Summary
Questo manoscritto descrive un metodo per registrazioni EEG video continue utilizzando elettrodi di profondità multipli in topi neonatali sottoposti a ipossia-ischemia.
Abstract
L'ischemia da ipossia è la causa più comune di convulsioni neonatali. I modelli animali sono cruciali per comprendere i meccanismi e la fisiologia alla base delle convulsioni neonatali e dell'ischemia da ipossia. Questo manoscritto descrive un metodo per il monitoraggio continuo dell'elettroencefalogramma video (EEG) nei topi neonatali per rilevare le convulsioni e analizzare lo sfondo EEG durante l'ischemia da ipossia. L'uso di video ed EEG in combinazione consente la descrizione della semiologia delle convulsioni e la conferma delle convulsioni. Questo metodo consente anche l'analisi degli spettrogrammi di potenza e delle tendenze del modello di sfondo EEG nel periodo di tempo sperimentale. In questo modello di ischemia ipossia, il metodo consente la registrazione EEG prima della lesione per ottenere una linea di base normativa e durante la lesione e il recupero. Il tempo totale di monitoraggio è limitato dall'incapacità di separare i cuccioli dalla madre per più di quattro ore. Sebbene in questo manoscritto abbiamo utilizzato un modello di convulsioni ipossico-ischemiche, questo metodo per il monitoraggio EEG video neonatale potrebbe essere applicato a diversi modelli di malattie e convulsioni nei roditori.
Introduction
L'encefalopatia ischemica ipossica (HIE) è una condizione che colpisce 1,5 neonati su 1000 all'anno ed è la causa più comune di convulsioni neonatali1,2. I neonati che sopravvivono sono a rischio di varie disabilità neurologiche come paralisi cerebrale, disabilità intellettiva ed epilessia3,4,5.
I modelli animali svolgono un ruolo fondamentale nella comprensione e nello studio della fisiopatologia dell'ipossia ischemia e delle convulsioni neonatali6,7. Un modello di Vannucci modificato viene utilizzato per indurre l'ischemia da ipossia (HI) al giorno 10 postnatale (p10)7,8. I cuccioli di topo di questa età si traducono neurologicamente approssimativamente nel termine completo neonato umano9.
Il monitoraggio video elettroencefalografico continuo (EEG) utilizzato in combinazione con questo modello di lesione consente un'ulteriore comprensione e caratterizzazione delle crisi ischemiche ipossiche neonatali. Studi precedenti hanno utilizzato vari metodi per analizzare le convulsioni neonatali nei roditori, tra cui registrazioni video, registrazioni EEG limitate e registrazioni EEG di telemetria10,11,12,13,14,15,16. Nel seguente manoscritto, discutiamo in profondità il processo di registrazione di video EEG continui nei cuccioli di topo durante l'ipossia-ischemia. Questa tecnica per il monitoraggio video continuo dell'EEG nei cuccioli di topo neonatale potrebbe essere applicata a una varietà di modelli di malattie e convulsioni.
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Protocol
Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Virginia.
1. Costruzione di elettrodi / costruzione di cavi
- Utilizzare un filo di acciaio inossidabile isolato unipolare (diametro nudo di 0,005 ", 0,008") per creare un elettrodo collegato con un connettore a presa femmina (connettore presa femmina 0,079).
- Utilizzare uno speciale cavo su misura per collegare gli animali all'amplificatore.
- Collegare un connettore maschio a 4 pin (connettore maschio 0,079") all'amplificatore operazionale (op-amp) a 4 canali di unità di guadagno corrispondente all'impedenza. Collegare un resistore da 10K ai fili che si collegano alla batteria da 9 V. Un filo di terra non collegato all'amplificatore operazionale funge da punto medio della batteria.
- Collegare un'estremità del cavo (AWG, 0,012" OD) all'amplificatore operazionale e collegare l'altra estremità del cavo all'amplificatore.
2. Chirurgia di impianto di elettrodi
- Anestetizzare il cucciolo (giorno 9 postnatale) con il 4-5% di isoflurano in una cappa a flusso verso il basso. Prima dell'inizio della procedura, iniettare i cuccioli con bupivacaina (0,02-0,05 ml, 0,25% di infiltrazione locale sottocutanea).
- Una volta che l'animale è immobile, trasferirlo in uno stadio stereotassico con un cono nasale. Usa il retro della barra dell'orecchio in quanto è morbido per tenere la testa ferma. A questa età, i cuccioli non hanno un orecchio completamente sviluppato per utilizzare l'estremità appuntita della barra dell'orecchio.
- Abbassare il flusso di isoflurano e mantenerlo al 2,5-3%. Tieni d'occhio la respirazione costante del cucciolo durante la procedura chirurgica. Pizzicare la coda per controllare la risposta al dolore e quindi procedere all'incisione.
- Sterilizzare l'area di incisione sul cranio con betadina e alcool (3 cicli di alternanza di iodio ed etanolo al 70%). Drappeggiare la parte del corpo circostante in modo tale che la regione dell'incisione sia visibile.
- Aprire il cuoio capelluto anteriormente-posteriore da leggermente sopra gli occhi e ritrarre circa 0,5 cm di pelle. Riposizionare la testa del mouse sullo stadio stereotassico in modo che la pelle tiri verso l'esterno esponendo il cranio.
- Applicare il perossido di idrogeno sul cranio usando un batuffolo di cotone e raschiare il cranio pulito usando una lama di bisturi. Il cranio è molto morbido; prestare attenzione durante il raschiamento.
- Applicare una goccia (circa 50 μL) di adesivo e stenderlo intorno all'area del cranio esposta utilizzando il suo applicatore. Esporre alla luce UV per 40 s per impostare l'adesivo.
- Misurate le coordinate utilizzando il bregma esposto come riferimento. Impiantare elettrodi bilateralmente nella regione CA1 dell'ippocampo [-3,5 mm Dorsale-Ventrale (DV), ±2 mm Mediale-Laterale (ML), -1,75 mm Profondità (D)] e bilateralmente nella corteccia parietale [-1,22 mm DV, ±0,5 mm ML, -1 mm D] e un elettrodo di riferimento nel cervelletto17. Utilizzare un ago da 32 G per creare un foro nella regione contrassegnata.
- Pulire il sangue dalla superficie del cranio. Elettrodi inferiori attaccati al connettore della presa femmina nel cervello con l'aiuto del braccio stereotassico e fissati in posizione con acrilico dentale. Impiantare l'elettrodo nel cervello. L'auricolare con connettore a presa si trova sulla parte superiore del cranio incollato insieme da acrilico dentale.
- Iniettare ketoprofene (5 mg/kg) per via sottocutanea nella regione interscapolare una volta fissato l'elettrodo. Rimetti i cuccioli con la madre.
NOTA: introdurre metà della lettiera con l'auricolare in una sola volta alla madre piuttosto che introdurli uno alla volta. Ciò impedirà alla madre di danneggiare l'auricolare del cucciolo.
3. Configurazione e registrazione EEG (baseline/pre-infortunio)
- Dopo 24 ore di recupero dopo l'impianto dell'elettrodo, posizionare ogni animale in una camera di plexiglas riscaldata (37 °C) su misura per la registrazione EEG. Questa camera servirà anche come camera per l'ipossia.
- Collegare i cuccioli nella camera a un sistema di monitoraggio video-EEG tramite un cavo flessibile (cavo op-amp personalizzato).
NOTA: con l'auricolare in posizione, i mouse sono liberamente mobili e non presentano differenze di comportamento. Una volta attaccati ai fili dell'elettrodo, i fili devono essere regolati all'interno del cavo della camera in modo da fornire la giusta quantità di allentamento in modo che il cucciolo possa muoversi liberamente in tutta la camera. - Digitalizza i dati EEG a 1000 Hz con guadagno 1K utilizzando un amplificatore erba. Rivedere il segnale EEG (filtro passa banda tra 3-70 Hz) in un secondo momento utilizzando un software (ad esempio, LabChart Pro).
- Registrare un EEG al basale pre-lesione per 30 minuti prima di disconnettere gli animali per la procedura di legatura dell'arteria carotidea.
4. Legatura dell'arteria carotide sinistra
- Anestetizzare il cucciolo (giorno 10 postnatale) con il 4-5% di isoflurano in un cappuccio a flusso verso il basso e posizionarlo su una configurazione appositamente disposta su un waterbath pad. Posizionare l'animale supino e fissare gli arti anteriori con del nastro adesivo.
- Abbassare il flusso di isoflurano al 2-3%. Pizzicare la coda per la risposta al dolore e monitorare la respirazione durante la procedura.
- Sterilizzare l'area di incisione (tra mandibola e clavicola) sul lato sinistro del collo con betadina e alcool (3 cicli di iodio alternato ed etanolo al 70%).
- Fai un'incisione lunga circa 1 cm sul lato sinistro del collo usando microscissori. Utilizzando un microscopio di dissezione, ritrarre con cura il tessuto sottocutaneo e la pelle per esporre l'arteria carotide. Fare attenzione a identificare il nervo vago (che corre lateralmente all'arteria) e separarlo delicatamente e ritrarlo dall'arteria.
- Infilare una sutura di seta sterile lunga 5 cm sotto l'arteria usando microforze. Legare una sutura a doppio nodo attorno all'arteria al flusso occluso.
- Tagliare la sutura in eccesso e chiudere l'arteria esposta tirando indietro il tessuto sottocutaneo e la pelle. Utilizzare il legame veterinario per sigillare l'incisione.
- Riposizionare l'animale su un monitoraggio EEG continuo in una camera a temperatura ambiente, che viene posizionata su un materasso riscaldante. Effettuare controlli della temperatura a infrarossi della temperatura interna del cucciolo per evitare di aprire la camera. Lasciare che l'animale si riprenda per 1 ora prima dell'ipossia.
5. EEG e ipossia
- Monitorare continuamente FiO2 (frazione di ossigeno inspirato) all'interno della camera tramite un monitor di ossigeno.
- Lavare la camera con 60 L/min di 100% N2 e 0,415 L/min per 100% O2. Una volta che la saturazione di ossigeno nella camera raggiunge il 12%, ridurre il flusso di N2 a 10 L / min mantenendo invariato il flusso di O2 . Con piccole regolazioni, mantenere il FiO2 all'8% per 45 minuti.
- Dopo 45 minuti di esposizione all'ipossia, riportare la FiO2 al 21%.
- Chiedi ai cuccioli di recuperare in camera e monitorare l'EEG per 2 ore post-ipossia.
- Dopo il completamento del periodo di registrazione, scollegare i topi dalla registrazione EEG e tornare alla madre.
6. Analisi EEG
- Analizza il file EEG con il video in LabChart Pro. Chiedi a un ricercatore in cieco di contrassegnare l'EEG per convulsioni e modelli di sfondo17. Le convulsioni sono definite come un evento elettrografico della durata superiore a 10 secondi con scariche d'onda acuta ritmiche ad alta frequenza (≥3x basale) con chiara evoluzione17.
- Chiedi a un secondo ricercatore in cieco di rivedere gli eventi contrassegnati a caso per l'accordo.
- Rivedere il video associato per ogni evento elettrografico marcato e analizzare in base al punteggio di crisi comportamentale del roditore neonatale16. In breve, questo punteggio varia da 0-6 (immobilità a grave comportamento tonico-clonico). Per caratterizzare ulteriormente la semiologia convulsiva, analizzare il comportamento per la lateralità (movimenti multifocali / bilaterali vs. focali / unilaterali vs. misti).
- Creare uno spettrogramma di potenza. Utilizzare una trasformazione di Fourier veloce con una finestra dati Coseno-Campana con una dimensione di 1024 punti dati. Crea un asse x liscio nello spettrogramma con l'aiuto di una sovrapposizione di finestre dell'87,5%. Esprimere la potenza come μV218.
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Representative Results
Semiologia convulsiva
L'esposizione neonatale all'ipossia-ischemia provoca convulsioni sia generalizzate che focali nei topi (Figura 1A-C). Le registrazioni video EEG consentono di correlare i risultati elettrografici al comportamento sul video. Questi comportamenti sono stati valutati utilizzando un punteggio comportamentale per roditori neonatali (BSS) precedentemente pubblicato. Oltre alla BSS, abbiamo classificato gli eventi in base al fatto che il comportamento fosse focale/unilaterale, bilaterale o misto (Figura 1B).
In questo modello, i topi hanno generalmente mostrato 3 modelli di semiologia convulsiva: 1) volteggio ripetitivo sul lato della legatura con estensione delle estremità controlaterali, 2) perdita di postura con flessione del corpo e coda arricciata sul lato della legatura, o 3) perdita di postura con pagaiata unilaterale o bilaterale delle estremità (diversa gravità e lunghezza). La maggior parte degli eventi osservati riguardava comportamenti focali/unilaterali o misti (Figura 1B). Inoltre, durante il periodo ipossico, un sottogruppo di topi ha mostrato attività convulsiva convulsiva, in cui il cucciolo era immobile con attività convulsiva sostenuta su EEG (Figura 1C).
Registrazioni elettrografiche
La registrazione EEG è stata avviata 30 minuti prima della legatura carotidea al fine di ottenere una linea di base pre-infortunio. L'attività basale (Figura 1A e Figura 2A) era simile allo sfondo precedentemente descritto nei cuccioli di topo p1017. Dopo la legatura, i cuccioli sono stati immediatamente rimessi in video EEG. Durante il periodo tra la legatura e l'inizio dell'ipossia, un sottogruppo di topi presenta convulsioni convulsive (Figura 1A-C).
A seguito dell'induzione dell'ipossia, l'ampiezza di fondo sull'EEG si è ridotta (Figura 3B) e ha mostrato in modo intermittente raffiche di scariche di onde spike, seguite da soppressione (Figura 2A). I topi mostrano convulsioni elettrografiche, che emergono da uno sfondo soppresso come scariche ritmiche di onde spike e progrediscono per diventare più complesse e frequenti, con onde polispike (Figura 2B). Durante l'ipossia, l'analisi dello spettrogramma di potenza è stata notevole per le asimmetrie tra l'emisfero ischemico e controlaterale (Figura 3A, B). L'emisfero ischemico ha mostrato un modello di soppressione dello scoppio e l'emisfero controlaterale ha mostrato uno sfondo soppresso (Figura 1A e Figura 3A, B). In media le convulsioni iniziano 5,5±8,1 minuti dopo l'induzione dell'ipossia, con ogni evento della durata di 56±57 secondi. C'è stato un tasso di mortalità del 13% durante l'ipossia (n = 4/30), con tutti i decessi a seguito di un attacco convulsivo (BSS = 5-6).
Durante la riossigenazione e il recupero, un sottogruppo di topi continua ad avere convulsioni per il resto del periodo di registrazione (2 ore post-ipossia). Lo sfondo EEG è stato soppresso rispetto al basale dopo ipossia (Figura 1A e Figura 3), con recupero graduale durante il periodo di registrazione post-ipossia. Durante l'intero periodo di registrazione, i topi hanno mostrato in media 9±5 eventi convulsivi, ciascuno durato 54±57,7 s.
Figura 1: Caratteristiche convulsive nei topi p10 esposti a ipossia-ischemia neonatale. (A) Spettrogramma di potenza rappresentativo dall'elettrodo della corteccia parietale ischemica attraverso la linea temporale sperimentale. (Scala della mappa di calore a colori di ampiezza x10-6). Le frecce indicano il tempo rappresentato dai tracciati dell'elettroencefalogramma grezzo al di sotto dello spettrogramma. (B) Comportamenti convulsivi per l'intero esperimento, postischemia/preipossia, durante l'ipossia e postiposia. (C) Punteggio di crisi comportamentale (BSS) e tempistica per tutti gli eventi convulsivi (n = 30 topi, ogni topo ha un simbolo unico, ogni punto è un evento convulsivo discreto). Il 100% dei topi sequestrati durante l'ipossia (scatola blu; il tempo = -60 minuti è il completamento della legatura carotidea, il tempo = 0 è l'inizio dell'ipossia). Il tredici per cento è morto durante l'ipossia a seguito di un attacco convulsivo (grado 5-6). Questa cifra è stata modificata da Burnsed et al13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Modelli caratteristici di elettroencefalografia (EEG) durante l'ischemia da ipossia. (A) Sfondo EEG da sinistra a destra: linea di base pre-infortunio, soppressione burst durante l'ipossia, soppressione postipoxia. Registrazione da elettrodo di profondità della corteccia parietale ipsilaterale. (B) Evoluzione di un attacco durante l'ipossia. Registrazione da elettrodo di profondità ippocampale ipsilaterale. Le caselle ombreggiate (I-V) corrispondevano agli estratti EEG espansi a destra di (B). Questa cifra è stata modificata da Burnsed et al13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Asimmetrie sullo sfondo EEG tra emisferi ischemico e controlaterale. (A) Spettrogramma di potenza asimmetrica nei topi HI durante l'ipossia (periodo di 45 minuti) nella corteccia ischemica (sinistra) e nella corteccia controlaterale (destra; scala di ampiezza x10-6). Modello di soppressione burst e convulsioni nell'emisfero ischemico, soppressione nell'emisfero CL. (B) Soppressione dello sfondo durante l'ipossia e la riossigenazione negli emisferi IL e CL. Tutte le misurazioni della tensione media prese da estratti casuali di 10 secondi dell'encefalogramma nel periodo di tempo sperimentale (basale, 30 minuti dopo la postligazione, durante l'ipossia - 15 minuti e 30 minuti dopo l'inizio, dopo la riossigenazione - 15 minuti e 60 minuti dopo l'inizio) sono state confrontate con il basale. La linea di base di ogni animale fungeva da controllo a sé stante e i dati sono riportati come percentuale del basale (n = 5 topi). Le misurazioni sono state prese da elettrodi corticali. Questa cifra è stata modificata da Burnsed et al13. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo presentato un modello per il monitoraggio video-EEG continuo nei topi neonatali durante le crisi ipossico-ischemiche. L'analisi video in combinazione con l'EEG consente la caratterizzazione della semiologia convulsiva. L'analisi dell'EEG consente l'estrazione di spettrogrammi di potenza e l'analisi dell'ampiezza di fondo.
Il posizionamento corretto e attento degli elettrodi è fondamentale in questo protocollo, poiché lesioni durante il posizionamento dell'elettrodo o un posizionamento impreciso possono influire in modo significativo sui risultati. La valutazione della normale attività EEG al basale prima della lesione è fondamentale, poiché possono verificarsi sanguinamenti o lesioni durante il posizionamento dell'elettrodo, sebbene rari. In secondo luogo, al fine di confermare il corretto posizionamento dell'elettrodo, i cervelli possono essere sezionati ed esaminati per le tracce dell'elettrodo nel posizionamento corretto. Inoltre, la mancata restituzione dei cuccioli alla madre in gruppi (individualmente) può causare danni alle cuffie degli elettrodi o l'uccisione o la negligenza dei cuccioli da parte della madre.
Una limitazione di questo metodo è il limite di localizzazione spaziale delle registrazioni degli elettrodi di profondità in un piccolo cervello neonatale. Ciò limita la capacità di localizzare specifici focolai di convulsioni sulle registrazioni EEG. Un'altra limitazione in questo modello di ischemia da ipossia è la variabilità del carico convulsivo. La variabilità delle dimensioni della lesione e i deficit comportamentali in questo modello di ischemia da ipossia da roditore sono stati ben descritti in precedenza7,8,19. Non sorprende che questa variabilità esista nel carico convulsivo (sia la durata degli eventi convulsivi che il numero di eventi convulsivi). Tuttavia, in modo coerente, il 100% dei cuccioli in questo modello presenta convulsioni durante l'ipossia. Infine, la quantità di tempo in cui i cuccioli possono essere monitorati EEG (lontano dalla madre) è limitata. Pertanto, non siamo in grado di caratterizzare le convulsioni in corso con EEG continuo in momenti successivi rispetto alla lesione.
Sebbene in questo manoscritto abbiamo utilizzato un modello di crisi ipossia-ischemia, questo metodo per il monitoraggio video-EEG continuo nei cuccioli di topo neonatale potrebbe essere facilmente applicato ad altri modelli di malattia / convulsioni. Le convulsioni nei roditori neonatali sono difficili da riconoscere in base al solo comportamento, rendendo importante il monitoraggio video-EEG. Indagini future potrebbero utilizzare queste tecniche per analizzare il carico convulsivo e la semiologia in altri modelli di convulsioni neonatali o la risposta a terapie e misure neuroprotettive.
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Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
Riconosciamo le seguenti fonti di finanziamento: NIH NINDS – K08NS101122 (JB), R01NS040337 (JK), R01NS044370 (JK), University of Virginia School of Medicine (JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SURGERY | |||
| Ball Point Applicator | Metrex Research | 8300-F | i-bond applicator |
| Cranioplast (Powder/Resin) | Coltene | H00383 | Perm Reline/Power |
| I-Bond | Kulzer GmbH, Germany | ||
| LOOK Silk Suture | Surgical Specialities Corporation | SP115 | LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture |
| RS-5168 Botvin Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS5168 | Forcep for surgery/ligation |
| RS-5138 Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS5138 | Forcep for surgery/ligation |
| UV light for I-Bond | Blast Lite By First Media | BL778 | UV ligth for I-bond |
| Vannas Microdissecting Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS5618 | Scissor for ligation |
| Vet Bond | 3M Vetbond | 1469SB | Vet Glue |
| HYPOXIA | |||
| Hypoxidial | Starr Life Science | ||
| Oxygen sensor | Medical Products | MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig | |
| EEG RECORDING | |||
| Female receptacle connector 0.079" | Mill-Max Manufacturing Corp | 832-10-024-10-001000 | Ordered from Digikey |
| Grass Amplifier | Natus Neurology Incorporated | Grass Product | |
| LabChart Pro | ADI Instruments | Software to run the system | |
| Male Socket Connector 0.079" | Mill-Max Manufacturing Corp | 833-43-024-20-001000 | Ordered from Digikey |
| Operational Amplifier | Texas Instruments, Dallas, TX, USA | TLC2274CD | TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier |
| Operational Amplifier | Texas Instruments, Dallas, TX, USA | TLC2272ACDR | TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier |
| Stainless Steel wire | A-M Systems | 791400 | 0.005" Bare/0.008" Coated 100 ft |
| Ultra-Flexible Wire | McMaster-Carr | 9564T1 | 36 Gauze wire of various color |
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