Summary
Denne protokol tillader differentiering af humane pluripotente celler i intestinale organoider. Protokollen efterligner normal menneskelig udvikling ved at differentiere celler til en population af endelig endoderm, hindgut endoderm og derefter tarmepitel. Dette gør protokollen velegnet til at studere både tarmudvikling såvel som sygdomsmodelleringsapplikationer.
Abstract
hiPSC-afledte tarmorganoider er epitelstrukturer, der selv samler sig fra differentierede celler til komplekse 3D-strukturer, der er repræsentative for det humane tarmepitel, hvor de udviser krypt / villus-lignende strukturer. Her beskriver vi dannelsen af hiPSC-afledte tarmorganoider ved trinvis differentiering af hiPSC'er til endelig endoderm, som derefter posterioriseres til dannelse af bagtarmepitel, inden de overføres til 3D-kulturbetingelser. 3D-kulturmiljøet består af ekstracellulær matrix (ECM) (f.eks. Matrigel eller anden kompatibel ECM) suppleret med SB202190, A83-01, Gastrin, Noggin, EGF, R-spondin-1 og CHIR99021. Organoider gennemgår passage hver 7. dag, hvor de mekanisk forstyrres før overførsel til frisk ekstracellulær matrix og får lov til at ekspandere. QPCR og immuncytokemi bekræfter, at hiPSC-afledte intestinale organoider indeholder modne intestinale epitelcelletyper, herunder bægerceller, Paneth-celler og enterocytter. Derudover viser organoider tegn på polarisering ved ekspression af villin lokaliseret på den apikale overflade af epitelceller.
De resulterende organoider kan bruges til at modellere menneskelig tarmudvikling såvel som talrige humane tarmsygdomme, herunder inflammatorisk tarmsygdom. For at modellere tarmbetændelse kan organoider udsættes for inflammatoriske mediatorer såsom TNF-α, TGF-β og bakteriel LPS. Organoider udsat for proinflammatoriske cytokiner viser en inflammatorisk og fibrotisk fænotype som reaktion. Parring af raske versus hiPSC'er afledt af patienter med IBD kan være nyttig til forståelse af mekanismer, der driver IBD. Dette kan afsløre nye terapeutiske mål og nye biomarkører for at hjælpe med tidlig sygdomsdiagnose.
Introduction
Egenskaberne af pluripotente stamceller (PSC'er), såsom selvfornyelse og evnen til at differentiere sig til enhver celletype i menneskekroppen, gør dem til værdifulde værktøjer i studiet af udvikling, sygdomspatologi og lægemiddeltest1. Human inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) er særligt nyttige til sygdomsmodelleringsundersøgelser, da de kan udledes af patienter og direkte indfange genomet, der er ansvarlig for sygdomsfænotype 2,3. Sådanne hiPSC'er kan differentieres til den celletype, der er påvirket af den genetiske defekt, hvilket muliggør omhyggelig undersøgelse af sygdommens molekylære mekanisme4.
Differentieringsprotokoller for humane PSC'er sigter mod at styre differentiering af celler via de vigtigste udviklingsstadier ved aktivering eller hæmning af specifikke signalveje, der styrer afstamningsforpligtelse og specifikation. Vedligeholdelse af hiPSC i en pluripotent tilstand kræver moderate niveauer af Activin A (Act-A) signalering, mens en høj dosis Act-A i 3 dage forpligter hiPSC til en endelig endoderm (DE) skæbne 5,6. Act-A og Wnt pathways direkte anterior-posterior identitet af DE. Signalering ved Act-A inducerer foregut (FG) markører såsom HHEX, HNF4α og GATA4, mens blokering af ekspression af baggut (HG) gener såsom CDX2. Wnt-signalering inducerer posteriorisering af DE, som derefter vedtager en HG-genekspressionsprofil 7,8. Når HG-celleidentitet er etableret, kan differentiering flyttes fra 2D til 3D og rettes mod dannelsen af tarmorganoider.
Intestinale organoider dyrkes typisk i en 3D ekstracellulær matrix (fx Matrigel eller andre kompatible ECM'er) baseret kultursystem9, der består af laminin, kollagen IV og entactin og beriget med vækstfaktorer som EGF, FGF, PDGF og IGF-1 for at bidrage til støtte overlevelse og spredning. Organoiderne dyrkes i et defineret medium indeholdende Gastrin, Noggin og CHIR for at stimulere og understøtte tarmstamcellevækst og proliferation under langvarig kultur.
Efter at intestinale epitelceller er indlejret i den ekstracellulære matrix, begynder intestinale krypter at danne og ekspandere til sidst og danne sfæroider. Disse modnes til organoide strukturer, der efterligner fysiologisk funktion af tarmepitelet. Organoider kan typisk dyrkes i mere end 1 år uden signifikant tab af funktionelle og genekspressionsprofiler. Passaging er påkrævet på ugentlig basis ved hjælp af enzymatisk fordøjelse af organoiderne i mindre fragmenter, som derefter selvsamler til komplette organoider.
Etablerede organoide linjer kan bruges som en pålidelig model af talrige lidelser forbundet med tarmen, herunder Crohns sygdom, ulcerøs colitis og kolorektal cancer 10,11,12,13. Dette er en foretrukken model for dyreceller, da de udtrykker menneskelige gener, der er forbundet med disse lidelser, og reagerer på eksterne stimuli, der ligner det, der forekommer i humant væv in vivo.
Protocol
BEMÆRK: Alt vævskulturarbejde, der er beskrevet nedenfor, skal udføres i en klasse II laminar flowhætte.
1. Human induceret pluripotent stamcelledifferentiering (hiPSC'er) til bagtarmens endoderm
- For at belægge en cellekulturkolbe med ekstracellulær matrix skal du først beregne mængden af den nødvendige matrix. Her er et eksempel på en 12-brønds plade, der er belagt med Matrigel. Beregn den krævede mængde ekstracellulær matrix for at belægge en 12 brøndplade. Brug følgende formel:
BEMÆRK: Coat cellekultur retter med ekstracellulær matrix valg. Hvis du bruger Matrigel, skal du bruge en koncentration på 0,035 mg/cm2 24 timer før såning til differentiering. Kontroller batchkoncentrationen af ekstracellulær matrix på produktbladet, og forbered mindre delprøver forud for eksperimenter i henhold til producentens anvisninger. - Fortynd den nødvendige mængde ekstracellulær matrix i kolde DMEM-medier ved hjælp af en p1000-pipette.
- Bland godt med en 5 ml stripette.
- Tilsæt 500 μL fortyndet matrix til hver brøndplade. Pladen rystes forsigtigt for at fordele den fortyndede ekstracellulære matrix jævnt og inkuberes i mindst 12 timer ved 37 °C.
- Før såning af celler til pladen, vask hver brønd med 500 μL PBS for at fjerne overskydende ekstracellulær matrix. Dette forhindrer cellefrigørelse under differentieringen.
- Lad den sidste vask stå i brøndene, indtil den er klar til frø for at forhindre tørring af ekstracellulær matrix.
- For at frø til hiPSC'ers differentiering mod endelig endoderm (DE) eller bagtarm (HG) skal du tage en kolbe hiPSC'er, der dyrkes i et valgfrit vedligeholdelsesmedie (f.eks. essentielle 8 medier) og aspirere mediet. (Her sås vi celler ved 25.000 celler/cm2).
BEMÆRK: Såtæthed er afgørende for vellykket differentiering og skal optimeres for hver enkelt hiPSC-cellelinje. - Cellerne i kolben vaskes med 5 ml PBS. Opsug PBS.
- Tilsæt 2,5 ml celledissociationsopløsning (f.eks. TrypLE) og lad det stå ved RT i 4 minutter. Opsug celledissociationsopløsningen, og bank forsigtigt på kolben for at løsne cellerne.
- Kolben vaskes med 5 ml DMEM-medie opvarmet til 37 °C, og alle cellerne samles i et 15 ml glas.
- Tag 10 μL resuspenderet celleopløsning og mål celledensiteten med et hæmocytometer.
- Tag nok af cellesuspensionen til at samle 1,05 x 106 celler og læg dem i et 15 ml rør.
- Spin ved 160 x g i 3 min. Mens cellerne centrifugeres, aspireres PBS fra den ekstracellulære matrixbelagte 12 brøndplade.
- Efter centrifugering aspireres supernatanten, og cellepelletsen resuspenderes i 12 ml vedligeholdelsesmedier med ROCK-hæmmer (10 μM).
- Ved hjælp af en p1000-pipette tilsættes 1 ml cellesuspension til hvert hul i 12-brøndpladen. Resuspender cellerne godt for at sikre en ligelig fordeling mellem brøndene.
- Ryst pladen forsigtigt for at fordele cellerne i pladens brønde, men undgå at hvirvle af mediet, da det vil koncentrere cellerne i midten af brøndene.
- Anbring i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Skift kun medie til vedligeholdelsesmedier (f.eks. essentielle 8 medier) (ingen ROCK-hæmmer) 24 timer efter såning.
- For at begynde differentiering til DE, forbered endoderm basale medier i henhold til tabel 1.
BEMÆRK: I starten af differentieringscellerne skal være mellem 60-80% sammenløb. - Forbered 12 ml DE-medier ved at tilføje Activin A (100 ng/ml) og Wnt3 (50 ng/ml) til endoderm basalmediet.
- Mediet opvarmes til 37 °C.
- Aspirer medier fra hvert hul i vævskulturpladen eller kolben.
- Start DE-differentieringen ved at tilføje 1 ml DE-medier til hvert hul i 12-brøndpladen.
- 24 timer efter start af DE-differentiering (D1 DE) skal du forberede friske DE-medier og udføre medieskift.
- Gentag trin 1.24 ved 48 timer (D2 DE). Hvis der er meget celledød på dette stadium, vaskes alle brønde med 500 μL PBS, før medierne ændres.
BEMÆRK: For at bekræfte vellykket endodermdifferentiering skal du udføre flowcytometri for at vurdere ekspression af SOX17. Vi forventer normalt, at >80% af cellerne er SOX17-positive ved D3 DE. Hvis ekspression af SOX17 er suboptimal, bør cellesåningstætheden optimeres såvel som koncentrationer af Act-A. - Start HG-differentiering på dette tidspunkt, dvs. 72 timer efter start af DE-differentiering. Forbered 12 ml HG-medier ved at tilføje CHIR99021 (3 μM) og RA (1 μM) til endoderm basale medier (tabel 1).
BEMÆRK: Ved D3 DE skulle cellen have dannet et ensartet monolag. Optimal DE-differentiering er afgørende for yderligere stadier af differentiering. - Aspirere DE-medier.
- Start HG-differentiering ved at tilføje 1 ml HG-medier til hver brønd på 12-brøndpladen.
- Fortsæt differentieringen i 4 dage med daglige medieændringer.
BEMÆRK: For at bestemme succesen med DE-posteriorisering skal du udføre flowcytometri for at vurdere ekspression af CDX2. Ved D4 af HG-differentiering forventer vi normalt, at >80% af cellerne er CDX2-positive. Hvis posterioritet ikke er optimalt, bør koncentrationen af CHIR99021 optimeres. - For at indsamle en prøve til RNA-ekstraktion, aspirat differentieringsmedier og vask brønden med 500 ul PBS.
- Aspirer PBS og tilsæt et passende volumen cellelysebuffer fra et RNA-ekstraktionssæt.
- Brug en p1000-pipette til at skrabe bunden af brønden for at sikre lysering af alle cellerne.
- Opsug cellelysatet og læg det i et rent rør.
- Fortsæt til RNA-ekstraktion eller frys lysatet ved -20 °C, indtil det er klar til RNA-ekstraktion.
- Til immunfarvning, aspirationsdifferentieringsmedier og vaskebrønde med 500 μL PBS.
- Opsug PBS og tilsæt 500 μL 4% PFA.
OBS: PFA er giftigt. Brug passende personlige værnemidler og følg lokale laboratorieprocedurer for bortskaffelse af PFA. - Der inkuberes ved 4 °C i 20 minutter.
- PFA fjernes og hullerne vaskes tre gange med 500 μL PBS.
- Lad den sidste PBS-vask stå på cellerne, indtil den er klar til at udføre immunfarvning.
2. Passaging af intestinale organoider
- Forbered intestinale basale medier i henhold til tabel 2.
- For at overføre fra 2D til 3D-cellekultur skal du bruge en 6-brøndplade til at generere DE-celler fra hiPSCS. Fjern monolaget af celler fra 6-cellepladen ved hjælp af en 5 ml stripette.
- Saml celler i et 15 ml centrifugerør, før centrifugering ved 400 x g i 1 min for at producere en cellepille.
- Resuspender cellepellet i intestinale vækstmedier, der indeholder vækstfaktorer: SB202190 (10 μM), A83-01 (500 nM), Gastrin (10 nM), Noggin (100 ng / μL), EGF (500 ng / μL), R-Spondin1 (100 ng / ml), CHIR99021 (6 μM), ROCK-hæmmer (10 μM).
- Der tilsættes en passende mængde ekstracellulær matrix afhængigt af antallet af huller, der belægges i. Dette kan beregnes ved hjælp af nedenstående ligninger.
[1] Samlet volumen af ekstracellulær matrix/medier (μL) = 30 μL * antal brønde med 48-brøndplade
[2] Påkrævet volumen ekstracellulær matrix (μL) = Svar fra [1] * 2/3
[3] Påkrævet medievolumen (μL) = Svar fra [1] * 1/3 - Der tilsættes 30 μL cellesuspension til midten af hvert hul i en 48-brønds plade.
- Pladen inkuberes i en inkubator på 37 °C i mindst 5 minutter for at lade den ekstracellulære matrix hærde.
- Når de ekstracellulære matrixkupler er indstillet, tilsættes 300 μL tarmvækstmedier, der indeholder alle vækstfaktorer, til hver brønd.
- Pladen sættes tilbage i en 37 °C inkubator med 5% CO2.
BEMÆRK: Hvis der efter 48 timer ikke kan observeres organoider, og/eller der er signifikant celledød, kan det være nødvendigt at optimere ROCKi- og NOGGIN-koncentrationerne. - For at passere organoiderne skal du observere cellerne under et lysmikroskop for at vurdere tæthed og størrelse af organoider og afgøre, om de har brug for passage.
- Udskift cellekulturmedier med iskold PBS.
BEMÆRK: Organoidkulturer skal opdeles ca. hver 5-7 dage. Overførsel af intestinale organoidkulturer er påkrævet, når der er en ophobning af celleaffald, der er tydeligt i organoidlumen og en gulfarvning af det omgivende intestinale vækstmedium. - Afmonter organoider og ekstracellulær matrixkugle mekanisk fra pladen ved hjælp af en skrabebevægelse med en 5 ml stripette.
- Organoiderne fra hver brønd samles i et 15 ml centrifugerør.
- Organoid suspension centrifugeres ved 400 x g i 1 min for at pelletere organoiderne. Supernatanten suges, indtil den når toppen af cellepelleten, idet man er forsigtig, når man har nået det synlige ekstracellulære matrixlag.
- Resuspender pellet i 15 ml iskold PBS.
BEMÆRK: Dette trin tjener til at vaske enhver resterende ekstracellulær matrix, der ikke blev fjernet i det oprindelige spin. - Der centrifugeres ved 400 x g i 1 min. Aspirer medierne indtil pelleten, der indeholder organoiderne.
- Resuspender i 1 ml iskold PBS. Brug en p200-pipette til manuelt at afbryde de intakte organoider ved pipettering op og ned flere gange.
BEMÆRK: Overhold organoidernes størrelse ved hjælp af lysmikroskop for at afgøre, om de skal adskilles yderligere. - Tilføj 9 ml medier uden vækstfaktorer.
- Der centrifugeres ved 400 x g i 1 min. Supernatanten suges, indtil organoiderne piller.
- Beregn den krævede mængde ekstracellulær matrix og medier ved hjælp af nedenstående ligninger:
[1] Samlet volumen af ekstracellulær matrix/medier (μL) = 30 μL * antal brønde med 48-brøndplade
[2] Påkrævet volumen ekstracellulær matrix (μL) = Svar fra [1] * 2/3
[3] Påkrævet medievolumen (μL) = Svar fra [1] * 1/3 - Resuspender organoidpelleten i det beregnede volumen tarmmedier med vækstfaktorer (inklusive Noggin & ROCK-hæmmer).
- Tilsæt det krævede volumen ekstracellulær matrix i denne cellesuspension og resuspender for at sikre jævn fordeling af organoider.
- 30 μL af denne suspension pipetteres ind i midten af hvert hul på en 48 brøndplade (helst forvarmet i en inkubator på 37 °C).
- Pladen sættes tilbage i en 37 °C inkubator i 5 minutter, indtil den ekstracellulære matrix er hærdet.
- Forbered tarmmedier med vækstfaktorer (+ ROCK-hæmmer) (ca. 17 ml pr. 48 brøndplade).
- Der tilsættes 300 μL til hvert hul.
- Der inkuberes ved 37 °C ved 5% CO2.
- Efter passaging aspireres medierne til tarmorganoiderne og erstattes med friske tarmmedier med vækstfaktorer (uden Noggin & ROCK-hæmmer) hver 2-4 dage.
BEMÆRK: Hvis der efter 48 timer ikke kan observeres organoider, og / eller der er signifikant celledød, kan det være nødvendigt at optimere ROCKi- og NOGGIN-koncentrationerne.
BEMÆRK: Intestinale organoider reagerer på en række inflammatoriske mediatorer in vivo. TNFα er et cellesignalprotein involveret i flere inflammatoriske processer. - For at udløse en inflammatorisk reaktion i tarmorganoider fremstilles TNFα i en koncentration på 40 ng/ml kun i basalmedier.
- Aspirat medier fra 48 brøndplade.
- Der tilsættes 300 μL tilberedte basalmedier indeholdende 40 ng/ml TNFα.
- Inkuber pladen ved 37 °C i 48 timer for at replikere et proinflammatorisk miljø.
BEMÆRK: Intestinale organoider reagerer på en række inflammatoriske mediatorer in vivo. TNFα er et cellesignalprotein involveret i flere inflammatoriske processer. - Eventuelle resterende celler bortskaffes ved aspiration i en vakuumfælde, der indeholder 5% Trigene.
Representative Results
Et skema over differentieringsprotokollen er vist i figur 1A. På dag 1 i protokollen skal hiPSC'er være kompakte og danne små kolonier med total sammenløb ca. 50-60%. 24 timer efter induktion af differentiering mod DE-celler begynder at migrere væk fra stamcellekolonierne for at danne et monolag af celler. Dette fortsætter i løbet af de følgende 3 dage og skal danne et komplet monolag på D3 af DE-differentiering (figur 1). Genekspression bør overvåges i løbet af differentieringen med pluripotensmarkører (OCT4, NANOG, SOX2), der udtrykkes højt på D0 og hurtigt nedreguleres under DE-differentiering. Under DE-differentiering skal T-ekspression toppe på D1, efterfulgt af EOMES og MIXL på D2. På D2 skal DE-gener (SOX17, FOXA2, GATA4, CXCR4) begynde at blive udtrykt og toppe ved D3 (figur 2 og figur 3). Celler skal være et monolag af DE D3 og kan derefter posterioriseres i bagtarmendoderm. Under posterioringsbegivenheden begynder 3D-strukturer at danne sig allerede D2. Men nogle gange begynder de kun at dukke op på D4 eller slet ikke; dette er ikke altid vejledende for, om cellerne vil fortsætte og danne tarmorganoider (figur 1). Under HG-specifikation skal CDX2- og HNF4a-ekspression induceres og øges over tid (figur 3).
Efter overførsel af 2D-ark af celler til ekstracellulær matrix observeres klumper af 2D-celler i de første 24 timer. Efter 48 timer skal ark celler begynde at automatisk organisere sig i mere komprimerede 3D-sfæroidstrukturer, der oprindeligt er små (figur 4A) og derefter gradvist stige i størrelse og kompleksitet over 7-10 dages kultur (figur 4B & figur 4C). Organoider bør ikke passeres, før de har opnået en klar organoid / sfærisk morfologi med tydeligt epitel med lumen vendt mod midten af organoid / sfæroide (figur 4D). På dette stadium kan immuncytokemi anvendes til at bekræfte ekspression af intestinale markører såsom villin og CDX2 (figur 5). Ikke alle klumper af 2D-celler vil udvikle sig til organoider, og der vil være nogle forurenende døde celler i den ekstracellulære matrix. Disse døde ark af celler bør ignoreres, indtil de overlevende celler har dannet store organoider og er klar til passage.
For at modellere inflammation kan TNFα tilsættes til vævskulturmediet i 24-48 timer. Efter inkubation med proinflammatoriske molekyler høstes organoider ved hjælp af den samme teknik, der anvendes til deres isolering og transitering, og lyseres derefter ved hjælp af en cellebufferkompatibel applikation såsom QPCR eller western blotting. Hvis kortere eksponeringer er påkrævet, skal organoider først fjernes fra den ekstracellulære matrix og udsættes for TNFα i suspension ved hjælp af et 1,5 ml rør. Behandling af tarmorganoider med TNFα i 48 timer inducerer typisk ekspression af proinflammatoriske markører (TNFα, IL1B, IL8, IL23), mens den påvirker ekspression af intestinale epitelmarkører (LGR5, VIL) negativt (figur 6).
| Endoderm basale medier | 50 ml | |
| RPMI 1640 | 48,5 ml | |
| B27 Tillæg | 1 ml | |
| 1% NEAA | 0,5 ml | |
Tabel 1: Sammensætning af endodermale basalmedier til endoderm differentiering.
| Intestinale basale medier | 50 ml | |
| Avanceret DMEM/F12 | 46,5 ml | |
| HEPES-buffer | 0,5 ml | |
| GlutaMAX | 0,5 ml | |
| Nicotinamid | 0,5 ml | |
| N2 Tillæg | 0,5 ml | |
| B27 Tillæg | 1,0 ml | |
| Pen/Strep | 0,5 ml | |
Tabel 2: Sammensætning af intestinale basale medier til dyrkning af tarmorganoider
Figur 1: Morfologiske ændringer under differentiering af hiPSC via definitiv endoderm til bagtarmsafstamningen.
(A) Skematisk oversigt over intestinal differentieringsprotokol. Denne cellelinje af hiPSC danner løse kolonier af små celler med et højt kerne til cytoplasmaforhold. Efterhånden som differentieringen fortsætter, gennemgår cellerne ændringer, der er i overensstemmelse med overgangen fra epitelial til mesenkymalfænotypen, og ved DE D3 danner et ensartet monolag. Når passende signaler er leveret, forlænges DE-celler og danner et tættere pakket monolag med 3D-sfæroider, der vises så snart HD D3, men dette afhænger af den anvendte cellelinje og er ikke et krav for overgang til 3D-kultur (B). Skalabjælke: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Differentiering af hiPSC'er til HG-endoderm inducerer ekspression af endodermale gener.
Immunfarvning af hiPSC, der differentierer til endelig endoderm, viser ændringer i ekspression af TF'er på proteinniveau. Pluripotensmarkører (NANOG og OCT4) nedreguleres af DE D3 (A). Ekspression af mesendoderm markør BH (T) er til stede ved D1 i protokollen (B) og DE specifikke TF'er SOX17 og FOXA2 vises på D2 (B & C). Vægtstang: 200 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Genekspressionsændringer ved qPCR under hiPSC-differentiering til hindgutendoderm (HG).
Gener forbundet med pluripotens nedreguleres (OCT4, NANOG, SOX2) efterfulgt af forbigående ekspression af mesendodermgener (T, EOMES, MIXL1) og endelig ekspression af DE-gener (SOX17, FOXA2, CXCR4) og bagtarmsgener (CDX2, GATA4, HNF4a). Data præsenteret som gennemsnitlig ±SD. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: HG endoderm samler sig selv for at danne 3D intestinale organoider i 3D ekstracellulær matrixkultur.
HG endoderm overføres til en passende 3D ekstracellulær matrixkultur og danner oprindeligt små faste klumper af celler (A). Klumper af HG-endoderm udvider sig over 7-10 dages kultur (B) og bliver derefter asymmetriske og begynder at danne et mere komplekst epitel (C), hvilket til sidst giver anledning til organoider med klar epitelmorfologi og en luminal overflade, der vender mod midten af organoiden (D). Vægtstænger = 50 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Etablerede hiPSC-afledte tarmorganoider udtrykker tarmmarkører.
Immuncytokemi, der viser ekspression af CDX2 og Villin. Skalabjælker = 100 μm Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Effekt af TNFα på den inflammatoriske profil og tarmcelleekspression af sunde tarmorganoider.
Inflammatorisk profil af raske kolonorganoider efter 48 timers behandling med TNFα (40 ng/ml). Ekspression af proinflammatoriske markører (TNFα, IL-8 & IL-23) øges efter eksponering for TNFα, samtidig med at ekspression af intestinale epitelmarkører (LGR5, VIL) nedreguleres. Statistiske analyser blev udført ved tosidet elevs t-test. Data udtrykkes som gennemsnit ± SD for hver gruppe. *P < .01; **P < .001; P < .0001. (n=3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Her beskriver vi en protokol til differentiering af humane pluripotente celler i humane tarmorganoider. Vi demonstrerer deres anvendelse til at studere betændelse; Dette kan dog anvendes i forskellige sammenhænge og kombineret med CRISPR/Cas9 genredigeringsmetoder14 på enhver genetisk baggrund. Når de er differentieret, efter den naturlige udviklingsdifferentieringssekvens af endelig endoderm, baggutendoderm og derefter tarmepitel, kan de resulterende organoider kontinuerligt dyrkes og passeres i mere end 12 måneder.
Et kritisk aspekt af denne protokol er den indledende pletteringstæthed af udifferentierede stamceller før endodermdifferentiering. Hvis dette ikke optimeres tilstrækkeligt, vil celler sandsynligvis dø under det indledende DE-differentieringstrin (hvis cellerne er for sparsomme) eller reducere effektiviteten af DE-differentieringen (hvis cellerne er for tætte). Den korrekte starttæthed skal optimeres for den cellelinje, der bruges, og den korrekte tæthed skal generere et monolag ved slutningen af DE D3. Flowcytometri skal bruges til at bestemme effektiviteten af DE-specifikationen, og vi ser typisk >80% af cellerne positive for SOX17 og / eller CXCR4. Når antallet af SOX17-positive celler er mindre end 60%, påvirkes effektiviteten af HG-mønster, hvilket resulterer i, at der dannes færre organoider, når de overføres til den ekstracellulære matrix. Dette vil i sidste ende få de resulterende organoidkulturer til at mislykkes. For at afgøre, om mønster af DE til HG har været vellykket, vurderer vi antallet af CDX2-positive celler ved flowcytometri og forventer typisk at se >80% positive celler. Igen, hvis antallet af CDX2-positive celler falder til under 50%, vil dette have en negativ indvirkning på antallet af intestinale organoider, der genereres, når de overføres til 3D ekstracellulær matrixkultur.
Efter overførsel af 2D-monolag til 3D-kultur skal små kompakte kugler vises 24-48 timer efter overførsel. Store ark døde celler kan vises afhængigt af differentieringseffektiviteten for den anvendte cellelinje. I stedet for straks at passere kulturer for at fjerne disse affald, tillader vi organoiderne fuldt ud at danne og udvikle deres mere komplekse, foldede struktur. At vente 7-10 dage, før du forsøger den første passage, sikrer, at der er tilstrækkelige delende celler til stede til at generere mange nye tarmorganoider. Ethvert affald, der stadig er til stede i kulturen, kan let fjernes under passageprocessen ved langsomt at dreje de dissocierede organoid/snavsblandinger i et rør med tilstrækkelig hastighed til at pelletere organoiderne, men lade ark af celler flyde i medierne. Medier og cellulært affald kan derefter suges, så kun pellet af organoider forbliver.
Begrænsningen ved denne tilgang er, at hiPSC-afledte celletyper ofte ikke er fuldt modne med hensyn til genekspression og funktionelle profiler. For at afgøre, om hiPSC-afledt tarmvæv er egnet til specifikke anvendelser, skal organoiderne karakteriseres for forskellige celletyper, herunder enterocytter (VIL), enteroendokrine celler (neurog3), bægerceller (MUC2), forbigående amplificerende celler (CD133), panethceller (FZD5) og LGR5+ stamceller (LGR5) for at bestemme den organoide cellulære sammensætning.
Samlet set er den største fordel ved denne protokol i forhold til mange andre organoiddifferentieringsprotokoller, at denne kulturplatform er meget omkostningseffektiv på grund af udskiftning af flere rekombinante proteiner og konditionerede mediepræparater med små molekyler15,16. Differentieringen i HG er meget enkel og hurtig og kan anvendes på både humane embryonale og inducerede pluripotente stamceller med identiske resultater. Når det følges nøje og optimeres til de cellelinjer, der bruges, giver det en relativt enkel modelplatform fri for forurenende mesenkymale celler, som derefter kan anvendes til at studere tarmepitel i en række sammenhænge, herunder inflammation, værtspatogeninteraktioner7. Intestinal fibrose modellering kunne undersøges ved at tilvejebringe pro-fibrotiske stimuli og derefter vurdere ekspression af ekstracellulære matrixproteiner såsom kollagen, laminin og fibronectin ved QPCR, western blot og ELISA. Brug af CRISPR/Cas9-genredigeringsteknikker på udifferentierede stamcellelinjer før differentiering giver mulighed for oprettelse af genknockout- eller proteinoverekspressionsorganoider, der kan bruges til at skabe sygdomsspecifikke organoider og mere komplekse sygdomsmodeller 14,17,18.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
NH finansieres af MRC (MR / S009930 / 1) og Wellcome Trust (204267 / Z / 16 / Z), PD finansieres af MRC PhD DTP, KLF finansieres af BBSRC iCASE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | |
| Advanced DMEM/F12 (1X) | Life Technologies | 12654-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046-5MG | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | 236-EG-01M | |
| Gastrin | Sigma Aldrich | G9145 | |
| GlutaMAX (100X) | Life Technologies | 15630-056 | |
| Growth Factor reduced Matrigel | BD | ||
| HEPES Buffer solution (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| N2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl-cysteine | Sigma Aldrich | A7250 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Noggin | R&D Systems | 6057-NG | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 9713.5 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Retinoic Acid | Sigma | 302-79-4 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254/1 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| RPMI | Sigma | R8758-500ml | |
| R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| SB202190 | Tocris | 1264 | |
| TrypLe Express | Gibco | 12604-021 | |
| Wnt 3a | R&D | 5036-WN |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120, 3127-3136 (2010).
- Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. Journal of Cell Science. 118, 4495-4509 (2005).
- Jaremko, K. L., Marikawa, Y. Regulation of developmental competence and commitment towards the definitive endoderm lineage in human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 10, 489-502 (2013).
- Forbester, J. L., et al. Interaction of Salmonella enterica Serovar Typhimurium with Intestinal Organoids Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Infection and Immunity. 83, 2926-2934 (2015).
- Hannan, N. R., et al. Generation of multipotent foregut stem cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 1, 293-306 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- de Souza, H. S., Fiocchi, C. Immunopathogenesis of IBD: current state of the art. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, 13-27 (2016).
- Tripathi, K., Feuerstein, J. D. New developments in ulcerative colitis: latest evidence on management, treatment, and maintenance. Drugs in Context. 8, 212572 (2019).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25, 1607-1614 (2019).
- Fair, K. L., Colquhoun, J., Hannan, N. R. F. Intestinal organoids for modelling intestinal development and disease. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373, (2018).
- Cuevas-Ocaña, S., Yang, J. Y., Aushev, M., Schlossmacher, G., Bear, C. E., Hannan, N. R. F., Perkins, N. D., Rossant, J., Wong, A. P., Gray, M. A. A Cell- Based Optimised Approach for Rapid and Efficient Gene Editing of Human Pluripotent Stem Cells. Int. J. Mol. Sci. 24, 10266 (2023).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470, 105-109 (2011).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Giacalone, J. C., et al. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 44, 1-22 (2018).
- Bruntraeger, M., Byrne, M., Long, K., Bassett, A. R. CRISPR Gene Editing: Methods and Protocols. Luo, Y. , Springer. New York. 153-183 (2019).
