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Neuroscience

रूपात्मक और प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए भ्रूण सुपीरियर सर्वाइकल गंगलिया से चूहा सहानुभूति न्यूरॉन्स culturing

Published: September 27, 2020 doi: 10.3791/61283
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Saint Mary's College of California

Summary

यह पत्र बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलिया से भ्रूण चूहे सहानुभूति न्यूरॉन्स के अलगाव और खेती का वर्णन करता है। यह इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला करने के लिए और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण के लिए न्यूरोनल अर्क तैयार करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल भी प्रदान करता है।

Abstract

भ्रूण चूहा बेहतर गर्भाशय ग्रीवा ganglia (एससीजी) से सहानुभूति न्यूरॉन्स अक्षीय विकास, अक्षीय तस्करी, सिनैप्टोजेनेसिस, dendritic विकास, dendritic प्लास्टिसिटी और सह संस्कृति प्रणालियों में तंत्रिका लक्ष्य बातचीत का अध्ययन करने के लिए परिधीय न्यूरॉन्स के लिए एक इन विट्रो मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया है । यह प्रोटोकॉल E21 चूहे भ्रूण के बेहतर ग्रीवा गैंगलिया से न्यूरॉन्स के अलगाव और वियोजन का वर्णन करता है, जिसके बाद सीरम-मुक्त माध्यम में शुद्ध न्यूरोनल संस्कृतियों की तैयारी और रखरखाव किया जाता है। चूंकि न्यूरॉन्स अनकोटेड प्लास्टिक का पालन नहीं करते हैं, इसलिए न्यूरॉन्स को या तो 12 मिमी ग्लास कवरलिप या 6-अच्छी प्लेटों पर सुसंस्कृत किया जाएगा जो पॉली-डी-lysine के साथ लेपित हैं। एक एंटीमिटोटिक एजेंट (आरा-सी, साइटोसाइन ए-डी-अरेबिनोफ्यूरिनोसाइड) के साथ उपचार के बाद, यह प्रोटोकॉल 5% से कम गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं के साथ स्वस्थ न्यूरोनल संस्कृतियों को उत्पन्न करता है, जिसे विट्रो में एक महीने से अधिक समय तक बनाए रखा जा सकता है। हालांकि भ्रूण चूहा एससीजी न्यूरॉन्स वीवो में 5-8 dendrites के साथ बहुध्रुवीय हैं; सीरम मुक्त परिस्थितियों में, ये न्यूरॉन्स संस्कृति में केवल एक ही अक्षतंख का विस्तार करते हैं और संस्कृति की अवधि के लिए एकध्रुवीय बने रहते हैं। हालांकि, इन न्यूरॉन्स को बेसमेंट झिल्ली निकालने, बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपीएस), या 10% भ्रूण बछड़े सीरम की उपस्थिति में dendrites का विस्तार करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। इन समरूप न्यूरोनल संस्कृतियों का उपयोग इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए किया जा सकता है। यह पेपर इन न्यूरॉन्स में माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन-2 (एमएपी-2) के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला करने के लिए और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए न्यूरोनल अर्क तैयार करने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का भी वर्णन करता है।

Introduction

भ्रूणीय बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलिया (एससीजी) से प्राप्त सहानुभूति न्यूरॉन्स व्यापक रूप से विकास कारक निर्भरता सहित तंत्रिका विकास के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृति प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया है, न्यूरॉन-टारगेट इंटरैक्शन, न्यूरोट्रांसमीटर सिग्नलिंग, एक्सोनल ग्रोथ, डेंड्राइट डेवलपमेंट एंड प्लास्टिसिटी, सिनैप्टोजेनेसिस और सिग्नलिंग मैकेनिज्म अंतर्निहित तंत्रिका-लक्ष्य/न्यूरॉन-ग्लिया इंटरैक्शन1,,2,,3,,4,,5,,6,7,,8,,9., उनके छोटे आकार (लगभग 10000 न्यूरॉन्स/गैंगलिया) के बावजूद, इस संस्कृति प्रणाली के विकास और व्यापक उपयोग के तीन मुख्य कारण हैं) सहानुभूति श्रृंखला में पहला गैंगलिया होने के नाते, वे बड़े हैं, और इसलिए बाकी सहानुभूति गैंगलिया10की तुलना में अलग करना आसान है; ii) केंद्रीय न्यूरॉन्स के विपरीत, एससीजी में न्यूरॉन्स तंत्रिका शिखा से प्राप्त होने वाले सभी न्यूरॉन्स के साथ काफी सजातीय हैं, एक समान आकार वाले, तंत्रिका विकास कारक पर निर्भरता और न ही-एड्रेनेर्जिक। यह उन्हें रूपात्मक और जीनोमिक अध्ययन10, 11,11 और iii के लिए एक मूल्यवान मॉडल बनाता है) इन न्यूरॉन्स को एक परिभाषित सीरम-मुक्त माध्यम में बनाए रखा जा सकता है जिसमें तंत्रिका विकास कारक एक महीने से अधिक10,,12के लिए है। डेन्ड्राइट्स2की दीक्षा और रखरखाव में अंतर्निहित तंत्रों का अध्ययन करने के लिए प्रसवकालीन एससीजी न्यूरॉन्स का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। इसका मुख्य कारण यह है कि, हालांकि एससीजी न्यूरॉन्स में वीवो में एक व्यापक डेंड्रिटिक आर्बर होता है, वे सीरम की अनुपस्थिति में विट्रो में dendrites का विस्तार नहीं करते हैं, लेकिन हड्डी मॉर्फोजेटिक,प्रोटीन2, 12,,13जैसे कुछ विकास कारकों की उपस्थिति में dendrites विकसित करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है।13

यह कागज भ्रूण चूहे एससीजी न्यूरॉन्स को अलग करने और बनाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। पिछले 50 वर्षों में, एससीजी से प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों का उपयोग मुख्य रूप से बड़े पैमाने पर जीनोमिक या प्रोटेओमिक परिवर्तनों की जांच करने वाले सीमित संख्या में अध्ययनों के साथ रूपात्मक अध्ययनों के लिए किया गया है। यह मुख्य रूप से छोटे ऊतक आकार के कारण होता है जिसके परिणामस्वरूप डीएनए या प्रोटीन की कम मात्रा में अलगाव होता है, जिससे इन न्यूरॉन्स पर जीनोमिक और प्रोटेओमिक विश्लेषण करना मुश्किल हो जाता है। हालांकि, हाल के वर्षों में, बढ़ी हुई पहचान संवेदनशीलता ने डेंड्रिटिक,विकास विकास14, 15, 16, 17के दौरान एससीजी न्यूरॉन्स मेंजीनोम,15,16मिरनोम और प्रोटेम की जांच करने के तरीकों के विकास को सक्षम बनाया है।17 यह पेपर इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग करके इन न्यूरॉन्स के रूपात्मक विश्लेषण के लिए विधि और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण के लिए न्यूरोनल प्रोटीन अर्क प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल का भी वर्णन करेगा।

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Protocol

जानवरों से जुड़े अध्ययनों में की गई सभी प्रक्रियाओं को कैलिफोर्निया के सेंट मैरी कॉलेज में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था । सेंट मैरी कॉलेज में पशु देखभाल और उपयोग दिशानिर्देश राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (https://olaw.nih.gov/sites/default/files/PHSPolicyLabAnimals.pdf और https://olaw.nih.gov/sites/default/files/Guide-for-the-Care-and-Use-of-Laboratory-Animals.pdf) में प्रयोगशाला पशु कल्याण कार्यालय द्वारा प्रदान किए गए दिशा-निर्देशों के आधार पर विकसित किए गए थे ।

1. संस्कृति मीडिया की तैयारी (जिसे नियंत्रण माध्यम भी कहा जाता है)

  1. निम्नलिखित सामग्री जोड़ें, नीचे सूचीबद्ध आदेश में, एक बाँझ 500 एमएल फ्लास्क में: 1x कम ग्लूकोज डीएमईएम के 190 एमएल, डीएमईएम में 20 मिलीग्राम/एमएल फैटी एसिड फ्री बोजातीय सीरम एल्बुमिन (एफएएफ-बीएसए) के 10 एमएल, 200 m L-ग्लूटामाइन का 2.8 एमएल, 100x इंसुलिन-सेलेनियम-ट्रांसफरिन मिश्रण का 4 एमएल, 125 माइक्रोग्राम/एमएल नर्व ग्रोथ फैक्टर (डीएमईएम में 0.2% अक्रिय प्रोटीन स्टेबलाइजर) का 0.4 एमएल, और हैम के एफ-12 मीडियम का 200 एमएल।
  2. पिपेट में प्रोटीन के चिपके रहने से रोकने के लिए इंसुलिन-सेलेनियम-ट्रांसफरिन और एनजीएफ जैसे प्रोटीन युक्त समाधानों को जोडऩे से पहले एफएएफ-बीएसए युक्त माध्यम के साथ पिपेट को कोट करना सुनिश्चित करें।
  3. प्रत्येक अतिरिक्त के बाद सामग्री मिश्रण करने के लिए फ्लास्क भंवर। एफ-12 के अलावा के बाद 25 एमएल पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिलाएं।
  4. 10 एमएल एलिकोट्स में संस्कृति मीडिया को अलीकोट करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एलिकोट्स को गतिविधि के नुकसान के बिना छह महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।

2. न्यूरॉन्स को बनाने के लिए प्लेटों की तैयारी

  1. पॉली-डी-lysine के 1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक को पतला करें (0.5 एम ट्रिस बफर, पीएच 8 में बनाया गया) बाँझ आसुत पानी के साथ 100 μg/mL।
  2. प्रोटेओमिक या जीनोमिक विश्लेषण के लिए, विच्छेदन से एक से दो दिन पहले, पॉली-डी-lysine (पीडीएल) के बाँझ 100 ग्राम/एमएल के लगभग 2 एमएल के साथ कोट 6-वेल प्लेटें। यह अच्छी तरह से सेल आसंजन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। प्लेटों को चिपकने वाली फिल्म से लपेटें और प्लेटों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. रूपात्मक विश्लेषण और माइक्रोस्कोपी के लिए, 24-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में12 मिमी 2 पूर्व-इलाज जर्मन ग्लास कवरस्लिप (जिसे नाइट्रिक एसिड उपचार का उपयोग करके साफ किया जा सकता है जैसा कि पहले18 या खरीदा गया है) रखें।
    1. पॉली-डी-lysine (पीडीएल) के बाँझ 100 ग्राम/एमएल के 0.3 एमएल के साथ कवरस्लिप कोट करें। प्लेटों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. विच्छेदन के दिन, विच्छेदन शुरू होने से पहले, कुओं से पॉली-डी-lysine समाधान को हटा दें और बाँझ आसुत पानी के साथ पांच बार कुओं को कुल्ला करें, इसके बाद एक बार कम ग्लूकोज डीएमईएम के साथ।
  5. गैंगलिया के एंजाइमेटिक पाचन के दौरान (कोशिकाओं को चढ़ाना से लगभग एक घंटे पहले), प्लेटों से डीएमईएम को हटाएं और इसे नियंत्रण मीडिया के 0.3 एमएल से बदल दें। एक आर्द्र कक्ष में 5% सीओ2 के तहत 35.5 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को स्टोर करें।

3. विच्छेदन सेटअप

  1. विच्छेदन के लिए मीडिया की 200 एमएल की तैयारी (विच्छेदन मीडिया के रूप में संदर्भित)
    1. कम ग्लूकोज डीएमईएम (1 मिलीग्राम/एमएल ग्लूकोज के साथ) में 20 मिलीग्राम/एमएल फैटी एसिड-फ्री गोजातीय सीरम एल्बुमिन (एफएएफ-बीएसए) के 8 एमएल और 100x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के 2 एमएल को बाँझ लीबोविट्ज के एल-15 माध्यम (या किसी भी एयर-बफर मध्यम) के 193 एमएल में जोड़ें
  2. हुड में, विच्छेदन के लिए निम्नलिखित वस्तुओं को सेट करें: प्रत्येक ट्यूब में विच्छेदन मीडिया के लगभग 20 एमएल के साथ चार 50 एमएल बाँझ शंकु ट्यूब, विच्छेदन मीडिया के 1.5 एमएल के साथ चार बाँझ 35 मिमी व्यंजन, एक बाँझ 50 एमएल शंकु नली अपकेंद्रण के लिए विच्छेदन मीडिया के 20 एमएल के साथ, गंगलिया को अपकेंद्री के लिए एक बाँझ 15 एमएल शंकु नली , और अलग कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक बाँझ 10 एमएल ट्यूब।
  3. कम से कम एक मिनट के लिए ठीक संदंश (नंबर 4 या नंबर 5 संदंश) की एक जोड़ी को निष्फल करने के लिए एक सूखे मनका स्टरलाइजर का उपयोग करें।

4. भ्रूण चूहे पिल्ले से बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलिया का अलगाव

  1. गर्भवती चूहे से E21 भ्रूण को हटाने
    नोट: गर्भाशय सींग को हटाने के हुड के बाहर किया जा सकता है अगर आसपास के क्षेत्र अच्छी तरह से निष्फल है ।
    1. सीओ2 साँस लेना का उपयोग कर गर्भवती चूहे इच्छामृत्यु। पेट के क्षेत्र से फर कतरनी और इसे बंध्याकरण करने के लिए 70% शराब के साथ क्षेत्र में त्वचा को पोंछें।
    2. बाँझ कैंची और संदंश के एक ताजा सेट का उपयोग करना, त्वचा के माध्यम से कटौती और फिर मांसपेशियों की परत भ्रूण युक्त गर्भाशय सींग का पर्दाफाश करने के लिए । इस प्रक्रिया में आंतों को नुकसान न पहुंचाने के लिए ध्यान रखते हुए कैंची और संदंश के एक नए सेट का उपयोग कर भ्रूण के साथ गर्भाशय सींग निकालें।
    3. भ्रूण के साथ गर्भाशय सींग को 150 मिमी2 बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और उन्हें हुड में स्थानांतरित करें।
    4. संदंश और कैंची के एक नए सेट का उपयोग करना, गर्भाशय सींग से भ्रूण को हटा दें और भ्रूण को एमनियोटिक झिल्ली और प्लेसेंटा से अलग करें।
    5. भ्रूण को इच्छामृत्यु के लिए, दाहिने हाथ के नीचे मिडलाइन के साथ भ्रूण की रीढ़ की हड्डी काटें। इससे एससीजी को हटाने के दौरान कैरोटिड धमनी से होने वाले रक्तस्राव में भी कमी आएगी।
    6. इन भ्रूणों को विच्छेदन मीडिया युक्त तैयार 50 एमएल शंकु नलियों में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि भ्रूण मीडिया में डूबे हुए हैं। प्रत्येक ट्यूब 3 भ्रूण तक पकड़ कर सकते हैं।
  2. भ्रूण से बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलियन का अलगाव
    1. विच्छेदन मीडिया से एक पिल्ला को बाँझ 150 मिमी2 पेट्री डिश पर स्थानांतरित करें, जो सब्सट्रेट पर इसकी पृष्ठीय सतह के साथ ठोस सब्सट्रेट (या तो पैराफिन मोम या सिलिकॉन पॉलिमर) से भरा हुआ है। तीन बाँझ 23 जी सुइयों का उपयोग करना, प्रत्येक हाथ के नीचे एक सुई के साथ पकवान के लिए पिल्ला पिन और मुंह के माध्यम से एक तिहाई सुई ध्यान से गर्दन हाइपरएक्सटेंड ।
    2. गर्दन क्षेत्र में त्वचा के माध्यम से बाँझ ठीक संदंश (नंबर 4 या नंबर 5 संदंश) का उपयोग करके कट नीचे लार ग्रंथियों का पर्दाफाश करने के लिए। इन ग्रंथियों को ठीक संदंश का उपयोग करके हटा दें।
    3. क्रमशः क्लैविकल और ट्रेकिया के पास स्टर्नोकलेइडोमास्टोइड और ओमोहॉयइड मांसपेशियों का पता लगाएं। सबसे पहले ट्रांसवर्स स्टर्नोकलिडोमेस्टोइड मांसपेशियों को काटें और फिर बारीक संदंश का उपयोग करके पतली ओमोहॉयड मांसपेशी को ध्यान से काटें। एक बार इन मांसपेशियों को हटा दिया जाता है, पूर्वकाल अंत पर कैरोटिड धमनी में विभाजन श्वासनली के दोनों ओर दिखाई देगा, एससीजी कैरोटिड धमनी में इस कांटा के तहत स्थित है।
    4. बंद संदंश का उपयोग करना, एससीजी की कल्पना करने के लिए कैरोटिड धमनी को धीरे से उठाएं। एससीजी के दोनों ओर एक संदंश का उपयोग करके, कैरोटिड को खींचें और इसे तैयार बाँझ 35 मिमी2 व्यंजनों में स्थानांतरित करें। इस ऊतक में सबसे अधिक संभावना कैरोटिड धमनी के साथ एससीजी, नोडोज गैंगलिया के साथ वेगस तंत्रिका के साथ-साथ क्षेत्र में मांसपेशियों या वसा के अन्य खंडों में शामिल होंगे।
    5. विच्छेदन प्रक्रिया को दूसरी तरफ दोहराएं। नीचे उल्लिखित शेष विच्छेदन चरणों के साथ जारी रखने से पहले सभी भ्रूणों से एससीजी निकालें। ऊतक नमूनों के प्रसंस्करण की सुविधा के लिए 35मिमी 2 व्यंजनों में से दो के बीच अलग ऊतकों को वितरित करें।
  3. एससीजी के बाद प्रसंस्करण
    1. एससीजी को विच्छेदित ऊतकों से अलग करने के लिए, पहले कैरोटिड विभाजन के पास के क्षेत्र से बचने के लिए देखभाल करने के लिए वसा या मांसपेशियों जैसे किसी भी बाहरी ऊतक को हटाने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें।
    2. एक बार इन ऊतकों को हटा दिया गया है, दो गैंगलिया दिखाई दे रहे हैं। नोडोज गैंगलियन छोटा और गोलाकार होता है, जबकि एससीजी बादाम के आकार का होता है। धीरे-धीरे वैगस तंत्रिका पर खींचें और कैरोटिड से गैंगलिया को अलग करें और फिर एससीजी को कैरोटिड धमनी से अलग करें।
    3. एससीजी को घेरने वाले कैप्सूल को हटाने के लिए बारीक संदंश का उपयोग करें। एससीजी को एक नए 35 मिमी कल्चर डिश में स्थानांतरित करें। सभी विच्छेदित ऊतक नमूनों के साथ प्रक्रिया दोहराएं।
    4. कोट एक निष्फल, कपास विच्छेदन मीडिया के साथ कांच पिपेट प्लग करने के लिए पिपेट दीवारों का पालन करने से ऊतक को रोकने के लिए । विच्छेदन मीडिया को कोलेजे प्रकार II (1 मिलीग्राम/एमएल) /डिस्पास टाइप II (5 मिलीग्राम/एमएल) के साथ कैल्शियम और मैग्नीशियम-मुक्त एचबीएसएस में बाँझ 2 एमएल के साथ बदलने के लिए पिपेट का उपयोग करें, और ऊतकों को तोड़ने में मदद करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: इनक्यूबेशन समय कोलेजनेस/Dispase के विभिन्न बैचों के साथ अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है और आमतौर पर ४० मिनट से एक घंटे के लिए पर्वतमाला ।
    5. इनक्यूबेशन के दौरान, डीएमईएम को प्लेटों से हटा दें और इसे नियंत्रण मीडिया के 0.3 एमएल से बदल दें। एक आर्द्र कक्ष में 5% सीओ2 के तहत 35.5 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को स्टोर करें।
    6. इनक्यूबेशन के बाद, कोलेजनेस/डिस्पास में एससीजी को बाँझ 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। प्लेटों को कुल्ला करने और ट्यूब के समाधान को स्थानांतरित करने के लिए विच्छेदन मीडिया का उपयोग करें। मात्रा को लगभग 10 एमएल तक लाने के लिए पर्याप्त विच्छेदन मीडिया जोड़ें।
    7. नमूना गोली मारने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम (1000 - 1200 आरपीएम) पर सेंट्रलाइज। गोली को उखाड़ न फेंकने का ख्याल रखते हुए, सुपरनेट को एस्पिरेट करें। विच्छेदन मीडिया के 10 एमएल के साथ गोली को फिर से खर्च करें। अपकेंद्री दोहराएं और सुपरनेट को त्याग दें।
    8. संस्कृति माध्यम के 1 - 2 एमएल के साथ बदलें। एक संकीर्ण-बोर, तुला-टिप बाँझ पाश्चर पिपेट (संस्कृति माध्यम के साथ पूर्व-लेपित) का उपयोग करके, यांत्रिक रूप से 5-6 बार धीरे-धीरे ट्रिट करके झुरमुट को अलग करें। बड़े झुरमुटों को लगभग एक मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें। सुपरनैंट सेल सस्पेंशन को एक नई 10 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    9. एससीजी के लगभग पूर्ण वियोजन सुनिश्चित करने के लिए हर बार ट्रिट्यूशन के बढ़ते बल के साथ इस प्रक्रिया को 3 बार दोहराएं। 10 एमएल ट्यूब के प्रत्येक दौर के बाद सुपरनेट को पहले ट्रिट्यूशन से सुपरनेट के साथ स्थानांतरित करें।
    10. मात्रा को 8 - 10 एमएल तक लाने के लिए पर्याप्त संस्कृति मीडिया जोड़ें। धीरे-धीरे सेल सस्पेंशन मिलाएं और सेल डेंसिटी को हीमोसाइटोमीटर से मात्रा दें।
    11. प्रयोगों के लिए उपयुक्त सेल घनत्व पर कुओं में सेल निलंबन वितरित करें। कुओं में कोशिकाओं का वितरण सुनिश्चित करने के लिए चढ़ाना प्रक्रिया के दौरान लगातार सेल निलंबन मिलाएं।
      नोट: रूपात्मक विश्लेषण के लिए, ८,००० कोशिकाओं के आसपास कोशिकाओं प्लेट/अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से प्लेटों में और जीनोमिक और प्रोटेओमिक प्रोटोकॉल के लिए, ३०,००० कोशिकाओं के रूप में उच्च के रूप में कोशिकाओं प्लेट/
    12. प्लेटों को एक आर्द्रीकृत कक्ष बनाने के लिए नीचे बाँझ पानी के साथ एक ग्लास डेसीकेटर में स्थानांतरित करें। सीलिंग से पहले, डिसिकेटर में5% सीओ 2 वातावरण प्राप्त करने के लिए पर्याप्त सीओ 2 (लगभग120 एमएल) इंजेक्ट करें। प्लेटों को 35.5 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। इसे प्रोटोकॉल में 0 दिन के रूप में जाना जाता है।
      नोट: इन प्लेटों को नियमित रूप से 5% CO2 इनक्यूबेटर में भी बनाए रखा जा सकता है। ऊपर वर्णित विधि तापमान और पीएच परिवर्तन को कम करती है और क्रॉस-संदूषण को रोकने में भी मदद करती है।

5. सुसंस्कृत एससीजी न्यूरॉन्स और उपचार का रखरखाव

  1. दिन 1 (चढ़ाना के बाद 24 घंटे), ध्यान से संस्कृति मीडिया के आधे को हटा दें, और 2 μM आरा-सी (साइटोसाइन-डी-अरेबिनोफुरानोसाइड, एक एंटी-माइटोटिक एजेंट) के साथ बदलें। 48 घंटे के लिए कोशिकाओं पर उपचार छोड़ दें। आमतौर पर, उपचार की यह लंबाई संस्कृति में गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को खत्म करने के लिए पर्याप्त है।
  2. 3 दिन पर, धीरे से आधे माध्यम आकांक्षी और नियंत्रण माध्यम के साथ बदलें ।
  3. 4 दिन, कोशिकाओं प्रयोगात्मक उपचार के लिए तैयार हैं । उचित माध्यम के साथ हर दूसरे दिन संस्कृतियों को खिलाएं, धीरे-धीरे आधे माध्यम को ताजा माध्यम के साथ अच्छी तरह से बदल दें।
  4. सीरम मुक्त माध्यम में सुसंस्कृत एससीजी न्यूरॉन्स केवल अक्षतंश का विस्तार करते हैं। यदि प्रयोगों के लिए dendrites की उपस्थिति की आवश्यकता होती है, तो या तो 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 75-100 μg/ml तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स निकालने या हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन-7 के ५० एनजी/एमएल के साथ कोशिकाओं का इलाज करें । उपचार के एक सप्ताह के भीतर मनाए गए विस्तृत डेंड्रिटिक आर्बर के साथ उपचार के 48 घंटों के भीतर डेंड्रिटिक विकास मनाया जाता है।

6. इम्यूनोस्टेपिंग सुसंस्कृत एससीजी न्यूरॉन्स

  1. धीरे-धीरे 0.1 एम फॉस्फेट बफर में 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ सेल कल्चर मीडियम को बदलें, पीएच 7.2 एक धूम हुड में।
    1. आधी संस्कृति मीडिया को अच्छी तरह से हटा दें और इसे धीरे से 4% पैराफॉर्मलडिहाइड से बदलें। फिर, इस प्रक्रिया को कम से कम दो बार दोहराएं, हर बार दो-तिहाई मीडिया को अच्छी तरह से हटा दें और 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के साथ बदलें। इस प्रक्रिया के अंत में, कुएं में मीडिया का रंग गुलाबी से रंगहीन में बदल जाना चाहिए था।
    2. एक बार सभी माध्यम को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है, कमरे के तापमान पर 15 -20 मिनट के लिए कुओं को इनक्यूबेट करें।
  2. ऊपर वर्णित इसी तरह की प्रक्रिया के साथ, धीरे-धीरे 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान को फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस), पीएच 7.2 के साथ बदलें। 5 मिनट के लिए छोड़ दें। पीबीएस के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए दो बार कुओं कुल्ला ।
    1. एक बार 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड को हटा दिया जाता है, तो प्लेटों को आगे की प्रक्रिया के लिए बेंचटॉप पर ले जाएं। यह कदम एक अच्छा रोक बिंदु है जहां प्लेटों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. सभी पीबीएस निकालें। कोशिकाओं को कवर करने के लिए पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स-100 की पर्याप्त मात्रा जोड़ें। न्यूरॉन्स को पार करने के लिए इसे 5 मिनट के लिए संस्कृतियों पर छोड़ दें। कोशिकाओं की अखंडता को बनाए रखते हुए अच्छा धुंधला सुनिश्चित करने के लिए इस कदम का समय महत्वपूर्ण है।
  4. ट्राइटन एक्स-100 समाधान को ध्यान से हटा दें और पीबीएस के साथ हर बार 5 मिनट के लिए तीन बार कुओं को कुल्ला करें। पीबीएस समाधान निकालें।
  5. पीबीएस में पर्याप्त 5% बीएसए जोड़ें कोशिकाओं को कवर करने और गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी को कम करने के लिए 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  6. अवरुद्ध समाधान निकालें और इसे पीबीएस में 5% बीएसए में पतला मानचित्र-2 प्रोटीन के खिलाफ माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी से बदलें। कोशिकाओं पर प्राथमिक एंटीबॉडी को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
  7. पुन: उपयोग के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी को निकालें और सहेजें। प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने की तीव्रता के नुकसान के बिना कम से कम दो बार पुन: इस प्रकार किया जा सकता है।
  8. कोशिकाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला। पीबीएस को कोशिकाओं पर 10 मिनट प्रति कुल्ला के लिए छोड़ दें।
  9. पीबीएस समाधान निकालें और इसे फ्लोरोसेंट टैग-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 1:1000 कमजोर पड़ने पर PBS में 5% बीएसए में बदलें। कमरे के तापमान पर अंधेरे में 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  10. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और इसे पीबीएस के साथ बदलें। कुल्ला प्रति 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तीन बार कुओं कुल्ला। किसी भी लवण को हटाने के लिए कुओं को एक बार पानी से कुल्लाएं।
  11. जलीय माउंटेंट की एक बूंद है कि फ्लोरोसेंटी लेबल नमूनों के लिए उपयुक्त है युक्त कांच स्लाइड पर कवरस्लिप माउंट। इमेजिंग के लिए तैयार होने तक स्लाइड फ़ोल्डर में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर करें।

7. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके प्रोटेम के विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी

  1. सुसंस्कृत न्यूरॉन्स की लाइसिस
    1. धीरे-धीरे कुओं में सभी संस्कृति मीडिया को हटा दें। इसे ठंड, बाँझ कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस), पीएच 7.4 से बदलें। जल्दी निकालें और पीबीएस के साथ बदलें और इसे 5 मिनट के लिए बैठने दें। यह कदम संस्कृति मीडिया में मौजूद किसी भी प्रोटीन को दूर करने के लिए किया जाता है।
    2. किसी खास इलाज के लिए सभी कुओं से सभी पीबीएस को सावधानी से हटा दें। इस प्रक्रिया को एक बार और दोहराएं। न्यूरोनल क्षति और प्रोटियोलिसिस को कम करने के लिए कोशिकाओं को लाइस करते समय बर्फ पर प्लेटें बनाए रखें।
    3. 100 - 50 mm अमोनियम बाइकार्बोनेट के 150 माइक्रोन जोड़ें, पीएच 7.5 (एनएच4एचसीओ3)कुओं में से एक और एक बाँझ सेल स्क्रैपर का उपयोग कर कोशिकाओं को परिमार्जन। माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, तरल को स्थानांतरित करें और एक विशेष उपचार के लिए सभी कुओं के साथ स्क्रैपिंग प्रक्रिया दोहराएं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि अधिकांश कोशिकाओं को हटा दिया गया है, खुरचने के बाद माइक्रोस्कोप के नीचे कुओं की जांच करें।
      1. न्यूरॉन्स की कम संख्या के साथ, प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए उच्च पर्याप्त एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को lyse करने के लिए एक सीमित मात्रा का उपयोग करें।
    4. सेल लाइसिस के साथ मदद करने के लिए रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर समाधान फ्रीज करें। इस स्तर पर आगे की प्रक्रिया के लिए तैयार होने तक lysates को संग्रहीत किया जा सकता है।
    5. एक बार गल जाने के बाद, कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से lyse करने के लिए 26 जी या 28 जी सुई के साथ एक सिरिंज के माध्यम से नमूनों को धार ।
    6. 10 मिनट के लिए दो बार एक सोनिकिंग पानी स्नान में नमूनों को सोनिकेट करें। प्रोटीन के ओवरहीटिंग और डेनैचेशन को रोकने के लिए पानी के स्नान में बर्फ जोड़ें। 12,000 x ग्रामपर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज।
    7. प्रोटीन एकाग्रता को मापें। विशिष्ट प्रोटीन सांद्रता 0.4 से लेकर - 1 μg/
  2. प्रोटेम विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी और ट्राइप्सिन पाचन
    1. एक DNase-, RNase-और प्रोटीज मुक्त 1.5 एमएल ट्यूब में प्रोटीन की अधिकतम 60 माइक्रोन स्थानांतरित करें। यदि lysate की मात्रा 60 माइक्रोन से कम है, तो वॉल्यूम बनाने के लिए पर्याप्त 50 एमएल अमोनियम बाइकार्बोनेट जोड़ें।
    2. 0.2% एसिड लैबिल सर्फेक्टेंट और भंवर के 25 माइक्रोन जोड़ें। 15 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक ब्लॉक हीटर में ट्यूब इनक्यूबेट। 30 एस के लिए 12,000 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें।
    3. 100 m m m dithiothreitol और भंवर के 2.5 माइक्रोन जोड़ें। यह एल्किलेशन और पाचन के लिए प्रोटीन को अधिक सुलभ बनाता है। 30 मिनट के लिए एक ब्लॉक हीटर में 60 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब इनक्यूबेट। कमरे के तापमान और अपकेंद्रित्र के लिए शांत।
    4. नमूना और भंवर में 300 m m iodoacetamide के 2.5 माइक्रोन जोड़ें। यह कदम साइस्टीन को एल्किलेट करने में मदद करता है और उन्हें डिसल्फाइड बॉन्ड्स में सुधार करने से रोकता है । 30 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    5. एक ट्राइप्सिन पर ट्यूब में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री ग्रेड ट्राइप्सिन (0.5 माइक्रोग्राम/माइक्रोन) जोड़ें: 1:10 का प्रोटीन अनुपात। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को पचाें।
    6. 5% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) और भंवर के 10 माइक्रोन जोड़ें। नमूनों को 90 मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यह कदम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के दौरान हस्तक्षेप को रोकने के लिए एसिड लैबाइल सर्फेक्टेंट को हाइड्रोलाइज करने के लिए आवश्यक है।
    7. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 x ग्राम पर नमूनों को अपकेंद्रित्र करें और प्री स्लिट टेफ्लॉन/सिलिकॉन पट कैप्स के साथ क्रोमेटोग्राफी प्रमाणित स्पष्ट ग्लास शीशी में सुपरनैटेंट स्थानांतरित करें। नमूनों को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    8. उच्च परिभाषा द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी के लिए नमूना शीशियों के अधीन।

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Representative Results

भ्रूण एससीजी न्यूरॉन्स की न्यूरोनल संस्कृतियों को अलग और बनाए रखना
चूहे भ्रूण एससीजी से अलग कोशिकाओं को पॉली-डी-lysine लेपित प्लेट या कवरस्लिप में चढ़ाया गया था और सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया में बनाए रखा गया था जिसमें बी-तंत्रिका विकास कारक होता है। न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं के मिश्रण वाले अलग कोशिकाएं चढ़ाना(चित्रा 1 ए)पर परिपत्र देखती हैं। चढ़ाना के 24 घंटे के भीतर, न्यूरॉन्स ग्लियल कोशिकाओं को सपाट और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी(चित्रा 1B)के तहत चरण-अंधेरे प्रदर्शित होने के साथ छोटे अक्षीय प्रक्रियाओं का विस्तार करते हैं । आरा-सी के साथ उपचार के बाद, ग्लियल कोशिकाओं का 99% समाप्त हो जाता है और संस्कृतियों में मुख्य रूप से एक अंडाकार कोशिका शरीर, व्यापक अक्षीय विकास और कोई dendrites(चित्रा 1C)के साथ न्यूरोनल कोशिकाएं होती हैं।

सुसंस्कृत भ्रूण चूहा बेहतर ग्रीवा गैंगलिया न्यूरॉन्स के इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला
पिछले अध्ययनों से पता चला है कि सीरम मुक्त माध्यम में उगाए गए सुसंस्कृत सहानुभूति न्यूरॉन्स केवल अक्षों का विस्तार करते हैं और केवल तहखाने झिल्ली निकालने, 10% सीरम या 50 एनजी/एमएल बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन-7 (बीएमपी-7)2,,12की उपस्थिति में एक विस्तृत डेंड्रिटिक आर्बर का विस्तार करते हैं। इन टिप्पणियों के साथ समझौते में, चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी से पता चलता है कि बीएमपी-7 (50 एनजी/एमएल) की उपस्थिति में 5 दिनों के लिए बड़े न्यूरॉन्स में सीरम-मुक्त नियंत्रण मीडिया(चित्रा 2)में उगाए गए न्यूरॉन्स की तुलना में कई मोटी पतला प्रक्रियाओं के साथ एक चपटा सेल शरीर होता है। डेनड्राइट्स के रूप में इन प्रक्रियाओं की पहचान की पुष्टि एमएपी-2 की उपस्थिति से होती है, जो मुख्य रूप से कोशिका शरीर में पाए जाने वाले साइटोस्केलेल प्रोटीन और डेन्ड्रिट्स19,,20में पाया जाता है। नियंत्रण की स्थिति में, मानचित्र-2 के लिए फ्लोरोसेंट धुंधला साइटोप्लाज्म और समीपस्थ अक्षों के भीतर मनाया जाता है और नाभिक से बाहर रखा जाता है (जैसा कि नाभिक(चित्रा 3ए-3 डी)की कल्पना करने के लिए परमाणु दाग के साथ सह-लेबलिंग द्वारा सबूत दिया जाता है। बीएमपी-7 के साथ 5 दिनों के लिए 50 एनजी/एमएल पर उपचार के बाद, एमएपी-2 के लिए इम्यूनोरेएक्टिविटी न केवल साइटोप्लाज्म में बल्कि डेंड्राइट्स(चित्रा 3ई-3H)में भी देखी जाती है।

नियंत्रण मीडिया में उगाए गए सुसंस्कृत एससीजी न्यूरॉन्स का नमूना प्रोटेओमिक विश्लेषण
E21 चूहा सहानुभूति न्यूरॉन्स नियंत्रण मीडिया में 6 दिनों के लिए विट्रो, lysed और एलसी-एमएस विश्लेषण के अधीन सुसंस्कृत थे । नमूना बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर पर तीन प्रतिकृति में चलाया गया था और प्रोटीन प्रत्येक नमूने के लिए मनाया खंडित पेप्टाइड्स की संख्या के आधार पर पहचान की गई । प्रोटीन की बहुतायत (0 से 300000 से अधिक मनमाने ढंग से इकाइयों को लेकर) और प्रत्येक प्रोटीन (5 -500 से लेकर) के लिए मनाए गए खंडित पेप्टाइड्स की संख्या के आधार पर प्रोटीन आईडी के लिए आत्मविश्वास स्कोर की गणना की गई थी। सीरम-मुक्त नियंत्रण मीडिया में सुसंस्कृत एससीजी न्यूरॉन्स से 30 माइक्रोन प्रोटीन के प्रोटेम के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण से सेट एक नमूना डेटा चित्र 4में दिखाया गया है ।

नमूने में 13, 134 पेप्टाइड्स का पता चला जो 1287 प्रोटीन से मेल खाती थी। इनमें से, 1100 जिनमें से सभी तीन तकनीकी प्रतिकृति में 500 से अधिक सामान्यीकृत बहुतायत मूल्यों के साथ मौजूद थे। इन ११०० प्रोटीन में से ९० प्रोटीन की पहचान एक ही पेप्टाइड हिट की मौजूदगी से की गई, जिसमें केवल प्रोटीन के एक छोटे से हिस्से को कवर किया गया । इसलिए, यह निर्धारित करना मुश्किल था कि पहचान सही थी और इन प्रोटीनों में कम प्रोटीन कॉन्फिडेंस स्कोर (स्कोर & 10) था । इन प्रोटीनों को विश्लेषण से समाप्त कर दिया गया था और शेष १०१० प्रोटीन को जीन ऑन्टोलॉजी का उपयोग करके यह निर्धारित करने के लिए और विश्लेषण किया गया था कि प्रोटोकॉल विभिन्न स्थानीयकरण और कार्य के साथ प्रोटीन का पता लगाने में सफल रहा था या नहीं ।

इस डेटासेट का जीन ऑन्टोलॉजी विश्लेषण पैंथर वर्गीकरण डेटाबेस (http://www.pantherdb.org/) का उपयोग करके यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि क्या इस डेटा सेट में विभिन्न सेलुलर स्थानीयकरण या आणविक और जैविक कार्यों के साथ प्रोटीन शामिल हैं और यह जांचने के लिए कि क्या पहचाने गए प्रोटीन और ज्ञात मार्गों के बीच कनेक्शन थे21। विश्लेषण से पता चला है कि हालांकि 700 से अधिक प्रोटीन साइटोप्लाज्मिक थे, उस डेटा सेट में प्रोटीन होते थे जो नाभिक, झिल्ली, कई सेलुलर ऑर्गेनेल्स और सेल जंक्शनों(चित्रा 4A)सहित कोशिका के अन्य क्षेत्रों में स्थानीयकृत थे। विश्लेषण से यह भी पता चला है कि ४०० से अधिक प्रोटीन उत्प्रेरक गतिविधि थी, और लगभग ३०० प्रोटीन संकेत रास्ते(चित्रा 4B और चित्रा 4C)में शामिल थे । इसके अलावा, डेटासेट में विभिन्न सिग्नलिंग रास्तों में शामिल प्रोटीन शामिल थे। तालिका 1 में जी-प्रोटीन सिग्नलिंग, सेल आसंजन, विकास कारक सिग्नलिंग पाथवे, और सिनेप्टिक वेसिकल ट्रैफिकिंग पाथवे में क्रमशः पांच प्रोटीन दिखाई देते हैं, जिनकी पहचान डेटासेट में की गई थी ।

Figure 1
चित्रा 1: समय के साथ सुसंस्कृत E21 चूहा भ्रूण एससीजी न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान में परिवर्तन। प्रतिनिधि चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी छवियों को 10x पर E21 चूहा एससीजी से 20 मिनट चढ़ाना(ए),चढ़ाना(बी)के बाद एक दिन और आरा-सी उपचार के ४८ घंटे के बाद (चढ़ाना के बाद 5 दिन)(सी)से अलग कोशिकाओं के आवर्धन । (बी)में ग्लियल कोशिकाओं (तीर) और अक्षीय विस्तार (तीर सिर) की उपस्थिति पर ध्यान दें, और ग्लियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स की अनुपस्थिति(सी)में व्यापक अक्षीय विकास दिखा रही है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: बीएमपी-7 के साथ उपचार के बाद E21 चूहा एससीजी न्यूरॉन्स के न्यूरोनल आकृति विज्ञान में परिवर्तन। गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं के उन्मूलन के बाद, सुसंस्कृत एससीजी न्यूरॉन्स को 5 दिनों के लिए 50 एनजी/एमएल (बी) पर नियंत्रण मीडिया (ए) या बीएमपी-7 के साथ इलाज किया गया। प्रतिनिधि चरण कंट्रास्ट माइक्रोग्राफ (10x आवर्धन) नियंत्रण न्यूरॉन्स(ए)में एक्सॉन के साथ परिपत्र न्यूरोनल सेल शरीर दिखाते हैं और बीएमपी-7 (तीर, बी)के साथ इलाज किए जाने पर कई छोटे डेंड्राइट जैसी प्रक्रियाओं के साथ न्यूरॉन्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सुसंस्कृत भ्रूण चूहा सहानुभूति न्यूरॉन्स में मानचित्र-2 प्रोटीन के लिए इम्यूनोस्टेटिंग। गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं के उन्मूलन के बाद, सुसंस्कृत एससीजी न्यूरॉन्स को नियंत्रण मीडिया(ए-डी)या बीएमपी-7 के साथ 5 दिनों के लिए 50 एनजी/एमएल(ई-एच)पर इलाज किया गया और एमएपी-2 के खिलाफ माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोडांगित किया गया और परमाणु मार्कर के साथ सह-लेबल किया गया। माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन-2 (एमएपी-2)(सी, जी),एक परमाणु दाग(डी, एच)के साथ चरण विपरीत माइक्रोग्राफ(बी, एफ)और तीन चैनलों(ए, ई)का विलय के साथ न्यूरॉन्स के इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला दिखा प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ । माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन-2 के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला कोशिका शरीर और नियंत्रण न्यूरॉन्स(सी)के समीपस्थ अक्षों में मौजूद है और सेल शरीर में एमएपी-2 प्रोटीन और बीएमपी-7 उपचारित न्यूरॉन्स(जी)में dendrites के लिए धुंधला । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सुसंस्कृत E21 चूहा एससीजी न्यूरॉन्स के प्रोटेओम विश्लेषण में पहचाने गए प्रोटीन का वर्गीकरण और वितरण। 1100 प्रोटीन के लिए प्रोटीन की सीडी को पैंथर वर्गीकरण प्रणाली पर जीन ऑन्टोलॉजी विश्लेषण के अधीन किया गया था ताकि सेलुलर स्थानीयकरण(ए),सेलुलर फ़ंक्शन और जैविक प्रक्रियाओं के संबंध में निर्धारित डेटा में प्रोटीन के वितरण की जांच की जा सके, जिसमें वे प्रोटीन संरचना(सी)के आधार पर(बी)और आणविक कार्य वर्ग में शामिल थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ए) जैविक आसंजन में शामिल प्रोटीन
यूनिप्रोट परिग्रहण आईडी जीन नाम जीन प्रतीक
Q9Z1Y3 कैथेरिन-2 सीडीएच2
O35112 सीडी166 एंटीजन अलकैम
P49134 इंटीग्रिन बीटा-1 Itgb1
D3ZES7 प्लेक्सिन A4 प्लक्सना4
F1LP44 इंटीग्रिन सबयूनिट अल्फा एल इगल
ख) विकास कारक संकेत में शामिल प्रोटीन
P35213 14-3-3 प्रोटीन बीटा/अल्फा Ywhab
Q5BJ92 सेरीन/थ्रेनिन-प्रोटीन फॉस्फेट 4 उत्प्रेरक उपइकांव पीपीपी4सी
P47196 आरएसी - अल्फा सेरीन/थ्रेनोइन प्रोटीन काइनेज Akt1
P62994 ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर बाउंड प्रोटीन 2 जीआरबी2
P21708 मिटोजेन-सक्रिय प्रोटीन काइनेज 3 मैप3
ग) जी-प्रोटीन युग्मित सिग्नलिंग मार्ग में शामिल प्रोटीन
पी08753 ग्वानाइन न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग प्रोटीन जी (कश्मीर) सबयूनिट अल्फा Gnai3
D4ABV5 कैलोडुलिन-2 शांत2
P18266 ग्लाइकोजेन सिंथेस किनेस-3 बीटा Gsk3b
पी09456 सीएएमपी-निर्भर प्रोटीन काइनेज प्रकार I-अल्फा नियामक सबयूनिट प्रकर1ए
P53534 ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलाज़ पाइबब (मस्तिष्क रूप)
घ) सिनैप्टिक वेसिकल तस्करी में शामिल प्रोटीन
P47861 सिनैप्टोटैग्मिन-5 Syt5
P63045 वेसिकल से जुड़ी झिल्ली प्रोटीन 2 वैम्प2
P61265 सिंटैक्सिन-1बी Stx1b
Q63537 सिनेप्सिन-2 Syn2
P60881 Synaptosomal से जुड़े प्रोटीन 25 स्नैप25

तालिका 1: सुसंस्कृत चूहे भ्रूण एससीजी न्यूरॉन्स से प्रोटेम डेटा में पहचाने गए प्रतिनिधि प्रोटीन, जो उनके जैविक कार्यों द्वारा वर्गीकृत होते हैं। ११०० प्रोटीन के साथ प्रोटेम डेटा पैंथर वर्गीकरण प्रणाली का उपयोग कर जीन ऑन्टोलॉजी विश्लेषण के अधीन किया गया था । नीचे सूचीबद्ध शीर्ष पांच प्रोटीन चार जैविक रास्तों के लिए पहचाने जाते हैं ।

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Discussion

यह कागज भ्रूण चूहे पिल्ले के बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलिया से सहानुभूति न्यूरॉन्स को बनाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस मॉडल प्रणाली का उपयोग करने के फायदे यह हैं कि विकास कारकों के लिए एक समान प्रतिक्रिया प्रदान करने वाले न्यूरॉन्स की एक सजातीय आबादी प्राप्त करना संभव है, और चूंकि इन न्यूरॉन्स के लिए विकास कारक आवश्यकताओं को अच्छी तरह से चिह्नित किया गया है, इसलिए सीरम-मुक्त परिस्थितियोंकेतहत इन न्यूरॉन्स को परिभाषित मीडिया में विकसित करना संभव है। यद्यपि प्रोटोकॉल ई 21 चूहे पिल्ले से एससीजी को अलग करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है, इस प्रोटोकॉल का उपयोग ई 17 से ई-21 तक चूहे के पिल्ले से एससीजी के विच्छेदन के लिए और भ्रूणीय माउस एससीजी10,22,,23के विच्छेदन के लिए किया जा सकता है।, इस विच्छेदन प्रोटोकॉल का उपयोग प्रारंभिक चरणों में मामूली संशोधन के साथ एससीजी को प्रसवोत्तर चूहों से अलग करने के लिए भी किया जा सकता है। इन संशोधनों में सी-सेक्शन की आवश्यकता को समाप्त करना, कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग करके प्रसवोत्तर जानवरों की इच्छामृत्यु, और ७०% शराब में पिल्ले के विसर्जन द्वारा इच्छामृत्यु के बाद प्रसवोत्तर पिल्ले की नसबंदी, उन्हें विच्छेदन मीडिया में स्थानांतरित करने से पहले10। कैम्पनॉट कक्षों और माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों24, 25,25का उपयोग करके अक्षीय मार्गदर्शन, अक्षीय परिवहन और सिनेप्स गठन का अध्ययन करने के लिए भी इस न्यूरोनल कल्टिंग प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जा सकता है। इन न्यूरॉन्स को पृष्ठीय रूट गैंगलिया या स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स से न्यूरॉन्स इंटरैक्शन और न्यूरॉन का अध्ययन करने के लिए न्यूरॉन्स के साथ न्यूरॉन्स के साथ सह-संस्कारी भी किया जा सकता है - परिधीय तंत्रिका तंत्र26,27,28, 29,29में लक्षित बातचीत ।,,

इम्यूनोसाइटोकेमिकल अध्ययन के लिए सुसंस्कृत एससीजी न्यूरॉन्स का उपयोग अच्छी तरह से प्रलेखित है। कागज में वर्णित प्रोटोकॉल अधिकांश एंटीबॉडी के साथ काम करने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है। हालांकि, ऐसे एंटीबॉडी हैं जो परमाणु प्रोटीन का पता लगाते हैं जिन्हें निर्धारण प्रोटोकॉल और पारमेबिलाइजेशन प्रोटोकॉल में संशोधन की आवश्यकता हो सकती है। फॉस्फो-एसएमैड एंटीबॉडी के मामले में, न्यूरॉन्स30,31 को ठीक करने और पार करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर100%मेथनॉल के साथ उपचार का उपयोग किया गया है।31

इस मॉडल प्रणाली में काम करने की मुख्य सीमाएं भ्रूण चूहे पिल्ले में एससीजी के छोटे आकार से उपजी हैं, जिसके परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स की छोटी संख्या होती है। इसके परिणामस्वरूप सीमित मात्रा में न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन होता है जिसे पिल्ले के एक कूड़े के विच्छेदन से प्राप्त किया जा सकता है। यह जीनोमिक और प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है, खासकर जब एक विच्छेदन में कई उपचारों के बीच तुलना करें। इसके अलावा, एक ही भ्रूण से एससीजी न्यूरोनल संस्कृतियों को प्राप्त करना संभव नहीं है। सभी प्रयोगों इसलिए एक कूड़े में सभी चूहा भ्रूण के एससीजी से प्राप्त कर रहे हैं कि पूल नमूनों पर किया जाता है। सिस्टम की एक और सीमा यह है कि एससीजी न्यूरॉन्स में कम डीएनए ट्रांसफैक्शन दक्षता (10 - 20%, अप्रकाशित अवलोकन) और केंद्रीय न्यूरॉन्स32की तुलना में ट्रांसफेक्शन के बाद उच्च विषाक्तता होती है। हालांकि यह ट्रांसफेक्शन दक्षता व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के साथ रूपात्मक अध्ययनों के लिए ठीक है, जीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों का पता लगाने/पुष्टि करने के लिए आणविक या जैव रासायनिक अध्ययन करना मुश्किल है ।

हालांकि, हाल के वर्षों में, सुसंस्कृत एससीजी न्यूरॉन्स का उपयोग डेंड्रिटिक विकास में अंतर्निहित तंत्रों की जांच करने के लिए और ट्रांसक्रिप्टोम और मिरनोम के विश्लेषण के लिए अध्ययन के लिए किया गया है14,15,,33।, जैसा कि पहले संकेत दिया गया है, कम प्रोटीन मात्रा के कारण, भ्रूण एससीजी से सुसंस्कृत न्यूरॉन्स का उपयोग पहले प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए नहीं किया गया है। यह प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि परिणाम इस बात का सबूत प्रदान करते हैं कि नमूनों की कम एकाग्रता के साथ भी, वर्तमान उच्च परिभाषा द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणों का उपयोग इन न्यूरॉन्स पर प्रोटेओमिक अध्ययनों के लिए किया जा सकता है। हालांकि नमूना तैयारी प्रोटोकॉल यहां वर्णित एससीजी न्यूरॉन्स के लिए है, इस प्रोटोकॉल एलसी-एमएस विश्लेषण के लिए कम प्रोटीन एकाग्रता के साथ किसी भी नमूने की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक सीमा यह है कि प्रोटीन एकाग्रता या ट्राइप्सिन पाचन की दक्षता में छोटे बदलावों के परिणामस्वरूप अधूरा विखंडन हो सकता है और एलसी-एमएस द्वारा पता लगाया गया प्रोटीन की संख्या में नाटकीय कमी आ सकती है। इसलिए, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्रोटीन सांद्रता शुरू करने के रूप में प्रोटीन के 10:1 अनुपात के साथ ५० μg के करीब हैं: ट्रिप्सिन । इसके अलावा, कई फ्रीज-गल चक्रों को रोकने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री-ग्रेड ट्राइप्सिन को अलीकोट करना एक अच्छा अभ्यास है।

प्रोटोकॉल की एक और सीमा यह है कि प्रोटेम में केवल सीमित संख्या में ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन का पता चला था। जबकि एसिड लैबाइल सर्फेक्टेंट को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एक प्रभावी सर्फेक्टेंट दिखाया गया है, सुसंस्कृत कोशिकाओं पर पिछले अध्ययन में पाया गया कि ये सर्फेक्टेंट साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन की संख्या को थोड़ा बढ़ा सकते हैं और प्रोटेओमिक प्रोफाइल34में झिल्ली प्रोटीन को कम कर सकते हैं। इसके अलावा, यह सुझाव दिया गया है कि ट्राइप्सिन पाचन से पहले एलवाईएसएस-सी जैसे बैक्टीरियल एंडोपेप्टिडेस का उपयोग करते हुए पूर्व पाचन झिल्ली बंधे प्रोटीन के ट्राइप्सिन पाचन की दक्षता में सुधार कर सकता है और झिल्ली प्रोटीन के टुकड़ों को एलसी कॉलम35पर बनाए रखने से रोक सकता है।

संक्षेप में, यह पेपर सुसंस्कृत चूहे भ्रूण सहानुभूति न्यूरॉन्स को बढ़ाने और इन न्यूरॉन्स पर रूपात्मक और प्रोटेरोमिक अध्ययन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को सेंट मैरी कॉलेज ऑफ कैलिफोर्निया में फैकल्टी डेवलपमेंट फंड एंड समर रिसर्च प्रोग्राम ग्रांट द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक ों को भी डेविस में कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में डॉ पामेला Lein और यूसी बर्कले मास स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा में डॉ एंथनी Iavarone इन प्रोटोकॉल के विकास के दौरान उनकी सलाह के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । लेखक वीडियो उत्पादन और संपादन के साथ उनकी मदद के लिए कैलिफोर्निया के सेंट मैरी कॉलेज में कॉलेज कम्युनिकेशंस के कार्यालय में हेली नेल्सन का भी शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D nanoACQUITY Waters Corporation
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830
BMP-7 R&D Systems 354-BP
Bovine Serum Alumin Sigma-Aldrich 5470
Cell scraper Corning CLS-3010
Collagenase Worthington Biochemical 4176
Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates Fisher Scientific 07-200, 140675, 142475
Cytosine- β- D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C1768
D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) ATCC 30-2200
Dispase II Roche 4942078001
Distilled Water Thermo Fisher Scientific 15230
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
DMEM - Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11885
Fatty Acid Free BSA Calbiochem 126609 20 mg/mL stock in low glucose DMEM
Fine forceps Dumont no.4 and no.5 Ted Pella Inc 5621, 5622
Forceps and Scissors for Dissection Ted Pella Inc 1328, 1329, 5002
Glass coverlips - 12mm Neuvitro Corporation GG-12
Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated Thermo Fisher Scientific A32723
Ham's F-12 Nutrient Mix Thermo Fisher Scientific 11765
Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) Thermo Fisher Scientific 14185
Insulin-Selenium-Transferrin (100X) Thermo Fisher Scientific 41400-045
Iodoacetamide Sigma-Aldrich A3221
L-Glutamine Thermo Fisher Scientific 25030
Leibovitz L-15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
Mounting media for glass coverslips Thermo Fisher Scientific P36931, P36934
Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) BioLegend SMI 52
Nerve growth factor Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) BT5017 Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM
Paraformaldehye Spectrum Chemicals P1010
Penicillin-Streptomycin (100X) Thermo Fisher Scientific 15140
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P0899
Prionex Millipore 529600 10% solution, 100 mL
RapiGest SF Waters Corporation 186001861 5 X 1 mg
Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry Waters Corporation
Trifluoro acetic acid - Sequencing grade Thermo Fisher Scientific 28904 10 X 1 mL
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trypsin Promega or NEB V511A, P8101S 100 μg or 5 X 20 mg
Waters Total recovery vials Waters Corporation 186000385c

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तंत्रिका विज्ञान अंक 163 सुपीरियर सर्वाइकल गंगलिया इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटेओमिक्स सहानुभूति एससीजी न्यूरॉन्स भ्रूण
रूपात्मक और प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए भ्रूण सुपीरियर सर्वाइकल गंगलिया से चूहा सहानुभूति न्यूरॉन्स culturing
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Holt, M., Adams, B., Chandrasekaran, V. Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (163), e61283, doi:10.3791/61283 (2020).

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