Summary
Questo metodo utilizza l'imaging della spettrometria di massa (MSI) per comprendere i processi metabolici nelle foglie di S. alba quando esposte agli xenobiotici. Il metodo consente la localizzazione spaziale dei composti di interesse e dei loro metaboliti previsti all'interno di tessuti specifici e intatti.
Abstract
Il metodo presentato utilizza l'imaging della spettrometria di massa (MSI) per stabilire il profilo metabolico delle foglie di S. alba quando esposte agli xenobiotici. Utilizzando un approccio non mirato, i metaboliti vegetali e gli xenobiotici di interesse sono identificati e localizzati nei tessuti vegetali per scoprire specifici modelli di distribuzione. Quindi, nella previsione silico dei potenziali metaboliti (cioè cataboliti e coniugati) dagli xenobiotici identificati viene eseguita. Quando un metabolita xenobiotico si trova nel tessuto, viene registrato il tipo di enzima coinvolto nella sua alterazione da parte della pianta. Questi risultati sono stati utilizzati per descrivere diversi tipi di reazioni biologiche che si verificano nelle foglie di S. alba in risposta all'accumulo xenobiotico nelle foglie. I metaboliti sono stati previsti in due generazioni, permettendo la documentazione delle successive reazioni biologiche per trasformare gli xenobiotici nei tessuti fogliari.
Introduction
Gli xenobiotici sono ampiamente distribuiti in tutto il mondo a causa delle attività umane. Alcuni di questi composti sono solubili in acqua e assorbitidal suolo 1e entrano nella catena alimentare quando si accumulano nei tessutivegetali 2,3,4. Le piante vengono mangiate da insetti ed erbivori, che sono preda di altri organismi. L'assunzione di alcuni xenobiotici e il loro impatto sulla salute di una pianta sono statidescritti 5,6,7,8, ma solo di recente a livello di tessuto9. Pertanto, non è ancora chiaro dove o come si verifichi il metabolismo degli xenobiotici, o se specifici metaboliti vegetali sono correlati all'accumulo xenobiotico in tessutispecifici 10. Inoltre, la maggior parte delle ricerche ha trascurato il metabolismo degli xenobiotici e dei loro metaboliti nelle piante, quindi si sa poco di queste reazioni nei tessuti vegetali.
Qui viene proposto un metodo per studiare le reazioni enzimatiche in campioni biologici che possono essere associati alla localizzazione tissutale di substrati e prodotti delle reazioni. Il metodo può disegnare il profilo metabolico completo di un campione biologico in un esperimento, poiché l'analisi non è mirata e può essere studiata utilizzando elenchi personalizzati di aliti di interesse. Fornito è un elenco di candidati monitorati nel set di dati originale. Se nel campione vengono annotato uno o più aaliti di interesse, la localizzazione specifica dei tessuti può fornire informazioni importanti sui relativi processi biologici. Gli aliti di interesse possono quindi essere modificati in silico utilizzando le leggi biologiche pertinenti per cercare possibili prodotti/metaboliti. L'elenco dei metaboliti ottenuti viene quindi utilizzato per analizzare i dati originali identificando gli enzimi coinvolti e localizzando le reazioni nei tessuti, aiutando così a comprendere i processi metabolici che si verificano. Nessun altro metodo fornisce informazioni sui tipi di reazioni che si verificano nei campioni biologici, sulla localizzazione dei composti di interesse e sui relativi metaboliti. Questo metodo può essere utilizzato su qualsiasi tipo di materiale biologico una volta disponibili tessuti freschi e intatti e i composti di interesse possono essere ionizzati. Il protocollo proposto è stato pubblicato a Villette etal.
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Protocol
1. Preparazione del campione
- Ottenere il campione biologico e mantenerlo fresco e intatto (ad esempio, non costringerlo in un tubo) o congelarlo. Il protocollo proposto si applica a qualsiasi tipo di campione biologico solido (cioè tessuti vegetali, animali o umani) per localizzare composti in tessuti specifici.
- Raffreddare un criomicrotomo a -20 °C. Mantenere il portacampioni e la lama alla stessa temperatura.
- Se necessario, incorporare l'oggetto nel mezzo di incorporamento M1 per preservarlo durante il taglio.
- Versare una matrice in uno stampo di plastica posto nella camera criomicrotoma. Aggiungere rapidamente il campione e versare un altro mezzo di incorporamento per coprirlo. Mantenete il campione al centro dello stampo mentre la matrice si solidifica durante il raffreddamento.
NOTA: L'incorporamento non è necessario per tutti gli oggetti biologici. Oggetti omogenei come il cervello del topo non hanno bisogno di un mezzo di incorporamento e possono essere tagliati congelati.
- Versare una matrice in uno stampo di plastica posto nella camera criomicrotoma. Aggiungere rapidamente il campione e versare un altro mezzo di incorporamento per coprirlo. Mantenete il campione al centro dello stampo mentre la matrice si solidifica durante il raffreddamento.
- Posizionare il campione incorporato o congelato sul supporto del criomicrotomo e tagliarlo con una lama affilata. Uno spessore di 5-30 μm è buono per i campioni vegetali, che sono difficili da tagliare a causa della loro eterogeneità. Adattare lo spessore e la temperatura di taglio al campione, effettuando diversi tagli per trovare le migliori condizioni. Nell'esempio fornito, il campione è stato tagliato a -20 °C. Prendere in considerazione la possibilità di mantenere il campione sotto 0 °C per evitare la degradazione del campione.
NOTA: L'uso di un microscopio binoculare posto accanto al criomicrotomo può aiutare a determinare la qualità delle fette. I tessuti devono rimanere intatti. - Spostare con cura la fetta su una diapositiva rivestita di ITO utilizzando le forcep o un piccolo pennello, quindi posizionare un dito sotto la diapositiva per riscaldare e asciugare il campione. Tenere la diapositiva nella camera criomicrotoma fino a quando tutti i campioni sono pronti. Togliere lentamente lo scivolo dalla camera per evitare urti termici.
NOTA: Per controllare quale lato dello scivolo è rivestito da ITO, posizionare una goccia d'acqua sullo scivolo a temperatura ambiente (RT). La goccia rimarrà rotonda sul lato rivestito di ITO o appiattirà sul lato non rivestito. - Disegnare segni sulla diapositiva utilizzando una penna marcatore sottile o un fluido di correzione e scansionarlo con uno scanner ad alta risoluzione prima della deposizione della matrice. I segni verranno utilizzati per determinare la posizione esatta del campione sullo scivolo quando si trova nello spettrometro di massa. Il modo migliore per ottenere punti di riferimento precisi è disegnare una croce.
2. Deposizione matriciale
- Preparare la matrice MALDI: pesare 70 mg di matrice di acido α-ciano-4-idrossicinnamico (HCCA) e diluirla in 10 mL di una soluzione di acqua e metanolo (50:50) con 0,2% di TFA. Sonicare la matrice per 10 minuti a RT. Ci può essere una matrice extra solida dopo la sonicazione.
NOTA: Diversi tipi di matrici MALDI possono essere utilizzati a seconda degli aaliti di interesse. - Pulire il robot di deposizione a matrice con metanolo al 100%.
- Utilizzando metanolo e una salvietta di precisione, pulire il vetrino, tenendo i campioni senza toccarli e senza rimuovere i segni. Aggiungere un coverslip pulito sulla diapositiva in un'area senza campione. Quella parte della diapositiva viene quindi posizionata sopra il rilevatore ottico per tracciare la deposizione della matrice.
NOTA: per tracciare otticamente lo spessore della matrice, il vetrino e il coverslip devono essere molto puliti. - Utilizzare il robot per la deposizione della matrice: posizionare solo 6 mL della soluzione matriciale nel serbatoio e aggiungere 2 mL di metanolo al 100% per un volume totale di 8 mL.
NOTA: La registrazione dello spessore della matrice lungo la deposizione è automatica e può essere recuperata utilizzando una chiavetta USB. Lo sviluppo di un metodo di spruzzatura non è dettagliato qui.
3. Acquisizione dei dati
- Posizionare 1 μL della matrice su una piastra MALDI per calibrare lo spettrometro di massa utilizzando i picchi della matrice come riferimenti. Lo sviluppo di un metodo di acquisizione sullo spettrometro di massa non è dettagliato qui.
- Inserire la piastra MALDI nella sorgente, fare clic su "Load Target" nel software ftmsControl e attendere il caricamento della piastra.
- Scegliete la posizione del punto della matrice cliccando sul punto dell'immagine che rappresenta la piastra MALDI.
- Indicare il nome di esempio e la cartellanella scheda" Informazioni di esempio " del software.
- Avviare l'acquisizione facendo clic su "Acquisizione".
- Spostare leggermente la piastra durante l'acquisizione usando il puntatore del mouse sulla scheda "MALDI video" in modo che il laser punti in punti diversi.
- Al termine dell'acquisizione, passare alla scheda "Calibrazione", scegliere L'elenco di calibrazione HCCA in modalità quadratica e fare clic su Automatico. Il risultato della calibrazione globale è indicato nella finestra "Calibration Plot" e deve essere inferiore a 0,2 ppm per un SolariX XR 7T.
- Se la calibrazione è buona, fare clic su "Accetta" e salvare il metodo.
- Una volta terminata la deposizione della matrice sui campioni, posizionare la diapositiva in un adattatore di scorrimento e recuperare la posizione dei segni utilizzando un coperchio di plastica.
- Nel software flexImaging, impostare una nuova esecuzione di imaging utilizzando la prima finestra che si apre con il software.
- Assegnare un nome all'esecuzione dell'imaging, selezionare la directory deirisultati e fare clic su Avanti.
- Indicare la dimensione raster (o almeno l'area di misura definita dall'utente), scegliere il metodo da utilizzare (calibrato nella sezione 3.1) e fare clic su Avanti.
- Caricare l'immagine ottica della diapositiva ottenuta al passaggio 1.6 dopo la scansione della diapositiva e fare clic su Avanti.
- L'immagine si apre in una finestra più ampia. Utilizzare i segni sulla diapositiva per insegnare la posizione delle diapositive: in ftmsControl, posizionare la destinazione della finestra video MALDI nella posizione esatta di un segno, quindi tornare a felxImaging e fare clic sullo stesso punto esatto sull'immagine ottica. Ripetete questo per tre punti indipendenti. La copertura in plastica recante i segni è posta su una piastra MALDI per recuperare la sua posizione e facilitare l'insegnamento.
NOTA: Se i segni sono stati fatti con un marcatore, l'aggiunta di liquido di correzione bianco sul retro della diapositiva può farli spiccarsi durante l'insegnamento.
- Disegna le regioni di interesse nei campioni nel software flexImaging usando gli strumenti "Add Measurement Regions".
- Salvate l'esecuzione dell'imaging e una "Sequenza AutoXecute" se devono essere analizzati diversi campioni.
- Lanciate una sequenza usando "AutoXecute Batch Runner" se vengono analizzati diversi campioni.
NOTA: sincronizzare regolarmente i dati in una posizione sicura.
4. Trattamento dei dati
- Importare i dati non elaborati nel software di visualizzazione (SCiLS Lab) e creare un set di dati. Questo viene fatto in due passaggi separati in questo software.
- Utilizzare lo strumento "Batch Importer" e selezionare i dati non elaborati, indicare la directory di destinazione e fare clic su "Importa".
- Dopo l'importazione, è possibile migliorare la combinazione di diversi set di dati per ulteriori analisi. Per combinare i set di dati, utilizzare il file| Nuovo| Dataset".
- Selezionare il tipo di strumento utilizzato per l'acquisizione, aggiungere i set di dati importati facendo clic su "+", e disporre le immagini facendo clic e trascinando gli oggetti.
- Controllare le impostazioni dell'intervallo di massa o modificarle se necessario indicando l'intervallo di interesse. Fare clic su Avanti per visualizzare il riepilogo delle importazioni e avviare l'importazione.
- Visualizzare il m/z di interesse nei diversi tessuti di un campione e/o in campioni diversi. Basta cliccare sugli spettri per selezionare il m/z di interesse o digitare il valore nella casella m/z .
- Eseguire test statistici se necessario per cercare valori colocalizzati o discriminanti tra tessuti diversi e/o campioni diversi per determinare l'm/z di interesse. Gli strumenti sono disponibili nel menu "Tool" e non saranno descritti in questo protocollo.
- Esportare l'm/z di interesse (ad esempio, composti colocalizzati e discriminanti) come file .csv dalla scheda Oggetto. L'intero set di dati può anche essere esportato se non è troppo grande (cioè, massimo 60.000 righe). Cliccasull'icona" Esporta " sul lato destro della regione di interesse indicata da una freccia rossa.
- Importare il file .csv per creare un nuovo set di dati nel software di annotazione (Metaboscape). Clicca su "Progetti | Importa progetto CSV". Tenere presente che verrà considerato solo l'esatto m/z e che il profilo isotopico viene perso.
NOTA: la versione software 5.0 consente l'importazione diretta di dati dal software di visualizzazione, che consente un'annotazione più accurata, perché il profilo isotopico può essere considerato. - Annotare con elenchi di aaliti personalizzati, che possono essere derivati da database disponibili pubblicamente. Un modello è fornito dal software per creare elenchi di alyte.
- Utilizzare il software di previsione (Metabolite Predict) per eseguire nella previsione silico dei metaboliti dei composti annotati. È necessaria la formula sviluppata del composto di interesse, disegnata dall'utente nel software o importata come file mol. Quindi il metodo è un semplice protocollo passo-passo.
- Recuperare l'elenco dei metaboliti, creare un elenco di aliti e utilizzarlo nel software di annotazione per annotare i dati grezzi con i metaboliti previsti. In alternativa, se l'elenco dei metaboliti è breve, cercarlo manualmente nel passaggio 4.8.
- Visualizzare la distribuzione tissutale dei metaboliti nei dati grezzi nel software di visualizzazione.
- Recuperare i nomi degli enzimi coinvolti nei processi metabolici nel software di previsione facendo clic con il pulsante destro del mouse sul metabolita previsto di interesse.
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Representative Results
Questo protocollo è stato applicato alle foglie fresche campionare da un albero di S. alba esposto agli xenobiotici nell'ambiente. Il processo è illustrato nella figura 1. Il primo passo è preparare sottili fette del campione di interesse. I campioni vegetali sono spesso più difficili da tagliare rispetto ai campioni animali, in quanto i tessuti sono eterogenei e possono contenere acqua e / o aria. Questa difficoltà viene gestita utilizzando un supporto di incorporamento, che forma un blocco omogeneo attorno al campione. La deposizione della matrice è facilitata dall'uso di un robot, evitando manipolazioni delle mani e garantendo risultati riproducibili. Lo spessore dello strato della matrice MALDI viene seguito durante l'intero processo e può essere registrato. L'acquisizione dei dati richiede l'apprendimento per gestire uno spettrometro di massa ad alta risoluzione e per adattare il metodo al tipo di campioni e composti studiati. I dati grezzi vengono importati in un software di visualizzazione per cercare i composti di interesse e visualizzare la loro localizzazione dei tessuti. Composti discriminanti o colocalizzati possono essere trovati utilizzando strumenti statistici disponibili nel software. In questo passaggio, sono noti solo l'esatto m/z dei composti. I composti di interesse vengono quindi esportati nel software di annotazione, che può confrontare l'esatto m/z con un elenco personalizzato di composti di interesse definiti dall'utente. Se l'esatto m/z corrisponde al m/z di un composto di interesse, viene annotato. Nel contesto di un'indagine sul profilo metabolico, i composti annotati sono selezionati per la previsione in silico dei metaboliti. I tipi di regole di reazione biologica utilizzati per generare metaboliti sono facilmente scelti dall'utente, così come il numero di generazioni su cui sono previsti i metaboliti. L'elenco dei metaboliti previsti può essere utilizzato nel software di annotazione per cercare corrispondenze tra i dati grezzi esatti m/z e i metaboliti previsti m/z (Figura 1). I metaboliti annotati possono essere cercati nel software di visualizzazione per ottenere la loro localizzazione dei tessuti (Figura 2). Gli enzimi coinvolti nel metabolismo dei composti originali di interesse possono essere recuperati per disegnare le reazioni metaboliche che si verificano nel campione biologico (figura 3).
In questo esempio, il farmaco telmisartan è stato identificato nelle foglie delle piante; è stato distribuito in tutti i tessuti. I metaboliti di Telmisartan sono stati previsti e cercati nei dati grezzi. Le annotazioni hanno mostrato che un metabolita di prima generazione (I) è stato rilevato nei tessuti interni delle foglie e ulteriormente degradato in metaboliti di seconda generazione (II), localizzati nei tessuti interni o più generalmente distribuiti in tutti i tessuti fogliari(figura 2). Questi risultati suggeriscono una reazione metabolica attiva nelle foglie per degradare il telmisartan. Il processo è stato applicato a diversi composti di interesse annotati nelle foglie, e gli enzimi coinvolti nelle reazioni sono stati recuperati per indagare il loro ruolo nella risposta della pianta all'accumulo di xenobiotici. Ciò fornisce una panoramica degli enzimi coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici nelle foglie di S. alba ( Figura3).
Figura 1. Struttura generale del metodo. Un campione fresco viene tagliato e posizionato su uno scivolo rivestito di ITO spruzzato con l'appropriata matrice MALDI. L'acquisizione MALDI fornisce dati grezzi da cui è possibile osservare la localizzazione all'interno del tessuto con il software SCiLS Lab. Metaboscape è usato per l'annotazione, e Metabolite Predict è usato per la previsione metabolita (cioè cataboliti e coniugati). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Esempio dei risultati ottenuti sulle foglie di S. alba esposte agli xenobiotici. Telmisartan è stato identificato nelle foglie della pianta e visualizzato in tutti i tessuti. I metaboliti telmisartani sono stati previsti e annotati sui dati grezzi per visualizzare la loro localizzazione dei tessuti. Il metabolita di prima generazione (I) C33H32N4O3 era localizzato principalmente nei tessuti interni, mentre i metaboliti di seconda generazione (II) erano talvolta distribuiti più generalmente. Questa cifra è stata adattata con il permesso di Villette etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Profilo enzimatico globale proposto per potenziali reazioni che si verificano nelle foglie di S. alba in risposta all'esposizione agli xenobiotici. La previsione e l'annotazione del metabolita sull'oggetto di interesse suggerivano le potenziali reazioni enzimatiche responsabili del metabolismo del composto di interesse. Questa cifra è stata adattata con il permesso di Villette etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La parte critica di questo protocollo è la preparazione del campione: il campione deve essere morbido e intatto. Il taglio è la parte più difficile, in quanto la temperatura e lo spessore del campione possono variare a seconda del tipo di campione studiato. I tessuti animali sono solitamente omogenei e più facili da tagliare. I campioni vegetali spesso incorporano strutture diverse e quindi sono più difficili da mantenere intatti poiché la lama incontra tessuti vascolari morbidi, duri o vuoti. Si consiglia vivamente di utilizzare tessuti freschi quando si lavora con campioni vegetali per evitare la formazione di ghiaccio nei tessuti idrofili e la loro distruzione. Le fette devono essere spostate delicatamente quando depositate sullo scivolo rivestito di ITO. La matrice MALDI è stata leggermente diluita per evitare l'intasamento della lastra di spruzzatura con cristalli a matrice, che può accadere se i 2 mL di metanolo al 100% non vengono aggiunti al passaggio 2.4.
Questo metodo offre un semplice protocollo di preparazione del campione di un giorno che fornisce risultati riproducibili grazie all'uso di un robot per la deposizione della matrice MALDI. Il protocollo proposto richiede la competenza nel taglio dei tessuti e nell'imaging della spettrometria di massa e si applica solo ai composti che possono essere ionizzati. Tuttavia, fornisce l'identificazione molecolare senza la necessità di etichettare come utilizzato nell'immunoistochimica11. L'elevata sensibilità si ottiene perché i composti sono direttamente ionizzati nei tessuti o nelle cellule, evitando effetti di diluizione prodotti da un protocollo diestrazione 12. I campioni vengono analizzati in modo non mirato, il che consente una profilazione su larga scala dei composti endogeni o xenobiotici nei campioni. Pertanto, possono essere seguite risposte biologiche ai composti esogeni. La previsione in silico dei metaboliti accoppiati ad analisi non mirate aggiunge un'altra dimensione all'imaging classico della spettrometria di massa, perché le reazioni metaboliche possono essere monitorate senza conoscere a priori i composti esogeni che si accumuleranno nei tessuti. Ad oggi, con questo metodo sono stati seguiti solo composti noti e alcuni metaboliti (ad esempio, farmaci di interesse somministrati ai ratti)13. Con il protocollo proposto, i composti originali e i loro metaboliti possono essere localizzati all'interno dei tessuti e possono essere seguite le risposte biologiche all'accumulo di composti esogeni e/o dei loro metaboliti.
Questo protocollo non si applica solo alla risposta delle piante agli xenobiotici, ma può anche essere utilizzato per comprendere il metabolismo animale in risposta ai farmaci, per seguire le interazioni pianta / funghi, risposta delle piante a stress biotici o abiotici, o per comprendere l'evoluzione delle malattie, rivelando i processi metabolici nei tessuti di interesse.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Charles Pineau, Mélanie Lagarrigue e Régis Lavigne per i loro suggerimenti e trucchi riguardanti la preparazione del campione per l'imaging MALDI di campioni vegetali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
| Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
| Excel | Microsoft corporation | ||
| flexImaging | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
| GTX primescan | GX Microscopes | ||
| HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
| ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
| ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
| M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
| Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
| Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
| MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
| Plastic molds | No specific reference needed | ||
| SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
| SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
| Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
| TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |
References
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