Summary
Bu protokol, sofistike bir dağıtım ve izleme sistemi kullanarak manyetik nanopartikül hipertermisinin doğru bir şekilde verilmesi için gerekli teknikleri ve metodolojiyi sunar.
Abstract
Hipertermi uzun zamandır kanser tedavisinde kullanılmaktadır. Teknikler, sıcak demir çubukların tümöral içe yerleştirilmesinden, 39 ° C (ateş seviyesi) ila 1.000 ° C (elektrokoter) arasındaki sıcaklıklarda ve saniyelerden saatlere kadar tedavi sürelerinde sistemik olarak verilen tümör antikor hedefli manyetik nanopartiküllere kadar değişmiştir. Sıcaklık-zaman ilişkisi (termal doz), doku ablasyonu ile sonuçlanan yüksek termal dozlar ve daha düşük termal dozlarla etkiyi belirler ve artan kan akışı, ilaç birikimi ve immün stimülasyon gibi subölümcül etkilere neden olur. En umut verici güncel tıbbi tedavilerden biri manyetik nanopartikül hipertermisidir (mNPH). Bu teknik, invaziv olmayan, toksik olmayan alternatif bir manyetik alanla sistemik veya intratümöral olarak verilebilen manyetik nanopartiküllerin aktive edilmesini içerir. Manyetik nanopartiküllerin boyutu, yapısı ve ilişkisi ve manyetik alanın frekansı ve alan kuvveti başlıca ısıtma belirleyicileridir. Büyük ve küçük hayvan modellerinde ve kültürlü hücrelerde tekrarlanabilir manyetik nanopartikül hipertermisi sağlamak için sofistike enstrümantasyon ve teknikler geliştirdik. Birden fazla yerde sürekli, gerçek zamanlı sıcaklık izlemeyi kullanan bu yaklaşım, hedef olmayan doku ısıtmasını sınırlarken, hedef dokuya (tümör) veya hücrelere iyi tanımlanmış termal dozların verilmesine izin verir. Birden fazla sahada sıcaklığın hassas kontrolü ve izlenmesi ve endüstri standardı algoritmanın (43 °C / CEM43'te kümülatif eşdeğer dakikalar) kullanılması, termal dozun doğru bir şekilde belirlenmesini ve miktarını sağlar. Çok çeşitli sıcaklıklara, termal dozlara ve biyolojik etkilere izin veren sistemimiz, ticari satın almalar ve kurum içi mühendislik ve biyoloji gelişmelerinin bir kombinasyonu ile geliştirilmiştir. Bu sistem, ex vivo, in vitro ve in vivo teknikler arasında hızlı dönüşüm sağlayacak şekilde optimize edilmiştir. Bu protokolün amacı, tekrarlanabilir ve doğru manyetik nanopartikül terapisi (mNP) hipertermisi sağlamak için etkili bir teknik ve sistemin nasıl tasarlanacağını, geliştirileceğini ve uygulanacağını göstermektir.
Introduction
Hipertermi tarihsel olarak kanser tedavisinde, tek başına veya diğer tedavilerle kombinasyon halinde kullanılmıştır. Uzun bir kullanım geçmişine sahip olmasına rağmen, bu tedaviyi sağlamak için en avantajlı yöntem hala tartışılmaktadır ve hastalığın bulunduğu yere ve konumuna bağlıdır. Hipertermi dağıtım yöntemleri arasında mikrodalga, radyofrekans, odaklanmış ultrason, lazer ve metalik nanopartiküller (altın veya demir oksit gibi)1,2,3,4 bulunur. Bu doğum yöntemleri, ateş seviyesinden yüzlerce derece C'ye kadar bir dizi tedavi sıcaklığına yol açabilir. Hiperterminin biyolojik etkisi öncelikle kullanılan sıcaklıklara ve tedavinin süresine bağlıdır5. Bu makale ve amaç için, manyetik nanopartikül hipertermisi (mNPH) üzerinde duruluyor. Bu yöntem, toksik olmayan, FDA onaylı, demir oksit nanopartikülleri kullanarak odaklanmış, lokalize, iyi izlenen ve kontrol edilen sıcaklık değişimlerine izin verir.
Diğer hipertermi modalitelerinin bir tuzağı, kesin hücresel hedefleme eksikliğidir; hipertermi doğası gereği yüksek bir terapötik orana sahip değildir, bu nedenle dikkatli termometri ve hedefleme gereklidir6. mNPH, mNP'lerin sistemik veya intratümöral enjeksiyonuna izin verir, ısı sadece mNP'lerin bulunduğu yerde üretilir, böylece tedaviyi doğrudan tümöre hedefler. mNPH, manyetik nanopartiküller hücrenin içine veya dışına yerleştirildiğinde etkili olabilir. Kanser tedavisi için, mNPH'ye genel bakış, manyetik nanopartiküllerin enjekte edilmesidir (intratümöral veya intravenöz olarak), daha sonra nanopartikül manyetik kutuplarının sürekli olarak yeniden hizalanmasına neden olan alternatif bir manyetik alan uygulanır ve nanopartiküllerle ilişkili hücrelerin ve dokunun lokalize bir şekilde ısınmasına neden olur 7,8 . Nanopartiküllerin hacmini ve alternatif manyetik alanın (AMF) frekansını / gücünü ayarlayarak, doku içinde üretilen sıcaklığı dikkatlice kontrol etmek mümkündür.
Bu tedavi, vücut yüzeyine yakın tümörlerde iyi çalışır, çünkü daha derin tümörler daha güçlü AMF gerektirir, bu nedenle girdap akımı ısınma riski9 artar. Hiperterminin klinik olarak monoterapi olarak kullanıldığına dair kanıtlar vardır, ancak çoğu zaman hipertermi radyasyon tedavisi veya kemoterapi ile birleştirilir ve daha hedefli bir anti-kanser etkisine yol açar10,11,12. Radyasyon tedavisi ile kombinasyon halinde çalışan hiperterminin klinik kanıtları önceki bir yayında gözden geçirilmiştir13. Laboratuvarımız mNPH yöntemi12,14,15'i kullanarak farelerden domuzlara ve spontan köpek kanserlerine kadar çeşitli hayvanları başarıyla tedavi etmiştir. Bu protokol, lokalize hipertermi tedavisinin etkilerini tek başına veya diğer tedavilerle kombinasyon halinde araştırmak isteyenler için tasarlanmıştır.
Hipertermideki en önemli faktörlerden biri, hedef / tümör dokusuna verilen termal dozu gerçek zamanlı olarak ölçebilmek ve anlayabilmektir. Dozu hesaplamanın ve karşılaştırmanın standart bir yolu, 43 ° C'de kümülatif eşdeğer ısıtma dakikalarının gösterilmesidir; Bu algoritma, dağıtım sisteminden bağımsız dozların, maksimum ve minimum sıcaklıkların (belirli bir aralıkta) ve ısıtma / soğuma parametrelerininkarşılaştırılmasına izin verir 5,16. CEM hesaplaması en iyi 39-57 °C5 arasındaki sıcaklıklar için çalışır. Örneğin, yaptığımız bazı çalışmalarda, CEM43 30'luk bir termal doz seçtik (yani, 43 ° C'de 30 dakika). Bu dozu seçmek, hem tek başına hem de tek bir radyasyon dozu17 ile kombinasyon halinde in vitro olarak güvenli, etkili, immünogenetik etkilere bakmamızı sağladı.
Manyetik nanopartikül hipertermisi ile, uygun bir dağıtım sistemi oluştururken göz önünde bulundurulması gereken birkaç faktör vardır. Enstrümantasyon tasarımı, manyetik alan dağıtım ekipmanının yüksek güçte çalıştırıldığında bile serin kalmasını sağlamak için bir soğutucunun kullanılması ve tüm sıcaklık, güç değerlendirmesi ve kontrol sistemleri etkinleştirilmediğinde sistemin açılmasını önleyen arıza emniyetli prosedürler gibi önemli güvenlik faktörlerini içerir. Ek olarak, hem in vivo hem de in vitro durumlar için dikkate alınması gereken önemli biyolojik faktörler vardır. Kültürlenmiş hücreleri kullanırken, sonuçları etkileyebilecek fizyolojik değişikliklerden kaçınmak için büyüme ortamlarında tedavi etmek ve tutarlı bir canlı sıcaklıkta tutmak gerekir. Bireysel nanopartikül tipleri için, AMF tabanlı ısıtma parametrelerini hesaplarken spesifik absorpsiyon oranını (SAR) bilmek önemlidir. Benzer şekilde, istenen ısıtmayı elde etmek için gerekli olan hücrelerdeki ve dokulardaki mNP / Fe konsantrasyonunu bilmek önemlidir. In vivo yöntemler, hayvanın tedavi sırasında anestezi altında tutulması ve hayvanın çekirdek vücut ısısının tedavi boyunca normal bir seviyede tutulması gerektiğinden, detaylara daha fazla dikkat edilmesini gerektirir. Hayvanın vücut ısısının düşmesine izin vermek, anestezi altında olduğu gibi, tedavi edilen dokunun termal dozu ile ilgili genel sonuçları etkileyebilir.
Bu yazıda, çok yönlü bir manyetik nanopartikül hipertermi sistemi tasarlamak ve inşa etmek için kullanılan yöntemlerin yanı sıra dikkate alınması gereken önemli kullanım faktörlerini tartışıyoruz. Açıklanan sistem, manyetik nanopartikül hipertermisinin sağlam, tutarlı, biyolojik olarak uygun, güvenli ve iyi kontrol edilen bir şekilde verilmesini sağlar. Son olarak, yürüttüğümüz mNPH çalışmalarının genellikle radyasyon, kemoterapi ve immünoterapi gibi diğer tedavileri içerdiği belirtilmelidir. Bu sonuçların anlamlı olması için, verilen ısının diğer modalitelerin etkinliğini ve / veya güvenlik-toksisitesini (veya tam tersi) ve hayvanın refahını nasıl etkileyebileceğini belirlemek önemlidir. Bu nedenle ve daha önce bahsedilen dozimetri ve terapötik durumlar için, manyetik nanopartikül hipertermi dozajlama doğruluğuna ve sürekli çekirdek ve hedef sıcaklık ölçümlerine çok dikkat etmek önemlidir. Bu protokolün amacı, güvenli ve etkili manyetik nanopartikül hipertermisinin verilmesi için basit, tutarlı bir yöntem ve açıklama sağlamaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dartmouth College Hayvan Bakımı ve Kullanımı Programı, Amerikan Laboratuvar Hayvanları Bakımı Akreditasyon Birliği (iAAALAC) tarafından akredite edilmiştir ve tüm UDSA ve NIH (Laboratuvar Hayvanları Refahı Ofisi) yönergelerine ve düzenlemelerine uyar. Tüm in vivo çalışmalar Dartmouth College Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Ötenazi prosedürü, Hayvanların Ötenazisi için 2020 AVMA Kılavuzlarına uygundur.
1. Sistemin enstrümantasyonu/tasarımı
- İstenilen manyetik alanı oluşturmak için şekilleri seçerek kapalı bir döngü olacak şekilde özel AMF anteni (bobin) tasarlayın. İstenilen alanı oluşturmak üzere uyumlu bobinler tasarlamak için güç jeneratörü seçiminden endüktans formüllerini ve özelliklerini kullanın. İn vitro ve in vivo deneyler için farklı tasarımlar kullanın.
- AMF anten endüktansının güç jeneratörünün kabul edilebilir aralığına girdiğinden emin olun. Anteni güç jeneratörüyle eşleştirmek (ayarlamak) için kapasitörler ekleyin veya çıkarın.
- In vitro deneyler için, aynı anda birden fazla numunenin işlenmesine izin veren 1,5 mL tüp içerebilen 14 dönüşlü bir sarmal bobin, iç çapı 2 cm ve uzunluğu 14 cm olan bir bobin tasarlayın. Bobini bir vinil polimerle yalıtın ve bobini tüplerden ayırmak için bir polistiren ara parça kullanın. Tasarım spesifikasyonunun ayrıntıları ve dikkat edilmesi gereken noktalar Ek Dosya 1'de mevcuttur.
- İn vivo deneyler için, tescilli tasarım bilgilerine sahip bir üreticiden özel olarak üretilmiş tüm vücut sarmal bobini edinin. 8 mm kare boru (bobinin deliği içinde daha düzgün bir alan yarattığından) ve hedeflenen tedavi alanında bir yoğunlaştırıcı kullanın. Konsantratörü 5,0 cm uzunluğunda, toplam 5 dönüşle 3,6 cm iç çap, 5,2 cm dış çap ile sonuçlandırın ve hedeflenen tedavi alanında yerini alın. Bobini bir polikarbonat kabukla çevreleyin.
- Güç kaynağı olarak 10 kW veya daha yüksek olarak derecelendirilmiş, ayarlanabilir güç ve frekansa sahip bir AMF jeneratörü kullanın. Endüktans, güç kaynağını ve antenleri/bobinleri 0,62 ila 1,18 μHenries (μH) aralığıyla eşleştirerek 30-300 kHz arasında değişen frekanslara izin verir. Jeneratörü, basıncı 50 psi'ye ayarlanmış bir santrifüj takviye pompası aracılığıyla geri dönüştürülmüş su kullanarak soğutun.
- Bobinleri, AMF anteni aracılığıyla su ile seyreltilmiş %25 etilen glikol bazlı ısı transfer sıvısı pompalayan 5,6 tonluk soğutma kapasiteli bir soğutucu ile soğutun. Soğutucunun sıcaklığını, anten numuneyi ısıtmayacak veya soğutmayacak şekilde ayarlayın.
- Hayvan muhafazası için, tutucu ile bobin yüzeyi arasında 0,5 cm'lik bir hava boşluğu ile bobinin ortasına asılabilen boru şeklinde bir tutucu oluşturun. Havayı bobinin etrafındaki kabuktan dolaştıran ayarlanabilir bir klimalı hava pompası bağlayın ve normal bir hayvan çekirdeği sıcaklığını koruyacak şekilde ayarlayın. Anestezinin uygun şekilde verilmesini sağlamak için anestezi makinesini hayvanın başının yakınındaki boru şeklindeki hayvan tutucusuna bağlayın.
- Hücre muhafazası için, bir su banyosundan gelen suyu, tüplerin yerleştirildiği ara parçadan geçiren bir aparat oluşturun. Bu su banyosunun sıcaklığını, tüpler 37 ° C'de suyla çevrili olacak şekilde ayarlayın.
- Tümör, hayvanın çekirdeği ve hayvan ortamı içindeki sıcaklıkları izlemek için veya in vitro çalışmalar için, hücre peletinin sıcaklığını ve tüpleri çevreleyen suyu izlemek için fiber optik problar kullanın.
- Tüm deneyler için 100 nm büyüklüğünde manyetik demir oksit nanopartikülleri kullanın.
NOT: Konsantrasyon ve spesifik absorpsiyon oranı (SAR), nanopartikülleri seçerken göz önünde bulundurulması gereken iki özelliktir, çünkü bunlar olası ısıtma ve termal doz18'i doğrudan etkiler.
2. İn vitro hipertermi
- Kültür B16F10 RPMI ortamındaki murin melanom hücreleri% 10 FBS ve% 1 Pen / strep ile. Plaka 150.000 hücre/kuyu 6 delikli plakalarda, 2 mL tam ortam ile.
- Her kuyucuk için uygun tedaviyi belirleyin, yani mNP'siz ve AMF'siz hücreler, mNP'li ve AMF'siz hücreler, mNP'siz ve AMF'siz hücreler, mNP'li ve AMF'li hücreler.
NOT: Ek olarak, hipertermiyi başka bir tedavi ile birleştirirseniz uygun kontroller olduğundan emin olun. AMF, gerekli güç ve soğutma yetenekleriyle güçlendirilmiş standart bir araştırma tezgahı laboratuvarında gerçekleştirilir. - Kaplamayı 24 saat sonra, önceki adımda belirtildiği gibi uygun kuyucuklara mNP'ler ekleyin. 3 mg demir / mL konsantrasyonuna mNP'ler ekleyin. Bir stok ortam/mNP çözümü oluşturarak (eski ortamları çıkararak, bu çözümü ekleyerek) veya homojen dağılım için mNP'leri doğrudan ve nazikçe dönen plakalar ekleyerek mNP'lerin kuyu boyunca dağıtıldığından emin olun.
- Tedaviye, mNP'lerin eklenmesinden 48 saat sonra, kuyular ~% 80 birleştiğinde, ortamı çıkararak ve kuyuları taze ortamla yıkayarak başlayın. Medyayı kaldırın.
- Tedavi edilen her kuyuya 0,5 mL tripsin ekleyin ve yavaşça girdap yapın. Hücrelerin ayrıldığını kontrol etmek için mikroskop kullanın.
- Hücreleri 1,5 mL tüplere toplamak için her bir kuyucuğa 1 mL ortam ekleyin. Tüm hücreleri kuyudan toplayın (~ 1 x 106 hücre). Her kuyucuk için açıkça etiketlenmiş ayrı bir tüp kullanın.
- Hücrelerin pelet yapmasına izin vermek için tüpleri 2-3 dakika boyunca 60 x g'da döndürün. Peleti ortamda tutun.
- Tüpleri bobin içindeki suyla dolu ara parçaya yerleştirin. Su banyosunun sıcaklığını, ortam ve hücre peleti 37 ° C'de tutulacak şekilde ayarlayın. Ayrı fiber optik sıcaklık probları kullanarak tüp ve su banyosu içindeki sıcaklığı izleyin.
- Soğutucuyu açın, soğutma sıvısının bobinden akıp akmadığını kontrol edin. Güç kaynağını açın ve maksimum yüzdesini istenen alana ayarlayın. 10 kW jeneratörle çalışan 14 dönüşlü solenoid bobini 165 kHz ve 23,87 kA/m'de (300 Oe) çalıştırın.
- Tüplerden birine ayrı bir fiber optik sıcaklık probu yerleştirin. Hücreleri daha önce belirlenen protokol termal dozuna kadar tedavi edin. Bir örnek, 43 ° C'de 30 dakikadır (CEM43 / 30).
- Tüplerindeki ortamdaki hücreleri yeniden askıya alın ve yeni 6 kuyu plakasına yeniden plakalayın. Yeni plakaları açıkça etiketleyin. Amaç, toplanan tüm hücreleri (~ 1 x 106 hücre) yeniden plakalamaktır.
NOT: Kültüre alınan hücrelerin tedavi görmesini sağlamak için yeni 6 kuyucuk plakası kullanılmalıdır. Eski plakalar kullanılırsa, plakalarda hala başarılı bir şekilde tripsinize edilmemiş hücreler kalabilir. - Gerekirse, bir sonraki deneysel prosedür için, RNA veya protein ekspresyon analizi için hücreleri lize edin.
3. İn vivo hipertermi
- Hücre kültürü ve aşılama
- Kültür B16F10 RPMI ortamındaki murin melanom hücreleri% 10 FBS ve% 1 Pen / strep ile. İstenilen sayıda hayvanın aşılanması için yeterli hücre sağlayacak tabaklar / tabaklar kullanın. Örneğin, 100.000 hücrede kaplanmış 10.100 mm'lik tabaklar, 48 saat içinde 20 fare enjeksiyonu için yeterli hücrelerle birleştirilecektir.
- Hücreleri tripsinize edin ve saf RPMI ortamı kullanarak toplayın (FBS veya kalem / strep yok).
- Hücreleri sayın ve aşılama hacmine ve fare sayılarına bağlı olarak istenen hücre konsantrasyonu için bir çözüm oluşturun.
- 6 haftalık dişi C57Bl / 6 fareleri buharlaştırılmış izofluran ve oksijen kullanarak anestezi uygulayın. Hayvanları, indükleninceye kadar% 5 izofluran ve% 95 oksijen içeren pleksiglas bir kutuya yerleştirin. İndüklendikten sonra, hayvanı çıkarın ve 3.1.5-3.1.7 ve 3.3.3-3.3.6 adımlarını tamamlamak için% 2 izofluranda bir yüz konisi kullanın.
NOT: Tedavi sırasında anestezi için dahili anestezi muhafazası kullanın. Fare anestezisi için standart kurumsal protokolleri takip edin. Hayvan deneylerinden önce uygun IACUC onayını sağlayın. Anesteziden sonra, hayvanı kafese geri koyun ve komplikasyon olmadığından emin olmak için iyileşmeyi izleyin. - Doğru reflekslere yanıt verilip verilmediğini kontrol edin.
- Elektrikli tıraş makinesi kullanarak sağ kanadı tıraş edin.
- Enjeksiyon bölgesini alkollü bir mendille temizleyin. 1-2 x 106 hücreyi, 28 G'lik bir iğne ile 100 μL'lik bir cam şırınga kullanarak, anestezi yapılan tıraşlı sağ kanadın üzerinde 50 μL medya içinde intradermal olarak dağılmış olarak enjekte edin.
- Tümör büyümesi / Nanopartikül enjeksiyonu
- Kaliperleri (uzunluk, genişlik ve derinlik) kullanarak tümörleri 3 boyutta ölçün ve hacimleri (uzunluk x genişlik x derinlik x π)/6 ile hesaplayın.
- Tümör hacimleri 120 mm3'e (+/- 20mm3) ulaştığında, hayvanları çalışmaya yerleştirin. Kombinasyonu tedavi kohortları (yani kontrol, mNPH, radyasyon ve kombinasyon) dahil olmak üzere uygun kontrol ve tedavi gruplarının olmasını sağlayarak çalışmayı tasarlayın.
- 3.1.4'te açıklandığı gibi mNP alacak fareleri anestezi altına alın.
- Alanı alkollü bir mendille temizleyin. AMF tedavisinden 3 saat önce mNP'leri tümöre enjekte edin. Doz 7.5 mg demir /cm3 tümör olacak şekilde bir hacim enjekte edin.
NOT: Laboratuvardan yayınlanmamış veriler, maksimum mNP alımının 3-6 saatte gerçekleştiğini göstermektedir.
- AMF tedavisi
- Fareyi anestezi altına alın ve çekirdek sıcaklığını korumak için bir ısıtma yastığına yerleştirin.
- Doğru reflekslere yanıt verilip verilmediğini kontrol edin. Kulak etiketini veya faredeki diğer metal nesneleri çıkarın.
- Yağlanmış bir fiber optik sıcaklık probunu farenin rektumuna yavaşça yerleştirin.
- İğneyi çıkararak tümöre bir kateter yerleştirin. Kateteri, tümörden çok fazla yapışmayacak şekilde kesin.
NOT: Fiberoptik sıcaklık kateterleri, fareler genel anestezi altındayken yerleştirilir ve çıkarılır, yani kateterler sadece tümör ısıtma prosedürü sırasında yerinde bulunur. Farelere, prosedür sırasında bir NSAID analjezi ilacı, ketoprofen (5 mg / kg) 'nin tek bir deri altı dozu verilir. Kateterlerin yerleştirilmesiyle ilişkili kısa veya uzun süreli rahatsızlık veya morbidite gözlemlemedik. - Kateterin içine 3 sensörlü fiber optik sıcaklık probu yerleştirin. Kateter, fiber optik sıcaklık probu sensörlerini korur.
- Rektal ve intratümöral probu, yerinde kalmalarını sağlamak için hayvanın kuyruğuna bantlayın.
- Fareyi 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin, aşağıya doğru ilerleyin. Tüpün başın yanında anestezinin bağlanacağı ve teslim edileceği bir delik bulunmalıdır.
- Tüpü bobin kurulumuna yerleştirin ve anesteziyi yeniden bağlayın.
- Ortam sıcaklığını ölçmek için tüpün içine gevşek bir şekilde fiber optik sıcaklık probu yerleştirin.
- Soğutucuyu açın ve soğutma sıvısının sirküle edildiğinden emin olun.
- Bilgisayar yazılımının çeşitli sıcaklıkları görüntülediğinden emin olun ve CEM43 hesaplamasının gerçek zamanlı olarak görüntülenmesini sağlamak için kayda başlayın. Gerekli CEM43 daha önce belirlenen dozdur.
NOT: Mıknatıs açılmadan önce, hayvana metal eşyaların takılmadığından emin olun, çünkü bunlar hızla ısınır. Ek olarak, odadaki herkesin kalp pili olmadığından ve orada bulunmalarının güvenli olduğundan emin olun. - Mıknatısı düşük güç yüzdesiyle açın.
- Fiber optik sıcaklık problarının sıcaklık değişimlerini kaydettiğinden emin olun. AMF etkinleştirildikten sonra alan arttıkça sıcaklıklar artacaktır. Hayvanın çekirdek sıcaklığının 38 ° C'de kalmasını sağlayın. Klimalı hava ceketini kullanarak çekirdek sıcaklığını düzenleyin.
- Jeneratör üzerindeki gücü değiştirerek, tümördeki sıcaklık seviyesini kontrol eden dahili kontrol kadranını kullanarak manyetik alanın gücünü ayarlayın.
- AMF'yi, kullanıcı tarafından daha önce belirlendiği gibi (örneğin CEM43 40) tümör içinde istenen doz elde edildikten sonra kapatın.
- AMF kapatıldıktan sonra, tüpü bobinden çıkarın.
- Fareyi tüpten çıkarın, çeşitli probları ve kateteri çıkarın. Gerekirse, hayvanı yeni bir metal kulak etiketi ile etiketleyin.
- Tedaviler tamamlandıktan sonra, soğutucuyu kapatın.
- Hayvanları anesteziden kurtarın ve komplikasyon oluşmamasını sağlayın. Normale dönmeyi sağlamak için davranışlarını izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İn vitro çalışmalar
Hücreler sadece manyetik nanopartiküllerin / demirin ve AMF'nin miktarı ve konsantrasyonu uygun şekilde eşleştirilirse istenen sıcaklık ve termal dozu elde eder ve korur. Hücreleri in vitro (ve in vivo) ısıtmak için manyetik nanopartiküller kullanırken, içselleştirilmiş manyetik nanopartiküllere sahip hücrelerde hipertermi elde etmek için, belirli bir hücre içi mNP / Fe seviyesinin gerekli olacağı ve mNP yüklü hücrelerin birbirine sayısı ve yakınlığının gerekli olacağı belirtilmelidir. Hedef hücrelerdeki/dokudaki mNP/Fe seviyesi bir ısıtma etkisi elde etmek için yeterliyse, manyetik alan frekansı ve kuvveti istenen sıcaklık ve etkileri elde etmek için ayarlanabilir. Düzgün bir şekilde kaplanırsa, farklı dozlar ve zamanlamalar arasındaki genetik ve moleküler farklılıklara bakan daha ileri çalışmalar takip edilebilir17. Şekil 1 , in vitro yöntemlerin bir şemasını temsil etmektedir.
Bu in vitro yöntemler hücresel mRNA ve protein ekspresyon değişimini araştırmak için kullanılabilir. Laboratuvarımızdan yeni bir örnek, CEM43 30 mNPH tedavisini, 8 Gy radyasyon tedavisini ve kombinasyonu takiben immünogenetik farklılıkları belirledi. Etkilerin arkasındaki mekanizmayı ve sinerjik olarak nasıl birleştiklerini daha iyi anlamak için bağışıklık ve sitotoksik yollar arasındaki ifadedeki benzerlikleri ve farklılıkları tanımlayabildik17. Her deneyde çeşitli çevresel ve ısıtılmış kontrol numuneleri kullanılır. Kontroller, hipertermi tedavisi alanlara kıyasla farklı mRNA ve protein ekspresyon seviyelerine sahip olacaktır.
İn vivo çalışmalar
In vivo çalışmalarda ek hususlar vardır. Hedef termal dozdan bağımsız olarak, tedavi edilen hayvanda fizyolojik olarak kabul edilebilir bir çekirdek sıcaklığının korunması kesinlikle gereklidir. Bu, anestezi altındaki kemirgenlerde zor olabilir, çünkü çekirdek sıcaklığı hızla kaybedilebilir (ısıtma pedleri gibi çekirdek sıcaklığı modüle etme teknikleri genellikle gereklidir). Normalden daha düşük vücut sıcaklıkları, tümörde belirli bir termal doz elde etmeye çalışırken AMF-mNPH'yi çok uzağa itme ihtiyacını gerektirebilir ve bu da hedef olmayan dokuda kabul edilemez etkilere neden olur (hedef olmayan doku girdap akımı ısıtması böyle bir olasılıktır). Çekirdek vücut ısısındaki küçük sapmalar bile tümörde veya normal dokuda istenmeyen fizyolojik komplikasyonlara yol açabilir. Daha önce de belirtildiği gibi, tekrarlamaya değer olsa da, doğru, tekrarlanabilir ısıtma için, mNP / Fe doku konsantrasyonu, AMF frekansı ve alan mukavemeti sıcaklık izleme parametreleri ile hedef doku boyutu ve derinliği arasında bir eşleşme elde etmek önemlidir. Ölçülebilir ısınmaya izin vermek için tümör içinde mNP'lerin temel konsantrasyonu olmalıdır. Isı seviyesi / kabiliyeti sadece mNP doku konsantrasyonuna (mg Fe / g doku) ve bunların tümör içindeki göreceli dağılımına değil, aynı zamanda AMF'nin sıklığına ve müteakip alan kuvvetine de bağlıdır. Yukarıdakilerin herhangi birindeki değişiklikler, doku içinde farklı ulaşılabilir sıcaklık aralıklarına yol açabilir. Uzun yıllara dayanan deneyimimiz sayesinde, klinik öncesi tümör tedavileri için kullandığımız konsantrasyonu ve AMF sisteminin sıklığını ve alan gücünü güvenli ve etkili aktivasyona izin verecek şekilde optimize ettik. Tüm doku bölgelerinde sıcaklık / termal dozu ölçmek imkansız olduğundan, Şekil 2'de görüldüğü gibi, gerçek zamanlı etkinlik ve güvenlik değerlendirmesine izin veren stratejik bölgelere mümkün olduğunca çok sayıda fiber optik sıcaklık probu yerleştirmek de önemlidir. Bu problar, deney boyunca sıcaklıkların kaydedilmesine izin vererek, deneyin doğru dozimetrisine ve termal geçmişine izin verir. Şekil 3 , bir in vivo deney sırasında oluşturulan eğrileri göstererek, sıcaklığı yakından izleme ve tümör sıcaklıklarını istenen aralıkta tutmak için sistemi ayarlama yeteneğini vurgulamaktadır. Şekil 4 , in vivo yöntemleri özetlemektedir.
Bu in vivo yöntemler, in vitro yöntemlere benzer şekilde, farklı kanser türlerini, farklı hipertermi dozlarını araştırmak ve çeşitli kombinasyon tedavileri ile kullanılabilir. Örneğin, laboratuvarımızda yapılan önceki çalışmalar hipertermi ve kemoterapikombinasyonunu araştırmıştır 12. Ayrıca etkinlik ve moleküler mekanizmaların belirlenmesi için çok sayıda hipertermi ve radyasyon deneyi tamamladık. Bu deneyler için kontrol fareleri, gerçek hipertermi üretimi dışındaki tüm prosedürlere tabi tutulur. Şekil 5 , in vitro ve in vivo mNP hipertermi tedavisini (mNPH) takiben diferansiyel olarak eksprese edilen genleri gösteren iki volkan grafiği içermektedir. Bu rakamlar, hipertermi etkilerini izlemek için moleküler teknikleri nasıl kullandığımızın örnekleridir.
Resim 1: In vitro mNP hipertermi şeması. Bu şema, in vitro manyetik nanopartikül hipertermisi için yöntemi göstermektedir. Isıtmanın gerçekleşmesini sağlamak için, hücrelere yeterli mNP alımı için yeterli parçacık ve zaman sağlanmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sıcaklık izleme için kateterlerin yerleştirilmesi. Bu şekil, tümör ve / veya tümör bölgesindeki farklı yerlerdeki sıcaklıkları kaydetmek için fiber optik sıcaklık problarını barındıran kateterlerin yerleştirilmesini göstermektedir. Bu şekil ref.19'dan uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bir fare tümörünün tedavisi sırasında gerçek zamanlı sıcaklık izleme. Bu grafik, in vivo bir deney sırasında çekirdek vücut sıcaklığını, çevresel sıcaklıkları ve tümör içindeki çoklu sıcaklıkları izlemeye izin veren gerçek zamanlı sıcaklık okumalarını göstermektedir. Tümör içindeki sıcaklıkların kontrolü, şeklin yakınlaştırılmış kısmındaki minimal büyük ölçekli varyasyonlarla gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: In vivo mNP hipertermi şeması. Bu şema, in vivo manyetik nanopartikül hipertermisi için yöntemi göstermektedir. Yeterli nanopartiküllerin enjeksiyonunun yanı sıra dağıtım ve emilim için yeterli süre, istenen termal dozu verme yeteneğini sağlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Diferansiyel gen ekspresyonu. İn vitro (A) ve in vivo (B) mNP hipertermi tedavisini takiben diferansiyel gen ekspresyonu. Bu volkan grafikleri, hem in vitro hem de in vivo mNPH yöntemleri için y ekseninde önemi olan bir log 2 x eksenindeki genetik değişiklikleri temsil eder. Her daire farklı bir geni temsil eder ve en önemli 20 farklı şekilde ifade edilen gen etiketlenir. Gen x ekseninde sıfırdan ne kadar uzaktaysa, kıvrım değişimi o kadar büyük olur ve gen y ekseninde ne kadar yüksek olursa, p değeri o kadar düşük olur. Her ikisi de aynı termal doza sahip olmasına rağmen, in vivo hipertermi, in vitro'dan daha fazla gen ekspresyon değişikliğine yol açtı. Bu grafikler, açıklanan protokol kullanılarak üretilebilecek biyolojik verilerin örnekleridir. In vitro volkan arsası ref.17'den uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu sistemin tasarımı ve uygulanması, in vitro ve in vivo manyetik nanopartikül hipertermi deneylerini doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde yürütme yeteneği sağlar. Sistemin, AMF frekansı ve alan kuvvetinin manyetik nanopartikül tipine, konsantrasyonuna ve istenen doku konumuna ve sıcaklığına yeterince uyacak şekilde tasarlanması çok önemlidir. Ek olarak, sıcaklığın gerçek zamanlı olarak doğru bir şekilde izlenmesi, güvenlik ve doğru bir termal dozun hesaplanması için çok önemlidir (43 ° C / CEM'de kümülatif eşdeğer dakikalar). Probların Şekil 1'de gösterildiği gibi yerleştirilmesi, Şekil 2'de görüldüğü gibi termal dozun ve çekirdek vücut sıcaklığının gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.
Manyetik nanopartikül hipertermisinin doğru bir şekilde verilmesinde ilk adım, hayvanlar ve operatörler için güvenli bir sistem oluşturmaktır. Sistemin tüm bileşenleri operasyonel ve teslim açısından da iyi anlaşılmalıdır. Bu durumda, AMF girdap akımlarının potansiyelini anlamak ve manyetik parçacıkların nerede bulunduğunu bilmek anlamına gelir. Antenler veya bobinler, alanın şekli ve gücünde önemli bir faktördür ve kullanılan soğutma sistemi, bobinin aşırı ısınmasını önlemek için önemlidir20. İletkenin dışındaki alan dayanımı, iletkenden akan akım kuvveti ile doğru orantılıdır. İletkeni çevreleyen uzayın herhangi bir noktasındaki manyetik alan kuvveti, iletkenler tarafından çevredeki alanda üretilen alanların vektör toplamıdır. Manyetik alan, akım akışına dik bir açıyla üretilir ve Biot-Savart ters kare kuralı21'e göre, iletkenden uzaklığın bir fonksiyonu olarak mukavemet katlanarak azalır. Böylece, bobin içinde daha düzgün bir alan için in vivo hipertermi için kare boru kullanılır. Potansiyel olarak klinik olarak ilgili bir sistem için gereken güç ve hacme sahip bir manyetik alan oluşturmak, yüksek bir elektrik akımı gerektirir. Bu nedenle, anten tasarımları önemli elektrik gücü seviyelerini barındırabilmelidir. Ayrıca, AMF antenleri, endüktansları güç jeneratörünün kabul edilebilir aralığına girecek şekilde tasarlanmalıdır. Tipik olarak kullanılan frekanslarda, akım akışının çoğu anten iletkeninin yüzeyindedir, yani yüzey, yüzey kusurlarını ortadan kaldırarak en aza indirilebilen rezistif ısıtmayı etkiler. Bu rezistif ısıtma aynı zamanda bobinin ve ortamın aşırı ısınmamasını sağlamak için bir bobin soğutma sistemine ihtiyaç duyulduğu anlamına gelir.
Sistem tasarımımızın bir sınırlaması, toplam frekans aralığına ve manyetik alanlara izin vermemesi, ancak hücreler, kemirgenler ve büyük hayvanlar için uygun alanların üretilmesine izin vermesidir. Spesifik olarak, herhangi bir indüksiyon ısıtma sisteminden elde edilebilecek maksimum alan mukavemeti, antendeki (bobin) akım akışıyla doğrudan ilgilidir. AMF jeneratörleri, mevcut voltajın mevcut akımla (amper) çarpılmasıyla hesaplanan kilowatt cinsinden derecelendirilmiştir. Bu nedenle, 500 V limitli 10kW'lık bir sistem maksimum 20 A ampere sahip olacaktır. Bobin tasarımı, önce hangi sınıra ulaşıldığını ve dolayısıyla sistem sınırını belirleyecektir. Herhangi bir akımın yarattığı manyetik alan kuvveti, iletkenden uzaklığın bir fonksiyonu olarak katlanarak azalır. Bu nedenle, aynı sistem üzerinde çalışan daha küçük çaplı bir bobinle aynı geometriye sahip daha büyük çaplı bir bobin, bobinin merkezinde daha düşük bir alan mukavemetine sahip olacaktır. Bu nedenle, gerekli manyetik alan boyutu ve gücü, AMF jeneratörünün kapasitesi ile sınırlıdır. Daha büyük bir bobin inşa etmek ve daha fazla güç kullanmak, öncelikle girdap akımı ısıtması olmak üzere ek endişelere yol açar.
Kullanıcıları, hayvanları ve sistemin kendisini korumak için bu sistemi kullanırken ele alınması gereken birkaç güvenlik endişesi vardır. İlk olarak, anestezi kullanımı sırasında yeterli oda havalandırması sağlanmalıdır. İkincisi, bobin ile ilişkili tüm alanlar, yüksek tuzlu karışımlar da dahil olmak üzere metal ve veya iletkenlerden arındırılmış olmalıdır. Kullanıcılar AMF'nin etrafında çalışırken yüzükleri ve diğer mücevherleri çıkarmalı ve numuneler herhangi bir metal türü içermemelidir. En önemlisi, kalp pili veya diğer implante edilmiş cihazları veya nesneleri olan kişiler, AMF etrafında çalışmadan önce doktorlarına danışmalıdır. Sistemi korumak için, güç uygulanmadan önce jeneratör ve bobin soğutma ihtiyaçlarının karşılanmasını sağlayan arıza emniyetli bir sistem kullanılmalıdır. Ek olarak, istenmeyen ısınmayı tespit etmek için termal kameraya genel bir bakış kullanılmalıdır.
İn vitro çalışmalar için, izlenecek en önemli adımlar hücrelerdeki demir konsantrasyonu, hücrelerin konsantrasyonu, AMF parametreleri ve termal doz değerlendirmesidir. Hücreler, manyetik nanopartikülleri süpernatant, hücreler veya her ikisine yerleştirerek manyetik nanopartikül hipertermisi ile tedavi edilebilir / ısıtılabilir. Manyetik nanopartikül ısıtma miktarı, manyetik nanopartiküllerin / Fe seviyesine bağlı olacaktır. Eğer arzu sadece içselleştirilmiş demir ile hücreleri tedavi etmekse, deneyimlerimiz bireysel kanser hücrelerinin yalnızca sınırlı sayıda manyetik nanopartikül alacağı ve alım optimal olduğunda bile, optimize edilmiş AMF ile bile hücre ısıtma durumu yaratmak için hücrelerin toplanması / peletlenmesi gerektiğidir. Ortamın ve hücrelerin sıcaklığını biyolojik olarak ilgili seviyelerde (ısıtılmadığında) tutmak, gerçek ısıtmanın doğru ölçümü için de önemlidir. Burada tarif edilen 14 dönüşlü solenoid bobin, numunelerin termal olarak kontrol edilen bir su kolonuna batırılarak biyolojik olarak ilgili sıcaklıkların korunmasını sağlar.
İn vivo çalışmalar için, hayvan çekirdeği sıcaklığını korumak ve tümör içindeki sıcaklığı doğru bir şekilde ölçmek kilit faktörlerdir. Bu hayvan muhafaza sistemi ve bobinin tasarımı, bobin / güç ayarları nedeniyle hayvanın ortamındaki termal sürüklenmeyi ortadan kaldırır ve normal çekirdek vücut sıcaklığının korunmasına yardımcı olur. Vücut çekirdek sıcaklığını korumak, anlamlı deney sonuçları için kritik öneme sahiptir. Rektal prob, hayvanın çekirdek sıcaklığının gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Anestezi altındayken, bir hayvanın çekirdek sıcaklığı doğal olarak azalır. Bu durumu ele almak için, hayvan muhafaza kabının etrafına sıcak hava sağlayan ve çekirdek sıcaklığının normal aralıkta kalmasını sağlayan bir çevresel ısıtma sistemi geliştirdik. Normal çekirdek sıcaklığının korunması, hipertermi tedavi sonuçlarının doğru yorumlanmasını ve çevresel faktörlerin ortadan kaldırılmasını sağlamak için gereklidir. Sıcaklık izleme problarının hedef doku/tümördeki birden fazla bölgeye yerleştirilmesi, elde edilen sıcaklık ve termal dozun doğru bir şekilde değerlendirilmesi için önemlidir. Manyetik nanopartikülleri bir tümör içinde homojen olarak dağıtmak imkansız olmasa da son derece zor olduğundan, birden fazla bölgedeki ısıtma parametrelerini bilmek, tutarlı ve doğru bir doku / tümör termal dozu elde etmek için çok önemlidir. İn vitro ve in vivo çalışmalar için konsantrasyonun değişken olduğuna dikkat etmek önemlidir. Bu varyasyonun nedeni, hücre kültüründe mNP'lere daha fazla erişime sahip hücrelerle daha az sınır olmasıdır, bu nedenle daha düşük bir konsantrasyon kullanılabilir. İn vivo, tümörlerin heterojen doğası ve karmaşık 3D morfolojisi nedeniyle daha yüksek bir konsantrasyon gereklidir. Bu nedenle, aynı partikül konsantrasyonunu in vivo ve in vitro olarak kullanmak, hücreler tarafından çok daha az miktarda alınmasına yol açacaktır.
Bu yazıda, manyetik nanopartikül hipertermisi tedavileri için etkili ve esnek bir alternatif manyetik alan üreteci ve bobin sistemi geliştirmek için gerekli parametreler ve enstrümantasyon açıklanmaktadır. Bu sistem hem in vitro hem de in vivo çalışmalar için kullanılabilir. Sistem, lokalize/hedefli hipertermi ve normal dokunun korunması için etkilidir ve diğer AMF-mNP hipertermi sistemlerine kıyasla onu çekici kılar. Bu hipertermi tedavileri, çeşitli nanopartiküller veya nanotaşıyıcılar ve yardımcı tedavilerle farklı dozların etkilerini araştırmak için değiştirilebilir. Doku ısıtması, özellikle manyetik nanopartikül ısıtması, birçok değişkenden etkilenebildiğinden, bir araştırmadaki parametreleri anlamak önemlidir. Bu kriterler karşılanırsa, manyetik nanopartikül hipertermisi, bağımsız ve adjuvan tümör kontrolü de dahil olmak üzere birçok moleküler, hücresel ve klinik durumu ele alabilir. Burada açıklanan yöntemler önemli çaba gerektirse de, kılavuzlara uyulduğu takdirde, mNP hipertermisinin tüm potansiyeli gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Çalışma hibe numaraları ile finanse edildi: NCI P30 CA023108 ve NCI U54 CA151662.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| .25% Trypsin | Corning | 45000-664 | available from many companies |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | Eppendorf 22363204 | available from many companies |
| B16F10 murine melanoma cells | American Type Culture Collection | CRL-6475 | |
| C57/Bl6 mice | Charles river | 027C57BL/6 | 6-week-old female mice |
| Chiller | Thermal Care | NQ 5 series | chiller that cools the coil |
| Coolant fluid | Dow Chemical Company | Dowtherm SR-1 | antenna cooling fluid |
| Fetal Bovine serum | Hyclone | SH30071 | available from many companies |
| fiber optic probes, software and chassis | FISO | FISO evolution software used to read the temperatures | |
| IR camera | Flir | infrared camera to monitor unintentional heating | |
| iron oxide nanoparticles | micromod Partikeltechnologie GmbH | Bionized NanoFerrite | dextran coated iron oxide nanoparticles |
| mouse coil, solenoid | Fluxtrol | custom built | |
| penicillin/streptomycin | Corning | 45000-652 | available from many companies |
| RF generator | Huttinger | TIG 10/300 | power source |
| RPMI media | Corning | 45000-396 | available from many companies |
References
- Chen, X., Tan, L., Liu, T., Meng, X. Micro-Nanomaterials for Tumor Microwave Hyperthermia: Design, Preparation, and Application. Current Drug Delivery. 14 (3), 307-322 (2016).
- Luo, W., et al. Effects of radiofrequency ablation versus other ablating techniques on hepatocellular carcinomas: A systematic review and meta-analysis. World Journal of Surgical Oncology. 15 (1), 126 (2017).
- Ter Haar, G. Heat and sound: Focused ultrasound in the clinic. International Journal of Hyperthermia. 31 (3), 223-224 (2015).
- Salunkhe, A. B., Khot, V. M., Pawar, S. H. Magnetic Hyperthermia with Magnetic Nanoparticles: A Status Review. Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (5), 572-594 (2014).
- Dewhirst, M. W., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hanson, M., Hoopes, P. J. Basic principles of thermal dosimetry and thermal thresholds for tissue damage from hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 19 (3), 267-294 (2003).
- Roizin-Towle, L., Pirro, J. P. The response of human and rodent cells to hyperthermia. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 20 (4), 751-756 (1991).
- Hergt, R., Dutz, S., Müller, R., Zeisberger, M. Magnetic particle hyperthermia: Nanoparticle magnetism and materials development for cancer therapy. Journal of Physics Condensed Matter. 18 (38), (2006).
- Kumar, C. S. S. R., Mohammad, F. Magnetic nanomaterials for hyperthermia-based therapy and controlled drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (9), 789-808 (2011).
- Stigliano, R. V., et al. Mitigation of eddy current heating during magnetic nanoparticle hyperthermia therapy. International Journal of Hyperthermia. 32 (7), 735-748 (2016).
- Johannsen, M., et al. Clinical hyperthermia of prostate cancer using magnetic nanoparticles: Presentation of a new interstitial technique. International Journal of Hyperthermia. 21 (7), 637-647 (2005).
- Horsman, M. R., Overgaard, J. Hyperthermia: a Potent Enhancer of Radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 418-426 (2007).
- Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Kaufman, P. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia enhancement of cisplatin chemotherapy cancer treatment. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 845-851 (2013).
- Peeken, J. C., Vaupel, P., Combs, S. E. Integrating hyperthermia into modern radiation oncology: What evidence is necessary. Frontiers in Oncology. 7, 132 (2017).
- Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Trembly, B. S., Hoopes, P. J. Comparison of magnetic nanoparticle and microwave hyperthermia cancer treatment methodology and treatment effect in a rodent breast cancer model. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 819-827 (2013).
- Stigliano, R. V., Shubitidze, F., Petryk, A. A., Tate, J. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia: predictive model for temperature distribution. Energy-based Treatment of Tissue and Assessment VII. 8584, 858410 (2013).
- Dewhirst, M., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hoopes, P. J., Hanson, M. A. Thermal dose requirement for tissue effect: experimental and clinical findings. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment II. 4954, 37 (2003).
- Duval, K. E. A., et al. Immunogenetic effects of low dose (CEM43 30) magnetic nanoparticle hyperthermia and radiation in melanoma cells. International Journal of Hyperthermia. 36, 37-46 (2019).
- Giustini, A. J., Petryk, A. A., Cassim, S. M., Tate, J. A., Baker, I., Hoopes, P. J. Magnetic Nanoparticle Hyperthermia in Cancer Treatment. Nano LIFE. 01, 17-32 (2010).
- Hoopes, P. J., et al. Intratumoral iron oxide nanoparticle hyperthermia and radiation cancer treatment. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment IV. 6440, (2007).
- Semiatin, S. L., Zinn, S. Coil design and fabrication basic design and modifications. Heat Treating. , 32-41 (1988).
- Maxwell, J. C.
