Summary
Vi præsenterer to forskellige farvning protokoller for NKG2D ligand (NKG2DL) afsløring i humane primære akut myeloid leukæmi (AML) prøver. Den første tilgang er baseret på et fusionsprotein, der er i stand til at genkende alle kendte og potentielt endnu ukendte ligands, mens den anden protokol er afhængig af tilsætning af flere anti-NKG2DL-antistoffer.
Abstract
Inden for samme patient viste fraværet af NKG2D-ligands (NKG2DL) overfladeudtryk at skelne leukæmiske delpopulationer med stamcelleegenskaber (såkaldte leukæmiske stamceller, LSC'er) fra mere differentierede modstykke leukæmiceller, der mangler sygdomsinitieringspotentiale, selvom de bærer lignende leukæmispecifikke genetiske mutationer. NKG2DL er biokemisk meget forskellige MHC klasse I-lignende selvmolekyler. Raske celler i homeostatic betingelser generelt ikke udtrykke NKG2DL på cellens overflade. I stedet fremkaldes ekspressionen af disse ligands ved eksponering for cellulær stress (f.eks. onkogen transformation eller infektiøse stimuli) for at udløse eliminering af beskadigede celler via lysis gennem NKG2D-receptor-udtrykke immunceller som naturlige dræberceller (NK). Interessant nok undertrykkes NKG2DL-overfladeudtryk selektivt i LSC-delpopulationer, så disse celler kan undgå NKG2D-medieret immunovervågning. Her præsenterer vi en side om side-analyse af to forskellige flowcytometrimetoder, der gør det muligt at undersøge NKG2DL-overfladeudtryk på kræftceller, dvs. en metode, der involverer pan-ligand-anerkendelse og en metode, der involverer farvning med flere antistoffer mod enkeltligaler. Disse metoder kan bruges til at adskille levedygtige NKG2DL negative cellulære delpopulationer med formodede kræft stamcelle egenskaber fra NKG2DL positive ikke-LSC.
Introduction
NK-celler er vigtige effektorer i det medfødte immunsystem, der kan genkende og eliminere ondartede celler eller stressede raske celler (f.eks. ved en virusinfektion) uden forudgående antigenstimulation1. Denne proces er stramt reguleret via et komplekst repertoire af aktiverende receptorer - såsom naturlige cytotoksicitetsreceptorer (NCR'er), NKG2D og CD16 - og hæmmende receptorer, der i vid udstrækning repræsenteres af dræber immunoglobulinlignende receptorer (KIRs)2. Binding af KIR'er til humane leukocytantigen (HLA) klasse I molekyler på somatiske celler sikrer selvgenkendelse og formidler NK celletolerance. På den anden side udløser fraværet af selvgenkendelse og øget binding af aktiverende receptorer til deres ligands på målcellerne frigivelsen af cytotoksiske granulater, der fører til NK cellemedieret cytotoksicitet1. Endelig kan NK-celler udøve antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC) ved at binde den aktiverende receptor CD16 til mål, der udtrykker Fc-delen af Ig (FcR)2. Bortset fra direkte cytotoksicitet kan NK-celler også udløse cytokinfrigivelse, der forbinder det medfødte med det adaptive immunsystem3.
NKG2D er en vigtig aktiverende receptor udtrykt på NK, NKT, γδ T og naive CD8+ T-celler4, der gør det muligt for sådanne cytotoksiske immunceller at genkende og lyse NKG2D ligand (NKG2DL), der udtrykker målceller. Raske celler udtrykker normalt ikke NKG2DL. I stedet er NKG2DL-udtryk upreguleret på ondartede eller virusinficerede celler for at gøre disse modtagelige for immunfrigang5.
Den menneskelige NKG2DL-familie består af otte kendte molekyler, blandt hvilke de to MHC I kæderelaterede molekyler A og B (MICA og MICB6) og cytomegalovirus UL16-bindende proteiner 1-6 (ULBP1-67). Udtrykket af NKG2DL er reguleret på transskriptionelle, post-transskriptionelle samt post-translationelle niveauer8. Som sådan, mens NKG2DL udtryk er almindeligt ikke påvises på overfladen af raske celler, NKG2DL mRNA9 og intracellulære protein udtryk blev rapporteret i sundt væv. Den funktionelle relevans af et sådant udtryk og de mekanismer , der ligger til grund for sådanne diskrete udtryksmønstre , mangler stadig at blive defineret10.
Den mekanistiske regulering af NKG2DL-ekspressionen i kræftcellerne er et fascinerende undersøgelsesområde. Veje, der vides at være involveret i enten cellulær stress,f.eks. Men selv om overfladeudtryk af NKG2DL er blevet effektivt induceret, kan dette udtryk gå tabt igen gennem proteolytisk medieret afgivelse, en mekanisme forbundet med immunflugt og dårlig klinisk prognose i nogle kræftformer13.
Fraværet af celleoverfladeNKG2DL kan også spille vigtige roller hos patienter med AML. Her fremkalder behandling med intensiv kemoterapi ofte remission, men tilbagefald opstår ofte fra leukæmiske stamceller (LSC), som selektivt overlever kemoterapier og undgår immunrespons. Som vi for nylig viste, undslipper LSC'er for eksempel NK-celle lysis ved at undertrykke NKG2DL-overfladeudtryk14.
Omvendt kan fraværet af NKG2DL-overfladeudtryk bruges som en metode til at identificere og isolere formodede stamceller fra bulk-modstykke leukemic delpopulationer. Her præsenterer vi to flow cytometriske tilgange, der kan bruges til at detektere NKG2DL overfladeudtryk og derved identificere NKG2DL negative stamceller i leukæmi og måske også i andre kræftformer: En metode til pan-ligand overfladegenkendelse og en metode, der involverer farvning med enkelt eller samlet antistoffer, der genkender individuelle kendte NKG2DL-proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Patientprøver blev indsamlet efter godkendelse fra Ethics Review Board på universitetshospitalerne i Basel og Tuebingen.
1. Biotinylering af NKG2D-fusionsproteinet
BEMÆRK: Dette trin udføres med et biotinyleringssæt (se Materialetabel) i henhold til producentens instruktion. Dette trin i protokollen skal udføres mindst 24 timer før farvningen. Det biotinylerede NKG2D-fusionsprotein skal opbevares ved -20 °C.
- Tø både biotin, samt NKG2D fusion proteinrør ved stuetemperatur (RT).
BEMÆRK: Hvis cellerne skal være sterile til yderligere forsøg (injektion i mus, kolonidannende assays osv.), skal fusionsproteinet rekonstrueres under en laminarflowhætte for at undgå kontaminering. Ellers kan hvert trin udføres på en bænk. - Spin hurtigt ned 50μg lyophilized NKG2D fusion protein. Der tilsættes 500 μL fosfatbufferet saltvand (PBS) for at rekonstruere pulveret og blandes grundigt ved hjælp af en P1000 mikropipette.
- Der tilsættes 100 μL af NKG2DL-fusionsproteinet til et biotinrør for at opnå en endelig lagerkoncentration på 100 μg/mL.
- Bland opløsningen grundigt ved kontinuerlig genudnytte med en P100 micropipette.
- Inkuber fusionsprotein/biotinopløsningen ved en kontrolleret RT i 24 timer. Fusionsproteinet er nu klar til brug.
2. Optøning af primære AML-celler
BEMÆRK: Ca. 5.000.000 frosne leukæmiske celler pr. patient, der opbevares i flydende nitrogen, blev optøet og derefter brugt til analysen med det samme. Leukemic celler blev opnået og frosset som tidligere beskrevet15. Kort sagt blev perifere blodprøver indsamlet fra patienter med AML og høje blast celle procenter (>90% af eksplosioner blandt mononukleare celler) behandlet med en densitet gradient adskillelse for at opnå mononukleare celler og efterfølgende frosset i føtal kalv serum (FCS), der indeholder 10% dimethyl sulfoxid opløsning (DMSO). Cellenumrene varierede meget mellem patienter i afhængighed af leukocytkoncentrationen hos patienten (interval: 1.000.000 til 30.000.000 leukæmiske celler pr. mL blod).
- Forvarmet RPMI-medium, der indeholder 10 % af FCS ved 37 °C ved hjælp af et vandbad. For hvert hætteglas med AML-celler (op til 30.000.000 celler i 1 ml FCS + 10% DMSO) tilsættes 10 ml forvarmet medium til et 15 ml reaktionsrør.
- Kryoglen, der indeholder primær AML, fjernes fra væsken til nitrogenopbevaring, og cellerne optøs straks ved hjælp af et 37 °C vandbad. Flyt forsigtigt røret frem og tilbage i vandet, så indholdet af hætteglasset kan tø op, indtil der kun er en lille iskrystal tilbage.
- De optøede celler overføres straks til det mediumholdige rør, og hætteglasset skylles med 1 mL medium.
- Centrifuge cellerne ved 300 x g i 10 min og kassér supernatanten uden at forstyrre pelleten.
- Cellerne vaskes med 5 mL RPMI-medium, der indeholder 10% af FCS og centrifuge ved 300 x g i 10 min.
3. Celletælling
- Genbrug cellepillen i et kendt volumen af RPMI-medium, der indeholder 10% af FCS.
- Overfør et lille volumen af celleaffjedringen til et 1,5 mL mikrocentrifugerør og fortynd i et kendt forhold med trypanblå eller ethvert andet alternativt farvestof, der tillader forskelsbehandling af levende celler/døde celler.
- Brug en hvilken som helst enhed til at tælle cellerne.
- Centrifuge cellerne ved 300 x g i 10 min og kassér supernatanten uden at forstyrre pelleten.
4. Farvning af primære AML-celler ved hjælp af det biotinylerede NKG2D-fusionsprotein
- Farvningsbufferen fremstilles ved at supplere 500 mL PBS med bovin serumalbumin (BSA) og ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA) til en endelig koncentration på henholdsvis 0,07 mM og 2 mM. PH-vinduet justeres (7.2-7.4) om nødvendigt.
- Resuspend cellepillen med farvningsbuffer til en endelig koncentration på 0,5 x 107 celler/mL.
BEMÆRK: Cellerne kan eventuelt inkuberes med et blokeringsmiddel (f.eks. hIgG (1μg/ml) i 30 minutter ved RT- eller FcR-blokeringsmiddel).. - 100 μL af celleophænget overføres til en cellekultur 96-brønds U-bundplade, og pladen centrifuges ved 300 x g i 10 min. Kassér supernatanten uden at forstyrre pelleten.
- Forbered en masterblanding af biotinyleret NKG2D-fusionsprotein, så cellerne genbruges i et slutvolumen på 50 μL pr. brønd med en endelig koncentration på 10 μg/mL pr. brønd.
- Masterblandingen, der er fremstillet i trin 4.4, tilsættes ved hjælp af en 100 μL pipette, og cellepillerne genbruges med en 300 μL multikanalpipette.
BEMÆRK: Nedskaler det endelige volumen i henhold til antallet af celler for at reducere mængden af fusionsprotein, der er nødvendigt for farvningen. - Celleaffjedringen inkuberes i 25 minutter ved RT eller 50 min ved 4 °C.
- Cellerne vaskes ved at tilsætte 200 μL farvningsbuffer pr. brønd med en 300 μL multikanalpipette.
- Pladen centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter, og supernatanten kasseres uden at forstyrre pelleten.
- Gentag trin 4.7 og 4.8.
BEMÆRK: Farvningen beskrevet her udføres i en cellekultur 96-godt U-bundplade. Derfor udføres vasketrin to gange på grund af sådanne pladers lille volumenkapacitet. Farvningen kan også udføres i andre rør, og vasketrin kan derefter kun udføres én gang ved hjælp af et større volumen. - Forbered en masterblanding ved hjælp af Streptavidin-PE (se tabel 1 for fortyndinger), således at cellerne genbruges i et slutvolumen på 50 μL.
BEMÆRK: Tilføj udvælgelsesantistoffer til din celletype som f.eks. for AML. - Masterblandingen, der er tilberedt i trin 4.10, tilsættes ved hjælp af en 100 μL pipette, og cellepillerne genbruges med en 300 μL multikanalpipette.
- Celleaffjedringerne inkuberes i 15 minutter ved RT eller 30 min. ved 4 °C i mørke.
- Cellerne vaskes ved at tilsætte 200 μL farvningsbuffer pr. brønd med en 300 μL multikanalpipette.
- Pladen centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter, og supernatanten kasseres uden at forstyrre pelleten.
- Gentag trin 4.13 og 4.14.
- Forbered en opløsning af farvning buffer herunder 7-AAD (7-Aminoactinomycin D, 1:1000) eller ethvert reagens til at skelne mellem levende og døde celler.
- Resuspend cellepiller i 200 μL farvningsbuffer + 7-AAD tilberedt i trin 4.16 ved anvendelse af en mikropipette på 300 μL multikanalmikropipette.
- Analyser cellerne ved hjælp af en flowcytometry-enhed.
5. Farvning af enkelt eller samlet enkelt anti-NKG2DL antistoffer
- Brug den samme celleophæng som i trin 4.2.
- Cellens affjedring på 100 μL overføres til en cellekultur 96-brønds U-bundplade ved hjælp af en 300 μL multikanalpipette og centrifuge pladen ved 300 x g i 10 min. Kassér supernatanten uden at forstyrre pelleten.
- Der fremstilles en antistofmasterblanding for hvert primært antistof eller puljede antistoffer (se tabel 2 for fortyndinger), således at cellerne genansættes i et slutvolumen på 50 μL.
- Masterblandingen, der er fremstillet i trin 5.3, tilsættes ved hjælp af en 100 μL pipette, og cellepillerne genbruges med en 300 μL multikanalpipette.
- Inkuber cellerne i 25 minutter ved RT.
- Cellerne vaskes ved at tilsætte 200 μL farvningsbuffer pr. brønd ved hjælp af en 300 μL multikanalpipette.
- Centrifuge cellekulturen 96-brønd U-bundplade ved 300 x g i 10 minutter og kassér supernatanten uden at forstyrre pelleten.
- Gentag trin 5.6 og 5.7.
- Der fremstilles en antistofmasterblanding ved at tilsætte det sekundære antistof (se tabel 2 for fortyndinger), således at cellerne genbruges i et slutvolumen på 50 μL pr. brønd.
- Masterblandingen, der er tilberedt i trin 5.9, tilsættes ved hjælp af en 100 μL pipette, og cellepillerne genbruges med en 300 μL multikanalpipette.
- Inkuber i 15 minutter ved RT eller 30 min ved 4 °C i mørke.
- Vaskes ved at tilsætte 200 μL farvningsbuffer pr. brønd ved hjælp af en 300 μL multikanalpipette.
- Centrifuge celleaffjedringen ved 300 x g i 10 minutter og kassér supernatanten uden at forstyrre pelleten.
- Gentag trin 5.12 og 5.13.
- Resuspendcellepiller i 200 μL farvningsbuffer indeholdende 7-AAD tilberedt i trin 4.16.
- Analyser cellerne ved hjælp af en flowcytometry-enhed som beskrevet i trin 6.
6. Erhvervelse af data
BEMÆRK: Sørg for, at der udføres ugentlige kvalitetskontroller af flowcytometeret for at sikre, at lasere fungerer korrekt. For protokollen præsenteret her udføres en ugentlig Cytometer- og Tracking (CTS) proces med relative perler for at kontrollere laserpræstationer på alle kanaler. Efter CTS registreres 10.000 hændelser ved hjælp af 8-peak perlerne som en intern kontrol. Alle toppe skal være i samme position inde i deres porte og godt adskilt fra hinanden.
- Opret matrixkompensationen for at trække spektral overlapning mellem detektorer med perler eller med cellerne16.
- Optag 10.000 hændelser for de ikke-indgroede celler og de enkelte farvede perler. For fluorescens minus en (FMO) kontrol, registrere 50.000 begivenheder og for fuld-farvede prøver registrere op til 100.000 begivenheder.
BEMÆRK: Alternativt kan der udføres enkelte farvede prøver på cellerne. Hvis det er tilfældet, skal du sørge for, at cellerne har et positivt signal til den ønskede markør. - Der udtages en enkelt farvet celle eller perleprøve for hver fluorophore, der anvendes i forsøget til at afsløre mængden af spektral overlapning. Brug den kompensationsskaber af flowcytometrienheden til at beregne afsmittende værdier og anvende kompensationsmatrixen på alle de målte prøver.
BEMÆRK: Sekundære antistoffer kan ikke bruges til oprettelse af kompensation ved hjælp af perler, hvis kompensationen beregnes med perler. Afhængigt af typen af kompensationsperler kan sekundære antistoffer ikke anvendes til kompensation med perler. - For FMO-kontrollerne og de fulde farvede prøver med fusionsproteinet skal du for det første vælge cellerne baseret på deres fremadrettede spredning (FSC) og side scatter (SSC). Efter udelukkelse af doublets, gate cellerne baseret på deres negativitet for 7-AAD (PercP-Cy5.5) signal til at udelukke de døde celler (se trin 5,15). Det sidste plot viser udtrykket af CD34 (Y-akse) og NKG2DL (X-akse) på levende singler.
- For de enkelte anti-NKG2DL-antistoffer, anvende den samme strategi til prøverne, men bemærk, at ligand positivitet ligger i Alexa Fluor 488 og ikke PE kanal.
- Juster portene i henhold til FMO-styringen for gating-strategi fra trin 6.4 og 6.5 (se tabel 3) for at få passende FMO-kontroller til at udføre dette eksperiment: Træk en port på den negative fraktion i analysesoftwaren. Under registrering af den fuldplettede prøve er cellerne over den tidligere oprettede port positive for den analyserede markør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Begge de protokoller, der præsenteres her, gør det muligt at berige AML LSC ved at flowcytometriske analyser ved hjælp af CD34, en kendt markør for LSC17, i kombination med NKG2DL overfladeudtryk ved enten at udnytte pan-ligand anerkendelse eller farvning med puljede antistoffer mod individuelle ligands. I figur 1viser vi, at de analyserede AML-prøver er positive for CD34 og NKG2DL, men der findes også negative delpopulationer, hvilket fremgår af tilstedeværelsen af fire forskellige populationer i alt. Vores data viser den typiske gating strategi for en sådan farvning, begyndende med udvælgelsen af de vigtigste population af celler via deres FSC og SSC. Doublets og døde celler er udelukket i downstream-analysen (Figur 1A). Porte justeres ved hjælp af FMO-kontroller for at sikre korrekt identifikation af positive celler(figur 1B).
I figur 1Cfremhæver vi fluorescensintensiteterne i celler, der er positive for CD34 (APC, Y-akse) vs. NKG2DL (PE, X-akse). AML-celler, der er positive for CD34, viser et lavere overfladeudtryk af NKG2DL (Figur 1C), som er i overensstemmelse med tidligere resultater fra vores laboratorium, hvilket viser, at NKG2DL-udtryk er forbundet med manglende stængel14.
Figur 2 angiver robustheden af begge NKG2DL-farvningsmetoder. I figur 2Aundersøger vi tre primære AML-prøver side om side, der viser 19,8, Henholdsvis 49,8 og 89,4% af de positive hændelser for fusionsproteinbegævningen vs. 20,4, 50,4 og 90,6% for den samlede anti-NKG2DL-antistofbegæring (puljede antistoffer mod henholdsvis MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 og ULBP3). På den anden side viser enkelt ligand (mod enten MICA, MICB, ULBP1, ULBP2/5/6 eller ULBP3) farvning en række positive begivenheder op til 92% (Figur 2B). Denne procentdel varierer afhængigt af selve liganden og patienten,f.eks. Bemærk, at en enkelt celle kan udtrykke flere NKG2DL.
Når flere anti-NKG2DL-antistoffer samles og kombineres i et enkelt rør, kan procentdelen af positive celler sammenlignes med procentdelen af fusionsproteinet (Figur 2A). Som sådan fungerer begge protokoller godt og kan give lignende resultater vedrørende NKG2DL-udtryk på primære AML-celler. I nogle AML kan fusionsproteinmetoden tillade højere følsomhed, da den kan tillade anerkendelse af yderligere NKG2DL-proteiner.
Figur 1: Typisk gating strategi primære AML prøver. (A) Cellerne indhegnes først på grundlag af deres størrelse (X-akse) og kompleksitet (f.eks. granularitet, Y-akse). Doublets udelukkes derefter ved at afbilde højden eller bredden mod området for fremad scatter. Endelig vælges levende celler baseret på deres størrelse (X-akse) vs deres negativitet for 7AAD (PerCP-Cy5.5, Y-akse). B)FMO-styringsmidler anvendes til at opstille porte, der bidrager til at skelne mellem positive og negative populationer for angivne markører. Gating-strategien forbliver identisk som vist i figur 1A. (C) Flowcytometry-plot, der viser positive og negative hændelser for CD34 (APC, Y-akse) vs. NKG2DL (PE eller AlexaFluor488, X-akse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Sammenligning af farvningsprotokoller. (A) Søjlediagrammer, der viser procentdelen af positive hændelser for fusionsproteinet i forhold til de samlede anti-NKGD2L-antistoffer (n = 3 AML-prøver) fra indhegnede enkelt levende celler. (B) Søjlediagrammer, der viser procentdelen af positive hændelser for enkeltligal farvning for alle kendte anti-NKG2DL-antistoffer og samlede enkeltligaler (se Materialeoversigten for detaljerede antistofoplysninger). Gating blev igen udført på enkelt levende celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Rørnavn | Antigen | Fluorophore | Fortynding/koncentration |
| Celler, der ikke er indgroet | - | - | - |
| Enkelt plet PE |
NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 for primært trin 1:100 for sekundært trin |
| Enkelt plet 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
Live/Død | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| Enkelt plet APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| Fuld farvede celler | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 for primært trin 1:100 for sekundært trin | |
| Live/Død | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tabel 1: Rør, der kræves for at plette prøver med NKG2D-fusionsproteinet. Denne tabel viser de rør, der kræves for at opsætte eksperimentet.
| Rørnavn | Antigen | Fluorophore | Fortynding/koncentration |
| Celler, der ikke er indgroet | - | - | - |
| Enkelt plet Alexa Fluor 488 |
ULBP-1 | Alexa Fluor 488 | 10 μg/mL for primært trin 4 μg/ml for sekundærtrin |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| GLIMMER | |||
| MICB | |||
| enkelt plet 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
Live/Død | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
| Enkelt plet APC |
CD34 | APC | 1:25 |
| Fuld farvede celler | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2DL | Alexa Fluor 488 | 10 μg/mL for primært trin 4 μg/ml for sekundærtrin |
|
| Live/Død | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tabel 2: Rør, der kræves for at plette prøver med anti-NKG2DL-antistofferne. Denne tabel viser de rør, der kræves for at opsætte eksperimentet.
| Rørnavn | Antigen | Fluorophore | Fortynding/koncentration |
| Celler, der ikke er indgroet | - | - | - |
| FMO_APC | ULBP-1 | Alexa Fluor 488 | 10 μg/mL for primært trin 4 μg/mL for sekundærtrin |
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| GLIMMER | |||
| MICB | |||
| NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 for primært trin 1:100 for sekundært trin |
|
| Live/Død | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_PE | CD34 | APC | 1:25 |
| ULBP-1 | Alexa Fluor 488 | 10 μg/mL for primært trin 4 μg/mL for sekundærtrin |
|
| ULBP-2/5/6 | |||
| ULPB-3 | |||
| GLIMMER | |||
| MICB | |||
| Live/Død | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 | |
| FMO_Alexa Fluor 488 | CD34 | APC | 1:25 |
| NKG2D-Fusionprotein | PE | 1:10 for primært trin 1:100 for sekundært trin |
|
| Live/Død | 7AAD (PerCP-Cy5.5) |
1:1000 |
Tabel 3: Rør, der er nødvendige for at opsætte de væsentlige betjeningsanordninger. Denne tabel viser de rør, der kræves for at oprette korrekt FMO, primære og sekundære antistofkontroller. Alle de nødvendige kontrolelementer (FMO) skal tilføjes af eksperimentatoren for at opnå gyldige resultater og fortolkelige data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi to flow cytometriske metoder, der kan detektere NKG2DL overfladeudtryk på menneskets primære AML-celler. Vi viser, at begge detektionsmetoder kan bruges sammen med andre antistofpletter (f.eks. detektering af CD34-udtryk). Lignende pletter kan også udføres på andre primære celletyper og cellelinjer.
Vi har for nylig vist, at fraværet af NKG2DL på overfladen af AML patient blaster kan berige LSC14. I AML besidder NKG2DL negative, men ikke NKG2DL positive leukæmiske delpopulationer clonogene og in vivo leukæmi-igangsættende kapaciteter. Fremtidig forskning vil vise, om fraværet af NKG2DL overfladeudtryk også kan bruges som et redskab til at berige stamceller i andre kræfttyper.
CD34 har været klassisk vist sig at markere LSC'er i AML, men AML er en meget heterogen sygdom, og ikke alle AML patienter viser CD34 udtryk (dvs. CD34 negative AML18). Vi har tidligere vist, at fraværet af NKG2DL overfladeudtryk er et nyt værktøj til at identificere LSC i denne undergruppe af CD34 negative AML. Her fokuserer vi derimod på undergruppen af CD34-positive AML'er og viser, at der kan forekomme forskellige delpopulationer. Fremtidig forskning vil vise, om co-farvning for NKG2DL i forbindelse med sådanne andre markører (f.eks CD34) kan mere effektivt berige LSC.
I flowcytometry er det vigtigt at medtage passende kontroller såsom FMO for at hjælpe eksperimentatoren med at skelne korrekt mellem positive og negative hændelser. Derudover er positive kontroller for hvert brugt antistof nødvendige for at sikre, at fraværet af farvning ikke skyldes et defekt antistof. Den protokol, vi præsenterer her, bruger kun et begrænset antal overflademarkører, som kan udvides i henhold til eksperimentatorens behov, for eksempel ved tilføjelse af CD33 eller potentielle LSC-markører19. Desuden kan de fluorophorer, der anvendes i denne protokol, tilpasses. Det er vigtigt, at sådanne ændringer ledsages af en antistoftitrering for at bestemme den bedste fortynding.
Et kritisk skridt før farvningen er optøning af primære AML-celler. Ud over deres skrøbelighed opbevares sådanne prøver i dimethylsulfoxid (DMSO), som i sig selv er giftigt for cellerne. Prøverne bør derfor håndteres med forsigtighed og skylles grundigt for at undgå langvarig udsættelse for DMSO. Selvom vores prøver blev behandlet og frosset i henhold til en tidligere etableret protokol15, er det vigtigt at nøje følge de trin, der er beskrevet i manuskriptet for at sikre en høj cellegendannelse. Arbejde med friske prøver vil sikre forbedret levedygtighed og anbefales derfor. I de fleste tilfælde er dette dog ikke praktisk muligt.
En anden faktor, der påvirker den beskrevne metode, er stikprøvespecifik afvigelse, der kan resultere i forskellige cellespredningsprofiler observeret via flowcytometry. På grund af sygdoms heterogenitet er dette uundgåeligt, men bør overvejes i analysen. Yderligere variabilitet kan indføres ved frysning/optøning eller andre mekaniske trin i prøvebehandlingen. Generelt er hurtighed nøglen til at undgå celledød. Alligevel kan døende celler og snavs ikke undgås og skal tages i betragtning og udelukkes i analysen. Gating baseret på FSC / SSC bør ske med grundighed og et kritisk øje, da det er det første trin i prøveanalysen.
En stor fordel ved fusionsproteinet er dets styrke til at detektere alle kendte og potentielt ukendte NKG2DLs, mens specifikke anti-NKG2DL antistoffer (f.eks. MICA, MICB) introducerer en udvælgelsesbias. Begge metoder er lige så gennemførlige. For det analyserede begrænsede antal prøver viste de også meget sammenlignelige resultater. Brug af NKG2D fusionsprotein har nogle store fordele: Mindre tidskrævende, nedsat reagensnummer og antal farvningsprøver samt en lavere sandsynlighed for menneskelige fejl (dvs. pipetteringfejl). Desuden kan denne metode også være mere effektiv til at opfange NKG2DL-udtryk i nogle prøver, da den også bør fange udtryk for ukendte proteiner med NKG2DL-funktionen, som kan udtrykkes i nogle AML-tilfælde. Samtidig med at der gives indsigt i NKG2DL's overfladetilstedeværelse, giver denne metode ikke oplysninger om de intracellulære niveauer af NKG2DL, deres handel eller regulering, og andre assays bør derfor udføres for at få yderligere viden om sådanne spørgsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Swiss National Science Foundation (179239), Foundation for Fight Against Cancer (Zuerich), Wilhelm Sander Foundation til CL (2019.042.1) og Novartis Foundation for medicinsk-biologisk forskning til C.L. Desuden har dette projekt modtaget støtte fra EU's Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftalen nr. 765104. Vi takker Flow Cytometry-faciliteten i Basel for støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
| 96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
| APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
| Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
| FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
| Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
| Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
| Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
| Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
| Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
| MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
| MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
| One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
| Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
| Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
| RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
| RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
References
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
- Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
- Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: "One for All, All for One". Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
- Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
- El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
- Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
- Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
- Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
- Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
- Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
- Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
- Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
- Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
- Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
- Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).
