Summary
In dit protocol beschrijven we procedures om ontwikkelingsfenotypes bij muizen geassocieerd met aangeboren hartafwijkingen kwalitatief en kwantitatief te analyseren.
Abstract
Aangeboren hartafwijkingen (CHD) zijn de meest voorkomende vorm van aangeboren afwijking bij de mens, die tot 1% van alle levende geboorten. Echter, de onderliggende oorzaken voor CHD zijn nog steeds slecht begrepen. De ontwikkelende muis vormt een waardevol model voor de studie van CHD, omdat cardiale ontwikkelingsprogramma's tussen muizen en mensen sterk worden bewaard. Het protocol beschrijft in detail hoe muisembryo's van het gewenste zwangerschapsstadium kunnen worden geproduceerd, methoden om het hart te isoleren en te behouden voor downstreamverwerking, kwantitatieve methoden om gemeenschappelijke soorten CHD te identificeren door histologie (bijv. ventriculaire septal defecten, atriumseptale defecten, octrooiductus arteriosus), en kwantitatieve histomorfometrie methoden om gemeenschappelijke spierverdichting fenotypes te meten. Deze methoden articuleren alle stappen die betrokken zijn bij monstervoorbereiding, verzameling en analyse, waardoor wetenschappers CHD correct en reproducibly kunnen meten.
Introduction
CHDs zijn de meest voorkomende vorm van aangeboren afwijking bij de mens en zijn de belangrijkste oorzaak van aangeboren afwijking gerelateerde sterfgevallen1,2,3,4,5,6. Hoewel ongeveer 90% van de pasgeboren kinderen CHD overleven, wordt het in de loop der jaren vaak geassocieerd met aanzienlijke morbiditeit en medische ingrepen, die een zware last opleggen voor het leven van de patiënten en het gezondheidszorgstelsel7,8,9,10. Buiten zuiver genetische factoren, zijn de oorzaken van CHD slecht begrepen4. Niet-geïdentificeerde oorzaken zijn goed voor ~ 56-66% van alle CHD gevallen volgens de American Heart Association en andere bronnen2,3,4,11. Bekende factoren zijn genetische mutaties, CV's, de novo single nucleotide varianten en aneuploïdie. Het vermoeden bestaat dat milieu- en voedingsfactoren ook belangrijke bronnen zijn die bijdragen aan CHD, zoals blijkt uit epidemiologische studies die de levensstijl van moeders met elkaar verbinden2,12, economische ontbering en ras13, en door onderzoek naar voedingsfactoren zoals foliumzuur11,14 en het bioactieve lipideretinoïnezuur15,16. Het onderzoeken van de mechanismen en oorzaken van CHD en andere cardiovasculaire defecten is belangrijk om preventieve strategieën en nieuwe therapeutische optiesteontwikkelen 1,4,17,18,19.
De ontwikkelende muis is een hoeksteenmodel voor het bestuderen van CHD bij zoogdieren. Echter, sommige van de gebruikte methoden en analyses, zoals dissecties behoud van hartmorfologie, analyse van ontwikkelingsstadia, en de identificatie van CHD-geassocieerde gebreken, kan ontmoedigend zijn voor wetenschappers die nieuw zijn voor de analyse van murine harten. Het doel van de in dit protocol beschreven methoden is om kwalitatieve en kwantitatieve richtlijnen voor deze processen aan te bieden. Zo leggen we in dit protocol uit hoe getimede paringen kunnen worden uitgevoerd om embryo's van het gewenste zwangerschapsstadium te produceren, zwangere vrouwtjes te ontleden voor intact hartherstel (inclusief bijbehorende weefsels zoals het uitstroomkanaal), hartfixatie en voorbereiding cryostat sectioning, basis histologie methoden, kwantitatieve analyses van gemeenschappelijke hartafwijkingen, en kwalitatieve analyse van hartspier verdichting, een gemeenschappelijke voorloper fenotype voor sommige soorten CHD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren die in de in dit document genoemde experimenten worden gebruikt, werden behandeld met behulp van de richtlijnen voor de verzorging van dieren van de Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Getimede paring van C57BL6/J muizen voor embryoproductie
- Zodra muizen de fokleeftijd (6-8 weken) hebben bereikt, zet ze ze samen in haremkweekformaat (d.w.z. twee vrouwtjes per één mannetje). Zet ze voor de fokkerij ergens in de middag of avond.
LET OP: Muizen broeden vaak binnen 1 uur nadat de lichten zijn uitgeschakeld binnen hun woonvoorziening. Vrouwtjes moeten worden teruggetrokken uit de fokkerij op ongeveer 6-8 maanden en mannetjes moeten worden gebruikt niet later dan 12 maanden oud. - Als u de weegmethode gebruikt om de bevruchting te bepalen, kweek dan muizen in grote groepen, omdat de weegmethode ervoor zorgt dat getimede paring langzamer verloopt dan methoden waarbij alleen copulatiepluggen worden gecontroleerd.
- De volgende ochtend, controleer op copulatie stekkers ergens tussen 8:00-12 uur. Zorg ervoor dat dit gebeurt op de juiste tijdstippen. Als de plug test eerder dan 8 uur wordt uitgevoerd, bestaat het risico dat de stekker te diep in het vaginale kanaal zit om te worden waargenomen. Als de stekkertest later dan 12 pm wordt uitgevoerd, bestaat het risico dat de stekker uitvalt.
- Pak het vrouwtje aan de basis van de staart en onderzoek de opening naar het vaginale kanaal met behulp van een micropipette tip. Een copulatie plug zal eruit zien als een slijmvlies barrière(Figuur 1A), die misschien een beetje moeilijk te zien in sommige gevallen. Crustiness is ook een indicatie dat een copulatie plug aanwezig is of was. Als er geen slijmvliesbarrière is(figuur 1B)dan is de vrouw waarschijnlijk niet gedekt of de copulatieplug kan al zijn uitgevallen.
- Verwijs naar de ochtend van de copulatie als e0.5.
LET OP: Met C57BL6/J muizen kunnen copulatiepluggen moeilijk te identificeren zijn. Daarom, soms de muizen gedekt, hoewel er geen stekker werd waargenomen. Copulatie leidt niet altijd tot conceptie. Dit is vaak waarschijnlijker bij C57BL6/J muizen. Controleer daarom de gewichtsprogressie om de zwangerschap te bevestigen (zie stap 1.4). De wegen ins kan helpen bij het identificeren van vrouwen die zwanger zijn en bevestigen dat stekkers leidde tot conceptie. Wees voorzichtig bij het paren van vrouwtjes voor opeenvolgende nachten. Als een bepaald mannetje wordt waargenomen om goed in het produceren van een copulatieplug te zijn, kan dat mannetje worden vertrouwd om voor opeenvolgende nachten met het zelfde wijfje te paren. - Houd in gedachten dat de kans op zwangerschap hoger zijn met muizen die bewezen fokkers, zoals ze met succes zijn gefokt voordat. Om de kans op bewezen fokkers te vergroten, moeten de gebruikte mannetjes niet te oud zijn.
- Na de plug test, weeg de vrouwtjes. Deze weging moet 7-10 dagen later worden opgevolgd. Als gewichtstoename meer dan 1,73 g, dan is de muis is waarschijnlijk zwanger20. Als gewichtstoename lager is dan 1,73 g, is het waarschijnlijk niets te maken met zwangerschap en moet de muis opnieuw worden geïntroduceerd in de fokpopulatie.
OPMERKING: C57BL6/J muizen produceren kleine nestjes (gemiddeld vijf tot zes embryo's). Weeg in methoden om zwangerschap te bepalen nauwkeurig zijn voor de meerderheid. Het gebruik van deze methode biedt een 12,8% vals positief tarief en zal uitsluiten 3% van de vrouwen die daadwerkelijk zwanger zijn20. Als de onderzoeker zich zorgen maakt dat de gewenste zwangerschapstijd later is, ga dan verder naar stap 1.5 - Optioneel: De dag waarop de dissectie gaat plaatsvinden, ervoor te zorgen dat de zwangerschap is gevorderd door fysieke inspectie. Pak het vrouwtje aan de basis van de staart en strek het lichaam uit. Dit is het gemakkelijkst te doen door het plaatsen van de muis op de pols en voorzichtig trekken de basis van de staart. Als het vrouwtje zwanger is, dan zal er waarschijnlijk gewichtstoename specifiek in de onderste romp, en het zal verschijnen als kleine brokken.
OPMERKING: Zwangerschap kan voelbaar zijn zo vroeg e12.5 en zal voelbaar zijn door e14.5 in de meeste gevallen. C57BL6/J muizen hebben kleine nestgroottes, daarom kan het vrouwtje zwanger zijn, zelfs als er geen fysieke tekenen zijn.
2. Dissectie van vrouwtjes en embryo's voor hartherstel
- Bereid voor aanvang van de dissectie de volgende oplossingen bij kamertemperatuur.
- Los ethyleenminetetraacetic acid (EDTA) op in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij een concentratie van 0,5 mM.
LET OP: Eenmaal voorbereid, is het beter om de oplossing op ijs te houden en alleen te gebruiken bij 4 °C. Als besmetting een probleem is, moet deze voorafgaand aan het gebruik automatisch worden afgegaan. - Los paraformaldehyde (PFA) op in PBS bij een concentratie van 4%.
LET OP: Eenmaal voorbereid, is het beter om de oplossing op ijs te houden en alleen te gebruiken bij 4 °C. Bewaar bij 4 °C of kouder voor langdurige opslag. De concentratie van de PFA-oplossing kan variëren afhankelijk van de downstreamtoepassingen van de weefselmonsters. Dit percentage wordt gebruikt voor hematoxyline en eosine kleuring, immunohistochemie en immunofluorescerende vlekken.
- Los ethyleenminetetraacetic acid (EDTA) op in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij een concentratie van 0,5 mM.
- Zodra het vrouwtje het gewenste zwangerschapsstadium heeft bereikt, moet de muis op het juiste moment van de dag worden geëuthanaseerd volgens de goedgekeurde richtlijnen voor dierlijk gebruik. Als de timings op de halve dag zijn (bijvoorbeeld e15.5) moeten ze bijna om 12.00 uur worden opgeofferd. Als de timings op hele dagen zijn (bijvoorbeeld e15.0) moeten ze bijna 12 uur worden opgeofferd.
OPMERKING: Conceptie wordt verondersteld om in de buurt van middernacht tijdens de nacht de muizen zijn gekoppeld. Het is echter moeilijk om het exacte tijdstip van de conceptie te bepalen. Hierdoor wordt de timing geschat, niet exact. - Na het vastpinnen van de vier ledematen naar beneden, zorgvuldig een I-vormige incisie langs de romp, vanaf rond de plasbuis omhoog naar het borstbeen.
- De baarmoeder zal waarschijnlijk net boven het bekkengebied liggen. De muisbaarmoeder is Y-vormig; daarom zal het waarschijnlijk erg lang en gewikkeld rond de romp. Verwijder het door het voorzichtig op te tillen. Doe dit met behulp van de zijkanten van fijne tangen in een scheppende beweging. De oppervlakkige weefsels van de baarmoeder kunnen zeer zorgvuldig worden gegrepen door de uiteinden van de fijne tangen wanneer in eerste instantie trekken de baarmoeder uit. Gebruik een schaar om de baarmoeder uit het lichaam te snijden.
OPMERKING: Rekening houdend met de ongewone Y-vormige van de baarmoeder, zorg ervoor dat de hele baarmoeder wordt verwijderd. - Week de baarmoeder in ijskoude PBS. Pin een uiteinde van de baarmoeder naar beneden en strek het uit in een enkele lijn.
- Snijd de baarmoeder in secties, elke sectie met een apart embryo. Pel het embryo voorzichtig uit met fijne tangen. Dit is het gemakkelijkst te doen met een paar tangen in elke hand. Eenmaal verwijderd, plaats het embryo onmiddellijk in een nieuwe petrischaal gevuld met PBS-EDTA oplossing op 4 °C.
OPMERKING: Normale PBS-oplossing kan ook worden gebruikt, maar de EDTA voorkomt stolling in de monsters. - Faseer de embryo's met Theiler Staging21. Omdat enscenering kan variëren tussen embryo's binnen een enkel nest, fase elk individueel embryo.
OPMERKING: Dit kan ook voorzien in een vooruitziende blik op de mogelijke aangeboren hartafwijkingen in de embryo's. Typisch, symptomen van een aangeboren hartafwijking kan worden waargenomen in de embryonale morfologie. Andere belangrijke gebreken vaak geassocieerd met bepaalde hartaandoeningen aanwezig kunnen zijn. - Het hart kan op verschillende manieren worden verwijderd, afhankelijk van de leeftijd van het embryo.
OPMERKING: Als het onduidelijk is of het uitstroomkanaal intact blijft tijdens het verwijderen, verwijder dan meer weefsels dan alleen het hart (het intact houden van het uitstroomkanaal en het minimaliseren van direct contact tussen het hart en de tangen) of analyseer het hele embryo.- Met behulp van een dissectie scope en twee paar fijne tangen, plaats het embryo op zijn rug en stabiliseren de toegang tot de borst. Dit kan worden gedaan door ofwel pinning de armen naar beneden met de tang of het verwijderen van de armen en het houden van de romp in positie.
- Gebruik het scherpe punt van een tweede paar fijne tangen om een incisie te maken langs het borstbeen van het embryo en uit te breiden tussen de sleutelbeenderen naar de navel. Begin met het maken van zeer fijne en oppervlakkige incisies terwijl geleidelijk werken aan de binnenkant van de borstholte. Het hart moet nauwelijks zichtbaar worden. Neem geen contact op met de tangen tijdens deze oppervlakkige insnijdingen.
- Pel de ribbenkast open met behulp van het eerste paar tangen om zachtjes te knijpen op de romp van het embryo, licht caudal aan de ribbenkast. Het hart moet eruit springen of duidelijk worden. Het hart kan wat zachte coaxing nodig hebben om naar buiten te komen. Gebruik de zijkant van de tangen, ervoor te zorgen dat het punt van de tangen nooit in contact komt met het hart. Om de werkruimte schoon te houden en forceps schoon te houden, houd een lint-vrij veeg in de buurt.
- Pak voorzichtig de longbloedvaten met de zijkanten van de tangen, zorg ervoor dat het weefsel niet doorsmijnt en trek het hart uit de borstholte. Maak dan het hart schoon.
LET OP: Voor embryo's e13.5 en jonger is het hart bedekt met het hartzakje. Dit moet worden verwijderd om het hart te bereiken.
- Met behulp van een stereoscoop, neem een foto van het hart voor latere referentie.
- Spoel de harten in PBS-EDTA oplossing voor 1-2 min, en plaats ze in 4% PFA oplossing voor ongeveer 45-60 min om ze te repareren. Als analyse van het hele embryo gewenst is, geniet dan van de ene op de andere dag. Het volume van de PFA-oplossing moet 5-6x het volume van het weefsel zijn dat wordt bevestigd.
OPMERKING: Deze incubatietijd kan variëren afhankelijk van de latere studies. Deze incubatietijd wordt gebruikt voor hematoxyline en eosine kleuring, immunohistochemie en immunofluorescerende vlekken. - Was 5-10 min met PBS-glycine 3x en plaats terug in PBS. Natriumazide of penicilline/streptomycine kan ook worden toegevoegd om bacteriële groei te minimaliseren en intacte weefsels te behouden. De harten kunnen nu op korte termijn worden opgeslagen bij 4 °C.
3. Weefselbereiding
OPMERKING: Weefsels kunnen worden bereid met behulp van OCT (optimale snijtemperatuur) inbedding of paraffine inbedding. Er zijn voor- en nadelen aan beide methoden en het doel van de analyse moet worden overwogen bij de beslissing welke inbeddingsmethode moet worden gebruikt.
- OCT-inbedding
OPMERKING: Deze methode kan de voorkeur hebben boven formaline/paraffine inbedding omdat cryosecties antigeenreactiviteit behouden, nog steeds kunnen worden gebruikt voor hematoxyline- en eosinevlekken en sneller plakjes produceren.- Bereid een oplossing van sacharose opgelost in PBS bij een 30% (w / v) concentratie.
- Breng de weefsels over op een nieuwe conische buis van 15 mL of 1,5 mL microcentrifugebuis met PBS-30% sacharose. In eerste instantie zal het weefsel drijven.
- Zet het op 4 °C in de koelkast. Het weefsel zal klaar zijn voor OCT inbedding wanneer het zinkt naar de bodem van de buis, meestal in 24-40 uur.
OPMERKING: Spierweefsels lijden aanzienlijk tijdens freeze / dooi cycli en verliezen hun inheemse morfologie. Sacharose wordt geabsorbeerd door het weefsel en werkt als een cryopreserving agent die een betere bewaring van de morfologie mogelijk maakt. Zorg ervoor dat er voldoende oplossing in de buis is om het zweven van de weefsels voldoende te kunnen controleren. PBS-sucrose is gemakkelijk besmet met bacteriën, dus controleer de oplossing vaak op troebelheid, wat duidt op schimmel- of bacteriële begroeiing. Om het risico op besmetting te minimaliseren, kan penicilline/streptomycine of natriumazide worden toegevoegd aan de PBS-sacharoseoplossing. - Verwijder de harten met een Pasteur pipet, zorg ervoor dat de opening van de pipet breed genoeg is om het weefsel niet te scheuren. Snijd de pipet indien nodig met een schaar. Als u met hele embryo's werkt, gebruikt u tangen om het monster op te halen.
LET OP: Doe dit voorzichtig. Zelfs als de pipet opening is breed genoeg om de harten te halen, kunnen de randen van de pipet nog steeds scheuren de weefsels. Tangen kunnen weefselmonsters inspringen als ze te agressief worden gebruikt. - Laat het weefsel kort drogen op een pluisvrij doekje. Plaats het monster in een OCT-mal in de gewenste positie om te snijden (d.w.z. sagittale, transversale, coronale). Voeg OCT-verbinding toe totdat het monster volledig onder water is, zodat er geen bellen in contact zijn met het weefsel.
- Plaats de mal 's nachts of meerdere dagen op -20 °C en verplaats de mal naar -80 °C. Na 24 uur is de mal klaar voor cryosectie. Weefsels in dit formaat kunnen op lange termijn worden opgeslagen.
- Paraffine inbedding
- Met behulp van ethanol, dehydrateren van de weefsels in deze opeenvolging: 50% ethanol voor 10 min, 70% ethanol voor 10 min, 80% ethanol voor 10 min, 95% ethanol voor 10 min, 100% ethanol voor 10 min (doe dit 3x).
- Week de weefsels in een reeks ethanol/xyleenoplossingen in deze opeenvolging: 2:1 ethanol/xyleenoplossing voor 10-15 min, 1:1 ethanol/xyleenoplossing voor 10-15 min, 1:2 ethanol/xyleenoplossing voor 10-15 min, 100% xyleen voor 10-15 min (doe dit 3x).
- Om het xyleen te vervangen door paraffine, laat de weefsels in een vacuümoven (tussen 54-58 °C) in deze opeenvolging weken: 2:1 xyleen/paraffineoplossing voor 30 min, 1:1 xyleen/paraffineoplossing voor 30 min, 1:2 xyleen/paraffineoplossing voor 30 min, 100% paraffine voor 1-2 uur, 100% paraffine voor 1-2 uur of 's nachts.
OPMERKING: Het verwarmen van de weefsels na 60 °C voor langere tijd zal ertoe leiden dat de paraffinepolymeren degraderen en het weefsel broos wordt. - Met behulp van verse paraffine, insluiten de weefsels in de gewenste positie.
4. Cryostat-sectie voor ingesloten weefsels van de LGO
- Plaats bij de cryostat alle monsters minimaal 1 uur binnen als de monsters eerder in de vriezer -80 °C zijn opgeslagen. Ze moeten daar blijven totdat alle secties zijn verzameld.
- Zorg ervoor dat de cryostat is ingesteld op de juiste temperatuurinstellingen. De omgevingstemperatuur in de cryostatkamer moet ongeveer -20 °C bedragen en de arm van de cryostat moet ongeveer -24 °C bedragen.
OPMERKING: Deze temperatuur kan variëren afhankelijk van hoe het blok reageert op snijden. Als inconsistente snijden een probleem is, kan de temperatuur van de omgeving worden verlaagd. - Verwijder het OCT-blok uit de mal door aan de randen van de open zijde van de mal te trekken om het los te maken en vervolgens het blok aan het gesloten uiteinde te knijpen, waar de mal vernauwt.
- Om het OCT-blok te monteren, plaatst u de kamertemperatuur OCT op de chuck, vanaf het midden en werkt u tot aan de rand. De hele chuck hoeft niet te worden gedekt.
- Plaats het OCT-blok (zie stap 3.1) op de mal. De rand van het blok dat was tegen de gesloten kant van de mal moet worden geconfronteerd op de chuck. Laat de OCT op de chuck bevriezen totdat het ondoorzichtig wit is, ongeveer 5-10 min.
- Plaats de klem op de arm voor nog eens 5-10 min voor het blok te komen tot de arm temperatuur. Als u een parallel segment wilt krijgen, past u de arm aan totdat de rand van het blok parallel aan het podium is en er een gelijkmatige afstand is tussen het podium en de onderste rand van het blok is hetzelfde als het podium en de bovenrand van het blok.
- Plaats het mes en pas de afstand van het blok van het blad aan om secties te nemen.
- Neem plakjes met een dikte van 10 μm. Blijf snijden totdat het punt van belang handmatig is bereikt of met behulp van de trimfunctie.
- Als u segmenten wilt verzamelen, gebruikt u een kleine platte penseel en een detailpenseel. Wanneer de mal begint te worden gesneden, gebruik dan de platte borstel om voorzichtig trek het plakje tegen de standaard. Bij het doorsnijden van het monster moet de beweging continu en zonder pauze zijn, hoewel de snelheid kan afhangen van de stevigheid van het monster.
- Gebruik tijdens het snijden de platte borstel om het segment voorzichtig te begeleiden terwijl het wordt gemaakt. Het segment hoeft niet gelijk te zijn met het stadium op dit punt, dus laat het billow om geen tranen of trekt veroorzaken en histologie beïnvloeden.
OPMERKING: Bij het snijden van hele embryo's, dit deel kan bijzonder moeilijk zijn, vooral bij het veranderen van weefseltypes. Zorg ervoor dat de segmenten zijn gemaakt zonder pauzes en de borstel niet te agressief aan de plakjes trekt. Wanneer weefseltypen veranderen, kan het segment breken, dus het koud houden van de temperatuur is de sleutel. Als breken een probleem is, verlaag dan de temperatuur of verhoog de dikte van het monster. - Pauzeer de beweging van het blok zodra het monster volledig is doorgesneden, maar het segment is nog niet vrij van het blok. Zonder de platte borstel uit het segment te verplaatsen, gebruikt u de detailborstel om het segment naar beneden te aaien om het plat te maken en tegen het podium te bevriezen.
- Houd het segment daar voor ~ 10 s voordat u de detailborstel verwijdert en het segment afwerkt. Gebruik de twee verfborstels om het segment zachtjes tegen het podium af te vlakken, te voorkomen dat u rolt en houd het tegen het podium voor ~20-30 s.
- Draai het segment om en plat tegen het podium. Verplaats een elektrostatisch geladen dia dicht genoeg om het segment aan te trekken en zich aan de dia te hechten zonder de dia naar het podium te hoeven raken. Label de dia's met een potlood.
- Bewaar de glijbanen in een luchtdichte doos om de weefsels te beschermen tegen ijsopbouw tijdens de opslag. Voor opslag op korte termijn moeten dia's bij -20 °C worden opgeslagen voordat ze worden bevlekken. Voor langdurige opslag houden ze op -80 °C.
5. Microtome-sectioning voor paraffine ingebedde weefsels
- Leg de blokken op ijs voorafgaand aan de sectie om de monsters te koelen. Wanneer koel, paraffine plakjes gemakkelijker en kan dunnere plakjes produceren.
- Bereid een waterbad van 40-45 °C voor met ultrazuiver water.
- Doe het mes in de houder in de microtoom. Zorg ervoor dat het veilig is en stel vervolgens de spelhoek in. Zorg ervoor dat de spelhoek correct is. Dit kan worden gecontroleerd volgens de instructies van de fabrikant.
- Plaats het paraffineblok in het microtoom. Zorg ervoor dat het correct is georiënteerd, zodat het blad recht over het blok zal snijden.
- Zorg ervoor dat het mes correct is georiënteerd met het blok door het maken van een paar plakjes. Doe dit zorgvuldig, zodat aanpassingen kunnen worden gemaakt.
- Knip het blok af totdat het punt van belang is bereikt.
- Maak plakjes op de gewenste dikte. Houd er rekening mee dat de eerste paar segmenten waarschijnlijk worden weggegooid.
- Pak de secties en verplaats ze in het waterbad met behulp van tangen. Dit moet ervoor zorgen dat de secties afvlakken. Gebruik de tangen om ze aan te passen als dat nodig is.
- Verplaats een elektrostatisch geladen dia dicht genoeg om het segment aan te trekken en zich aan de dia te hechten. Label de dia's met een potlood.
- Plaats alle verzamelde dia's in een schuifrek. Laat de glijbanen 's nachts drogen bij 37 °C.
6. Deparaffinisering van weefsels
- Was de dia's in de volgende volgorde: 3 min in xyleen (2x), 3 min in een 1:1 xyleen/100% ethanol oplossing, 3 min in 100% ethanol (2x), 3 min in 95% ethanol, 3 min in 70% ethanol, 3 min in 50% ethanol.
7. Hematoxyline en eosine kleuring
- Bereid de glijbanen voor op vlekken.
- Bij gebruik van OCT bereide weefsels, weken in gedestilleerd water voor ~ 4 min tot OCT is opgelost en laat drogen.
- Bij gebruik van paraffine ingebedde weefsels, moeten ze worden gedeparaffiniseerd. Zie stap 6.1.
- Plaats de glijbaan in gefilterd0,1% hematoxyline gedurende 10 min. Plaats de glijbaan in gedestilleerd water, het water 1x onmiddellijk te vervangen en vervolgens weer na 3 min.
- Plaats de dia in 0,5% eosine voor 10 s of dip 12x. Dompel de glijbaan in gedestilleerd water tot de eosin niet meer strepen, ongeveer 2-3 dips.
- Dehydrateer de glijbaan door te weken in 50% ethanol voor 10 s, 75% ethanol voor 10 s, 95% ethanol voor 30 s, en 100% ethanol voor 1 min. Dip in xyleen tot xyleen komt glad, ~ 5-7 dips.
- Laat xyleen verdampen en monteren met een snel drogend montagemedium dat een brekingsindex dicht bij glas heeft.
8. Kwalitatieve analyse van veelvoorkomende hartafwijkingen
- Maak foto's van alle monsters met behulp van een omgekeerde of stereo microscoop en de respectieve camera. Neem macroscopische en microscopische beelden, afhankelijk van de soorten gebreken die worden geanalyseerd. Macroscopische beelden kunnen worden genomen met elke vergroting onder de 10x. Microscopische beelden moeten worden genomen bij 40x vergroting of hoger. De foto's genomen in dit papier werden genomen met 5x vergroting met behulp van een stereo microscoop en een 40x luchtdoelstelling (lens N.A. van 0,55) met behulp van een omgekeerde microscoop.
OPMERKING: Macroscopische beelden zijn een goed uitgangspunt omdat ze een weergave geven naar het hele hart(figuur 3). Naarmate patronen worden geïdentificeerd, kunnen specifieke gebieden worden gericht op en verder worden onderzocht. - Line-up van alle beelden naast elkaar op een computerscherm. Hebben alle beelden van de controle monsters aan de ene kant van het scherm en alle beelden van experimentele monsters aan de andere kant van het scherm. Het is het beste om één behandelingsgroep tegelijk te analyseren.
- Zoek naar verschillen in fenotypes tussen behandelingsgroepen, te beginnen op belangrijke gebieden waar gemeenschappelijke hartafwijkingen plaatsvinden. Dit zal variëren afhankelijk van de vraag of de beelden macroscopisch zijn, die de brutoanatomie van het hart of microscopisch uitbeelden, die microscopische anatomie van het hartweefsel afbeelden.
- Begin te zoeken naar veelvoorkomende macroscopische hartafwijkingen, zoals ventriculaire septaldefecten(figuur 2A),atriumseptale defecten(figuur 2B)en octrooiductus arteriosus ( figuur2C). Al deze gebreken zijn het gemakkelijkst te zien in de dwarse weergave van het hart.
- Om septal defecten te identificeren, overwegen te kijken naar meerdere plakjes, omdat ze kunnen worden waargenomen in een vlak van het weefsel en niet een ander.
LET OP: Soms is een defect niet het ontbreken van een septum, maar een gat in het septum. Besteed daarom veel aandacht aan het niet verwarren van een scheur voor een septaal defect. Op zoek naar consistentie tussen de nabijgelegen segmenten in een specifieke regio kan bevestigen of dit daadwerkelijk een defect of een scheur van het snijden. - Om defecten in het uitstroomkanaal te identificeren, zoals de patentductus arteriosus, gebruik je meerdere plakjes om de belangrijkste bloedvaten te volgen terwijl ze het hart verlaten. Maak een beeld van de belangrijkste bloedvaten ten opzichte van elkaar. Een voorbeeld is te zien in figuur 2C.
OPMERKING: Sommige onregelmatigheden kunnen te wijten zijn aan het ontwikkelingsstadium van een embryo (bijvoorbeeld de patentductus arteriosus sluit postnataal, kort na de geboorte; het ventriculaire septum sluit pas ~e14.5 volledig. Enkele andere veelvoorkomende macroscopische hartafwijkingen die niet in de cijfers zijn opgenomen, zijn persistente truncusatereriosus, die het gemakkelijkst kan worden gedetecteerd op e16.5 en hoger; dubbele uitlaat rechter ventrikel (DORV), die kan worden gedetecteerd in plakjes waarin het hart in de uitstroom tract; en een dwingende aorta22. Een veel voorkomende microscopische hartafwijking omvat verminderde spierverdichting(figuur 4).
9. Kwantitatieve analyse van hartspierverdichting met hematoxyline en eosine gekleurde weefsels
- Aan de hand van de macroscopische weergave van de gekleurde weefselmonsters(figuur 4A) wordt een gebied van belang voor de afbeelding bij een vergroting van 40x(figuur 4B) geïdentificeerd. Voor dit papier werd de wand van de linker ventrikel gebruikt. Sla de afbeelding op in de gewenste indeling. Voor deze paper werden afbeeldingen opgeslagen als .tif-bestanden.
- Open de afbeelding in ImageJ-software.
- Stel de afbeelding in op 8-bits. Hierdoor kan de afbeelding gebruik maken van de drempeltool in de volgende stap23,24. Selecteer hiervoor "Afbeelding | Type | 8-bits".
- Stel de drempel waarde van de foto in. Het doel van deze stap is om alleen de pixels te selecteren die de achtergrond vertegenwoordigen, met uitzondering van de pixels die de weefsels23,24vertegenwoordigen.
OPMERKING: Dit oppervlak wordt later afgetrokken. Een juiste drempel selecteert de pixels die de onderzoeker wil uitsluiten van het oppervlak van spierweefsel. Daarom moet het eindresultaat het weefsel in grijswaarden bevatten en wordt de achtergrond geselecteerd.- Klik op "ImageJ | Afbeelding | Aanpassen | Drempel". Verplaats de bovenste balk om drempelaanpassingen te maken. Sluit het venster drempelaanpassingen af zonder andere wijzigingen aan te brengen zodra de gewenste secties zijn geselecteerd21.
- Gebruik het gereedschap Veelhoekselecties om de ruimte te selecteren die het weefsel inneemt. Zorg er zorgvuldig voor dat de contouren de weefselranden traceren, omdat losse tracering valse metingen zal opleveren.
- Pas de meetinstellingen op ImageJ aan, zodat de software alleen het gebied van pixels meet die zijn geselecteerd met behulp van het drempelwaardegereedschap in stap 9.423. "ImageJ | Analyseren | Metingen vaststellen | Gebied en Limiet aan drempel". Selecteer alleen Gebied en Limiet aan drempelwaarde.
- Meet het gebied van de gemarkeerde pixels. "ImageJ | Analyseren | Maatregel". Deze waarde vertegenwoordigt het gebied van de negatieve ruimte.
- Meet het gebied van de gehele regio van belang. Dit is het gebied dat is geselecteerd met het gereedschap Veelhoekselecties. "Afbeelding J | Analyseren | Metingen vaststellen | Gebied". Selecteer alleen Gebied en schakel Limiet aan drempelwaardeuit . Meet vervolgens , selecteer "Afbeelding J | Analyseren | Maatregel".
- Bereken het gebied dat het eigenlijke spierweefsel beslaat binnen de regio van belang. Trek het gebied van de negatieve ruimte af van het gebied van de gehele regio van belang. Deze waarde is het gebied van het spierweefsel.
- Bereken de Muscle Compaction Index (MCI). Verdeel het gebied van het spierweefsel door het gebied van de regio van belang.
Hoe groter de MCI-waarde, hoe compacter de spier is. Deze MCI-waarden kunnen vervolgens worden gebruikt voor statistische analyse om te testen op significante veranderingen in spierverdichting tussen behandelingsgroepen(figuur 4C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De spierverdichtingsindex werd vergeleken tussen harten die zich ontwikkelden onder twee verschillende omgevingen, een controle en een experimentele groep. Deze protocollen werden gebruikt om de verdichting van spierweefsel kwantitatief te analyseren, wat statistische analyse mogelijk maakte. Spierverdichting bleek aanzienlijk te zijn verminderd in de experimentele harten ten opzichte van de embryo's die zich ontwikkelden in niet-experimentele omstandigheden.
Embryo's werden weggegooid als de observatietiming onjuist leek. Hoewel een onvolgroeide groei van embryo's het gevolg zou kunnen zijn van de behandeling van het experiment en er een bereik is in ontwikkelingsvooruitgang, werd de kweek voldoende gespreid om de timing van de embryoontwikkeling te garanderen. Enscenering van de embryo's werd gedaan met behulp van Theiler Staging21. Monsters werden als slecht gesneden beschouwd als de plakjes geen consistentie weergaven of als ze duidelijke tranen of plooien hadden. Kleuring op voorwaarde dat genoeg contrast te maken uit het weefsel randen, maar was niet zo donker om cel kenmerken niet te onderscheiden. Dia's werden vervolgens afgebeeld met een omgekeerde microscoop met een 40x doelstelling. MCI-waarden zijn berekend met ImageJ-software en Microsoft Excel. Deze MCI-waarden werden geanalyseerd met behulp van een T-test.
Figuur 1: Plug test resultaten in C57BL6/J muizen. (A) Een muis met een gemakkelijk identificeerbare copulatie plug. (B) Een muis zonder copulatie plug. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Veelvoorkomende hartafwijkingen. Schema's van de echte verwachte morfologie van een aangeboren hartafwijking. (A) Transversale weergave van een ventriculair septum defect. (B) Transversale weergave van een atriumseptumdefect. (C) Patent ductus arteriosus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Hematoxyline en eosine vlek van e15.5 harten. (A) Een gekleurd hart dat zich ontwikkelde onder normale omstandigheden. Schaalbar = 750 μm. (B) Een gekleurd hart dat zich onder experimentele omstandigheden ontwikkelde. Schaalbalk = 750 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Kwantitatieve analyse van spierverdichting tussen harten die zich ontwikkelden onder normale moederdiëten en harten die zich ontwikkelden onder essentiële vetzuurtekort moederdiëten. (A) Hematoxyline en eosine bevlekte harten bij een macroscopische (5x) weergave. Schaalrepen = 1.000 μm. (B) Hematoxyline en eosine bevlekte harten bij microscopisch uitzicht (40x). Schaalbalken = 75 μm. (C) De resulterende gegevens van spierverdichtingsindexmetingen. De waarden werden geanalyseerd met behulp van een T-test (n = 4 per behandelingsgroep). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol onderzoekt de technieken die betrokken zijn bij de analyse van de hartontwikkeling in embryonale harten. Sommige beperkingen van deze methode zijn de vereiste fysieke behendigheid voor de voorbereidende technieken, die oefening kunnen vereisen, en vaardigheid met microscoopbeeldvorming. Als de plakjes verkregen op de cryostat zijn rommelig, de hematoxyline en eosine vlekken zal niet duidelijk zijn, of als de beelden genomen op de microscoop hebben slechte verlichting, dan is de methode die wordt gebruikt met ImageJ zal niet werken. Een beperking van de drempelfunctie van ImageJ-software is dat pixels aan het ene uiteinde van een drempelwaarde worden geselecteerd, afhankelijk van de pixelwaarde. Daarom worden alle pixels die aan de verkeerde kant van de drempel staan onjuist opgenomen of uitgesloten in de berekening. Uiteindelijk zal het oplossen van problemen nodig zijn voor de goedkeuring van de protocollen voor gebruik in een studie.
In het geval dat hartextractie te moeilijk is, overweeg dan over te slaan naar stap 2.8. Bovendien, overweeg het verwijderen van meer dan alleen het hart en de longen uit de borstholte. Het doel wordt dan groter en gemakkelijker te manipuleren, en direct contact tussen het hart en de fijne tangen wordt geminimaliseerd. Bij cryostat sectioning worden de experimentele monsters altijd direct vergeleken met controlemonsters. Dit maakt enige ruimte voor gebruikersfouten, zolang de fout consistent is in alle monsters. Om gebruikersfouten te minimaliseren en valse resultaten te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat vergelijkbare secties worden verkregen uit beide behandelingsgroepen. Als meer dan één persoon bijvoorbeeld secties produceert, moet u ervoor zorgen dat één persoon een even aantal secties produceert voor besturingselementen en alle behandelingsgroepen, en niet slechts één subgroep. Ten slotte wordt bij het drempelen van afbeeldingen op ImageJ het drempelpuntgereedschap gebruikt om maximale vrijheid toe te staan bij het selecteren van pixels die weefsel en pixels vertegenwoordigen die dat niet doen. Pas indien nodig het contrast van de afbeeldingen aan om de pixelwaarde van de achtergrond verder te verhogen ten opzichte van de pixelwaarde van het weefsel. Hoewel er probleemoplossingsopties zijn, vereisen de technieken nog steeds een hoge mate van vaardigheid. Het uitvoeren van dit protocol biedt echter toegang tot gegevens die doorgaans niet worden gemeten in andere onderzoeken naar cardiale ontwikkelingsontwikkeling. Het gebruik van kenmerken van dit protocol kan dus een belangrijke bijdrage leveren aan een wetenschappelijk onderzoek.
Het identificeren van de effecten van experimentele behandelingen in cardiologie onderzoek wordt vaak onderzocht door middel van morfologie beoordeling. Dit is vooral het geval in de ontwikkelingsbiologie, waarbij de placenta het moeilijk maakt om fysiologische kenmerken van het ontwikkelen van harten te meten. Daarom verschuift morfologische analyse die inzicht in de functie van het hart mogelijk maakt het traject van ontwikkelingsbiologieonderzoek drastisch. Hoewel de meeste papers de dikte van de hartspier analyseren om de sterkte van het hart te bepalen, kan directe meting van spierverdichting verder inzicht geven in de fysiologie van het zich ontwikkelende zoogdierhart25,26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen te melden.
Acknowledgments
Het Aguirre Lab wordt ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute van de National Institutes of Health onder award nummer K01HL135464 en door de American Heart Association onder award nummer 19IPLOI34660342.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J - stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat - Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) - p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
- Kathiresan, S., Srivastava, D.
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
- Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
- Kenny, L. A., et al.
- Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
- De Leval, M. R., Deanfield, J. E.
- Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
- Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge - A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
- Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
- Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
- Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).
- Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
- Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
- Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- Baldock, R., Bard, J., Davidson, D. Stage Definition. , https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998).
- Newbern, J., et al. Mouse and human phenotypes indicate a critical conserved role for ERK2 signaling in neural crest development. , http://www.pnas.org/cgi/content/full (2008).
- Carleton College. Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center. , https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017).
- Reinking, L. Examples of Image Analysis Using ImageJ. , https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007).
- MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
- Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J.
- Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).
