الغبار سوف تعطل انتشار الحل في فيلم رقيقة. ولذلك يجب إجراء التصوير الضوئي في مرافق غير ملوثة، وهي مرافق مكلفة للصيانة وتتطلب خبرة خاصة للاستفادة منها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن المواد الكيميائية المستخدمة في التصوير الضوئي غالبا ما تكون سامة للخلايا ويمكن أن تشوه الجزيئات الحيوية الهامة. وبالتالي، فإن الطباعة الضوئية تشكل عقبات كبيرة أمام تصنيع الأنماط الدقيقة للتطبيقات البيولوجية المريحة.
في عام 1994، تغلب وايتسايدس وزملاؤهاما 4 على بعض التحديات المرتبطة بالطباعة الضوئية من خلال ريادة مجموعة من التقنيات تسمى الطباعة الحجرية الناعمة. في الطباعة الحجرية الناعمة ، يتم استخدام سطح صغير الحجم مصنوع من البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) ، وهو مادة شفافة تشبه المطاط ، لتوليد نمط من بروتينات ECM4. وتشمل التقنيات الطباعة الحجرية الناعمة الشائعة طباعة الاتصال الدقيق والنقش الميكرووتوني. في الطباعة microcontact، حاليا الطريقة الحجرية الناعمة الأكثر شعبية، ختم PDMS المغلفة مع بروتينات ECM ينقل المواد على سطح في المناطق التي اتصل بها الطابع(الشكل 1B). في الأنماط الدقيقة، تم تصميم الهياكل الدقيقة على سطح PDMS بحيث عندما يتم الضغط على الطابع إلى الركيزة، يتم إنشاء شبكة من القنوات الدقيقة، التي يمكن من خلالها تسليم السوائل إلى المناطق المطلوبة،(الشكل 1C)5. يوفر الطباعة الحجرية الناعمة العديد من الفوائد على الطباعة الضوئية. بمجرد أن يتم تصنيع رقاقة رئيسية ، يمكن بسهولة تكرار طوابع PDMS دون مزيد من التوظيف لمرافق الغرف النظيفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم وجود مذيبات عضوية في عملية الطباعة الحجرية الناعمة يسمح باستخدام المواد البوليمرية مثل البوليسترين ، التي تستخدم عادة في زراعة الخلايا. وأخيراً، لا يقتصر النقش المجهري باستخدام أساليب الطباعة الحجرية الناعمة على الأسطح المسطحة. وبالتالي ، يزيد الطباعة الحجرية الناعمة من إمكانية الوصول إلى تصنيع النماذج الدقيقة ووظائفها على الطباعة الضوئية6. ومع ذلك، الطباعة الحجرية الناعمة لها عيوب كبيرة. على سبيل المثال، لا تزال هناك حاجة إلى خطوة النقش الأولية، باستخدام الطباعة الضوئية، لتلفيق الطابع. بالإضافة إلى ذلك ، يخضع النقش المجهري باستخدام طابع PDMS لاختلافات في جودة نقل البروتين إلى الركيزة6. تجنب هذه التناقضات يتطلب التحسين والاتساق في الضغط المطبق على ختم PDMS أثناء نقل البروتين ، وإلا يمكن أن يحدث تشوه وتشويه أحجام الميزات لقوالب PDMS6. هناك أيضا قلق كبير من استخدام PDMS بشكل متكرر بسبب امتصاص جزيء صغير7.
لتجنب استخدام الطباعة الضوئية الناعمة وطوابع PDMS ، نصف طريقة micropatterning خلية واحدة قائمة على الاستنسل ، خالية من الطباعة الحجرية التي تتغلب على العديد من العقبات المرتبطة بالطباعة الضوئية والطباعة الحجرية اللينة. في هذه الطريقة، يتم استخدام هيدروجيل البولياكريلاميد كركيزة لدمج بروتين ECM القائم على الاستنسل، مما يسمح بالطلاء الانتقائي لـ hiPSC-CMs واحد. هذه التقنية متوافقة للغاية مع المواد البوليمرية المستخدمة في ظروف ثقافة الخلايا الكلاسيكية. وعلاوة على ذلك، مع التنظيف السليم والصيانة، والاستنسل قابلة لإعادة استخدام ومقاومة للتدهور وامتصاص البروتين أثناء عملية التصنيع المجهري. وأخيراً، فإن عملية الأنماط قوية تقنياً وغير مكلفة وقابلة للتخصيص ومتاحة لأولئك الذين ليس لديهم مهارات متخصصة في الهندسة الحيوية. وقد استخدمت هذه التقنية المجهرية الاستنسل القائم على نطاق واسع في منشوراتنا الأخيرة نمذجة أمراض القلب المتنوعة8،9،10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تلفيق من الأنماط السلبية البولي الاستنسل القائم
- إنشاء نمط(الشكل 2A)في تنسيق .dxf باستخدام برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (على سبيل المثال، أوتوكاد، SolidWorks، Onshape، أدوبي المصور).
- إنشاء دائرة (قطر = 22 ملم) لترسيم حدود الاستنسل.
- رسم شكل مملوء بصلابة أو النمط المطلوب.
- تضمين حرف chiral (على سبيل المثال، R) لوضع علامة على الجانب الأمامي من الاستنسل.
ملاحظة: على سبيل المثال، يتم إنشاء صفيف من المربعات والمستطيلات لنمط iPSC-CMs على مستويات خلية واحدة وزوج الخلية. تتوفر ملفات التصميم (انظر الملفات التكميلية). الحد الأقصى لقرار التصنيع المجهري هو ~ 10 ميكرومتر.
- تقديم التصميم إلى شركة microfabrication إلى ليزر قطع polyimide فيلم وتلفيق الإستنسل(الشكل 2B،C).
2- إعداد المستحضرات المنفوحة السلفو-سانباه
ملاحظة: يتم تعديل البروتوكول من فيشر وآخرون11.
- استخدام صندوق تخزين عينة من الورق المقوى المقاوم للرطوبة (على سبيل المثال، 100 بئر، 10 × 10 مساحات لأنابيب الطرد المركزي، الأبعاد: 13.4 سم × 13.4 سم × 5.1 سم). وسمها "الاسم/التاريخ/السلفو-سانباه 40 ميكرولتر/أعيد تشكيلها بـ 200 1 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني".
- تسمية 50 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (البولي بروبلين، 1.5 مل) مع 'S' على الغطاء.
- تأخذ 4 مل من اللامائية، إضافية الجافة ثنائي ميثيل السلفوك (DMSO) وفلتر معقم الحل باستخدام وحدة تصفية غشاء (حجم المسام = 0.22 ميكرومتر) في أنبوب مخروطي معقم 15 مل.
- إعداد حمام النيتروجين السائل وتغطية مع الغطاء للحد من تبخر النيتروجين السائل.
- حل 50 ملغ من السلفو-SANPAH في 2 مل من DMSO المصفاة.
- دوامة جيدا لإذابة تماما sulfo-SANPAH في DMSO.
- توزيع 40 μL aliquots من محلول السلفو-SANPAH في أنابيب معقمة 1.5 مل.
- نقل الأنابيب إلى مربع.
- فلاش تجميد الأنابيب في النيتروجين السائل لمدة 5 دقيقة.
- تخزين aliquots في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن استخدام العليوات لمدة تصل إلى 6 أشهر دون انخفاض الكفاءة. تركيز السولفو-سانباه هو 25 ملغ/مل أو 50.77 مللي متر.
3- تعقيم الأدوات
- أوتوكلاف ملقطين، 24 غطاء زجاجي (22 × 22 ملم، رقم 1 أو رقم 1.5)، شفرة حلاقة واحدة، وثلاثة مناديل ماصة خالية من الوبر.
ملاحظة: لجعل 12 الهيدروجيل بنيات، هناك حاجة إلى 24 coverslips الزجاج. يجب أن يكون هناك اثنين من coverslips لكل بناء. من المستحسن إعداد بعض قسائم التغطية الاحتياطية. - ضع قطعتين من فيلم البارافين (4 × 4 بوصة) في صندوق بلاستيكي مقاوم للإيثانول (على سبيل المثال، صندوق تلميح ماصة 1000 ميكرولتر) وتعقيمهما في الإيثانول الطازج بنسبة 70٪ لمدة 15 دقيقة على الأقل.
4. إعداد محلول السلائف الهيدروجيل البولياكريلاميد
ملاحظة: يتم تعديل البروتوكول من Lee وآخرون12.
- حل 125 ملغ من أمينوثيل ميثاكريلات (AEM) في 36.25 مل من الماء المنزوع الأيونات في أنبوب الطرد المركزي البولي بروبلين 50 مل عن طريق الدوامة.
- لإعداد 50 مل من محلول سلائف البولي اكريلاميد 10 كيلو باسكال (8-0.15-15 mM)، اخلط يُمُمل 10 مل من محلول الأكريلاميد بنسبة 40%، و3.75 مل من محلول bis-acrylamide، و36.25 مل من محلول AEM الذي تم إعداده في الخطوة 4.1 في أنبوب طرد مركزي جديد بـ 50 مل بولي بروبلين.
ملاحظة: التركيز النهائي لحل السلائف هو 8٪ الأكريلاميد، 0.15٪ مكررا-الأكريلاميد، و 15 mM AEM، والتي تم قياسها لديها ~ 10 كيلو باسكال تصلب عن طريق المجهر القوة الذرية. وفقا لتطبيقات الأنسجة ذات الاهتمام، يمكن تغيير صلابة الهيدروجيل عن طريق تغيير نسبة الأكريلاميد 40٪ إلى محلول 2٪ مكرر الأكريلاميد. على سبيل المثال، 8% الأكريلاميد–0.08% محلول bis-acrylamide ينتج 3 كيلو باسكال هيدروجيلات; 8% الأكريلاميد–0.48% محلول بيس-أكريلاميد ينتج 38 كيلو باسكال هيدروجيل؛ 8% الأكريلاميد–0.48% محلول بيس-أكريلاميد ينتج 60 كيلو باسكال هيدروجيل. فمن المستحسن لتأكيد صلابة الهيدروجيل المصنوعة من حلول السلائف مع معدلات متغيرة.
5. إعداد حل البادئ الضوئي
- ل1 مل من 5٪ حل البادئ الضوئي، أولا حل 50 ملغ من 2-هيدروكسي-4'-(2-هيدروكسيتوكسي)-2-مسحوق ميثيل بروبيوفينونون في 700 ميكرولتر من الإيثانول 100٪ في أنبوب الطرد المركزي البولي بروبلين 1.5 مل مع غطاء.
ملاحظة: 2-هيدروكسي-4'-(2-هيدروكسيتوكي)-2-ميثيل بروبيوفينونون غير قابل للذوبان في الماء. تأكد من حل المسحوق بالكامل في الإيثانول عن طريق الدوامة. - بعد حل كامل 2-هيدروكسي-4'-(2-هيدروكسيتوكي)-2-ميثيلبروبيوفينون في الإيثانول عن طريق الدوامة، إضافة 300 ميكرولتر من المالحة المخزنة مؤقتا الفوسفات (PBS) لحجم النهائي من 1 مل.
ملاحظة: التركيز النهائي من 2-هيدروكسي-4'-(2-هيدروكسيتوكسي)-2-ميثيلبروبيوفينون حل هو 5٪. احباط 5٪ حل photoinitiator جيدة لمدة 4 أسابيع في 4 درجة مئوية.
6. إعداد غشاء الطابق السفلي حل البروتين مصفوفة
ملاحظة: مصفوفة غشاء الطابق السفلي(جدول المواد)هي مادة حساسة لدرجة الحرارة. تأكد من العمل على الجليد مع نصائح الأنابيب المبردة وأنابيب فضلا عن حلول الجليد الباردة. وينبغي إذابة مخزون جديد من مصفوفة غشاء الطابق السفلي ببطء على الجليد في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- إعداد 200 ميكرولتر من محلول بروتين مصفوفة غشاء الطابق السفلي لكل بناء هيدروجيل. ل12 يبني، وهناك حاجة إلى 2.4 مل من غشاء الطابق السفلي حل البروتين مصفوفة. إعداد حل إضافي بنسبة 10٪ (على سبيل المثال، 2.6 مل).
- لكل دفعة جديدة / الكثير من محلول بروتين مصفوفة غشاء الطابق السفلي ، قم بتحسين نسبة التخفيف. لأول مرة، اختبار نسب تخفيف من 1:10، 1:20، 1:40 للعثور على نسبة التخفيف التي تسفر عن أفضل الصفات لنقش الخلية.
ملاحظة: إذا كان محلول بروتين مصفوفة غشاء الطابق السفلي لزجًا جدًا ، فسيشكل هلامًا أعلى الاستنسل ، ومن المرجح أن يقشر عند إزالة الاستنسل. إذا كان محلول البروتين سائلًا جدًا ، فسوف يخترق ثقوب النمط في الاستنسل ، مما سيؤدي إلى أنماط ذات جودة رديئة. - تمييع غشاء السرداب غشاء مصفوفة بروتين محلول المخزون على الجليد مع الجليد الباردة Dulbecco في جلف تعديل المتوسطة / المغذيات خليط F-12 (DMEM/F12) وسائل الإعلام أو 1x PBS إلى نسبة التخفيف الأمثل أعلاه. على سبيل المثال، تمييع 120 ميكرولتر من محلول المخزون في 2.4 مل من وسائط DMEM/F12 (1:20) والحفاظ على الجليد للاستخدام في وقت لاحق.
7- تصنيع هيدروجيل
- ضع مصباح ًا على مقاعد البدلاء للأشعة فوق البنفسجية (365 نانومترًا ، 4 mW / cm2)في غطاء أمان بيولوجي.
- ضع أفلام البارافين المعقمة من الخطوة 3.2 وتجف تمامًا في ظل ظروف معقمة. إذا لم تكن أفلام البارافين جافة تمامًا ، فاستخدم نظام ًا للشفط للفراغ لإزالة أي سائل متبقي. ضع ستة قسائم تغطية أوتوكلاف من الخطوة 3.1 على كل فيلم من أفلام البارافين باستخدام ملقط الأوتوكلاف.
- إعداد الأشعة فوق البنفسجية crosslinkable محلول سلائف البولياكريلاميد عن طريق تخفيف 5٪ حل البادئ الضوئي (الخطوة 5.2) مع محلول سلائف البولياكريلاميد (الخطوة 4.2) في أنبوب الطرد المركزي البولي بروبلين 50 مل. ل5 مل من الأشعة فوق البنفسجية عبر لينكحل محلول السلائف البولياكريلاميد، إضافة 50 ميكرولتر من 5٪ حل البادئ الضوئي إلى 5 مل من محلول السلائف البولياكريلاميد.
- تصفية محلول السلائف من الخطوة 7.3 باستخدام وحدة تصفية 50 مل مع حجم مسام 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
ملاحظة: دائما إعداد حل السلائف الطازجة. - الاستغناء عن 200 ميكرولتر من محلول سلائف البولياكريلاميد من الخطوة 7.4 على كل 22 × 22 مم زلة غطاء زجاجي في طبق البارافين تصويربيتري وتغطية بعناية مع آخر 22 × 22 ملم غطاء زجاجي على رأس شطيرة الحل في ما بين(الشكل 3A).
ملاحظة: يتم استخدام فيلم البارافين لتجنب الانسكاب وحصر محلول السلائف بين قسائم التغطية. - ضع طبق بيتري المحتوي على الغطاء من الخطوة 7.5 تحت مصباح مقاعد البدلاء للأشعة فوق البنفسجية وفوتوبوليمر الهيدروجيلات البولية للأشعة البولية للأشعة البولية للأشعة فوق البنفسجية لمدة 5 دقيقة(الشكل 3B).
ملاحظة: إذا كان السطح غير أبيض، فإن امتصاص الأشعة فوق البنفسجية للسطح يقلل من كفاءة الربط الضوئي. تغطية ورقة بيضاء على سطح غير أبيض مهم للحد من فقدان كثافة الأشعة فوق البنفسجية. للحماية من الأشعة فوق البنفسجية، قم بتغطية المصباح برقائق الألومنيوم وارتداء نظارات واقية من الأشعة فوق البنفسجية. - فصل بعناية غطاء واحد زلة قبالة من الآخر باستخدام شفرة حلاقة عن طريق الاستفادة من العمل(الشكل 3C).
ملاحظة: الهيدروجيل عادة ما تتمسك الغطاء العلوي. إيلاء اهتمام إضافي عند فصل coverslip من الهيدروجيل لينة، لأنه من المرجح أن كسر. - ملء خزان البولي بروبلين المتاح مع برنامج تلفزيوني. نقل مركبات الهيدروجيل الغطاء في خزان يحتوي على PBS لشطف الهيدروجيل في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقيقة. بعد الرصانة، ضع الهيدروجيل بناء مرة أخرى على فيلم البارافين في طبق بيتري.
8- اقتران البروتين
- إعداد دلو الثلج وPBS بارد مسبقا.
ملاحظة: بالنسبة لستة هيدروجيلات، هناك حاجة إلى 1200 ميكرولتر من PBS الباردة. - إخراج العلية السلفو-SANPAH (1 قارورة = 6 المواد الهلامية).
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن تقليل كمية السلفو-SANPAH المستخدمة بعد التحسين. - إضافة 1200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة في قارورة من العلية السلفو-SANPAH وتخلط عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
- الاستغناء عن 200 ميكرولتر من السلفو-SANPAH على فيلم البارافين في طبق بيتري وتغطية مع مركب هلام الغطاء مع هيدروجيل الاتصال sulfo-SANPAH(الشكل 3D).
ملاحظة: سولفو-سانباه هو عرضة جدا للمياه بسبب التحلل المائي. ذوبان الطازجة من -80 درجة مئوية الحق قبل الاستخدام. لا تقم بإعادة استخدام أو إعادة تجميد أي بقايا. - فضح الهيدروجيل لمصباح الأشعة فوق البنفسجية في 365 نانومتر، 4 mW/cm2 لمدة 5 دقيقة لتنشيط sulfo-SANPAH.
ملاحظة: بعد التعرض، سوف تتغير السلفو-SANPAH من البرتقالي إلى البني(الشكل 3E). إذا تحول الهيدروجيل إلى اللون البني ، فإنه يشير إلى التنشيط الناجح لمجموعة الأزيد الفينيل من sulfo-SANPAH ودمج sulfo-SANPAH على الهيدروجيل. المضي مباشرة في الخطوات 8.6-8.9 في حدود 10 دقيقة كحد أقصى، لأن نشاط السلفو-سانباه سينخفض. - تجديد خزان البولي بروبلين القابل للتصرف مع برنامج تلفزيوني جديد. بعد تنشيط sulfo-SANPAH، قم بنقل الهيدروجيلات المنشطة وشطف الهيدروجيلبسرعة في خزان PBS لإزالة sulfo-SANPAH غير المنضمة.
ملاحظة: يمكن أن يؤدي الغسيل الطويل إلى انخفاض كفاءة الاقتران بالبروتين. - بعد شطف سريع، ضع قسائم التغطيات المرفقة بالهيدروجيل على فيلم البارافين في أطباق بيتري ومارس بعناية الهيدروجيل مع مناديل خالية من الوبر المعقم.
ملاحظة: سوف PBS المتبقية على رأس هيدروجيل يؤدي إلى تسرب من غشاء الطابق السفلي حل البروتين مصفوفة من خلال الاستنسل، والتجفيف على نطاق واسع جدا سيؤدي إلى تمزق الهيدروجيل عند إزالة الاستنسل بسبب الالتزام عالية جدا إلى الاستنسل. - وضع الاستنسل على رأس hydrogels والداب مع مناديل خالية من الوبر الأوتوكلاف لضمان ختم ضيق بين الاستنسل والهيدروجيل(الشكل 3F).
- الاستغناء بعناية 200 ميكرولتر من محلول البروتين مصفوفة غشاء القبو المخفف أعدت من الخطوة 6.3(الشكل 3G)على القمة. ترك بين عشية وضحاها في الحاضنة (37 درجة مئوية).
ملاحظة: عندما يكون الاتصال الاستنسل هيدروجيل ضيقًا وتركيز محلول بروتين مصفوفة غشاء الطابق السفلي هو الأمثل ، سيتم عزل محلول بروتين مصفوفة غشاء الطابق السفلي والبقاء على رأس الاستنسل(الشكل 3H). يمكن تقليل وقت الحضانة عند التحسين. نظريا، يمكن تخفيضها إلى 30 دقيقة-2 ساعة. - في اليوم التالي، نقل hydrogels إلى لوحة جيدة 6 وتزج تماما لهم في برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: فمن المستحسن لتقشير قبالة الاستنسل مع الغمر PBS على coverslip لمنع تمزق والالتصاق من الهيدروجيل إلى الاستنسل. - إزالة الاستنسل بعناية باستخدام ملاقط الأوتوكلاف دون تمزيق الهيدروجيل. إعادة تعليق جيدا مع DMEM، والعودة هيدروجيلات منقوشة إلى الحاضنة، وتركها بين عشية وضحاها لاختبار أي تلوث.
- إذا ظلت وسائل الإعلام واضحة، فإن الهيدروجيل جاهزة للاستخدام في طلاء الخلايا. تحسين كثافة طلاء الخلايا ووقت الحضانة للسماح التصاق الخلايا للتطبيقات المعنية.
ملاحظة: لنقش خلية واحدة من hiPSC-CMs، البذور واحتضان بين عشية وضحاها. يوصى بأرقام الخلايا التالية للبذر: 30,000 و60,000 و90,000 خلية/بئر. البذر الكثير من الخلايا يؤدي إلى أكثر من خلية واحدة لكل نمط. يوصى بمصفاة الخلية لإجهاد الخلايا غير المفردة قبل بذر الخلايا. - في اليوم التالي، لاحظ مرفق الخلايا وانتشارها، وتغيير وسائل الإعلام للتخلص من الخلايا المنفصلة.
9. تنظيف الاستنسل المستخدمة
- لإزالة بروتينات المصفوفة المتبقية على الاستنسل المستخدم ، قم بغمر الاستنسل في محلول الإنزيم(جدول المواد)لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب اختيار الإنزيم اعتمادًا على بروتينات المصفوفة المستخدمة. لبروتين مصفوفة الكولاجين الغنية حل، استخدام الكولاجين. ويوصى أيضا بالموجات فوق الصوتية 10-15 دقيقة في حل الإنزيم. - يُستنشق الحل ويُجدد مع التبييض بنسبة 10%. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف 3x مع برنامج تلفزيوني.
- تخزينها في الإيثانول 70٪ في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد ثبت تلفيق الاستنسل التي تحتوي على مجموعة من المربعات أو المستطيلات(الشكل 4A). بعد هذا البروتوكول، حصلنا على جزر بروتين مصفوفة منقوشة(الشكل 4B والشكل 5A)والخلايا(الشكل 4C). أدى تركيز محلول بروتين المصفوفة دون المستوى الأمثل إلى الأنماط دون المثلى(الشكل 5B). من الأهمية بمكان استخدام الجانب الأمامي من الاستنسل. إذا تم استخدام الجانب الخلفي من الاستنسل ، فإن حجم جزر بروتين المصفوفة يزيد بسبب اتجاه القطع بالليزر(الشكل 6A،B). في حين أن عرض الأنماط المستطيلة لم يتغير بشكل كبير(الشكل 6C)، زاد الارتفاع بشكل كبير عند استخدام الجانب الخلفي من الاستنسل ، مما أدى إلى انخفاض في نسبة العرض إلى الارتفاع المقصودة(الشكل 6D،E). طبقنا النقش القائم على الاستنسل على ركائز السيليكون الإيلاستير(الشكل 7). تم تصور خلايا القلب المنقوشة على ركائز الإيلاستير السيليكون بواسطة الكيمياء المناعية لتروبونين T القلبيعند التكبير المنخفض(الشكل 7A)وبروتين ساركوميريك α-actinin عند التكبير العالي(الشكل 7B). ويمكن أيضا أن يتم تطبيق النقش القائم على الاستنسل إلى نمط اثنين من خلايا القلب جنبا إلى جنب على hydrogels مع صلابات مختلفة. كدليل، ونحن تظهر أنماط cardiomyocyte على صلابة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية(الشكل 8A)وتصلب ذات الصلة المرضية(الشكل 8B).
الشكل 1: التخطيطية لثلاث استراتيجيات للتقويم الدقيق للذهب. (أ)التصوير الضوئي. (ب)الطباعة Microcontact. (C)النقوش Microfluidic. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سير عمل تصميم الإستنسل. (أ)تصميم بمساعدة الكمبيوتر من الاستنسل. (ب)صورة تمثيلية لاستنسل البوليميد قطع الليزر. (ج)صورة مجهرية تمثيلية لاستنسل. تمثل المنطقة الصفراء استنسل البوليميد ، في حين تمثل المنطقة الزرقاء الفاتحة مجموعة من الثقوب المقطوعة بالليزر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور لخطوات تصنيع الهيدروجيل. (أ)Polyacrylamide تصنيع الهيدروجيل عن طريق تقع حل السلائف في ما بين اثنين من coverslips. (B)الأشعة فوق البنفسجية الصورة عبر الربط من هيدروجيلات polyacrylamide تحت مصباح مقاعد البدلاء الأشعة فوق البنفسجية. يتم تغطية مصباح الأشعة فوق البنفسجية مع رقائق الألومنيوم لحماية المستخدم. (C)يتم استرداد الهيدروجيل المرتبط بالصور عبر عن طريق فصل غطاء على جانب واحد. (D)بناء الهيدروجيل على اتصال مع سولفو-SANPAH الحل لتعديل الهيدروجيل لدمج بروتين ECM. قبل تفعيل الأشعة فوق البنفسجية، والسلفو-SANPAH هو البرتقالي. (E)بعد تنشيط الأشعة فوق البنفسجية، sulfo-SANPAH يتحول البني، مما يدل على أنه يتم تنشيطه ودمجها على سطح الهيدروجيل. (F)بعد dabbing الهيدروجيل مع مناديل المعقمة الخالية من الوبر لإزالة المياه الزائدة، يتم وضع الاستنسل على الهيدروجيل. (G)محلول بروتين مصفوفة غشاء الطابق السفلي هو pipetted على بنيات الاستنسل هيدروجيل. (H)إذا كان الاتصال الاستنسل هيدروجيل هو ضيق بنجاح، فإن غشاء الطابق السفلي حل البروتين مصفوفة البقاء على رأس ولن تغلي من خلال. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الأنماط الدقيقة لبروتينات مصفوفة غشاء الطابق السفلي وخلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات البشرية (hiPSC-CMs) بأشكال مستطيلة مختلفة. (أ)صور مجهرية من الاستنسل التي تحتوي على مستطيلات بالليزر مع نسب عرض إلى ارتفاع مختلفة (1:1، 4:1، 11:1). (ب)صور تمثيلية لجزر بروتين المصفوفة المناعية على ركائز هيدروجيل. (C)صور تمثيلية من hiPSC-CMs ملطخة للنواة (السماوية) وتروبينين القلب T (أرجواني). شريط مقياس = 20 ميكرومتر للألواح B و C. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تركيز بروتين ECM يلعب دورا أساسيا في توليد الأنماط المناسبة. (أ)صورة تمثيلية لتركيز أمثل مع توزيع متجانس جدا من بروتينات مصفوفة غشاء الطابق السفلي في أنماط واحدة. (B)أنماط بروتين المصفوفة دون المستوى الأمثل بسبب انخفاض التركيز ، مما تسبب في تسرب بروتين المصفوفة خارج الأنماط وكميات منخفضة من بروتينات المصفوفة ضمن الأنماط كما يحددها تلطيخ agglutinin جرثومي القمح. شريط مقياس = 20 ميكرومتر للألواح A و B. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الآثار الجانبية ستينسيل. (أ)أنماط بروتين مصفوفة غشاء الطابق السفلي عندما تم استخدام الجانب الأمامي من الاستنسل. (ب)أنماط بروتين مصفوفة غشاء الطابق السفلي عندما تم استخدام الجانب الخلفي من الاستنسل. القياس الكمي للعرض(C)والعرض ،(D)الارتفاع ،(E)نسبة العرض إلى الارتفاع من جزر بروتين مصفوفة غشاء الطابق السفلي المستطيلة. رسم الرسم البياني يعني ± SEM. يتم حساب الإحصاءات بواسطة اختبار T الطالب غير المقترن. n.s. = ليست كبيرة. = p < 0.0001. شريط مقياس = 20 ميكرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: النقش القائم على ستينسيل على ركيزة السيليكون الإيلاستير. (أ)صورة تمثيلية لخلايا واحدة منقوشة cardiomyytes على ركائز السيليكون اللاستيرومر ملطخة بعلامة القلب، تروبونين القلب T (cTnT)، في التكبير منخفضة. شريط مقياس = 300 ميكرومتر .(ب)ممثل أحادي الخلية منقوشة عضلة القلب ملطخة بروتين ساركومريك α-actinin في التكبير عالية. شريط مقياس = 10 ميكرون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: الأنماط الدقيقة لـ hiPSC-CMs على هيدروجيلات البولياكريلاميد مع صلابات مختلفة. (أ)10 كيلو باسكال ،(ب)60 كيلو باسكال. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| خطوه | المشكلة التي لوحظت | السبب المحتمل | حل |
| 1.1 | حجم النمط أكبر من المتوقع | انقلبت الاستنسل | تضمين حرف/ شكل chiral في تصميم الاستنسل للإشارة إلى الجانب الأمامي والخلفي من الاستنسل |
| 8.1 | كسور هيدروجيل عند تقشير الاستنسل | هيدروجيل العصي على الاستنسل | تنظيف الاستنسل |
| لا هيدروجيل الجافة كثيرا قبل وضع الإستنسل | |||
| 8.13 | مرفق الخلية دون المستوى الأمثل | السولفو -سانباه المتدهورة | استخدام السلفو-سانباه الجديدة |
| إدراج البروتين غير الفعال | إعداد حل بروتين ECM جديد | ||
| حل بروتين ECM القديم | |||
| 8.13 | نمط الخلية دون المستوى الأمثل | غشاء الطابق السفلي مصفوفة بروتين محلول ينسكب على | إجراء المناعة باستخدام fluorophore-مترافق المضادة للفأرة الأجسام المضادة IgG أو القمح جرثومة agglutinine لدراسة توزيع غشاء الطابق السفلي حل البروتين مصفوفة على هيدروجيل |
| 8.13 | أكثر من خلية واحدة على فتحة واحدة | ليس في تعليق خلية واحدة | استخدام مصفاة الخلية 40-70 ميكرومتر للحصول على تعليق خلية واحدة |
| كثافة البذر ليست مثالية | تحسين كثافة البذر من 30 ك إلى 90 كيلو لكل مل |
الجدول 1: إرشادات استكشاف الأخطاء وإصلاحها. وتناقش المشاكل المتكررة والأسباب المحتملة والحلول المحتملة.
ملفات تكميلية. الرجاء الضغط هنا لتحميل الملفات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن نصف طريقة النقش المجهري المستندة إلى الاستنسل الخالية من الطباعة الحجرية التي تمكن من الأنماط الفعالة للخلايا الملتصقة. في هذا البروتوكول، ونحن نظهر النقش من hiPSC-CMs في نسب مختلفة طول إلى العرض عن طريق micropatterning الطابق السفلي غشاء مصفوفة جزر البروتين على هيدروجيلات البولياكريلاميد مع تصلب الأنسجة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية أو المرضية أو ركائز الإيلاستير القائم على السيليكون. هذه الطريقة بسيطة نسبيا ومتاحة للغاية لأي باحث ، بما في ذلك أولئك الذين لديهم خلفية ضئيلة في تقنيات التصوير الضوئي والتصنيع المجهري. الطريقة الموصوفة تتحايل على التحديات الكبيرة المرتبطة بتوليد الطوابع باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة ونقل البروتينات من قوالب الطوابع إلى ركائز الاهتمام التي تنطوي عليها تقنية الطباعة microcontact. يوفر هذا البروتوكول سير عمل إلى 1) إنشاء استنسل مصمم خصيصًا مع منطقة وشكل من الاهتمام بطريقة فعالة من حيث التكلفة؛ 2) تلفيق الركيزة هيدروجيل مع صلابة الفائدة؛ و 3) بكفاءة اقتران بروتينات ECM على الركيزة هيدروجيل.
وقد استخدمت أساليب الطباعة الحجرية الناعمة التقليدية لنقش أشكال مختلفة من البروتينات ECM بما في ذلك المثلثات والنجوم على ركائز من مواد مختلفة مثل المواد القائمة على السيليكون وcoverslips الزجاج13،14. في هذه الدراسة ، نحن فقط تظهر أنماط مستطيلة نظرا للشكل الفسيولوجي والمرضي ذات الصلة من خلايا القلب. ونحن نعتقد أن النقش القائم على الاستنسل من الأشكال المعقدة الأخرى يمكن أن تعمل طالما أصغر ميزة من الشكل لا تتجاوز القرار (~ 10 ميكرون). وفيما يتعلق بمواد الركيزة، ونحن نظهر يمكن تطبيق النقش القائم على الاستنسل على هيدروجيل(الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4، الشكل 5، الشكل 6 والشكل 8)أو الركيزة اللاستيرومر القائم على السيليكون(الشكل 7). الطريقة المعروضة لا تعمل على ركائز مع الحد الأدنى من اللصق إلى مواد البوليميد مثل البلاستيك ثقافة الأنسجة وcoverslips الزجاج لأن الختم الضيق بين الاستنسل القائم على البوليميد وهذه الركائز لا يتحقق. لتمكين الختم ضيق، مطلوب مزيد من تعديل السطح. وأخيرا، نحن نظهر أن الطريقة يمكن استخدامها لإنتاج أنماط بشكل موثوق الخلية زوج على hydrogels مع صلابات مختلفة (أي، 10 كيلو باسكال، 60 كيلو باسكال)(الشكل 8).
في البروتوكول ، فإن الخطوة الأكثر أهمية هي تحسين تركيز بروتين ECM (القسم 6 من البروتوكول). الهدف من هذه الخطوة هو العثور على التركيز الأمثل لبروتين ECM الذي هو لزج بما يكفي لمنع محلول البروتين للتشعب من خلال ثقوب الاستنسل ، ولكن ليس مركزًا جدًا ، لتجنب الهلام(الشكل 5). هذه الطريقة القائمة على الاستنسل لا تقيد نوع بروتين ECM. على الرغم من أن محلول بروتين ECM اللزج أكثر عرضة للبقاء على قمة الاستنسل ، يمكن أيضًا استخدام بروتين أقل لزوجة. أحد المتطلبات هو التأكد من أن أسطح الاستنسل وهيدروجيل السلطة الفلسطينية جافة بما يكفي لتشكيل واجهة مسعورة مستقرة نسبية. في هذه المظاهرة، تم استخدام بروتين مصفوفة غشاء الطابق السفلي لأنه لزج ومناسب لزراعة hiPSC-CMs. ومع ذلك، يمكن استخدام بروتينات ECM أخرى على الأرجح (على سبيل المثال، فيليكتين، الجيلاتين، الكولاجين، الصفيحة).
بالإضافة إلى تحسين حل بروتين ECM لكل تطبيق معين ، فإن إنشاء ختم مناسب بين الاستنسل وسطح الهيدروجيل أمر بالغ الأهمية للحصول على نمط دقيق مع بروتين ECM. لأن التجفيف المفرط يمكن أن يؤدي إلى تمزق الهيدروجيل ، فمن الضروري عدم الإفراط في الاستنسل. هذه الخطوات (أي وضع الاستنسل على الهيدروجيل وكذلك التبيلة بلطف قبالة بعد ذلك) تتطلب بعض الممارسة. إنشاء إجراء المناولة الأمثل لكل شرط معين سوف تجنب أيضا وجود عصا الهيدروجيل إلى الاستنسل. مع هذا التحسين ، وحروق الليزر تحت micron نطاق الناجمة عن عيوب في قطع الليزر لن تؤثر بشكل كبير على هذه التقنية فيما يتعلق الضرر الهيدروجيل.
خطوة أخرى مهمة هي استخدام الجزء الأمامي من الاستنسل عند وضع الاستنسل على الركيزة الهيدروجيل. وجدنا أن استخدام كل جانب له تأثير على الركيزة ، ويفترض أن ذلك يرجع إلى قطع الليزر(الشكل 6). توصية واحدة عند نقش الخلايا في حجم أو شكل معين للمرة الأولى هو إنشاء استنسل التحسين. ميزات تصميم الاستنسل لا تتطابق بالضرورة مع أحجام الخلايا المنقوشة النهائية. نوصي بإنشاء استنسل التحسين الذي يحتوي على تدرج من أحجام الميزات. أعدنا جدولاً يسرد المشاكل المحتملة والحلول الممكنة للمساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها(الجدول 1).
ليس مطلوباً استخدام نفس شركة التصنيع المجهري المذكورة في هذه المخطوطة. مفاتيح التوليد الدقيق للاستنسل هي قطر شعاع الليزر وسماكة فيلم الاستنسل ، في حالتنا ، polyimide (50 ميكرومتر). نعتقد أن مختبر الليزر المجهز بالليزر المناسب يمكن أن يولد الاستنسل مع بضع خطوات ، وتحسين كثافة الليزر ، والمحاذاة ، والمتغيرات الأخرى. على الرغم من أننا عملنا فقط مع شركة واحدة ، هناك العديد من الشركات المتاحة التي تقوم بالقطع الدقيق بالليزر.
تقييد إلى هذا الأسلوب هو الحل. في حين أن التصوير الضوئي يمكن أن يحقق دقة النانو، يقتصر دقة النقش المستندة إلى الاستنسل على دقة القطع بالليزر من الاستنسل البوليميد، والتي حتى الآن عادة ما تكون على مقياس عدد قليل من ميكرون (~ 10 ميكرون). ومع ذلك، وبالنظر إلى أن متوسط حجم الخلية هو أكثر من 10 ميكرومتر، فإن القرار ينطبق بشكل عام على أي نقش خلية واحدة.
وباختصار، توفر هذه الطريقة منصات متعددة الاستخدامات لدراسة تفاعلات الخلية وECM، وفحص ارتباط بنية الخلية ووظيفة، والعديد من التطبيقات الأخرى. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول سيفيد العديد من الباحثين في الطب الحيوي ويسهل دراسات الخلية الواحدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه من معهد ستانفورد لأبحاث صحة الطفل (CHRI) والمعهد الوطني للصحة (1F32HL142205-01) إلى S.L، جائزة رائد مكتب المعاهد القومية للصحة (LM012179-03)، وجمعية القلب الأمريكية جائزة المحقق (17EIA33410923)، ومعهد ستانفورد لأمراض القلب والأوعية الدموية، ومؤسسة هوفمان وشروبفر، وقسم ستانفورد لطب القلب والأوعية الدموية، قسم الطب إلى S.M.W ، جوائز من المعهد الوطني للصحة (UG3 TR002588، P01 HL141084، R01 HL126527، R01 HL113006، R01 HL123968) وبرنامج أبحاث الأمراض المرتبطة بالتبغ (TRDRP 27IR-0012) إلى J.C.W، وجمعية القلب الأمريكية (AHA) جائزة زمالة ما بعد الدكتوراه (18POST34030106) إلى H.Y، وزمالة هنغستبرجر إلى T.S. نشكر الدكتور أندرو أولسن من خدمة الفحص المجهري لعلم الأعصاب في ستانفورد على دعم التصوير البؤري لـ hiPSC-CM المنقوشة بالميكروها. نشكر H.Y. لتصميم الاستنسل الأول، والتصنيع، وmicropatterning خلية واحدة من iPSC-CM على polyacrylamide هيدروجيل المغلفة coverslip، والتصوير الأولي confocal من بنية ساركومير من خلية واحدة micropatterned iPSC-CMs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
