Summary
Qui descriviamo un metodo per la generazione di pulcini privi di germi dalle uova di una linea di polli da carne commerciale, il Ross PM3. Questo metodo può essere adattato per la generazione di animali privi di germi da altre specie di pollame.
Abstract
Gli studi sul contributo del microbiota intestinale alla fisiologia e all'immunocompetenza dell'ospite sono facilitati dalla disponibilità di modelli animali privi di germi, che sono considerati il gold standard. Gli uccelli nidificanti sono modelli ideali per la produzione di animali privi di germi poiché non è necessario allevare i loro parenti in condizioni sterili. I polli privi di germi sono generati principalmente da linee sperimentali prive di agenti patogeni specifici (SPF), che sono scarsamente rappresentative delle linee di pollo commerciali. Il metodo qui proposto ha permesso la produzione di polli privi di germi dalla linea di polli da carne a crescita rapida Ross PM3, comunemente utilizzata dall'industria avicola. Le uova sono state rapidamente raccolte dopo la deposizione in una fattoria di allevatori di polli da carne. Hanno subito un rigoroso processo di decontaminazione dalla raccolta all'introduzione in un isolatore sterile per la schiusa delle uova. I pulcini sono stati schiusi e tenuti in questi isolatori sterili durante il periodo necessario per controllarne la sterilità. Originariamente sviluppato per una linea sperimentale SPF a livorno bianca, il presente protocollo è stato adattato non solo alla linea di polli da carne Ross PM3 ma anche alle quaglie. Rappresenta pertanto una procedura robusta e facilmente adattabile ad altre specie avicole e ai volatili nidificanti di rilevanza economica, biologica o ecologica.
Introduction
C'è stato un drammatico aumento dell'interesse scientifico e popolare per quanto riguarda il contributo del microbiota intestinale alla salute degli animali. Il microbiota, costituito da batteri, virus, funghi e archei che abitano diverse nicchie nell'intestino dell'animale, è implicato direttamente o indirettamente nella regolazione di malattie infiammatorie, infettive e metaboliche che colpiscono non solo le specie di mammiferi ma anche il bestiame, come il pollame1. Sono stati sviluppati diversi modelli animali per studiare meglio il contributo del microbiota intestinale alla salute e alla malattia. Ad esempio, gli animali privi di germi e gnotobiotici consentono lo studio della completa assenza di microbi o di un microbiota noto, rispettivamente, sulla fisiopatologia delle infezioni 2,3. Tuttavia, la generazione e il mantenimento di questi animali richiede tecniche e strutture specializzate e i costi, la manodopera e le competenze necessarie per mantenerli limitano il loro accesso a molti ricercatori. In effetti, gli animali privi di germi devono essere monitorati regolarmente per possibili contaminazioni utilizzando una combinazione di metodi di coltivazione batterica, microscopia, sierologia, morfologia grossolana e tecniche di rilevamento basate sul sequenziamento. Procedure simili si applicano anche ad altre specie, come il bestiame, dove gli animali sono generalmente più grandi e richiedono strutture più grandi per il loro allevamento e mantenimento, il che può ostacolare, in una certa misura, la ricerca sul microbiota.
Il pollame, in particolare i polli, è la pietra angolare della produzione zootecnica in tutto il mondo, con una popolazione di gregge che può superare i 40 miliardi di uccelli all'anno. È la più importante fonte di proteine animali al mondo (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Inoltre, non ci sono tabù culturali o religiosi associati all'allevamento o al consumo di polli. Il microbiota intestinale del pollame è coinvolto in modo importante nella crescita degli animali, nel rapporto di conversione del mangime, nell'immunità, nella resistenza agli agenti patogeni, tra molti altri processi nutrizionali, fisiologici o patologici4. La generazione di polli privi di germi è quindi indispensabile per sottolineare il dialogo tra il microbiota e il suo ospite4. Anche se le comunità microbiche abitano l'ovidottodi pollo 5, il contenuto di un uovo appena deposto da una gallina sana è per lo più privo di microrganismi, il guscio d'uovo e le membrane possiedono barriere meccaniche per evitare l'invasione di microrganismi4. Inoltre, i pulcini sono facilmente allevati in assenza dei loro parenti, il che, a differenza dei mammiferi, consente la produzione di animali privi di germi senza l'allevamento dei genitori in condizioni sterili.
La struttura sperimentale "Infettivologia dell'allevamento, del modello e degli animali selvatici" (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Francia, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) fa parte della rete infrastrutturale nazionale francese EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). PFIE ha padroneggiato la produzione di polli privi di germi per eseguire vari studi sperimentali per più di 40 anni 7,8,9,10,11. Questi animali sono stati prodotti da uova specifiche prive di agenti patogeni (SPF) da una linea di deposizione livorno bianca allevate in allevamento chiuso dal 1970. Utilizzato principalmente per studi microbiologici 7,8,9, gli uccelli privi di germi stanno vivendo una rinascita di interesse con domande come il contributo del microbiota intestinale al comportamento13, l'utilizzo dei nutrienti14, lo sviluppo immunitario15 e l'attività endocrina. Anche se alcuni studi sono stati pubblicati utilizzando linee di polli da carne prive di germi16, questi studi rimangono sottorappresentati rispetto agli studi che utilizzano linee di strati sperimentali. L'evoluzione delle questioni scientifiche verso la diafonia tra il microbiota e il suo ospite nella salute e nel benessere del pollame ci ha portato ad adattare il nostro protocollo storico per produrre polli da carne privi di germi della linea Ross PM3, la linea di polli da carne più utilizzata al mondo.
Protocol
Le procedure di cura degli animali sono state eseguite conformemente alle linee guida stabilite dalla direttiva del Consiglio delle Comunità europee (86/609/CEE) e dai regolamenti francesi sulla sperimentazione animale.
1. Preparazione dell'isolatore
- Inserire i materiali necessari in un isolatore rigido a pressione positiva: tubi da 50 ml, pipette di plastica da 5, 10 e 25 ml, alimentazione irradiata, acqua autoclavata e contenitori di plastica sigillati sterili.
- Riempire la trappola germicida di trasferimento con una soluzione di ammonio quaternario al 2%.
- Sterilizzare l'isolatore tre volte con vapore di formaldeide utilizzando 60 ml di formalina (24% formaldeide) aggiunti a 30 g di permanganato di potassio per metro cubo (m3). Spostare i materiali all'interno dell'isolatore tra una sterilizzazione e l'altra per garantire la sterilizzazione di tutte le superfici di contatto.
- Impostare la temperatura dell'isolatore a 37 °C per almeno 2 giorni prima di introdurre le uova. Impostare l'igrometro al 65-70% di umidità relativa (RH) il giorno dell'introduzione.
2. Raccolta e incubazione delle uova
- Raccogliere le uova provenienti da allevamenti selezionati sulla base di un buon tasso di schiusa delle galline ovaiole (almeno l'80% al picco della produzione di uova) e del loro buono stato sanitario (cioè assenza di comuni agenti patogeni del pollame e assenza di malattie all'interno del gregge). Seleziona visivamente uova pulite e impeccabili sul tapis roulant.
- Decontaminare immediatamente la superficie dell'uovo immergendole per 5 minuti in una soluzione di acido peracetico all'1,5% a temperatura ambiente.
- Trasportare le uova alla struttura sperimentale utilizzando una scatola decontaminata con vapore di formaldeide.
- Conservare le uova per 24 ore a 4 °C. Ripetere il processo di decontaminazione descritto nel passaggio 2.2 e metterli in un incubatore da cova (Giorno 0) per 19 giorni.
3. Schiusa
- Il giorno 19, verificare la fertilità, la vitalità (motilità) e lo sviluppo dell'embrione candificandoli usando un leggero candler di uova in condizioni sterili. Introdurre solo uova embrionate vive negli isolatori sterili da cova.
- Decontaminare le uova selezionate spruzzando una soluzione di acido peracetico all'1,5% per 30 s o fino a coprire l'intera superficie di ciascun uovo. Le uova rimarranno a contatto con lo spray per 16 minuti e 30 secondi durante il trasferimento in isolatori.
- Trasferire le uova negli isolatori sterili da cova e sciacquarle con acqua demineralizzata sterile prima di metterle nello spazio di schiusa.
NOTA: Gli animali vengono schiusi e allevati in isolatori sterili. Sono alimentati ad libitum con una dieta commerciale sterilizzata mediante irradiazione gamma e annaffiati con acqua di rubinetto autoclavata fornita da distributori d'acqua.
4. Analisi dello stato batteriologico
- Un giorno dopo la schiusa, prelevare un campione fecale direttamente dal retto di diversi pulcini e raggrupparli in una provetta di vetro sterilizzata per rendere questo campione rappresentativo di tutti gli animali all'interno di un determinato isolatore.
- I campioni fecali essendo più o meno liquidi, aggiungere un equivalente di 1 mL di feci a 9 mL di brodo di tioglicolato con resazurina. Aggiungere il campione fecale rimanente a 9 ml di brodo per infusione cardiaca cerebrale (BHI) e incubare le provette a 37 °C senza agitare per 18-48 ore. Ciò consentirà la crescita di una vasta gamma di specie anaerobiche aerobiche, facoltative e non fastidious.
NOTA: Il brodo di tioglicolato con resazurina è destinato alla rilevazione di batteri anaerobici nonfastidi ma consente anche il rilevamento di batteri aerobici. Questo mezzo è conforme alle farmacopee europee, americane e giapponesi per i test di sterilità 18,19,20. - Osservare visivamente se si verificano modifiche nei mezzi di crescita dopo 18 ore di incubazione. Dopo 48 ore, prendere una goccia dal mezzo di brodo fecale BHI, posizionarla su un vetrino e osservare al microscopio (ingrandimento 40X) per l'assenza o la presenza di batteri.
- Se c'è un sospetto sulla presenza di batteri, prelevare un campione dalla coltura BHI e seminarlo su piastre di agar BHI. Incubare a 37 °C per 18-48 ore.
- Se sono presenti colonie, eseguire tecniche ad alto rendimento come la spettrometria di massa MALDI-TOF per una precisa identificazione microbica.
NOTA: Dopo 72 h, se le analisi batteriologiche sono negative, gli animali sono dichiarati privi di germi.
Representative Results
Sei cicli di generazione di pulcini privi di germi sono stati condotti con uova Ross PM3 provenienti da due diversi allevamenti francesi (Tabella 1). Sono state raccolte un totale di 853 uova e dopo due fasi di decontaminazione e 19 giorni di incubazione, l'86,40% era vitale. 490 di queste uova vitali hanno subito una terza fase di decontaminazione e sono state introdotte in vari isolatori da cova, per un tasso medio di schiusa del 79,80%. Ciò rappresenta un tasso di schiusa del 68,94% rispetto al numero iniziale di uova raccolte.
Tuttavia, i risultati della schiusa variano sostanzialmente a seconda delle serie effettuate: dal 41,67% all'88,16% dei pulcini vitali rispetto al numero di uova raccolte. Queste variazioni sono state osservate anche tra i diversi boccaporti durante lo stesso esperimento. Poiché non tutti gli isolatori sono stati utilizzati per tutte le corse, è difficile escludere un effetto dipendente dall'isolatore. Tuttavia, questo effetto batch era direttamente correlato all'età delle galline ovaiole (Figura 1), dove le uova provenienti da galline più anziane erano meno vitali.
Le sei corse sono state effettuate utilizzando quattro diversi isolatori di schiusa. Dopo il controllo batteriologico, gli animali di 14 dei 16 isolatori sono stati confermati privi di germi. Ciò corrisponde a un tasso di successo dell'87,5%. I due isolatori rimanenti sono stati contaminati da un singolo batterio ambientale e non patogeno.
Tutti gli animali utilizzati per gli esperimenti scientifici sono rimasti privi di germi fino alla fine degli studi, per almeno tre settimane dopo la schiusa.
Figura 1: Effetto dell'età della gallina sul tasso di schiusa La presente cifra evidenzia i tassi di schiusa osservati in base all'età del gregge di galline ovaiole, espressa in settimane di deposizione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Uova raccolte | D19 uova vitali | D19 uova vitali/uova raccolte | Uova trasferite in isolatore 1 | Uova trasferite in isolatore 2 | Uova trasferite in isolatore 3 | Uova trasferite in isolatore 4 | totale delle uova trasferite | pulcini vitali nati nell'isolatore 1 | pulcini vitali nati nell'isolatore 2 | pulcini vitali nati nell'isolatore 3 | pulcini vitali nati nell'isolatore 4 | totale dei pulcini nati vitali | isolatore vitale di uova schiuse/trasferite1 | isolatore vitale di uova tratteggiate/trasferite2 | isolatore vitale di uova schiuse/trasferite3 | isolatore vitale di uova schiuse/trasferite4 | uova schiuse/trasferite vitali a livello globale | |
| Corsa 1 | 101 | 93 | 92.08% | 23 | 24 | - | - | 47 | 22 | 23 | - | - | 45 | 95.65% | 95.83% | 95.74% | ||
| Corsa 2 | 130 | 117 | 90.00% | 25 | 25 | 25 | 75 | 20 | 24 | 18 | - | 62 | 80.00% | 96.00% | 72.00% | 82.67% | ||
| Corsa 3 | 132 | 97 | 73.48% | 26 | - | 26 | 45 | 97 | 14 | - | 13 | 28* | 27 | 53.85% | 50.00% | 62.22% | 56.70% | |
| Corsa 4 | 130 | 116 | 89.23% | 36 | 35 | - | - | 71 | 33 | 34 | - | - | 67 | 91.67% | 97.14% | 94.37% | ||
| Corsa 5 | 180 | 148 | 82.22% | 30 | 30 | 30 | 30 | 120 | 26* | 25 | 17 | 24 | 66 | 86.67% | 83.33% | 56.67% | 80.00% | 76.67% |
| Corsa 6 | 180 | 166 | 92.22% | - | 40 | 40 | - | 80 | - | 35 | 35 | - | 70 | 86.67% | 87.50% | 87.50% | 87.50% | |
| Totale | 853 | 737 | 86.40% | 140 | 154 | 121 | 75 | 490 | 89 | 141 | 83 | 24 | 337 | 82.14% | 91.56% | 68.60% | 69.33% | 79.80% |
Tabella 1: Risultati tecnici dei diversi esperimenti di schiusa. La presente tabella evidenzia i risultati delle 6 serie di schiusa germ-free effettuate: numero di uova raccolte, vitalità dell'embrione a 19 giorni e pulcini nati vitali nei vari isolatori.
Discussion
Diversi metodi per generare polli privi di germi sono stati precedentemente descritti 7,21,22. Metodi semplici, come quello qui presentato, utilizzano diversi disinfettanti per ridurre la carica batterica nella superficie dell'uovo e negli isolatori. I disinfettanti più comunemente usati sono cloruro mercurico, ammonio quaternario, iodoformio, ipoclorito di sodio e soluzioni di biossido di cloro. I risultati sono spesso soddisfacenti. Tuttavia, nonostante l'accessibilità di questi metodi, poche strutture possono applicare il metodo e allevare gli animali su larga scala, rendendo così l'utilizzo di polli privi di germi un approccio relativamente raro, utilizzato solo per affrontare questioni scientifiche molto specifiche. I metodi, i materiali e le attrezzature qui descritti consentono una percentuale di schiusa altamente efficiente di polli da carne privi di germi, che rimangono sani e sterili per almeno 3 settimane (la durata degli esperimenti scientifici a cui sono stati prodotti).
I risultati mostrano che l'adattamento del protocollo alla produzione di pulcini privi di germi da uova raccolte in allevamenti di pollame commerciali ha successo. L'esperienza con la produzione di uova SPF rivela che l'efficienza della schiusa dipende principalmente dall'età delle galline ovaiole e dalla qualità delle uova raccolte. Entrambi i parametri sono stati presi in considerazione quando sono stati scelti gli allevamenti e le uova raccolte. Utilizzando lo stesso metodo, il tasso medio di schiusa dei polli da carne privi di germi è molto migliore di quello ottenuto nell'ultima produzione di galline ovaiole SPF presso il nostro stabilimento (79% vs 35%), senza influire sulla sterilità degli animali (87% vs 83%). Queste differenze possono essere associate al background genetico degli uccelli (polli da carne contro strati) e alla qualità del guscio d'uovo, che è probabile che sia più fragile nelle uova degli animali SPF, tenuti in allevamento chiuso per più di 40 anni. Inoltre, mostriamo anche che il trasporto di più di 2 ore (dalle fattorie alla struttura sperimentale) non influisce sull'efficienza e sulla qualità della schiusa.
Sebbene il processo di sterilizzazione utilizzato per gli isolatori da cova e il protocollo per la decontaminazione delle uova siano stati ottimizzati, circa il 10% degli isolatori non era privo di germi. Per comprendere l'origine della contaminazione, è molto importante effettuare il controllo di routine della sterilità degli isolatori nati prima dell'introduzione delle uova.
Per quanto riguarda lo stato di sterilità degli uccelli, abbiamo cercato di applicare metodi che consentano la crescita di batteri anaerobici aerobici e nonfastidi da campioni fecali, assicurando così che stiamo rilevando batteri vivi e vitali. Questi metodi sono conformi alle farmacopee internazionali per i test di sterilità e rappresentano tecniche rapide, facili e a costi ridotti da utilizzare abitualmente. Tuttavia, tecniche di biologia molecolare come il sequenziamento del gene rRNA 16S, sebbene non forniscano informazioni sulla vitalità dei batteri, possono essere applicate per la conferma della presenza di batteri non coltivabili. In effetti, uno studio recente ha suggerito che alcuni batteri del microbiota dell'ovidotto materno sembrano essere trasferiti all'embrione attraverso l'albume, costituendo in seguito la maggior parte della popolazione batterica intestinale dell'embrione5. Inoltre, un altro studio ha suggerito che parte dei colonizzatori microbici ospitati nei primi embrioni sono stati ereditati dalle galline materne e l'abbondanza e la diversità microbica intestinale sono state successivamente influenzate da fattori ambientali e genetica dell'ospite durante lo sviluppo23. Tuttavia, i risultati di questi studi si basano sull'analisi della sequenza del DNA, in cui un gran numero di questi batteri potrebbe essere morto o non replicabile nell'albume d'uovo (notevolmente caricato con molecole antimicrobiche). Thomas e collaboratori16 hanno eseguito test di sterilità attraverso la valutazione di batteri aerobici e facoltativi coltivabili attraverso la caduta fecale su piastre BHI, evidenziando così l'efficienza dei metodi batteriologici standard per il controllo della sterilità priva di germi. Inoltre, nel protocollo proposto, abbiamo utilizzato il monitoraggio della crescita in brodo di tioglicolato con resazurina per essere in grado di rilevare la crescita di batteri anaerobici nonfastidi.
Già utilizzato per la produzione di quaglie e polli privi di germi, il protocollo è adattabile alla produzione di animali privi di germi dalla maggior parte degli uccelli nidificanti e offre prospettive per lo studio del contributo del microbiota alla fisiologia di questi animali. Oltre all'uso di questo modello per studiare le interazioni reciproche ospite-microbiota nell'intestino del pollame, potrebbe anche essere utile per la ricerca applicata. Ad esempio, potrebbe essere utilizzato per valutare la sicurezza e l'efficacia dei probiotici derivati da microrganismi commensali dell'intestino di pollo per migliorare la salute e la robustezza degli animali.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori sono grati agli allevatori e alla società Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, Francia) per la fornitura di uova fecondate. Questo studio è stato condotto sotto l'egida del consorzio di ricerca APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019), finanziato dal Région Centre Val de Loire, Francia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL sterile plastic pipettes | Starsted | 86.1252.001 | |
| 50 mL tubes | Falcon | ||
| BHI agar plates | Thermo fisher diagnostic | PO1198A | |
| Brain Heart Infusion broth | Thermo fisher diagnostic | CM1135 | |
| Glass tubes with 9 mL BHI broth | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin | home made and sterilized by autoclaving | ||
| Hatching incubator | Fieme | MG 576 | |
| Incubator | Memmert | for bacteriological culture, 37 °C | |
| Irradiated feed | Safe | U8983G10R | 40 kG irradiated |
| Isolators | home made. 1 m3 rigid isolator under positive pressure | ||
| Microbiological safety cabinet | thermon electron corporation | model: Hera Safe | |
| Microscope Visiscope series 300 | VWR | ||
| Pipette aid | Drummond | ||
| Plastic pipettes | |||
| Sterile sealed boxes | Tuperware | diameter | |
| Sterilized glass tube | "sovirel" | ||
| Thioglycolate Broth with Resazurin | Merck | 90404-500G | |
| Water bath | Fisher scientific | model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 °C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium |
References
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