Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عزل القلب البطيني البشري من شرائح عضلة القلب المقطّع بالهزاز

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61167
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2
1Institute of Cellular and Molecular Physiology, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Muscle Research Center Erlangen (MURCE), Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Summary

قدم هو بروتوكول لعزل القلب البطيني البشري والحيواني من شرائح عضلة القلب قطع هزاز. يمكن الحصول على غلة عالية من الخلايا المتحملة للكالسيوم (تصل إلى 200 خلية/ملغ) من كميات صغيرة من الأنسجة (<50 ملغ). البروتوكول ينطبق على عضلة القلب المعرضة لاقفوية البرد لمدة تصل إلى 36 ساعة.

Abstract

إن عزل الخلايا العضلية القلبية البطينية عن قلوب الحيوانات والبشر هو طريقة أساسية في أبحاث القلب. عادة ما يتم عزل الخلايا القلبية الحيوانية عن طريق التسريب التاجي مع الإنزيمات الهضمية. ومع ذلك، فإن عزل عضلة القلب البشرية يشكل تحدياً لأن عينات عضلة القلب البشرية عادة لا تسمح بالانكسار التاجي، وتؤدي بروتوكولات العزل البديلة إلى نقص الغلة للخلايا القابلة للحياة. بالإضافة إلى ذلك، فإن عينات عضلة القلب البشرية نادرة ولا تتوفر إلا بانتظام في المؤسسات التي جراحية في القلب في الموقع. وهذا يعوق ترجمة النتائج من الحيوانات إلى أمراض القلب البشرية. هو موضح هنا بروتوكول موثوق به التي تمكن من عزل فعالة من myocytes البطينية من عضلة القلب الحيوانية والبشرية. لزيادة نسبة السطح إلى الحجم مع تقليل تلف الخلايا، يتم توليد شرائح أنسجة عضلة القلب 300 ميكرومتر سميكة من عينات عضلة القلب مع هزاز. ثم يتم هضم شرائح الأنسجة مع البروتياز والكولاجيناز. تم استخدام عضلة القلب الجرذ لإنشاء البروتوكول وقياس غلة الخلايا myocytes القابلة للحياة والمتحملة للكالسيوم عن طريق عد الخلايا الخلوية المتدفقة. وأظهرت المقارنة مع طريقة قطعة الأنسجة المستخدمة بشكل شائع عوائد أعلى بكثير من خلايا القلب على شكل قضيب (41.5 ± 11.9 مقابل 7.89 ± 3.6٪، p < 0.05). وقد تُرجم البروتوكول إلى عضلة القلب البشرية الفاشلة وغير الفاشلة، حيث كانت الغلة مماثلة كما في عضلة القلب الجرذ، ومرة أخرى، أعلى بشكل ملحوظ مما كانت عليه مع طريقة قطعة الأنسجة (45.0 ± 15.0 مقابل 6.87 ± 5.23 خلية/ملغم، p < 0.05). وتجدر الإشارة إلى أنه مع تقديم البروتوكول من الممكن عزل أعداد معقولة من خلايا القلب القلبية البشرية القابلة للحياة (9-200 خلية/ملغ) من كميات دنيا من الأنسجة (<50 ملغ). وبالتالي، فإن الطريقة تنطبق على عضلة القلب صحية وفشل من قلوب الإنسان والحيوان على حد سواء. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لعزل myocytes مثير وانكماشية من عينات الأنسجة البشرية المخزنة لمدة تصل إلى 36 ح في حل القلب النابل البارد، مما يجعل الأسلوب مفيدا بشكل خاص للمختبرات في المؤسسات دون جراحة القلب في الموقع.

Introduction

تقنية المنوية التي مهدت الطريق إلى رؤى هامة في علم وظائف الأعضاء cardiomyocyte هو عزل القلب البطيني الحية من قلوب سليمة1. يمكن استخدام خلايا القلب المعزولة لدراسة الهيكل الخلوي الطبيعي والوظيفة ، أو عواقب التجارب الحية. على سبيل المثال، لتقييم التغيرات في الفيزيولوجيا الكهربائية الخلوية أو اقتران الإثارة والانكماش في النماذج الحيوانية لمرض القلب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام خلايا القلب المعزولة لثقافة الخلايا، والتدخلات الدوائية، ونقل الجينات، وهندسة الأنسجة، والعديد من التطبيقات الأخرى. ولذلك، أساليب فعالة لعزل القلب و القلب هي ذات قيمة أساسية للبحوث القلب الأساسية والترجمة.

عادة ما يتم عزل الخلايا القلبية من الثدييات الصغيرة ، مثل القوارض ، ومن الثدييات الكبيرة ، مثل الخنازير أو الكلاب ، عن طريق ضخ القلب التاجي مع حلول تحتوي على الكولاجين الخام و / أو البروتياز. وقد وصفت هذه الطريقة بأنها "معيار الذهب" لعزل القلب والخلايا العضلية، مما أدى إلى غلة تصل إلى 70٪ من الخلايا القابلة للحياة2. وقد استخدمت أيضا النهج مع قلوب الإنسان، مما أدى إلى نتائج القلب وكوسومييت مقبولة3،4،5. ومع ذلك، لأن الضخ التاجي هو ممكن فقط إذا كان القلب سليمة أو إسفين كبير عضلة القلب التي تحتوي على فرع الشريان التاجي هو متاح، معظم العينات القلبية البشرية ليست مناسبة لهذا النهج نظرا لصغر حجمها وعدم وجود الأوعية الدموية المناسبة. ولذلك ، فإن عزل القلب البشري هو التحدي.

عينات عضلة القلب الإنسان تتكون في الغالب من قطع الأنسجة ذات الحجم المتغير (حوالي 0.5 × 0.5 × 0.5 سم إلى 2 × 2 × 2 سم) ، تم الحصول عليها من خلال الخزعات الرحمية6، استئصالات الحاجز7، زرع VAD8، أو من قلوب explanted9. تبدأ الإجراءات الأكثر شيوعًا لعزل القلب والأنسجة باستخدام المقص أو المشرط. ثم يتم تعطيل الاتصالات من خلية إلى خلية عن طريق الانغماس في مخازن خالية من الكالسيوم أو منخفضة الكالسيوم. ويتبع ذلك خطوات الهضم المتعددة مع مستخلصات الإنزيم الخام أو الإنزيمات المنقية مثل البروتياز (مثل التربسين) والكولاجيناز والهيلورونيداز أو الإلستاز مما يؤدي إلى تفكك المصفوفة خارج الخلية وتحرير خلايا القلب. في الخطوة النهائية، الحرجة، تركيز الكالسيوم الفسيولوجية يجب أن يتم استعادتها بعناية، أو يمكن أن يحدث تلف الخلوية بسبب الكالسيوم مفارقة10،11،12. وهذا النهج العزلي ملائم ولكنه غير فعال عادة. على سبيل المثال، وجدت إحدى الدراسات أن ما يقرب من 1 غرام من أنسجة عضلة القلب كان مطلوبا للحصول على عدد كاف من خلايا القلب المناسبة للتجارب اللاحقة13. أحد الأسباب المحتملة لانخفاض الغلة هو طريقة قاسية نسبيا من مفروم الأنسجة. وهذا قد يضر بشكل خاص cardiomyocytes الموجودة على حواف قطعة على الرغم من أن هذه myocytes هي الأكثر احتمالا أن يطلق سراحه عن طريق الهضم الأنزيمي.

جانب آخر قد يؤثر على كفاءة العزل وجودة الخلايا التي تم الحصول عليها من عينات الإنسان هو مدة نقص التروية الأنسجة. تذكر معظم البروتوكولات أوقات النقل القصيرة إلى المختبر كشرط مسبق لتحقيق نتائج جيدة. هذا يحد من دراسة القلب البطينية البشرية إلى المختبرات مع مرافق جراحة القلب القريبة. معا، هذه القيود تعوق التحقق من النتائج الهامة من النماذج الحيوانية في أمراض القلب البشرية. بروتوكولات العزل المحسنة التي تسمح لعوائد القلب و القلب عالية من كميات صغيرة من الأنسجة، ويفضل دون أضرار جسيمة بعد تمديد أوقات النقل، ولذلك من المرغوب فيه.

وصف هنا هو بروتوكول العزل على أساس الهضم الأنزيمي من شرائح رقيقة الأنسجة عضلة القلب ولدت مع هزاز14،15. نثبت أن العزلة عن شرائح الأنسجة أكثر كفاءة بكثير من تلك التي من قطع الأنسجة المفروم مع مقص. الطريقة الموصوفة لا يسمح فقط لغلة عالية من القلب البشري قابلة للحياة من كميات صغيرة من أنسجة عضلة القلب ولكن ينطبق أيضا على العينات المخزنة أو المنقولة في محلول القلب النابل البارد لمدة تصل إلى 36 ساعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب مع الفئران من قبل لجنة العناية الحيوانية واستخدام ميتيلفرانكنكن، بافاريا، ألمانيا. وقد وافقت مجالس المراجعة المؤسسية لجامعة إرلانغن - نورمبرغ وجامعة روهر بوخوم على جمع عينات من أنسجة القلب البشرية واستخدامها. أجريت الدراسات وفقا للمبادئ التوجيهية إعلان هلسنكي. أعطى المرضى موافقتهم الخطية المستنيرة قبل جمع الأنسجة.

تم الحصول على فئران Wistar (150-200 غرام) تجارياً، وتم تخديرها عن طريق حقن 100 ملغم/كغم من الثيوبنتال-الصوديوم داخل التوازن، والقتل الرحيم بخلع عنق الرحم يليه استئصال الصدر واستئصال القلب. تم جمع عينات الأنسجة القلبية البشرية من القلب البطيني الأيسر أثناء زرع أجهزة المساعدة الميكانيكية ، من استئصال النخاع الحاجز ، من رباعية الجراحة التصحيحية Fallot ، أو من الجدار البطيني الأيسر الحر للقلوب explanted. يصف البروتوكول التالي العزلة عن الأنسجة البطينية البشرية. تم إجراء عزل الجرذان cardiomyocytes وفقا لذلك، ولكن مع إنزيمات مختلفة (انظر جدول المواد). ويوضَّح في الشكل 1سير عمل تخطيطي للبروتوكول.

1. إعداد المخازن المؤقتة والحلول والإنزيمات

  1. إعداد المخازن المؤقتة والحلول كما هو موضح في الجدول 1.
  2. الاحماء حلول 1، 2، 3 والحل Tyrode المعدلة إلى 37 درجة مئوية. تخزين الحل القطع في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: بالنسبة لشرائح عضلة القلب 1-2 يلزم ما مجموعه 15 مل و8 مل و5 مل من الحلول 1 و2 و3 لعزل طبق زراعة الأنسجة 35 مم. توسيع نطاق وفقا لعزل myocyte في وقت واحد في أطباق متعددة. يمكن تجميد حل القطع والاحتفاظ به عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
  3. تزن 1 ملغ من البروتينات 24 (انظر جدول المواد)في أنبوب الطرد المركزي 15 مل قبل التل وتخزينها على الجليد حتى الاستخدام. هذا لمعالجة عينة واحدة. رفع حجم المبلغ وفقا لذلك. لا تخلط البروتينات والكولاجيناز.
  4. تزن 8 ملغ من الكولاجين CLSI (انظر جدول المواد)في أنبوب الطرد المركزي 15 مل prechilled وتخزينها على الجليد حتى الاستخدام. هذا لمعالجة عينة واحدة. رفع حجم المبلغ وفقا لذلك. لا تخلط البروتينات والكولاجيناز.
    تنبيه: ارتدي قناع الوجه أو اعمل تحت غطاء الدخان لتجنب استنشاق مسحوق الإنزيم.
    ملاحظة: قد يختلف نشاط الإنزيم في حصص مختلفة. ولذلك، قد تختلف التركيز الأمثل وينبغي تحديد مع كل انزيم شراؤها حديثا16.

2. تخزين ونقل الأنسجة عضلة القلب

  1. تخزين ونقل عينات القلب الإنسان في تبريد، 4 ° C حل القطع(الجدول 1).
  2. استخدم نفس الحل لمزيد من معالجة الأنسجة وتشريح الاهتزاز.
    ملاحظة: يجب نقل الخزعات وعينات القلب الجراحية على الفور إلى محلول القطع عند 4 درجات مئوية ويمكن بعد ذلك تخزينها أو نقلها عند 4 درجات مئوية بحد أقصى 36 ساعة قبل تطبيق هذا البروتوكول.

3. تجهيز وتقطيع الأنسجة

ملاحظة: بروتوكول تشريح الأنسجة يتبع فيشر وآخرون15.

  1. تقليم كتلة الأنسجة
    تنبيه: أنسجة القلب البشرية قد تكون معدية. استخدم التآكل الواقي دائمًا واتبع لوائح السلامة في مؤسستك. التعامل بعناية مع شفرات المستخدمة والتخلص في حاويات السلامة.
    1. ضع العينة في طبق ثقافة الأنسجة 100 مم المليء بمحلول القطع البارد 20 مل والحفاظ على لوحة تبريد 4 درجات مئوية.
    2. إزالة الأنسجة الليفية الزائدة والدهون الايكليفية مع مشرط. في حالة وجود عينة عبر الطبيعة، إزالة الترابيكولا وطبقات الأنسجة بالقرب من بطانة القلب.
      ملاحظة: الأنسجة الليفية قاسية ويبدو أبيض. الدهون عادة لينة ويظهر الأبيض إلى الأصفر. يمكن تحديد طبقات الأنسجة الترابيكولاية والأنسجة الداخلية من تكوين الأنسجة الفضفاضة واتجاه الألياف غير المناصفة مقارنة بـ myocardium من الطبقات الايقعية
    3. لمعالجة الاهتزاز الأمثل، قطع كتل الأنسجة المستطيلة من حوالي 8 مم × 8 مم × 8 مم مع مشرط من عينة الأنسجة أكبر. بالنسبة للخزعات الصغيرة، تخطي هذه الخطوة والانتقال إلى agarose تضمين.
  2. تضمين أنسجة القلب في أغاروز منخفض الذوبان
    1. يغلي 400 ملغ من نقطة ذوبان منخفضة agarose في 10 مل من حل القطع في كوب زجاجي.
      تنبيه: ارتدي القفازات ونظارات السلامة لتجنب الحروق. التعامل مع الأواني الزجاجية الساخنة فقط مع ارتداء الحماية من الحرارة.
    2. ملء حقنة 10 مل مع الساخنة، هلام agarose المذاب. ختم الحقنة والسماح agarose لتكواسير في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل.
    3. استخدام ملقط لوضع العينة القلبية أو خزعة قلصت في نظيفة 35 ملم طبق زراعة الأنسجة مع epicardium التي تواجه أسفل وإزالة السوائل الزائدة مع مسحة معقمة.
    4. صب agarose توازنها (الخطوة 3.2.2) على الأنسجة عن طريق تفريغ الحقنة. تأمين الأنسجة ضد الحركة مع ملقط في حين صب agarose. تأكد من أن الأنسجة مغمورة تماما في agarose.
    5. وضع على الفور الطبق على الجليد والسماح لأغاروز ترسيخ لمدة 10 دقيقة.
  3. تشريح عضلة القلب
    1. قم بتركيب شفرة حلاقة جديدة إلى حامل الشفرة من الاهتزاز ومعايرة الاهتزاز عن طريق ضبط انحراف z-من النصل إذا كان ذلك ممكنا.
      ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول اهتزازًا مع جهاز معايرة بمساعدة الأشعة تحت الحمراء لمحاذاة النصل في موضع أفقي مع الحد الأدنى من انحراف z (الانحراف المقاس < 0.1 ميكرومتر).
    2. استخدام مشرط لمعالجة كتلة agarose الأنسجة التي تناسب حامل العينة من هزاز. لضمان الاستقرار، تأكد من أن الأنسجة لا تزال مغمورة بما فيه الكفاية في agarose (أجاروز هوامش ≥ 8 مم).
    3. إصلاح كتلة agarose إلى حامل العينة مع طبقة رقيقة من الغراء سيانوكريلات والضغط لطيف.
    4. ضع حامل العينة مع الأنسجة في حمام الاهتزاز. ملء الحمام مع حل القطع والحفاظ على 4-6 درجة مئوية في جميع أنحاء تجهيز مع الثلج سحقت، مليئة في خزان التبريد الخارجي من هزاز.
    5. توليد 300 ميكرون شرائح سميكة مع سرعة تقدم من ≤ 0.1 مم / ث، وتواتر متذبذب من 80 هرتز، و واسعة جانبية من 1.5 ملم، وزاوية شفرة من 15 درجة. عند التعامل مع شرائح, عقد agarose بدلا من الأنسجة نفسها لتجنب تلف الأنسجة. تخزين شرائح في الحل القطع في 4 درجة مئوية لمدة أقصاها 2 ساعة، إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: يتم توجيه Cardiomyocytes بالتوازي مع epicardium. ولذلك، من المهم أن تقطع بالتوازي مع epicardium لتجنب الضرر myocyte المفرط. فمن المستحسن أن نتخلص من أول 1-3 شرائح، كما ينبغي استخدام شرائح موحدة فقط من سمك ثابت لعزل. بالنسبة للخزعات النسيجية الصغيرة، مع ذلك، تخلص فقط من الشريحة الأولى.
    6. تحقق من محاذاة cardiomyocyte تحت مجهر ضوء قياسي مع تكبير 40-100x.

4. هضم الأنسجة

  1. وضع لوحة الحرارة على شاكر المختبر والدفء إلى 37 درجة مئوية. بدء شاكر المختبر في 65 دورة في الدقيقة.
  2. قم بحل البروتينات (المعدة في الخطوة 1.3) في 2 مل من الحل 1 (الخطوة 1.1 و 1.2) واحتضان في 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. لا تخلط البروتينات والكولاجيناز.
  3. قم بحل الكولاجيناز (المعد في الخطوة 1.4) في 2 مل من الحل 1 (الخطوة 1.1 و 1.2) واحتضان في 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. لا تخلط البروتينات والكولاجيناز.
    تنبيه: ارتداء النظارات الواقية والقفازات، لأن الإنزيمات المذابة يمكن أن تسبب إصابات في الجلد والعين.
  4. إضافة كلوريد الكالسيوم (CaCl2) إلى محلول الكولاجين الذي يحتوي على (المعد في الخطوة 4.3) إلى تركيز نهائي من 5 ميكرومتر.
  5. استخدام ملقط لنقل شريحة من الأنسجة من حمام هزاز نظيف 60 ملم طبق ثقافة الأنسجة مليئة 5 مل من محلول القطع prechilled (الخطوة 1.1 و 1.2) والحفاظ على الجليد.
  6. قم بإزالة الأاروز بعناية من أنسجة عضلة القلب مع شفرة أو ملقط.
    ملاحظة: تجنب التوتر الزائد والإجهاد القص على شرائح عضلة القلب، لأنها يمكن أن تلحق الضرر بتي في عضلة القلب.
  7. لتنفيذ الغسيل الأولي، ضع طبق زراعة الأنسجة 35 مم على لوحة الحرارة وملئه بـ 2 مل من محلول ما قبل ال تدفئة (37 درجة مئوية) 1. نقل 1-2 شرائح عضلة القلب إلى طبق المعدة مع ملقط. استلهم الحل مع ماصة 1 مل وتنفيذ خطوات الغسيل 2x لإزالة بقايا الحل القطع.
    ملاحظة: لا تتبخر شرائح القلب. يجب أن تبقى الحلول والشرائح عند درجة حرارة ثابتة 35 درجة مئوية على لوحة الحرارة المهتاجة. ضبط درجة حرارة لوحة الحرارة إذا لزم الأمر.
  8. إزالة الحل 1 من الطبق وإضافة 2 مل من محلول البروتينات (الخطوة 4.2). احتضان لمدة 12 دقيقة على لوحة الحرارة في 65 دورة في الدقيقة.
  9. غسل 2x مع 2 مل من محلول ما قبل الدفء 1 (37 درجة مئوية).
  10. إزالة الحل 1 من الطبق وإضافة 2 مل من محلول الكولاجيناز (الخطوتين 4.3 و 4.4). احتضان ما لا يقل عن 30 دقيقة على لوحة الحرارة في 65 دورة في الدقيقة.
  11. تحقق من وجود myocytes الفردية مجانا في 30، 35، 40 دقيقة، الخ، عن طريق وضع الطبق تحت المجهر الخفيف. العمل بسرعة لتجنب تبريد كبير من الحل.
    ملاحظة: قد يختلف وقت الهضم المطلوب وفقًا لدستور الأنسجة ودرجة التليف. بمجرد أن يحصل على الأنسجة لينة بشكل واضح ويفصل بسهولة عندما سحبت بلطف، وقد تم التوصل إلى وقت الهضم الأمثل. إذا كان هناك ما يكفي من الأنسجة المتاحة، يمكن هضم عدة شرائح بالتوازي مع أوقات الهضم متفاوتة.
  12. عندما يتم هضم الأنسجة و myocytes الفردية مرئية (الخطوة 4.11)، 2x غسل مع 2 مل من محلول ما قبل الدفء 2 (37 درجة مئوية) وملء مرة أخرى مع 2 مل.

5. تفكك الأنسجة

  1. افصل شرائح الأنسجة المهضمة بالملقط عن طريق سحب الألياف عن بعضها البعض بعناية.
  2. دقيق الماصة عدة مرات مع ماصة باستور واحدة الاستخدام (قطر الافتتاح> 2 مم).
    ملاحظة: يمكن استخدام ملقط و pipetting الحث على الإجهاد الميكانيكية وتسبب تلف القلب. ومع ذلك، فهي خطوة حاسمة لفصل الخلايا. استخدام ملقط غرامة للحد من تلف الخلايا وتفكك بعناية شرائح إلى قطع أصغر.
  3. تحقق من وجود القلب على شكل قضيب المحررة تحت المجهر الخفيف.

6. إعادة إدخال تركيز الكالسيوم الفسيولوجي

  1. زيادة تركيز الكالسيوم ببطء من 5 μM إلى 1.5 mM بينما يهيج عند 35 درجة مئوية على لوحة الحرارة. استخدم 10 mM و 100 mM CaCl2 حلول الأسهم. الخطوات الموصى بها: 20، 40، 80، 100، 150، 200، 400، 800، 1،200، 1500 ميكرومتر.
  2. إزالة قطع الأنسجة غير مهضومة بعناية مع ملقط أو تصفية تعليق الخلية من خلال شبكة نايلون مع حجم المسام 180 μm في نهاية زيادة الكالسيوم.

7. إزالة عامل فك الميكانيكية

  1. وقف الانفعالات وإزالة ببطء ثلث المحلول (~ 700 ميكرولتر) من الأعلى مع ماصة 1000 ميكرولتر. تجنب طموح عضلة القلب.
    ملاحظة: إذا تمت إزالة الأنسجة غير المهضومة، سوف تتراكم في وسط الطبق، مما يسهل الطموح من محلول خال من الخلايا. إذا لم يكن كذلك، نقل محلول الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل والسماح للخلايا إلى الرواسب لمدة 10 دقيقة في 35 درجة مئوية، ثم الpirate 700 μL من عظمى والتخلص، resuspend الخلايا، ونقلها مرة أخرى إلى طبق ثقافة الأنسجة 35 ملم والمضي قدما في الخطوة 7.2.
  2. إضافة 700 μL من الحل 3 إلى الخلايا، واستئناف الانفعالات على لوحة الحرارة واحتضان لمدة 10 دقيقة.
  3. كرر الخطوات 7.1 و 7.2.
  4. نقل الحل إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل والسماح للقلب العضلي إلى الرواسب لمدة لا تقل عن 10 دقيقة والحد الأقصى من 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو تدور في 50 × ز لمدة 1 دقيقة. إزالة supernatant تماما وإعادة تعليق في حل Tyrode تعديل أو المخزن المؤقت التجريب المطلوب.
    ملاحظة: يمكن تخزين اِكُناء القلب في محلول تيرود المعدل(الجدول 1)لعدة ساعات عند 37 درجة مئوية و5% CO2 قبل الاستخدام.
  5. تحقق من جودة الخلية باستخدام مجهر ضوء قياسي عند 40x و 200x تكبير.
    ملاحظة: يجب أن يكون حوالي 30-50٪ من خلايا القلب على شكل قضيب، على نحو سلس دون غشاء blebs، وعرض واضحة عبر التصدعات. فقط 5-10% من الخلايا القابلة للحياة يجب أن تظهر تقلصات عفوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للتحقق من كفاءة العزل ، تم استخدام البروتوكول مع عضلة القلب الفئران ، وتمت مقارنة العدد الناتج من الخلايا myocytes قابلة للحياة مع الأرقام التي تم الحصول عليها عن طريق العزل عن طريق التسريب التاجي والعزلة عن قطع الأنسجة الصغيرة (عزل قطعة ، الشكل 2). تم إجراء عزل القطعة والعزلة عن شرائح الأنسجة من نفس القلوب. لعزل عن طريق الضخ التاجي، ومع ذلك، تم استخدام القلب كله. أسفرت الضخ التاجية في الغالب على شكل قضيب وعبرtriated cardiomyocytes. مع العزل من شرائح عضلة القلب لوحظت نسبة أقل من الخلايا على شكل قضيب، ولكن العدد الإجمالي كان لا يزال مرتفعا. في المقابل، بعد العزل من قطع الأنسجة، تم استرداد عدد قليل من الخلايا على شكل قضيب فقط (الشكل 2 ألف). تم استخدام عملية استئصال التدفق لمقارنة النتائج كمياً. نظرا لحجمها الكبير نسبيا وتصدع عبر، تظهر عادة cardiomyocytes قيم كبيرة لكل من إلى الأمام والجانب مبعثر. وقد استخدمت هذه الخصائص لحساب myocytes على شكل قضيب مع تدفق الخلايا الخلوية محلل، وتطبيق مخطط الغات بسيطة التي تميز على شكل قضيب من hypercontracted وتقريب cardiomyocytes. (الشكل التكميلي 1). يتم تصوير مخططات نقطة تمثيلية في الشكل 2 ب. أظهر التحليل الإحصائي عددًا أعلى بشكل مميز في بوابة cardiomyocyte CM1 لعزله عن الشرائح من قطع الأنسجة (41.5 ± 11.9 مقابل 7.89 ± 3.6٪، على التوالي؛ n = 3 عزل؛ p < 0.05, paired two-tailed t-test). As expected from visual inspection, coronary perfusion yielded the highest counts, with 71.0 ± 9.4% (n = 3 isolations; p < 0.05, unpaired two-tailed t-test) (الشكل 2C). وهكذا، فإن عزل عضلة القلب من شرائح الأنسجة لا يصل إلى العائد الذي يتم الحصول عليه عن طريق الضخ التاجي، ولكن يؤدي إلى عدد أكبر بكثير من الخلايا العضلية على شكل قضيب من العزلة عن قطع الأنسجة، وتوفير ما يكفي من الخلايا للتجارب اللاحقة. بالإضافة إلى عدد الخلايا، تم تحديد المعلمات الهيكلية من الجرذان cardiomyocytes كميا. لم يختلف طول الخلية وعرض الخلية وطول الساركومير في الخلايا المعزولة بسبب التسريب أو من شرائح الأنسجة (الطول = 110.0 ± 5.4 ميكرومتر مقابل 99.4 ± 3.2 ميكرومتر، p > 0.05؛ العرض = 33.9 ± 1.9 ميكرومتر مقابل. 30.6 ± 1.2 ميكرومتر، p > 0.05، لـ n = 19 و n = 21 خلية، على التوالي؛ طول الساركومير = 1.62 ± 0.04 ميكرومتر مقابل 1.68 ± 0.04 ميكرومتر، p = 0.28، n = 24 و n = 23 خلية على التوالي ( 23)الرقم التكميلي 2A-C). باستخدام Fluo-4 تحميل myocytes تعرض لتحفيز المجال الكهربائي17 كما تم تقييم المعلمات الوظيفية (الشكل التكميلي 2D–و). متوسط وقت التنشيط (27.5 ± 1.5 مقابل 23.6 ± 2.5 مللي ثانية، n = 100 مقابل n = 31 خلية؛ perfusion مقابل شريحة، p> 0.05) (الشكل التكميلي 2D) وتقصير نسبي (12.2 ± 1.1 مقابل 11.3 ± 2.5٪، ن = 42 مقابل n= 7 خلايا، perfusion مقابل شريحة، p > 0.05) (الرقم التكميلي 2F) من cardiomyocytes التي استجابت للتحفيز لم تختلف اختلافا كبيرا بين المجموعتين. السعة عابرة الكالسيوم (أقصى تطبيع كاليفورنيا2+، F / F0) (الشكل التكميلي 2E) تم زيادة طفيفة في عضلة القلب المعزولة من شرائح بالمقارنة مع cardiomyocytes معزولة عن طريق perfusion (4.9 ± 0.2 مقابل 5.7 ± 0.3 ، ن = 104 مقابل ن = 25 خلية ، perfusion مقابل شريحة ، ع < 0.05). Although the fraction of rod-shaped cardiomyocytes responding to electrical stimulation was approximately 15% higher in preparations obtained by perfusion, the majority of cells was also excitable in preparations from tissue slices (74.3 ± 4.2% vs. 62.1 ± 2.9%, perfusion vs. slice, p < 0.05, ten fields of view, 452 vs. 276 counted cells, respectively) (الرقم التكميلي 2G). لتقييم جودة الخلية بعد الزراعة، تم تحديد النسبة المئوية للوسيعات myocytes التعاقد استجابة لتحفيز المجال الكهربائي بعد 48 ساعة في زراعة الخلايا17. تم تخفيض جزء الخلايا المستجيبة بمقدار النصف تقريبًا في كلتا المجموعتين (41.9 ± 3.6٪ مقابل 31.5 ± 2.3٪، perfusion مقابل شريحة، p. < 0.05, 10 fields of view, n = 371 vs. n = 329 counted cells, respectively) (الرقم التكميلي 2H).

بعد ذلك، تم تطبيق البروتوكول على عضلة القلب البشرية. وتمت مقارنة عدد من قضيب على شكل وقابلية للحياة معزولة القلب البطيني البشري التي تم الحصول عليها من شرائح الأنسجة pairwise مع عدد من قطع الأنسجة من نفس العينات عضلة القلب(الشكل 3). وجدنا أن العزلة عن شرائح عضلة القلب أسفرت عن نسبة كبيرة من قضيب على شكل ونسبة صغيرة فقط من القلب مدورة(الشكل 3A). قمنا بحساب myocytes على شكل قضيب من الصور واسعة المجال وتطبيع عددها من الوزن الرطب الأنسجة المستخدمة لعزل. وأظهر القياس الكمي أن العزلة عن شرائح عضلة القلب أدت إلى عدد أكبر بشكل لافت للنظر من الخلايا myocytes على شكل قضيب من العزلة عن قطع الأنسجة (45.0 ± 15.0 مقابل 6.87 ± 5.23 خلايا / ملغم ، ن = 7 عزل ، p < 0.05 ، يقترن اثنين من الذيل t-test) (الشكل 3B). وعلاوة على ذلك، تم تقييم قابلية البقاء مع MTT قابلية البقاء14، تطبيع امتصاص الهضان الضوئية إلى الكمية الإجمالية من البروتين في الخلية lysate. وأكد القياس الكمي الضوئي قابلية الحياة العضلية أعلى بكثير بعد العزل من شرائح عضلة القلب (4.76 ± 0.47 مقابل 1.09 ± 0.18 الاتحاد الافريقي، ن = 3 العزل، p < 0.05، يقترن اثنين الذيل t-test) (الشكل 3C).

في المجموع، تم تطبيق الطريقة على عينات عضلة القلب من 30 قلوب بشرية مع أوقات نقل تصل إلى 36 ساعة. من 23 من 30 عينات'تم الحصول على خلايا قابلة للحياة للتجارب اللاحقة (انظر أيضا الجدول التكميلي 1). مثال على تجربة غير ناجحة (أي <100 خلية لكل طبق) يظهر في الشكل الإضافي 3. هنا، لم تتسامح معظم الخلايا مع الكالسيوم خارج الخلية وارتفاع التراكم. قمنا بتقييم قابلية التقلص في الخلايا الميوسية من 14 عزلة ، وفي حالتين لم تستجب الخلايا للتحفيز الكهربائي. لاحظ أن هذه التقنية لم تعمل فقط مع عينات كبيرة تم الحصول عليها من قلوب البالغين ، ولكن أيضا مع الخزعات الصغيرة (أقل من 40 ملغ) من قلوب الأطفال (الشكل التكميلي 4).

لإثبات أن الخلايا البشرية المعزولة مع البروتوكول الموصوف يمكن أن تخضع للتحليل الهيكلي، كانت ملطخة مع ألفا أكتينين، و EC اقتران البروتينات L-نوع قناة الكالسيوم (LTCC) ومستقبلات ريان اليود (RyR)، فضلا عن غشاء الخلية والنوى، وفقا لطريقة تلطيخ وصفت مؤخرا في الجرذان myocytes17 (الشكل 4). كشفت تلطيخ ألفا أكتينين نمط خط ض عالي كثيف ومنتظم ومتوسط طول الساركومير 1.92 ± 0.06 ميكرومتر في عضلة القلب يستريح (ن = 4، الشكل 4A). وأظهرت LTCC وRyR مجموعات واضحة وكانت، كما هو متوقع، كولويدير بالقرب من غشاء الخلية و تي-أنابيب (الشكل 4B).

واستخدمت الصبغة القوية FluoVolt18 والكالسيوم الحساسةFluo-4 17 لإثبات أن cardiomyocytes البشرية معزولة مع البروتوكول الموصوف كانت منفعلة ويمكن استخدامها لإجراء دراسات على الفيزيولوجيا الكهربائية الخلوية أو اقتران الإثارة الانكماش(الشكل 5). تم تحليل إمكانات العمل (AP) الشكل والمدة (الشكل 5A،B). القيم من 50٪ و 90٪ مدة AP (APD50: 400.6 ± 41.1 مللي ثانية، APD90:748.9 ± 56.6 مللي ثانية، ن = 10 خلايا) كانت في نطاق ذكرت من قبل الآخرين للبطين القلبية القلبية من قلوب بشرية الفشل4،6،7،9. وأظهرت العابرين الكالسيوم المسجلة عن طريق مسح خط confocal من الخلايا المحملة Fluo4(الشكل 5C،D)ضربة رقية واضحة بعد التحفيز ونسبة إشارة مقبولة إلى الضوضاء. كان السعة عابرة الكالسيوم (الحد الأقصى F / F0)2.9 ± 0.5 (ن = 31 خلية). ويمكن رؤية اختصار القلب عن طريق الانكماش في المثال من انحراف الحد الخلية السفلية، التي كان متوسط 4.6 ± 0.8٪ (ن = 31 الخلايا).

Figure 1
الشكل 1: سير عمل بروتوكول العزل من شرائح الأنسجة القلبية البشرية. كتل الأنسجة أو الخزعات من عضلة القلب البشرية (أعلى اليسار) جزءا لا يتجزأ في انخفاض ذوبان نقطة agarose ويتم توليد شرائح سميكة 300 ميكرومتر مع شفرة متذبذبة من هزاز (أعلى الأوسط). يتم نقل الشرائح إلى طبق ثقافة وإزالتها من agarose المحيطة بها (أعلى اليمين). يتم هضم الأنسجة في ~ 35 درجة مئوية و 65 دورة في الدقيقة على لوحة ساخنة ومهتاجة (وسط، يسار) وتشمل: (الخطوة 4.8) حضانة في محلول خالي من الكالسيوم اسميا تكمله البروتينات، (الخطوة 4.10) هضم المصفوفة خارج الخلية مع الكولاجيناز، (الخطوة 5) انفصام وتحرير القلبية الفردية مع القوة ولأنابيب. (الخطوة 6) ارتفاع بطيء من تركيز الكالسيوم خارج الخلية من 5 μM إلى 1.5 mM في فترات من 5 دقائق (الخطوة 7) إزالة متدرجة من uncoupler الميكانيكية 2،3-butanedione مونوكسيم (BDM). يتم استرداد القلبيات البشرية على شكل قضيب ومشابكة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: العائد Cardiomyocyte من شريحة عضلة القلب، والضخ، والعزلة قطعة. (A) ميكروجراف ضوئية تمثيلية من خلايا القلب الجرذان المعزولة إما عن طريق الضخ التاجي (Perfusion) ، من الأنسجة التي تقطع الاهتزاز (شرائح عضلة القلب) ، أو من الأنسجة المفرومة (قطع الأنسجة). (ب) ممثل المعني تدفق نقطات نقطة من العزل cardiomyocyte الموصوفة في A. واستخدمت منطقة التشتت الجانبي (منطقة SSC) ومنطقة التشتت الأمامي (منطقة FSC) كمؤشرين للزباء الخلوي والحجم، على التوالي. يشار إلى مخطط البوابات CM1 البوابة لـ cardiomyocytes بواسطة الخط الأسود ويتم عرض الكسور ذات الصلة من إجمالي الأعداد في النسبة المئوية. (C)يعني ± الخطأ القياسي لكسور عضلة القلب (CM1) التي تم تقييمها من قبل تحليل تدفق- cytometric كما هو موضح في B من ن = 3 عزل الخلايا لكل مجموعة. تم إجراء العزلة عن شرائح عضلة القلب وقطع الأنسجة من نفس القلوب (مقترنة باختبار t-الذيل). تم إجراء العزلة عن طريق التسريب من قلوب كاملة من الحيوانات المختلفة ومقارنتها باختبار t ذو الذيلين غير المُزدوج. * p < 0.05، بعد تصحيح مقارنة متعددة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مقارنة العائد وقابلية صلاحية عضلة القلب البشرية بعد العزل عن شرائح عضلة القلب وقطع الأنسجة المفرومة. (أ)صورة تمثيلية للكالسيوم االمتسامحة القلب البطينية بعد العزلة عن شرائح الأنسجة. قضيب على شكل وtried cardiomyocytes هي الغالبة (السهم الأسود)، مع عدد قليل فقط من الخلايا مدورة وفرط التعاقد (السهم الأبيض). (B) القياس الكمي للكالسيوم المتسامحة ، على شكل قضيب myocytes معزولة في موازاة ذلك ، إما من شرائح عضلة القلب أو قطع الأنسجة التي يتم عدها من ميكروجرافات حقل واسع وتطبيعها إلى الوزن الرطب للمادة المدخلة (في ملليغرام) من ن = 7 عزلات مقترنة. (C) القياس الكمي لقابلية صلاحية القلب و القلب من خلال القياس الضوئي لامتصاص صبغة الغدد الصماء بعد اختبار MTT. تم تطبيع امتصاص إلى كمية البروتين الإجمالية، التي تم تقييمها من قبل BCA مقايسة من ن = 3 العزلة المقترنة. * p < 0.05، **p < 0.01 (اختبار t ثنائي الطرفين). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: توصيف ميكروستروي للقلب البشري بعد العزل. (أ)تمثيلي الصورة المجهرية confocal بعد المناعة من ألفا actinin (الأخضر) والصبغة النووية مع 4′، 6-diamidin-2-فينيليندول (DAPI، الأزرق). وكان طول الساركومير 1.92 ± 0.06 ميكرومتر (ن = 4 myocytes)، يحدد من خلال تحليل الطيف فورييه. (ب) ممثل الصور المجهرية confocal من القلب البطيني البشري الثابتة coimmunos التي تحتوي على قناة الكالسيوم من نوع L (LTCC) ومستقبلات دريود القلب (RyR). كما يظهر تراكب RyR وLTCC (تراكب) وتلطيخ المصفوفة خارج الخلية مع agglutinin جرثومة القمح (WGA، أرجواني). كانت النوى ملطخة DAPI (الأزرق). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: إمكانات العمل والكالسيوم داخل الخلايا عابر في الخلايا العضلية البطينية البشرية. (A) صورة ثنائية الأبعاد من القلب البشري معزولة محملة بصبغة فلوفوليت قوية (الأخضر، 488 نانومتر الموجة). يشير المربع الأحمر إلى عنصر من النظام الأنبوبي t الذي تم قياسه بمسح سريع خلال تحفيز الحقل الكهربائي عند 0.5 هرتز (B)متوسط وفلوروس فلوو فولت (F/F0)من خمسة إمكانات عمل متتالية تم الحصول عليها من خلال التصوير confocal كما هو موضح في A. (C) خط مسح صورة من القلب البشري المعزولة محملة صبغة الكالسيوم الحساسة Fluo-4 AM (488 نانومتر الإثارة الطول الموجي) على طول محور الخلية الطولية. تظهر شدة الفلور في القيم الرمادية [AU] وتشير النقاط الزرقاء إلى الارتفاع الأقصى لشدة الفلور (dF/dtmax)لكل بكسل على طول الخط الممسوح ضوئيًا. وكان معدل أخذ العينات 529 هرتز(D) الكالسيوم عابر تم الحصول عليها عن طريق متوسط الفلورسيه لكل بكسل على طول خط المسح الضوئي من الصورة في C والتطبيع إلى القيم الأساسية قبل التحفيز (F /F0). تم إجراء جميع التجارب في درجة حرارة الغرفة.. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اسم التركيبة في mmol/ L ملاحق الرقم الهيدروجيني حجم مطلوب في مل
الحل 1 20 KCl، 10 KH2PO4، 10 MgCl2، 10 جلوكوز، 70 حمض الجلوتاميك، 20 تورين، 10 بيتا هيدروكسي بوتيرات، 30 BDM 2 ملغ / مل بولين مصل الزى الزه 7.3 مع كوه 300
الحل 2 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 جلوكوز, 70 حمض الجلوتاميك, 20 تورين, 10 بيتا هيدروكسي بوتيرات, 0.005 CaCl2, 30 BDM 10 ملغ / مل بولين مصل الزى 7.3 مع كوه 300
الحل 3 20 KCl, 10 KH2PO4, 10 MgCl2, 10 جلوكوز, 70 حمض الجلوتاميك, 20 تورين, 10 بيتا هيدروكسي بوتيرات, 1.5 CaCl2 10 ملغ / مل بولين مصل الزى 7.3 مع كوه 300
حل تيرود المعدل 130 NaCl, 0.4 NaH2PO4, 5.8 Nahco3, 5.4 KCl, 0.5 MgCl2, 1.5 CaCl2, 25 HEPES, 22 جلوكو 2 ملغ / مل بولين مصل الزى الزه 7.3 مع NaOH في 5 ٪ CO2 100
حل القطع 138 NaCl, 0.33 NaH2PO4, 5.4 KCl, 2 MgCl2, 0.5 CaCl2, 10 HEPES , 10 جلوكوز , 30 BDM 7.3 مع NaOH 500

الجدول 1: المخازن المؤقتة والحلول. تكوين المخازن المؤقتة المطلوبة والحلول.

الشكل التكميلي 1: التحقق من صحة نظام البوابات في القلب (CM1). نقطات من تدفق القياسات النقّية، قياس منطقة التشتت الأمامي والجانبي (FSC-A, SSC-A) الذي يشير إلى حجم وثني الخلايا المكتشفة في عينة التحكم (CTRL) من خلايا القلب الجرذان المعزولة بالفور وبعد حضانة خلايا القلب من نفس الإعداد لـ 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في محلول Tyrode المعدل الذي يحتوي على 100 m calcium (جرعة زائدة). يسبب ارتفاع الكالسيوم خارج الخلية فرط الاتزان وتقريب خلايا القلب على شكل قضيب، مما يؤدي إلى انخفاض الخلايا (87.6٪ مقابل 6.00٪) في البوابة المحددة (CM1). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: خصائص Cardiomyocyte معزولة عن طريق التسريب أو من شرائح. طول الخلية (A) وعرض الخلية (B) تم تحديدهما من فئران القلب الثابتة مباشرة بعد العزلة عن طريق التسريب أو من شرائح عضلة القلب عن طريق المجهر (ن = 19 و n = 21 خلية على التوالي). تم تحديد طول السارومير (C) من الصور المجهرية بعد الكبت المناعي مع تحليل ألفا أكتينين وفورييه (n = 24 و n = 23 خلية على التوالي). متوسط وقت التنشيط(D)،الحد الأقصى F /F0 (E)وتقصير النسبي(F)تم تقييمها من Fluo-4 تحميل عضلة القلب المعزولة عن طريق التسريب أو من شرائح عضلة القلب واستجابة للتحفيز الكهربائي (ن = 100/31 myocytes في D، n = 104/25 myocytes في E و n = 42/7 myocytes في F). تم تقييم جزء من القلب على شكل قضيب(G)التي تعاقدت على التحفيز الكهربائي، من خلال عد العدد الإجمالي للخلايا على شكل قضيب والخلايا العقدية في عشرة حقول الرؤية في التكبير 200x في مجهر ضوء قياسي للضخ وعزل شريحة (ن = 452/276 الخلايا، على التوالي). (H) تحليل كما أجريت في G ولكن بعد 48 ساعة من الزراعة (ن = 371/329 الخلايا، على التوالي). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 3: عزل القلب البشري مع انخفاض العائد. صورة مجهرية خفيفة تمثيلية من myocytes من العزلة مع hypercontracted الغالب (الأزرق) أو الخلايا المستديرة (أسود) وعدد قليل فقط من الخلايا على شكل قضيب وtriated (أبيض). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 4: عزل القلب من خزعات القلب الرضع. (أ) صورة لخزعة بطانة القلب (الوزن الرطب حوالي 40 ملغ) التي تم الحصول عليها خلال الجراحة التصحيحية لرباعية فالوت في الرضيع. (B)شريحة عضلة القلب من الأنسجة المعروضة في أ، جزءا لا يتجزأ من agarose. (C)Cardiomyocytes معزولة عن شريحة عضلة القلب كما هو مبين في B. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: بيانات المريض البشري. وترد قائمة بعدد العينات المأخوذة من المرضى البشريين المشمولين في هذه الدراسة. تم تصنيف العينات وفقًا لأنواع الجراحة والعمر والأمراض المسببة للمرض ووقت النقل ، مع العدد الإجمالي للعينات وعدد العزلات myocyte الناجحة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على الرغم من أن عزل أمراض القلب الحية تأسست منذ أكثر من 40 عاما، ولا يزال شرطا مسبقا للعديد من النهج التجريبية في أبحاث القلب، فإنه لا يزال تقنية صعبة مع نتائج لا يمكن التنبؤ بها. يتم استخدام عزل Cardiomyocyte عن طريق ضخ الشرايين التاجية مع محلول الإنزيم عادة لقلوب الحيوانات الصغيرة ويسفر عن أعداد كبيرة من الخلايا القابلة للحياة. غير أن هذا يتطلب نظاماً وخبرة معقدين نسبياً. وعلاوة على ذلك، فإن معظم عينات الأنسجة البشرية ليست مناسبة لهذه الطريقة، نظرا لصغر حجمها أو عدم وجود فروع الشريان التاجي، مما يجعل أساليب جديدة لعزل القلبية البشرية مرغوب فيه. ويستند البروتوكول الموصوف هنا على الجيل الاتنمي من شرائح الأنسجة القلبية الرقيقة ، والتي تتعرض بعد ذلك لعملية الهضم الأنزيمية. ويمكن تطبيقه على عينات عضلة القلب من قلوب الحيوانات ونخاع القلب البشري مثل النوى اللبنية من زرع الجهاز المساعد للبطين الأيسر ، الخزعات الرحمية من استئصال النخاع الحاجز ، أو القلوب المزروعة (انظر الجدول التكميلي 1) ، وتنتج بشكل موثوق كميات كافية من الخلايا القلبية القابلة للحياة والمتسامحة للكالسيوم التي يمكن استخدامها للتجارب اللاحقة ، مثل زراعة القلب والقلبية 17.

قد يكون السبب الرئيسي لارتفاع غلة myocytes من شرائح الأنسجة المقطوعة الهزاز من قطع الأنسجة المفروم درجة أقل من الضرر myocyte أثناء تشريح. عندما لا يكون الضخ التاجي ممكنًا ، فإن تقطيع أو تحديد عينة الأنسجة أمر ضروري لزيادة سطح الاتصال لهضم الإنزيمات. تسمح أبعاد الشريحة التي تبلغ 8 مم × 8 مم × 0.3 مم بالوصول الجيد للأنزيمات بسبب نسبة كبيرة نسبياً من السطح إلى الحجم (~ 7 مم-1). باستخدام المقص، يمكن تحقيق نسبة مماثلة من السطح إلى الحجم (~ 6 مم-1)عن طريق جمع العينات إلى قطع صغيرة تبلغ حوالي 1 مم × 1 مم × 1 مم. على الرغم من أن الضرر العضلي في شرائح وقطع مفرومة قبل الهضم الأنزيمي لم يتم قياسها كميا، تشريح على هزاز يسبب على الأرجح أقل بكثير الضرر لأنه يتيح قطع لطيف في اتجاه الألياف. في الواقع، كان يقدر أن في شرائح قطع هزاز أقل من 5٪ من myocytes معطوبة19. تظهر النتائج أن خلايا القلب البشرية يمكن عزلها بكفاءة عالية مع البروتوكول المقدم ، مع نسبة أعلى بكثير من الخلايا القابلة للحياة مقارنة بقطع الأنسجة. هذا وفقا للبروتوكول الذي استخدم شرائح من الأنسجة الأذينية20. لدينا طريقة تسفر عن ما يصل الى 200 ميقاية البطينية التي تحمل الكالسيوم لكل ملليغرام من الأنسجة ويوفر إمكانية تخزين أو نقل الأنسجة القلبية لمدة تصل إلى 36 ساعة قبل العزل. وهذا يجعل البروتوكول قابلا للتطبيق على المختبرات دون جراحة القلب في الموقع وبالتالي يوسع إمكانيات التعاون.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي المعالجة الصحيحة لمائي القلب إلى شرائح على الاهتزاز والهضم وكذلك الخطوات النهائية لإعادة إدخال الكالسيوم وتبييض BDM. على النقيض من أساليب أخرى19,21, جزءا لا يتجزأ من أنسجة القلب في agarose مع انخفاض درجة حرارة ذوبان لتجنب الحركة أثناء عملية تشريح14,15. وكان هذا ضروريا لتحقيق الاستقرار في كتلة الأنسجة وتوليد شرائح موحدة. عند تضمين الأنسجة، يجب أن يكون agarose لا يزال سائلا، ولكن يجب أن لا تتجاوز درجة الحرارة 37-38 درجة مئوية لتجنب تلف الخلايا عن طريق ارتفاع الحرارة. على العكس من ذلك، إذا كان agarose بارد جدا (<35 درجة مئوية)، فإنه لا يرتبط جيدا إلى كتلة الأنسجة، وربما كسر أثناء تشريح. لاختبار القدرة على البقاء myocyte بعد معالجة هزاز، ويقترح اختبار MTT بسيطة التي تسمح للتقييم السريع لقابلية الخلية عن طريق المجهر الخفيفة وأيضا للقياس الكمي عن طريق التحليل الضوئي14،22. يمكن أن يحدث تلف القلب والخلايا أيضا أثناء إعادة إدخال الكالسيوم خارج الخلية بعد فترة من الحضانة في محلول خال من الكالسيوم23,24. هذه الظاهرة متناقض الكالسيوم في الخلايا المعزولة يمكن تخفيفها من خلال بطيئة, زيادة تدريجية من مستويات الكالسيوم للسماح للقلب العضلية للتكيف. وينبغي أن تنفذ هذه الخطوة بعناية خلال التحريض المستمر في 35 درجة مئوية ومع فترات من 5 دقائق. انخفاض حرارة طفيف (21 درجة مئوية) يزيد من تحمل الكالسيوم من الجرذان cardiomyocytes أثناء إعادة إدخال, وهو وفقا لتقارير سابقة25. ومع ذلك، لم تظهر cardiomyocytes الإنسان اختلافات كبيرة في تحمل الكالسيوم عند 35 درجة مئوية أو 21 درجة مئوية. استخدام BDM أثناء قطع, الهضم, وإعادة إدخال الكالسيوم يمنع تقلص myocyte والنفقات الطاقة الخلوية وكذلك hypercontraction وبالتالي هو واقية. ومع ذلك ، للتجارب اللاحقة تقييم انكماش القلب أو اقتران الإثارة انكماش ، BDM يحتاج إلى إزالة26. تم تطبيق تبييض تدريجي لتقليل فرط الثبات التلقائي. يمكن حذف BDM ، ولكن هذا سيزيد بشكل ملحوظ من كمية myocytes hyperconted ، كما لوحظ في التجارب السابقة والدراسات6.

البروتوكول الموصوف يستخدم محلول يحتوي على البوتاسيوم عالية وآثار الصوديوم فقط للهضم. أعطى هذا الحل أعلى غلة من قضيب على شكل, عبرtriated cardiomyocytes. أما بالنسبة للهضم الأنزيمي، فقد تطلب تركيزًا أعلى من الكولاجيناز (4 ملغ/مل) مقارنة بالهضم في محلول تيرود العادي (1.5 ملغ/مل). قد يؤدي ارتفاع الصوديوم خارج الخلية إلى زيادة الصوديوم داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى تفاقم الآثار السلبية لمفارقة الكالسيوم ، وبالتالي تقليل غلة الخلايا27. لذلك ، يقترح استخدام حلول مع البوتاسيوم العالي والصوديوم المنخفض. وكثيرا ما تستخدم تركيز المغنيسيوم خارج الخلية عالية في القلبmyocyte بروتوكولات العزل3,28, وقد ثبت للحد من إصابة نقص التروية - reperfusion29,30 وتحسين وظيفة القلب بعد فترات طويلة من نقص تروية الباردة31. ولذلك، فإن الحل المطبق هنا يحتوي أيضا على تركيز عال من المغنيسيوم (10 mM). ومع ذلك، فقد تبين أن الإثارة، وقوة الانقباض، وسرعة الاتّقل يمكن أن تنخفض بتركيزات المغنيسيوم العالية32. على الرغم من أن هذه الآثار تبين أن عكسها، لا يمكن استبعاد الآثار على عضلة القلب المعزولة. وهكذا، فإن استخدام المغنيسيوم في التركيزات الفسيولوجية (1-2 mM)، قد يؤدي إلى انخفاض العائد الكلي للخلية ولكن تحسين الإثارة.

الوقت الأمثل للهضم هو متغير جدا، كما يمكن أن تختلف كمية المصفوفة خارج الخلية أو التليف إلى حد كبير في عضلة القلب فشل الإنسان. وينبغي أن الأنسجة لا تزال متصلة بقوة في وقت التفكك، مع عدد قليل فقط من الخلايا myocytes قابلة للحياة سراح، وزيادة وقت الهضم في خطوات من 5 دقائق والتحقق بانتظام من myocytes الحرة ويوصى نسيج الشرائح. إذا ظلت الأنسجة غير مهضومة بعد فترات طويلة (> 45 دقيقة)، وزيادة تركيز collagenase في الخطوات من 1 ملغ / مل أو اختبار دفعة انزيم مختلفة ينصح16. يمكن أن تكون القيم الخاصة المقدمة في هذا العمل بمثابة التمهيدي لعزل قوي من عضلة القلب، ولكن الظروف لتحقيق العائد الأمثل ومقومات البقاء يمكن صقلها في كل مختبر، مع الأخذ في الاعتبار التباين الكبير في أنشطة الانزيم ودساتير الأنسجة. ومن مزايا هذه الطريقة أنه نظراً لصغر كميات الأنسجة المطلوبة وسير العمل البسيط في دفعات صغيرة، يمكن إجراء عدة اختبارات بالتوازي. وهكذا، يمكن تحقيق بروتوكول أمثل بسرعة.

يتطلب توليد شرائح عضلة القلب عالية الجودة اهتزازًا عالي الدقة. الحاجة إلى شريحة نسيج عالية الدقة أو هزاز هو عيب محتمل من الأسلوب، لأنه لا يتوفر بسهولة في كل مختبر. الجهاز المستخدم لهذه الدراسة هو وصفها بمزيد من التفصيل في مكان آخر14,15. وقد استخدمت أجهزة مختلفة بنجاح لتوليد شرائح عضلة القلب من قبل مجموعات أخرى33،34،35. وبالتالي، إذا كان يمكن تلبية إعدادات سرعة التقدم، وسعة النصل، وتردد التذبذب، واتجاه شفرة أفقي مع انحراف z-أقل من 0.1 ميكرومتر، ينبغي أن يكون تشريح ناجحة والعزلة مجدية مع الهزازات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تقطيع الأنسجة متقن ويطيل بشكل كبير مدة البروتوكول (حوالي 1-2 ساعة). استخدام BDM كعامل فك الميكانيكية له آثار وقائية عن طريق الحد من التعرض للطاقة الخلوية، إصابة الإقفار، وفرط الثبات26،36،37. على الرغم من أن التأثير السلبي inotropic من BDM أظهرت أن يكون سريع التراجع بعد الاغتسال38,39, فإنه ليس من الواضح ما إذا كان قد يكون BDM عواقب غير معروفة على وظيفة cardiomyocyte40. تظهر هذه الدراسة أن الخلايا يمكن عزلها مع غلة عالية بعد أوقات تخزين الأنسجة تصل إلى 36 ساعة وأنه يمكن استزراع خلايا القلب البشري لمدة تصل إلى ثلاثة أيام بعد العزلة مع هذه الطريقة17. لم نلاحظ اختلافات وظيفية أو هيكلية بين myocytes مع أوقات التخزين القصيرة والطويلة. غير أن هذا لم يُقيَّم بصورة منهجية. من ناحية أخرى، لقلوب الأرانب كلها، تبين أن الاختلافات الوظيفية بين قلوب جديدة وقلوب تتعرض لاقفوية البرد في حل خارج الخلية التي تحتوي على 30 M BDM كانت لا تذكر31، ونفس الشيء قد يكون صحيحا في هذه الحالة.

يوفر البروتوكول المقدم أساسًا متينًا لجميع أنواع التجارب مع عضلة القلب البطيني المعزولة وقد يكون ذا قيمة خاصة للبحث عن عينات عضلة القلب البشرية. مع بعض التعديلات، والعزلة من الخلايا القلبية الأخرى، مثل الخلايا الليفية أو الخلايا البطانية يبدو أيضا من الممكن41. لأنه يتطلب سوى كميات صغيرة من الأنسجة التي يمكن شحنها في محلول التخزين البارد من مختبرات أخرى، وتطبيق البروتوكول قد يقلل من عدد الحيوانات المختبرية التضحية. في الواقع، تم تطبيق البروتوكول بنجاح على أنسجة القلب الأرنب والبورسين. وعلاوة على ذلك، كما التجارب على المدى الطويل زراعة شرائح الأنسجة عضلة القلب زيادة21،,33،,42 ويتم تحسين باستمرار لتوفير ظروف الثقافة المثلى15،,43،,44،ويمكن تطبيق طريقة بسهولة بعد زراعة شريحة. قد يساعد عزل الخلية المفردة من عضلة القلب المزروعة في توصيف التغيرات في أمراض القلب بعد التدخلات الدوائية أو البدنية في المختبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر أندرياس ديندورفر من مركز والتر بريندل للطب التجريبي، LMU ميونيخ، للمساعدة في بروتوكول تشريح. لتوفير عينات الأنسجة عضلة القلب البشرية نود أن نشكر الغزالي ميناباري وكريستيان هايم من قسم جراحة القلب، مستشفى جامعة إرلانجن، هندريك ميلتينج من معهد إريك وحنا كلسمان، جامعة روهر بوخوم ومهند الكسار من قسم أمراض القلب لدى الأطفال، مستشفى إرلانجن الجامعي. للحصول على الدعم مع تدفق cytometry نود أن نشكر سيمون فولكل وزملاؤه من مركز البحوث الترجمة (TRC)، مستشفى جامعة إرلانجن. ونود أيضا أن نشكر لورينز ماكارغو وسيلين غرونينغر من معهد علم وظائف الأعضاء الخلوية والجزيئية إرلانجن على الدعم الفني الممتاز.

وقد دعم هذا العمل المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية، والمركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) في المستشفى الجامعي في جامعة إرلانغن نورنبرغ، وجامعة إرلانغن نورنبرغ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
2,3-butanedionemonoxime Carl Roth 3494.1 Purity>99%
Bovine serum albumin Carl Roth 163.2
CaCl2 Carl Roth 5239.2
Creatine monohydrate Alfa Aesar B250009
Glucose Merck 50-99-7
HEPES Carl Roth 9105.3
KCl Carl Roth P017.1
KH2PO4 Carl Roth 3904.2
L-glutamic acid Fluka Biochemica 49450
Low melting-point agarose Carl Roth 6351.5
MgCl2 x 6H2O Carl Roth A537.1
MgSO4 Sigma Aldrich M-7506
NaCl Carl Roth 9265.1
NaHCO3 Carl Roth 8551.2
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Taurine Sigma Aldrich T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS Thermo Fisher Scientific D3167
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific F14201
FluoVolt Thermo Fisher Scientific F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I Worthington LS004196 Used for human tissue at 4 mg/mL
(activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II Worthington LS004176 Used for rat tissue at 1.5 mg/mL
(activity 330 U/mg)
Protease XIV Sigma Aldrich P8038 Used for rat tissue at 0.5 mg/mL
(activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV Sigma Aldrich P5147 Used for human tissue at 0.5 mg/mL
(activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa) BD Bioscience 649225
Centrifuge tube, 15 mL Corning 430790
Centrifuge tube, 50 mL Corning 430829
Compact shaker Edmund Bühler KS-15 B control Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes Carl Roth EA65.1 For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps FST 11271-30
Heatblock VWR BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm Merck NY8H04700
TC Dish 100, Standard Sarstedt 83.3902
TC Dish 35, Standard Sarstedt 83.3900
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901
Vibratome (VT1200S) Leica 1491200S001 Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
  2. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
  3. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
  4. Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
  5. Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
  6. Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
  7. Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116 (2014).
  8. Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
  9. Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
  10. Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
  11. Trube, G. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Springer. Boston, MA. 69-76 (1983).
  12. Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
  13. Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
  14. Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
  15. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
  16. Worthington-Biochemical. Worthington Tissue Dissociation Guide. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html (2019).
  17. Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47 (2019).
  18. Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
  19. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
  20. Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
  21. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
  22. Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
  23. Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
  24. Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
  25. Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
  26. Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
  27. Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
  28. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
  29. Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
  30. Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
  31. Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
  32. Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), Pt 2 622-633 (1992).
  33. Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
  34. Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
  35. Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
  36. Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
  37. Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
  38. Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
  39. Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
  40. Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
  41. Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. Pierce, G. N., Claycomb, W. C. , Springer US. 195-198 (1997).
  42. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
  43. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
  44. Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).

Tags

علم الأحياء، العدد 159، الإنسان، قصور القلب، شرائح عضلة القلب، عزل عضلة القلب، هزاز، myocytes انكماشية، تصوير الكالسيوم، اقتران استثارة القلب انكماش
عزل القلب البطيني البشري من شرائح عضلة القلب المقطّع بالهزاز
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T.… More

Fiegle, D. J., Volk, T., Seidel, T. Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices. J. Vis. Exp. (159), e61167, doi:10.3791/61167 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter