Summary
Vi beskriver utarbeidelsen av bånd av serielle seksjoner og deres innsamling på stor overføringsstøtte for bruk som Array Tomography-prøver, sammen med automatiserte bildebehandlingsprosedyrer i et skanningselektronmikroskop. Protokollen tillater screening, henting og målrettet avbildning av lokale, sjeldne hendelser og innsamling av store datavolumer.
Abstract
Elektronmikroskopi brukes i biologi og medisin for avbildning av cellulære og strukturelle detaljer ved nanometeroppløsning. Historisk sett ga Transmission Electron Microscopy (TEM) innsikt i celle ultrastruktur, men i det siste tiåret har utviklingen av moderne skanning elektronmikroskop (SEM) endret måten å se inne i cellene på. Selv om oppløsningen av TEM er overlegen når strukturelle detaljer på proteinnivå er nødvendig, er SEM-oppløsning tilstrekkelig for de fleste av de organelle cellebiologiske spørsmålene. Utviklingen i teknologiaktiverte automatiske volumanskaffelsesløsninger som seriell blokk-ansiktsavbildning (SBF-SEM) og fokusert ionstråle SEM (FIB-SEM). Likevel, til denne dagen, forblir disse metodene ineffektive når identifisering og navigering til interesseområder er avgjørende. Uten midler til presis lokalisering av målområder før avbildning, må operatørene skaffe seg mye mer data enn de trenger (i SBF-SEM), eller enda verre, forberede mange rutenett og bilde dem alle (i TEM). Vi foreslår strategien for "lateral screening" ved hjelp av Array Tomography i SEM, som letter lokalisering av interesseområder, etterfulgt av automatisert bildebehandling av den relevante brøkdelen av det totale prøvevolumet. Matrisetomografieksempler lagres under avbildning, og de kan ordnes i inndelingsbiblioteker som er klare for gjentatt avbildning. Flere eksempler vises der lateral screening gjør det mulig for oss å analysere strukturelle detaljer som er utrolig utfordrende å få tilgang til med en hvilken som helst annen metode.
Introduction
Til tross for viktigheten av EM-relaterte teknikker, holder innsatsen som kreves for å mestre dem hele feltet begrenset til et lite antall spesialister. En betydelig vanskelighet er identifisering og gjenfinning av en region av interesse (ROI) i prøvene bevart for EM. Utseendet til den samme prøven varierer betydelig når den analyseres ved optisk mikroskopi og etter behandling for EM-observasjon. Endringene for kjemisk forberedte prøver inkluderer anisotrop prøvekrymping etter dehydreringstrinnene (~ 10% i hver dimensjon) og tap av fluorescens ved bruk av osmium i fikserings- og fargingsprotokollen (Figur 1A). For ultratynnende seksjonering er prøvene innebygd i epoksy- eller akrylharpikser ved hjelp av forskjellige strategier (figur 1B). For vellykkede resultater av dette preparatet må hele prøven fraksjoneres i stykker som ikke overstiger 1 mm x 1 mm. For å oppfylle standard TEM-observasjonsforhold (Transmission Electron Microscopy), er denne lille delen av prøven videre seksjonert til 50-150 nm tykke skiver. De resulterende gråtonebildene viser vevsorganisering og organellstruktur på et minutt brøkdel av hele prøven mer detaljert enn noen annen mikroskopiteknikk (Figur 1C). Et typisk TEM-datasett gir 2D-informasjon, teoretisk ekstrapolert for å forstå prosessene som naturlig forekommer i et 3D-rom i celler og vev. Figur 1D presenterer utfordringen med oppkjøp av ultrastrukturelle volumer: Hvis en kube på side 1000 μm er seksjonert med 50 nm tykkelse, vil det være nødvendig med 20.000 seksjoner for å dekke hele volumet; For en 500 μm sidekube, vil det være 10.000 seksjoner. For å dekke et volum på 50 μm x 50 μm x 50 μm, kan det være nødvendig med 1000 seksjoner "bare". Å skaffe dette volumet manuelt er praktisk talt umulig og ekstremt utfordrende å utføre med automatisering. Hvis vi i tillegg til prøvedybden må dekke hele overflaten av slike hypotetiske kuber, blir dekningen av 1 μm2 overflate med rimelig oppløsning et alvorlig logistisk problem (Figur 1E). Mens for de ekstraordinære store prosjektene, som connectomics tilnærminger, er det store antallet seksjoner avgjørende, for de fleste av de "verdslige" EM-prosjektene, og genererer flere seksjoner som kreves for observasjonen, gir en betydelig ulempe.
Det finnes flere metoder for å skaffe 3D ultrastrukturell informasjon: seriell seksjonering Transmission Electron Microscopy (TEM), TEM tomografi, Array Tomography (AT), Serial Block Face Imaging Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) og Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM). Hovedforskjellene mellom disse metodene er seksjoneringsstrategien og om bildeanskaffelsen er koblet til seksjonsgenerering1. I TEM for serielle inndelinger samles sekvensielle inndelinger på sporrutenett, TEM-bilder genereres fra disse sekvensene og justeres2,3,4,5. I TEM-tomografi gir vippeserier fra 150-300 nm-seksjoner på et rutenett, og når de kobles til seriell inndeling, en svært høy oppløsning, men relativt små volumer6,7,8. AT-tilnærmingen bruker fysisk seksjonering med forskjellige manuelle og halvautomatiske manerer av seksjonssamling på relativt stor støtte, for eksempel glassdekslerlip, silisiumskiver eller et spesielt tape. For bildeanskaffelse analyseres støtten i SEM, med forskjellige bildeanskaffelsesstrategier tilgjengelig9,10,11,12,13,14,15 . For SBF-SEM oppnås fysisk seksjonering ved hjelp av en minimikrotom med en diamantkniv satt direkte inne i SEM-kammeret, med SEM-bildet generert fra overflaten av harpiksblokk16,17,18,19. For FIB-SEM fjerner ionkilden tynne lag av prøven, etterfulgt av automatisk bildebehandling av den eksponerte overflaten av SEM20,21. TEM-tomografi og AT genererer fysiske seksjoner, som kan avbildes om nødvendig, mens FSBF-SEM og FIB-SEM eliminerer delen etter avbildning. En nylig kombinasjon av fysiske seksjoner avbildet av en multi-beam SEM gir en kombinasjon av metoder som løser "flaskehalsen" problemet med hastigheten på bildeoppkjøp22. Hver av disse teknikkene har revolusjonert måten EM-data kan innhentes og analyseres på, og hver tilnærming har sine praktiske effekter knyttet til et gitt forskningsspørsmål.
Gitt arten av preparatet og omfanget av de ultrastrukturelle dimensjonene, er det ikke enkelt å forutsi hvor en bestemt målstruktur ligger i prøveblokken (Figur1D,E). En løsning for ROI-lokaliseringen er å ta opp bildene fra hele blokken med ønsket oppløsning fra begynnelsen. Strukturene av interesse kan være i det oppkjøpte datavolumet når de er borte fra mikroskopet. Innsamlingstid og datahåndtering knyttet til denne strategien er problematisk. Det er ønskelig å redusere mengden registrerte data, spesielt hvis ROIene er mye mindre enn vevsblokken, det vil si hvis gjenstandene av interesse er spesifikke typer celler (ikke hele organer). Ulike korrelative lys- og elektronmikroskopiteknikker (CLEM) kan lykkes når fluorescensen bevares og lokaliseres før eller etter tilberedning i samme prøve23,24,25,26,27,28,29. Likevel er mange cellulære strukturer gjenkjennelige selv uten fluorescenskorrelasjon, bare basert på den kjente ultrastrukturen. I disse tilfellene mener vi at lateral screening Array Tomography gir en balanse avveining mellom innsatsen investert i ROI lokalisering og ultrastrukturell informasjonskvalitet. Ved hjelp av denne strategien blir et undersett av seksjoner på waferen screenet innenfor jevne mellomrom, som kan etableres basert på avkastningens størrelse og natur. Når ROIer er funnet, settes datainnsamlingen opp i en kontinuerlig serie av seksjoner som starter før og slutter etter ankerdelen, og samler inn relevant informasjon på en målrettet måte.
Vi presenterer protokoller for AT som forenkler og akselererer oppkjøpet av regioner eller hendelser av interesse i mange seksjoner og gir bedre justerte bildevolumer. Lateral screening og multistep-anskaffelse produserer data med svært høy oppløsning i nøyaktig målrettede regioner. Prosedyren vi beskriver tar for seg flere utfordringer ved datainnsamling i 3D EM, som den sørger for: kompatibilitet med et bredt spekter av prøver uten fundamental endring av arbeidsflyten for prøveforberedelse; målrettet lokalisering for seksjonering og SEM-oppkjøp; redusert tid og krefter under installasjonen; avbildning av områder i flere seksjoner med bedre justering av de resulterende volumene; og en jevn søm- og justeringsprosedyre for å kompilere forskjellige bilder til et sydd mosaikkbilde. Vi valgte å demonstrere styrken på metoden vår med flere prøver fra publiserte og pågående prosjekter. Vi tror at denne tilnærmingen kan legge til rette for generering og innsamling av målrettede EM-data, selv for etterforskere med begrenset EM-erfaring.
Protocol
MERK: Eksempler på forberedelsesmetoder er beskrevet andre steder14,30,31, og dekkes ikke i denne publikasjonen. Kort sagt, eksemplene som ble vist var kjemisk festet med glutaraldehyd, post-fast med 1% OsO4, deretter behandlet med 1% vandig uranylacetat før innebygging i innebyggingsharpiksen. Alternativt kan prøver fremstilles ved hjelp av høytrykksfrysing, fryse erstattet med 0,1% uranylacetat i aceton og innebygd i akrylharpiks. Prøveblokker ble utarbeidet ved hjelp av en flat innebyggingsmetode som tillater en klar visning av prøven, noe som letter retningen for inndelingen (figur 1B).
1. Prosedyre for generering av rekker
- Innebygd prøveretning og beskjæring
- Bruk kikkerten/mikroskopet til å identifisere og markere avkastningen på den innebygde blokkoverflaten ved å skrape blokkens overflate lett med et barberblad. Dette vil bidra til å orientere prøven inne i ultramikrotomet og vil redusere seksjonsoverflaten.
- Klem prøven på ultramikrotomholderen (Figur 2A).
- Trim harpiksen rundt prøven, først med barberbladet (grov trimming) og fortsett med diamanttrimmingsverktøyet (fin trimming; Figur 2A). Bruk kniver med 20° eller 90° kant helling for å sikre at topp- og bunnflatene på blokken er parallelle med knivens skjærekant.
MERK: Dette trinnet er avgjørende for seriell seksjonering og oppkjøp av rette bånd. - Bland xylen og lim i 3: 1 andel. Med en øyenvippe festet til en tannpirker, bruk denne blandingen på toppen og de nederste kantene på den trimmede blokken. La det tørke grundig.
- Klargjør monteringsstøtten A (dvs. silisiumskiver).
- Klipp waferstykket ved hjelp av et wafer cleaving-verktøy (EMS), og juster størrelsen til prosjektmålet. 2 cm x 4 cm er praktisk for både lys- og elektronmikroskopiobservasjoner.
- Rengjør skiven i destillert vann for å kvitte seg med ruskene.
- Glødutladning/plasma rengjør overflaten ved hjelp av standardutstyr. De nøyaktige parametrene vil avhenge av maskinen som brukes. Start med parametrene for utslipp av gitter og juster tiden empirisk. Dette trinnet er avgjørende for en god spredning av seksjonene på støtten mens seksjonene tørker og bør ikke utelates.
- Klargjør arrayenes monteringsstøtte B (dvs. glassdeksler)
- Hvis du planlegger multippel immunmerkingseksperimenter, kan du overføre prøvene på en dekslelip for bedre å oppdage fluorescenssignalet. For å forbedre dekslerlip lim, bruk en detaljert gelatin-belegg prosedyre er beskrevet tidligere9.
- Øk ledningsevnen ved å belegge lysbildene med indium-tinnoksid (ITO) eller gull ved fordampning. Hold de tilberedte dekslene i et rent miljø. Glød utladning av prøvene som beskrevet i 1.2.3.
2. Seksjonering av prøven
- AT kniv forberedelse
MERK: For å generere matrisene, bruk en modifisert kniv (ATS), designet for å lette oppkjøpet av lange bånd. Histo-Jumbo kniver eller lignende kniver unnfanget for generering av seksjonene på store støtter kan tjene for AT seksjonering også.- Fest nålen til bunnen av kniven ved hjelp av den skummende klebrige tapen og pierce den (Figur 2B). Plasser ATS-kniven i ultramikrotomholderen ved 0°. Juster kanten på kniven parallelt med blokkoverflaten ved hjelp av standardprosedyren.
- Før den trimmede blokken til kanten av kniven i en posisjon som er klar til seksjonering.
- Plasser skiven/dekslene inne i knivbeholderen og fyll den med vann på samme nivå som knivkanten. La diamantkanten av kniven fukte ordentlig og, om nødvendig, trekke ut vann ved hjelp av den vedlagte sprøyten (Figur 2C).
- Array-seksjonering og overføring
- Sett mikrotomet til de ønskede skjæreparametrene. Med ATS-kniven anbefales rekkevidden 50-100 nm og en skjærehastighet på 0,6-1 mm / s. Start inndeling (Figur 2Di).
- Skaff deg et bånd av lengden som dekker et målrettet z-volum og stopp samlingen. Avhengig av blokkstørrelsen, homogeniteten til vevet og typen harpiks, vil båndet være relativt rett (Figur 2D-ii). Mange prøver vil ikke produsere rette bånd, til tross for den investerte innsatsen og typen kniv brukes.
- Avhengig av det endelige målet, gjør du ett langt eller flere korte bånd justert side ved side. En støtte på 2 cm x 4 cm kan enkelt holde 100 til 1000 seksjoner. Arrangementet av båndet på støttetrinnet er et trinn som krever fingerferdighet og stødige hender. Imidlertid er læringskurven for denne ferdigheten raskt oppnådd.
- Løsne båndet fra knivkanten ved hjelp av en ren, ikke-klebrig spiss av en øyenvippe limt på tannpirkeren (Figur 2Diii).
- Bruk øyenvippen til å flytte båndet forsiktig over midten av støttemediet. På dette tidspunktet, bruk kloroform eller varmepenn for strekking av seksjonene om nødvendig. Husk imidlertid at denne manipulasjonen kan føre til båndbrudd og deformasjon.
- Begynn å tømme vannet ved å trekke i sprøyten. For mer delikate bånd eller en langsommere vannuttrekking, la vann dryppe ved å løsne sprøyten fra slangen. Når vannstanden senkes til skivenivået, kontrollerer du båndet og omplasserer det om nødvendig ved å skyve båndet forsiktig til midten. Etter å ha avgjort båndene på waferoverflaten, fortsett å drenere til det gjenværende vannet er helt trukket tilbake fra bassenget.
MERK: Hvis du ikke bruker ATS-kniven for tilbaketrekking av bunnvann, må du forsiktig redusere vannet fra sidene av ATS-kniven for ikke å fremkalle turbulens. - La seksjonene på støtten inne i badekaret tørke helt. Avhengig av hydrofobiskheten til støtte- og miljøfuktighetsnivået, vil vann fordampe med en annen hastighet (Figur 2Div). Det er viktig å la prøven tørke sakte for å avta eller helt unngå alle bretter på prøven.
- Overfør den tørre prøven til en tett lukket boks for å beskytte mot smussforurensning og plasser den i en 60 °C ovn i minst 30 minutter. Om nødvendig, motvirke seksjoner ved hjelp av tungmetaller for å forbedre den generelle kontrasten.
- På slutten av prosedyren, rengjør forsiktig kniven i henhold til produsentens instruksjoner
MERK: Overføringen av flere eller serielle seksjoner på en wafer (Figur 2E) sammenlignet med overføringen på et sporgitter (Figur 2F) endrer EM-forberedelsesopplevelsen helt. Den uavbrutte inndelingen og samlingen av seksjonene på enkel støtte reduserer mengden seksjonerings- og seksjonssamlingsrelaterte feil som hyppige i seriell seksjonering. Tilsvarende 100 seksjoner på 1000 μm x 500 μm samlet på en wafer tilsvarer 33 sporgitter (Figur 2G).
3. Eksempelobservasjon
MERK: Denne delen beskriver arbeidsflyttrinnene som implementert ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig programvare (se Tabell over materialer). Enhver bildeanskaffelsesprogramvare på hvilken som helst SEM utstyrt med de riktige detektorene kan brukes, men de spesifikke brukerhandlingene vil variere og vil ofte være mer manuelle.
- Skaff deg et oversiktskart over SEM-bilder som avslører seksjonsplasseringer på skiven. Et innebygd optisk kamerabilde hjelper deg med å definere en SEM-bildemosaikk som dekker et bånd av seksjoner eller alle seksjoner. Opprett mosaikken ved å klikke og dra med musen rett på kamerabildet av prøven, og start automatisk anskaffelse.
MERK: Svært grove bildebehandlingsinnstillinger, det vil si 1-2 μm pikselstørrelse og 1 μs dvelende tid er nok. Denne prosessen er illustrert i Tilleggsmateriale (side 2-7). - Finn deler med funksjonen Automatisk gjenkjenning av seksjonssøker, eller finn dem manuelt. Seksjonsposisjoner og disposisjoner hentes automatisk med denne programvaren basert på bildegjenkjenning. For illustrasjon av denne prosessen, se Tilleggsmateriale (side 8 - 15).
- Hvis oversiktsbildene ikke viser ROIer tydelig, kan du skaffe bilder med høyere oppløsning av seksjoner. Bruk funksjonen Forhåndsvisning av inndeling til å opprette og hente bilder automatisk. Denne prosessen er illustrert i Tilleggsmateriale, side 16-18. Bildeinnstillinger må velges i henhold til arten og størrelsen på avkastningen som brukeren søker etter.
- Hvis du vil finne optimale innstillinger, aktiverer du Live Imaging i programvaren for mikroskopkontroll og navigerer til én avkastning. Endre bildeinnstillingene til bildene viser ROIer tydelig, men bildeanskaffelsen er ikke for lang.
- Definere bildeområder
MERK: Det foreslås flere ulike strategier.- Hvis bare noen få seksjoner må avbildes, bruker du bildene av seksjoner som er opprettet så langt, til å navigere til de relevante delene og bruke Zoomable Viewer som viser alle innhentede bilder på de opprinnelige relative stedene for å se på alle delene. Når det er funnet en inndeling som skal avbildes med høy oppløsning, oppretter du et bildeområde med klikk og dra. Velg bildeinnstillinger med høy oppløsning, og lagre innstillingene i en mal. Bruk denne malen på nytt for flere deler.
- For å finne spesielt små eller vanskelige å oppdage sjeldne hendelser, bruk Lateral Screening-tilnærmingen. Opprett et bildeområde manuelt med bildeinnstillinger med høy oppløsning i hver tiende del eller på én del per bånd, og hent bildene. Se gjennom bildene og merk seksjonene som inneholder avkastningen i programvaren, eller noter deg.
- Fra inndelinger som inneholder avkastningen, navigerer du fremover og bakover gjennom inndelingssettet og oppretter bildeområder med høy oppløsning på samme relative plasseringer så lenge strukturen fremdeles er synlig i -delen. Dette kan gjøres manuelt eller ved å bruke fremgangsmåten som er beskrevet i de neste trinnene.
- Hent bilder i mer enn ti påfølgende deler. Klikk Startposisjonsforbedring etter at du har zoomet bildet for å øke presisjonen til registrerte inndelingssteder som beskrevet i håndboken. Når du gjør dette, reduseres plasseringen av bildeserien. Prosedyren er illustrert og forklart i Tilleggsmateriale side 19-21.
- Klikk og dra i en inndeling for å definere et bildeområde mens du holder nede Alt-tasten, og velg Opprett matrise for flissett på hurtigmenyen som åpnes når museknappen slippes. Programvaren oppretter deretter bildeområder på samme relative plassering i alle seksjoner som er funnet eller merket tidligere. Det er mulig å begrense bildebehandlingen til et bestemt område med inndelinger med glidebryteren Seksjonsspenn.
MERK: Denne prosedyren kan gjentas med et hvilket som helst antall bildeområder og tillater derfor opptak av mange små høyoppløselige bilder i stedet for å spille inn et enkelt større bilde på hver seksjon. - Når pikselantallet er opprettet, kan du konfigurere pikselstørrelse, flisoppsett, pikselbohetstid osv. Når bildeserier er opprettet og satt opp, vises alle i en jobbindikator.
- Konfigurere automatiske funksjoner og starte bildeanskaffelse
- Opprett en egen bildeserie for automatiske funksjoner ved hjelp av samme metode som beskrevet i forrige trinn. Flytt bildeserien til en plassering i inndelingen som inneholder strukturer med høy kontrast.
- Sett bildeserien til 1024 x 884 piksler, og velg en pikselstørrelse som tilsvarer den høyeste oppløsningen som ble brukt i bildeserien som ble satt opp i de forrige trinnene. I listen over automatiske funksjoner merker du av for Autofokus og Auto Stigmator.
- Velg Etter inndeling i kontrollene for anskaffelsessekvensen, og kontroller at bildet for automatiske funksjoner er det første elementet i listen. Start bildeanskaffelsen ved å klikke Kjør -knappen ved siden av jobbindikatoren. Disse prosedyrene er illustrert i Tilleggsmateriale, side 22-23.
MERK: Det er ikke nødvendig å forhåndsfokusere manuelt på hver seksjon. Under innspillingsøkten, når mikroskopet går videre til en ny seksjon, vil autofunksjonene bli utført før alle andre bilder blir tatt opp i denne delen.
4. Datajustering og analyse
- Eksport av data
- Kontroller at data lagres i .tif format, så det er ikke behov for en dedikert eksportfunksjon. Sortere data i en mappestruktur som tilsvarer lagene og elementene i lagtreet.
- Når bildemosaikk er tatt opp, bruker du StitchAll-funksjonen til å sy alle brikkene automatisk.
- Stable justering og beskjæring i Fiji
NOTAT. Mange programvarepakker (gratis og kommersielle) kan brukes til å arbeide med Array Tomography-data. Trinnene nedenfor vises med åpen kildekode-programmet Fiji32 fordi det er allment tilgjengelig og inneholder alle nødvendige funksjoner.- Importer en stabel med bilder (eller sydde bilder) til Fiji som en virtuell stabel.
- Hvis kontrast/lysstyrke må normaliseres, velger du Forbedret kontrast... fra Prosess-menyen. Sett Mettede bildepunkter til 0,1 eller mindre, og merk av for Behandle alle stykker.
- Velg Registrering på Plugins-menyen | Lineær stakkjustering med SIFT.
- Velg Stiv eller Affine på rullegardinmenyen Forventet transformasjon. Hvis ikke, beholder du standardinnstillingene. Start justeringen ved å klikke OK.
MERK: Ved å laste inn dataene som virtual stack kan Fiji håndtere stabler av alle størrelser. Utdataene for justeringen opprettes i RAM. Dette kan imidlertid begrense den maksimale størrelsen på stakker som kan behandles. I så fall bruker du Registrer virtuelle stack slices, som er en mappe-til-mappe-implementering av samme registreringsalgoritme. Når registreringen er fullført, laster du inn utdatadataene som en virtuell stakk. - Beskjær bildestakken ved å klikke Beskjær slik at den bare inneholder avkastningen.
- Lagre stakken som ett enkelt .tif bilde eller en serie med .tif bilder.
MERK: Kritiske trinn i matrisetomografi vises i figur 3.
Representative Results
Eksemplene nedenfor tar sikte på å demonstrere allsidigheten til de anbefalte arbeidsflytene. Casestudieillustrasjonene er prosjekter som vi hadde problemer med å oppnå tilfredsstillende resultater med andre teknikker. Vi valgte Drosophila voksen for å illustrere typiske utfordringer man kan støte på med mange typer prøver. Dette rørformede organet på ca. 6 mm langt, 500-1000 μm i tverrsnitt, er delt inn i forskjellige regioner med en unik funksjon og cellulær sammensetning (Figur 4A)33. Avhengig av seksjonsretningen varierer dimensjonene til tarmprofilen og utseendet på delen. Enten tverrgående eller langsgående orienterte seksjoner er relativt store, og bare et par kan plasseres på et enkelt TEM-rutenett (Figur 2F). Bare en liten del av vevet kan avbildes i FIB, og for SBF-SEM er vanskeligheten lik alle ikke-homogene prøver. AT gir en effektiv avveining for analyse av slike prøver og flat innebygging letter ROI-lokaliseringen. Forsiktig trimming av egenandelen rundt det valgte området (Figur 4B) er viktig for effektiv innsamling av matrisene fra det aktuelle området (Figur 4C). Hundrevis av seksjoner kan samles på en enkelt wafer sekvensielt eller tilfeldig (Figur 4D). Avhengig av problemstillingen vil utvalgsscreening og oppkjøp kreve en annen strategi, som vi vilkårlige delt inn i flere scenarier. For å illustrere ulike presenterte scenarier på en mer målrettet måte, valgte vi flere casestudier fra det ulike forskningsprosjektet.
Analyse av mange tilfeldig fordelte store strukturer 1-10 μm område (Figur 4E)
Ofte kreves ultrastrukturelle data for å validere en hypotese som oppsto fra flere eksperimentelle tilnærminger, og sammenligner en standard og eksperimentelt endret tilstand. I disse tilfellene samles flere seksjoner vanligvis tilfeldig inn på rutenett og screenes for å lokalisere og avbilde interesseområdene. Denne taktikken er vanligvis mindre systematisk og begrenset til et lite antall analyserte seksjoner. Vi foreslår opptaksoversikter over titalls/ hundrevis av mellomoppløselige seksjoner fra et gitt bånd (Figur 4D). For typiske seksjoner på 70 nm vil 200 seksjoner strekke seg over ca. 14 μm, som vil inneholde mange celler, enten helt eller delvis, fullført innen en halv time. Som det første trinnet registreres lavoppløsningsoversikten over hele båndet, og oversikten bidrar til å utelate delene som viser forberedelsesartefakter (f.eks. bretter, smuss). Deretter kan oppkjøpet utføres manuelt eller automatisk direkte på utvalgte deler av seksjonen, eller en hel seksjon, ved hjelp av enkelt- eller mosaikkavbildning, etterfulgt av søm (figur 4E). Etter kan bilder fra det valgte området hentes ved hjelp av høyoppløselige parametere. Mitokondrier, kjerner og mikrovilli kan for eksempel dra nytte av en slik statistisk forbedret metode (Figur 4Ei-iii).
Analyse av flere små, tynt distribuerte strukturer 500-1000 nm rekkevidde (Supplementary Movie 1)
I dette scenariet kan ikke avkastningen bare identifiseres i en skanning med lav forstørrelsesoversikt, og bilder med høy oppløsning er nødvendig. I konvensjonelle TEM-prøver er det nødvendig med kjedelig zooming inn og ut av seksjonen til den nødvendige funksjonen er funnet. Ofte er avbildning av flere uavhengige steder i flere utvalg mer relevant statistisk enn genereringen av et enkelt stort volum. I slike tilfeller vokser kompleksiteten i manuell oppkjøp eksponentielt. Selv om flere TEM-løsninger muliggjør automatiske anskaffelser eller screening av flere nett, gjør størrelsen på nett- og serieseksjonsutfordringene ofte tilnærmingen inkompatibel for mange prøver. I lignende tilfeller genererer vi et komplett mellomoppløselig kart over en samlet avkastning i flere seksjoner ved en løsning som er tilstrekkelig til å identifisere strukturene av interesse. I løpet av dette laterale screeningtrinnet er det tilrådelig å hoppe over flere seksjoner om gangen, med sikte på å treffe minst en del av strukturen av interesse når de nærmer seg tilfeldig. Dette vil i stor grad avhenge av strukturens overordnede dimensjoner: Hvis for eksempel den totale størrelsen på strukturen er 500 nm og seksjonene er 50 nm tykke, vil minst ni sekvensielle seksjoner på rad sannsynligvis inneholde en del av strukturen av interesse. På denne måten skal hoppingen av 6-7 seksjoner være effektiv for å finne mange forskjellige typer strukturer på flere områder. Automatisk oppkjøp av de løste mosaikkkartene til utvalgte seksjoner muliggjør nøye screening av disse seksjonene etter oppkjøpet. Når et slikt høyoppløselig kart er anskaffet, kan flere ROIer beskjæres eller brukes til å definere flere lokale bildeområder på ROIer (Tilleggsfilm 1). Golgi, centrioles, veikryss, mikrotubuler, forskjellige typer vesicles er gode eksempler på strukturer som kan dra nytte av dette scenariet (Supplementary Movie 1).
Analyse av tynt distribuerte store ROIer i store utvalg (figur 4F-4H)
Dette scenariet innebærer sjeldne hendelser, som ofte beskrives som "en nål i en høystakk" der problemet ikke er i ROI-identifikasjon, men lokalisering. For mange prøver er korrelativ tilnærming ikke et gyldig alternativ, men ofte har avkastningen en avslørende ultrastruktur og, når den er lokalisert, kan identifiseres med høy pålitelighet. For disse prøvene er det viktig å bruke anskaffelse på flere nivåer, fra og med de forhåndsscreenede prøvene med titalls til hundrevis av seksjoner med middels oppløsning. I programvaren som brukes her, er det to forskjellige strategier for å skaffe bildesett med flere seksjoner: Spille inn forhåndsvisningsbildene med høyere oppløsning eller anskaffe et array-flissett med passende innstillinger (Figur 4F). Ulike spesialiserte celletyper iDrosophila-tarmen fordeles tilfeldig (f.eks. stamme, enterokrine celler) og tynne seksjonert ved tilfeldig orientering. Likevel kan de visuelt skilles etter screening av bildene som er oppnådd ved hjelp av høyoppløselige parametere enten fra enkeltdeler eller som en samling serielle bilder (Figur 4G). Etter justeringen kan stakkene gjengis ved hjelp av forskjellige programvareløsninger (Figur 4H, Tilleggsfilm 2).
Scenario 1: Organoider i tarmen (Figur 5A)
Organoider blir raskt et av de mest banebrytende verktøyene i moderne livsvitenskap. Denne nesten fysiologiske 3D stamcelle-avledede organmodellen gjør det mulig å få en nøyaktig studie av en rekke in vivo biologiske prosesser, inkludert vevsfornyelse, respons på legemidler og regenerativ medisin. Nylig introdusert mini-gut rør34 åpne opp en ny generasjon organoid teknologi, nært ligner in vivo vev fysiologi, celle-type sammensetning, og homeostase, muliggjør brede perspektiver for sykdom modellering, host-microbe interaksjon, og narkotika oppdagelse. Men når ultrastrukturell karakterisering er nødvendig, kan lokalisering av forskjellige celletyper i så stort vev ved hjelp av tilfeldige prøver være utfordrende. Også i variable "infeksjonsanalyser" er det avgjørende å sikre at analysen avslører forskjellige utviklingsstadier som påvirker vevet. For slike studier er statistisk signifikant dekning av utvalget sentralt, men likevel vanskelig å oppnå ved hjelp av den tradisjonelle TEM-tilnærmingen på nettet. AT-scenario 1 er gunstig i slike tilfeller: mange sekvensielle seksjoner kan genereres på en wafer (Figur 5Aii) og screenes ved hjelp av lavoppløsningsparametere for å lokalisere de generelle interesseområdene (Figur 5Aiii; piler). Disse områdene kan målrettes mot videre analyse ved hjelp av avanserte anskaffelsesparametere (Figur 5Aiv og Figur 5Av). Når en relevant struktur oppdages (vanligvis en klynge med 5-10 seksjoner én gang i hver 100-300 seksjon), er det enkelt å konsentrere seg om hver av strukturene av interesse og skaffe seg enkeltbilder manuelt eller bruke automatiseringsfunksjonene til å skaffe bildevolumer på tvers av flere seksjoner.
Scenario 2: Drosophila pupal notum ( Figur5B)
Å studere celledeling og mekanismene som styrer progresjonen gjennom cellesyklusen er avgjørende for å forstå både standard og endrede prosesser i multicellulære organismer. Informasjon som finnes, avledes ofte fra encellede systemer. Denne løsningen mangler imidlertid den kritiske konteksten av 3D-interaksjonene mellom cellene i et vev. En encellet monolayer av notumet, den utviklende baksiden av Drosophila-larven, er en perfekt modell for samspillet mellom epitelceller generelt og celledeling spesielt35. Det er en etablert modell for molekylære og cellulære interaksjonsstudier ved hjelp av kombinasjonen av dataene som er tilgjengelige ved fluorescerende mikroskopi og genetiske manipulasjoner. Abscission, det siste trinnet i celledeling, sikrer den endelige separasjonen mellom to skilleceller, og karakterisering av de strukturelle endringene som oppstår under abscission er avgjørende for vår forståelse av mitose. Imidlertid er mititotiske divisjoner i notumet ikke lett å lokalisere på ultrastrukturelt nivå: cellene er relativt store, sammenlignet med abscission-sonen (Figur 5B). Forholdet mellom den totale størrelsen på abscission-sonen og overflaten av delen som skal dekkes er stor (Figur 5Bi). Selv om det er mulig å lokalisere abscission-sonen ved hjelp av TEM- eller SBF-SEM-metodene36, er oppgaven arbeidskrevende. Med dette scenariet kan de automatiske oversiktsbildene med middels oppløsning av sprangene på 20-40 seksjoner brukes til å lokalisere delingscellene (Figur 5Bii). Når slike celler identifiseres, tjener seksjonene som anker for nærmere undersøkelse av seksjonene i nærheten, og mange skilleceller kan bli funnet og valgt for videre analyse. På denne måten kan abscission-sonen plasseres og avbildes i sin helhet (Figur 5Biii). Avhengig av spørsmålet kan enkeltbilder med høy oppløsning eller 3-7 bildesekvenser samles inn for å dekke dybden på strukturen (Figur 5Biv).
Scenario 3: Mus tanycytt nevroner (Figur 5C)
Musen gir en veletablert modell for hjerneutvikling og er godt dokumentert på forskjellige nivåer, inkludert av EM. Selv om ulike automatiserte serieblokk-ansiktsmetoder har blitt brukt mye for å studere hjernevev, er det tilfeller der AT er bedre tilpasset for å samle inn de nødvendige dataene. Hypothalamus er en veletablert nevrovitenskapsmodell, en del av hjernen som inneholder flere nevrontyper funksjoner. Hypothalamus tanycytter representerer en bestemt undergruppe av ependymogliale celler som fôrer bunnen av den tredje ventrikelen, med uvanlig lange prosesser (opptil 300 μm) og stor endfeet (~ 5 μm)37. Dette gjør dem upraktiske for analysen enten ved hjelp av TEM- eller FIB-metoder. Oppgaven er ytterligere komplisert når flere uavhengige tanycytter må lokaliseres og analyseres. En av tilnærmingene for å lette denne oppgaven kan være semi-korrelasjonsmålretting, der fluorescenskartet er hentet fra de fluorescerende merkede prøvene før du fikser og legger inn for EM. Seksjoneringen utføres på området som fanges opp ved å kombinere posisjonsinformasjonen fra fluorescensprøven og den flate innebygde plastkopien. Etter det kan AT-scenariet 3 brukes: Mosaikkbildene på høyt nivå genereres for å avsløre regionene med tanycytt endfeet-klynger. Deretter brukes automatiseringsfunksjoner i programvaren til å sette opp anskaffelse av sekvenser av bildene fra ett eller flere områder i en enkelt bilde- eller flismodus. Disse bildene kan analyseres separat, som justerte stabler eller gjengis etter det.
Kraften i AT-metoden tillater den relativt uanstrengte "oppgraderingen" av data fra 2D til 3D: kartene er tilgjengelige fra den primære anskaffelsen, og volumene kan fås fra det valgte området og dets nærhet. Den resulterende stakken kan justeres og gjengis senere. Det er viktig å bestemme på forhånd hvilken oppløsning og bildekvalitet som trengs for å finne ROIer. Imaging bør gjøre det mulig å gjenkjenne ROIene, men ikke utover denne verdien fordi anskaffelsestiden skaleres proporsjonalt til pikselbotid og den inverse firkanten av pikselstørrelse.
Figur 1: Utfordringer med EM-prøvepreparering og volumanskaffelse. (A) Tapet av fluorescens og krymping skjer på grunn av høy tungmetallkonsentrasjon og dehydrering under prøvepreparering. (i) En skjematisk tegning av en prøve observert under LM (ii) den samme prøven forberedt for EM, som blir helt ugjennomsiktig og mister rundt 10% av volumet. (B) Prøveinnbygging gjøres vanligvis ved hjelp av epoksy- eller akrylharpikser. Tradisjonelle blokker (i) kan med hell brukes til homogene prøver som ikke krever en bestemt orientering. Flate blokker (ii) er nyttige når det er viktig å målrette og orientere under mikroskopet, et presist område rettet mot seksjonering, for eksempel i ikke-homogene prøver eller korrelative mikroskopiprosedyrer. (C) Av hele prøvevolumet er bare en begrenset brøk representert på en enkelt 50 nm-del, noe som gir et 2D-bilde av en 3D-prøve, ofte i en ukjent retning. (D) For å illustrere problemet med å registrere altfor store volumer kontra presis målretting, valgte vi tre konsentriske kuber med ansiktene på 1000, 500 og 50 μm er organisert for å inkludere en hypotetisk 1000 x 500 x 500 μm prøve (mørk rødbrun). Hvis slike hypotetiske prøvebiter er grundig seksjonert med 50 nm skiver, for å dekke hele volumet, vil det kreve totalt 20.000, 10.000 og 1.000 skiver, og 800 tb, 100 tb og 100 gb, tilsvarende (bildeoppløsning 5 nm x 5 nm x 50 nm, 8 bit data). Dette viser viktigheten av å planlegge innsamling av EM-data bare for å skaffe det minste nødvendige volumet. (E) Hvis du vil dekke et stort prøveoverflateområde i høy oppløsning, er det et problem som ligner på store volumer. Å plassere flere høyoppløselige bilder i ett er en nyttig løsning på et slikt problem. Men for å dekke en 1 mm x 1 mm overflate ved hjelp av 2024 x 1048 rammen i 10,000x forstørrelse vil kreve et stort antall fliser, noe som kan bli utfordrende å sy. Hvis inndelinger komprimeres eller forvrenges under kutting, blir de resulterende datastakkene nesten umulige å justere. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Arbeidsflyten for direkte generering av rekkene av seksjoner på stor støtte. (A) For tett trimming ved hjelp av trimverktøyet festes blokker inne i mikrotomholderen. Dette trinnet bidrar til å sikre parallelle sider av en blokk og reduserer også tom harpiks rundt prøven. (B) En modifisert kniv for AT seksjoner oppkjøp. En stor båt letter overføringen av seksjonene og deres manipulering under prøveseksjon og overføring på støtten. Et stort basseng muliggjør manipulering av seksjonene; dreneringssystemet begrenser bevegelsen av båndene under dreneringstrinnet, den flate bunnen gjør gradvis tørking av støtten pålitelig. (C) Kniven, klar til seksjonering med en glødeutladet skive plassert på bunnen av bassenget og vann som er nivellert til kantene. Konstruksjonen av kniven holder nålen innebygd, uten å forstyrre støtten. (D) Array generering, topp visning på mikrotome seksjonering området. (i) De første seksjonene er vanligvis enkle å få tak i når de holder seg til hverandre og danner et vanlig bånd. (ii) Når flere inndelinger legges til på båndet, og det blir lengre, mister båndet stabiliteten og ofte kurver. Det er avgjørende å holde sekvenssporene organisert i rekkefølge som forberedelse til bildeanskaffelsestrinnet. (iii) Når et bånd av seksjoner når ønsket lengde, løsnes det forsiktig fra knivkanten ved hjelp av en øyenvippe. (iv) Vann dreneres fra bassenget; skiven forblir inne til den er helt lufttørk. Dette trinnet er viktig, da det bidrar til å rette seksjonene og unngå dannelsen av mikrofoldene. Skiven er plassert i ovnen ved 60 °C i minst 30 minutter for å feste seksjonene på støtte. (E) Eksempelskiver med de overførte seksjonene. Selv om det er praktisk å oppnå rette og nøyaktige bånd, forhindrer faktiske prøver dannelsen av slike ideelle bånd i de fleste tilfeller. Likevel er selv "slurvete" bånd veldig informative for det store antallet tilfeller, og betydningen av det "ryddige" båndet vil avhenge av en forskningsstrategi som seksjonene samles inn for. Skalastang 1 cm. (F) Eksempel på sporrutenett med de serielle delene. Selv når mange seksjoner samles på ett rutenett, er det fortsatt en liten brøkdel av det som kan samles på en enkelt wafer. Ferdigheten som kreves for å mestre overføringen av seksjonene på et rutenett (spesielt sporgitter) representerte en betydelig flaskehals for å mestre elektronmikroskopiprøvepreparering. Skalalinje 500 μm. (G) Uansett hvilken seksjonsinnsamlingsmetode som ble brukt, er styrken til AT-tilnærmingen den relative enkle genereringen av sekvensielle seksjoner, sammenlignet med samlingen på rutenettet. Hvis en prøveblokk på 1000 μm x 500 μm vurderes, er det ikke noe problem å passe rundt 100 seksjoner på en 2 cm x 4 cm wafer (i). De samme størrelsesdelene på et sporrutenett passer bare til tre seksjoner/rutenett maksimalt (ii). Vi tilbyr et skalert bilde for å vise hvor mange rutenett som kan være nødvendig for å dekke samme antall seksjoner, uten å nevne vanskeligheten med å samle serielle seksjoner på rutenettet. Skalastang = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kritiske trinn i arbeidsflyten matrisetomografi. Skjematisk for arbeidsflyten for uovervåket anskaffelse av bildestakker med høy oppløsning. Alle forberedende trinn er automatiserte (grønne girsymboler) og krever ingen handlinger som skal utføres manuelt, seksjon for seksjon. Bildestakker kan justeres i alle bildeanalyseprogrammer som er i stand til automatisk stiv eller affine justering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tre oppkjøpsscenarier med Drosophila voksen tarm som demonstrasjonsmodell. (A) tegning av en dissekert Drosophila midgut, med tre hovedregioner utpekt av forskjellige farger: fremre, midtre og bakre. (B) Trimmet flat blokk der en tarm er orientert for tverrgående seksjonering. Vær oppmerksom på at den tomme harpiksmengden er nøye balansert rundt vevet som inneholder interesseområdet (hvitt rektangel). (C) Tverrgående serielle seksjoner flyter på vannoverflaten inne i vasken på AT-kniven. Alle bilder ble anskaffet i sekundær elektron SEM-modus ved hjelp av speildetektoren med den inverse kontrasten. (D) Sydd mosaikk bilde av tverrgående serielle seksjoner på en wafer. Skala bar er 1000 μm. (E) Tverrsnitt gjennom Drosophila tarm. Skala bar 20 μm. Bildet er en sydd mosaikk av 7 x 7 mellomtonebilder. Innsett - høyere forstørrelses- og oppløsningsbilder av de spesifikke interesseområdene: (ii) kjerne, (iii) børstekantlinje og (i) mitokondrier. Skalastang 5 μm for alle. (F) Et mellomtonebilde av en tverrgående inndeling gjennom tarmen som er rettet mot plasseringen av utviklingsceller (firkantet). Skalalinjen er 20 μm. (G) Den målrettede matrisen av serielle seksjoner samlet inn basert på området som er lokalisert under analysen av avsnittet som finnes i panel F. Skalalinjen er 10 μm. (H) 3D-modellen gjengis basert på 50 seksjoner stakksekvens hentet fra den målrettede serielle oppkjøpet i panel G. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Casestudier for AT-applikasjonsscenarioene. (A) Lokalisering av forskjellige cellestrukturer i tarmorganoiden. (i) Innebygd silisiummikrochip. Skalastang = 200 μm. (ii) Et sydd mosaikkbilde av 127 tverrsnitt gjennom den sentrale delen av brikken. Skalastang = 1500 μm (iii) Fire bilder med lav oppløsning av en komplett tverrsnitt gjennom den delen av tarmorganoidet. Piler peker på det potensielle interessestedet. Skalalinjen er 20 μm. (iv) Forskjellige ROIer, målrettet mot mikrografer med lav oppløsning valgt for videre analyse. Skalalinje = 10 μm. (v) Høyoppløselig bilde av den infiserte cellen av interesse. Analyse av samme region i de tilstøtende delene kan gi målrettet 3D-informasjon om nødvendig. Skala bar = 5 μm. (B) Midbody lokalisering i Drosophila melanogaster pupal notum. (i) Et skjematisk syn på en dissekert Drosophila pupa. Notum eksponert for disseksjonen (beige) etter fjerning av den delen av den beskyttende kutiklen (brun). Den svarte linjen angir retningen for inndeling (ii) Et tverrsnitt gjennom området som presenteres i diagrammet. Bildet kombinerer 3x7 sekvensielt tatt høyoppløselige SEM-bilder sydd til ett mosaikkpanel. Det svarte rektangelet avgrenser området som inneholder en delingscelle. Skalalinjen er 15 μm. (iii) Et zoomet bilde på delecellen fra panel ii. Ved denne forstørrelsen og oppløsningen er midbody tydelig (hvite piler). Hele inndelingen analyseres for å finne de delte cellene. Hoppe mellom ulike bånd av seksjoner i 20-30 seksjoner intervaller under lateral screening trinn tillater sto lokalisere mange dele cellepar. Skalalinjen er 5 μm (iv) når en delingscelle er lokalisert, sekvensielle bilder av midbody samlet fra fire seksjoner rundt midbody avgrenset av gul firkant i panelet (iii). Skalalinjen er 1 μm. (C) Tanycytes endfeet lokalisering i mus hypothalamus. (i) Fluorescensbilde av en vibratomskive. Tanycytter uttrykker tdTomato fluorescerende protein (rødt). Et hvitt rektangel avgrenser interesseområdet. Skalastang 500 μm. (ii) Samme vibratome seksjon utarbeidet for EM vil bli nøye trimmet rundt interesseområdet basert på indirekte korrelasjon av fluorescerende informasjon fra panel (i). Den prikkete hvite linjen representerer området med ultratynn seksjonering. Skalalinjen er 50 μm for begge panelene. (iii) Tverrsnitt gjennom vibratomskiven i interesseområdet. SEM mosaikk bilde består av 75 sydde bilder. Flere seksjoner er målrettet av lateral screening og avbildet med lignende parametere. Seksjonene analyseres "offline" for å finne avkastningen - tanycytten endfeet. Det svarte rektangelet representerer området som inneholder tanycyttsluttfeet. Denne delen vil fungere som et anker for videre analyse. Skalalinjen er 15 μm. (iv) Høyoppløselig, høy forstørrelsesbilde av tanycytt endfeet rundt et blodkar. Etter den første lokaliseringen av avkastningen på en seksjon, samles z-sekvensen fra de tilstøtende seksjonene oppstrøms til ankerdelen (panel iii). Skalalinje 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Problemer under ultramikrotomi, seksjonsinnsamling og seksjonslagring kan føre til gjenstander. (A) Hjerneprøveseksjoner på en wafer. Det meste av den tomme harpiksen løsnet fra vevet og brettet på seg selv (sepia). Stiplet svart boks angir et område som brukes til å inneholde hele inndelingen. Skalastang 500 μm. (B) En liten, lokal fold på overflaten av en 50 nm tykk sebrafiskseksjon. Skala bar 1 μm. (C) Knivmerke på overflaten av en 70nm mus hjerne seksjon. Skala bar 5 μm. (D) Håret (stjerne) på overflaten av skiven som delvis dekker en sebrafisk muskelseksjon. I gult er vevet målrettet for analysen. I rosa, en celle som brukes til å tjene som en referanse for størrelsen på det berørte området. Skala bar 50 μm. (E) Sebrafisk notochord med rynker nederst til høyre (svarte piler), hvor tett nevralt vev (skyggelagt i blått) grenser på mykere muskelvev og tom harpiks (svarte piler). Skalalinje 10 μm. (F) Volumsegmentering av en stabel med 50 bilder som i E, som viser at denne regionen viste rynker i de fleste seksjoner. Stiplet polygon skisserer området som vises på G. Skalalinjen 10 μm. (G) XY-visning av samme volumsegmentering som i F, og viser rynkene som korte svarte slag i høyre halvdel av blokken. Legg merke til at justeringen av stabelen i de resterende delene av vevet ikke påvirkes av rynker. Skalastang 5 μm. (H) XZ projeksjon av samme område som i G, viser rynker i alle 50 seksjoner. Skalalinje 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfilm 1: Et høyoppløselig montasjebilde av et tverrsnitt gjennom Drosophila fremre midgut. Mosaikkbilde av et invertert SE-MD SEM-bilde. 352 separate bildefliser ble automatisk anskaffet med 5 nm oppløsning og sydd for å presentere hele tverrsnittet. Det er mulig å zoome inn for flere detaljer og få en uttømmende dekning av dataene ved hjelp av samme bilde. Tette veikryss, microtubuli, forskjellige typer vesicles kan være når du zoomer inn. Skalalinjen er 10 μm. Klikk her for å laste ned denne filmen.
Tilleggsfilm 2: Drosophila tarmceller gjengivelse. Femti justerte mosaikkbilder av seksjonene i området med å dele tarmceller. IMOD-gjengivelse av cellekantlinjer (blå, turkis og oransje) og kjerner (hvit). Klikk her for å laste ned denne filmen.
Tilleggsmaterialer. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Elektronmikroskopi gir innsikt i ultrastruktur av cellene og organismene, som det ofte er ønskelig å bildestrukturer av interesse for i deres 3-dimensjonale kontekst. Til tross for mange EM-taktikker for ultrastrukturell analyse, er det fortsatt ingen "gullstandard" -løsning. Hovedårsaken er det brede utvalget av prøver, mange biologiske spørsmål, som ofte krever en skreddersydd tilnærming. Den foreslåtte AT-arbeidsflyten er utformet for å minimere tiden som er nødvendig for prøvebehandling, datainnsamling, evaluering og lagring. Videre gir den modifiserte kniven et nyttig verktøy for å forenkle matriseanskaffelse. Den kompakte utformingen av seksjoner på wafers er praktisk, både for observasjon og etterfølgende lagring av prøvene. Denne ordningen gjør det mulig å "Lateral Screening" av eksempler ved å flytte vannrett fra bånd til bånd og skanne bare én del på hver, noe som reduserer tiden det tar å lokalisere en avkastning. Foreslåtte datainnsamlingsscenarier legger til rette for målretting av små og tilfeldig fordelte områder. Når AT/SEM er funnet, begrenses bildet med høy oppløsning nøyaktig til det interessante volumet, enten det utføres manuelt eller ved hjelp av automatisk funksjon. AT for begrensede volumer kan fullføres manuelt, med operatøren som navigerer gjennom prøven og definerer bildeområder en etter en. Den automatiserte modulen av programvaren gir en fleksibel bildeinnhentingsstrategi for avbildning av små områder på store seksjoner. Automatiseringen i denne programvaren gjør det mulig å spille inn store høyoppløselige bilder på hundrevis av seksjoner, og oppnår lignende volumer som SBFI. Registrering av oversiktsbilder av alle seksjoner forenkler ROI-lokaliseringen og reduserer tiden som brukes på mikroskopet. Siden avsnittene ikke skades under opptak av oversikter og forhåndsvisninger med høyere oppløsning, tillater AT/SEM gjenbruk av prøven til å samle inn ytterligere data om andre ROIer eller med høyere oppløsning.
Bildeanskaffelsestid er en av de viktigste (og dyreste) aspektene ved 3D EM og bør derfor vurderes i eksperimentdesignet. Selv om det ikke er overraskende at det tar lengre tid å forestille seg store områder enn å forestille seg små områder, er det enkelt å undervurdere virkningen: Avhengig av hvilke bildeparametere som er valgt, kan anskaffelsestiden på hver seksjon variere fra sekunder til timer. Kritiske bildeparametere inkluderer størrelsen på synsfeltet, oppløsningen og oppholdstiden. Forutsatt en måloppløsning på 10 nm per piksel og 1 μs oppholdstid, tar bilde av et felt på 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm eller 500 μm x500 μm tar 4 sekunder, 100 sekunder eller 2500 s å registrere. Vi kan multiplisere disse bildetidene per seksjon med antall seksjoner for å estimere tiden som kreves for hele bildebehandlingsjobben. Lange bildetider per seksjon kan være akseptable hvis antall seksjoner er lite eller hvis mikroskopverktøyets tid ikke er til bekymring.
Det er imidlertid nødvendig å begrense opptakstiden til en overnattingsjobb eller en helgejobb i de fleste tilfeller. Et like kritisk aspekt ved 3D EM som bør vurderes, er mengden og strukturen til de resulterende bildedataene. Registrering av bildefelt ovenfor i 100 deler genererer henholdsvis 400 mb, 10 gb eller 250 GB bildedata. bildene på 500 μm x 500 μm utgjør det ekstra problemet med å være større enn 2 gb hver. Mange av programmene som brukes til dataevaluering, kan ikke åpne bilder av denne størrelsen.
For å redusere bildetiden er det viktig å velge pikselbohetstid for å oppfylle kravene til signal-til-støy-forhold for den påfølgende dataevalueringen (f.eks. rekonstruksjon, sporing) og begrense opptakene til definerte ROIer. AT-utvidelsen av programvaren letter bildeanskaffelse i små områder i serielle seksjoner. Programvaren støtter manuelle og automatiske arbeidsflyter og mange halvautomatiske varianter: Bildeområder kan plasseres manuelt og fokuseres på hver seksjon, eller brukeren kan bruke funksjonene for automatisk seksjonssøker og posisjonsjustering. Avhengig av nivået på automatiseringen som er valgt og støttet av eksempeltypen eller bildemålene, kan tiden som kreves for å sette opp bildeinnhenting i hundrevis av seksjoner, ta en hel arbeidsdag (gjøres manuelt) eller bare noen få minutter. I prinsippet gjør Array Tomography det mer utfordrende enn andre 3D EM-metoder for å skaffe seg små ROIer; upresis regionplassering på påfølgende seksjoner må kompenseres ved å anskaffe større områder. For eksempel, hvis avkastningen er 20 μm x 20 μm i størrelse og seksjon-til-seksjon-posisjonsvariabiliteten til bildefelt er 10μm, må man skaffe seg 40 μm x 40 μm bilder for å være sikker på at avkastningen er fullstendig fanget i hvert bilde, på hver seksjon. Variasjonen i bildeposisjonen i den virkelige verden varierer fra 100 μm til <10 μm, avhengig av tilgjengeligheten eller kvaliteten på programvarefunksjoner for posisjonsjustering eller brukerens tålmodighet. Med denne programvaren kan 10 μm oppnås uten for mye manuell inngripen i de fleste prøver.
Som enhver teknikk har AT flere svake punkter som kan påvirke vellykket datainnsamling, og mange ligner på andre seksjonsbaserte metoder. Mangel på homogen fordeling av tom harpiks versus vev kan resultere i buede eller ødelagte matriser. I ekstreme tilfeller kan seksjoner løsne fra støtten (Figur 6A). Variabel komprimering eller strekking under skjæreprosessen kan skape bretter som kan forstyrre prøven i variable områder i etterfølgende seksjoner (Figur 6B). Knivmerker kan vises på overflaten av de oppsamlede delene med en skadet kniv (Figur 6C). Forskjeller i seksjonsforhold kan føre til sporadiske kompresjons- og tykkelsesforskjeller. Støv- eller smusspartikler kan lande på en seksjon og delvis skjule interessesonen (Figur 6D). Bildeanskaffelse kan mislykkes på grunn av ufullkomne funksjoner for automatisk kontrast, autofokus og automatisk stigmator. Plasseringen av automatisk opprettede bildeområder kan være variabel og kan mislykkes i å fange opp avkastningen i alle seksjoner.
Flere problemer kan oppstå på scenen av søm og justering. Den automatiske søm av mosaikkfliser oppkjøp kan mislykkes, for eksempel på grunn av den store tomme plassen inne i prøven. På grunn av en drastisk endring i form i 3D, kan bildestakker være utfordrende å registrere. Spesialutviklede programmer (f.eks. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB eller MAPS-AT) kan forenkle halvautomatisk justering32,38,39,40. Mer utfordrende seksjoner kan justeres manuelt ved hjelp av fotoredigeringsprogramvare. Dessverre kan noen datasett være umulige å justere riktig.
Store prøver er utfordrende for TEM serielle seksjoner som passer på rutenett; På den annen side rettferdiggjør mange prosjekter ikke lange automatiske oppkjøp ved hjelp av FIB / SEM eller SBF-SEM. AT er et enkelt alternativ til en kjedelig seriell seksjon TEM der innsamling og manipulering av serielle seksjoner på en wafer er enklere enn med sporgitteret. Flere strategier ble utviklet for å lette samlingen av matrisene, og vi deler vår metode for å utvide det eksisterende verktøysettet. I tilfeller der identifiseringen av avkastningen er utfordrende, gir AT-SEM en grunnleggende fordel, med effektiv screening av prøvene der organelle-skalaoppløsning over 50 til 500 seksjoner er nødvendig. For større volumer kan AT-strategiene for automatisk innsamling samles inn effektivt hvis det kreves flere seksjoner. AT-prøver kan avbildes på nytt flere ganger, noe som letter målrettet bildebehandling av områder med høy oppløsning basert på tidligere oppkjøpte oversiktsbilder. Vi mener at den målrettede analysen og redusert oversampling av AT/SEM som foreslås her, reduserer kravene til arbeids- og datalagring. Til syvende og sist kan biblioteker av seksjoner samles inn og vedlikeholdes for senere gjenbruk og konsultasjon. For volumanskaffelse tilbyr FIB- eller SBF-SEM-tilnærminger en utmerket løsning når avkastningen er enkel å identifisere på blokkflaten eller hvis store 3D-volumer er nødvendige for analysen. FIB/SBF-SEM er imidlertid mindre effektive når stabelen med høy oppløsning må samles inn fra en definert avkastning på en målrettet måte. For å konkludere tillater de foreslåtte metodene for screening av AT-prøver og bruk av middels oppløsningsoversiktsbilder å begrense bildeinnhentingen til de relevante delene av seksjonsmatrisen. Nøyaktig målgang av bildeområder øker hastigheten på tid til data og forenkler dataevaluering.
Oppsummert, selv om begrepet AT / SEM ikke er nytt, er bruken fortsatt ikke så utbredt som fordelene antyder. Totalt sett gir det en komplementær prosedyre til andre eksisterende EM-metoder. AT/SEM er kompatibel med det bredeste utvalget av prøveprepareringsprotokoller og bildearbeidsflyter og kan gjøres på alle FIB/SEM- eller SBF-SEM-mikroskoper som en tilhørende teknikk. I dette dokumentet har vi konsentrert oss om AT for registrering av ultrastrukturelle data fra prøver som det er mindre sannsynlig at blir adressert av andre metoder. Vi håper at den beskrevne prosedyren for praktisk innsamling av seksjoner og betydelig automatiserte anskaffelsesstrategier vil hjelpe i de første forsøkene for de som aldri har møtt metoden og vil bidra til å perfeksjonere den for de som allerede har litt erfaring.
Disclosures
Forfatteren Tilman Franke er ansatt i Thermo Fisher som produserer elektronmikroskop og piloteringsprogrammer som brukes i artikkelen.
Acknowledgments
Vi vil takke medlemmene av EM-anlegget ved Universitetet i Lausanne for deres støtte under denne utviklingen av ulike trinn i AT-prosedyren. Vi vil takke Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O'Brien og Lindsay Lewellyn for diskusjoner under utarbeidelsen av manuskriptet og kritisk lesning. Vi ønsker å anerkjenne gruppene som bidro med prøvene som ble brukt til å demonstrere de ulike scenariene: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat og Fanny Langlet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cutting | |||
| AT sectioning knife | Diatome | DUATS3530 | Diatome Jumbo knife |
| Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | Diatome trimming 20° Glass knife |
| Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | |
| Silicon wafer | Ted Pella | 16015 | Resistance: 1-30 Ohms Type P: (Boron) (1 primary flat) Roughness: 2 nm No SiO2 top coating TTV: = <20 µm Wafer is polished on one side |
| Ultramicrotome | Leica UC6 | Alternative: Leica UC7 | |
| Wafer cleaving kit | EMS | 7642 | EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652 |
| Image acquisition | |||
| FESEM | Thermo Fischer Helios | 1072419 | Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN |
| Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography | Thermo Fisher Scientific | 1135932 | Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation. |
| Image analysis | |||
| Amira x.y | Thermo Fisher Scientific | 1131599 | Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction. |
| Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | IMOD, MIB (See text for refferences) |
References
- Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transaction of Royal Society of London B Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
- Mulcahy, B., et al. A pipeline for volume electron microscopy of the caenorhabditis elegans nervous system. Frontiers in Neural Circuits. 12, 94 (2018).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Baumeister, W., Grimm, R., Walz, J. Electron tomography of molecules and cells. Trends in Cell Biology. 9 (2), 81-85 (1999).
- Hoog, J. L., et al. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
- Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography. Cells. 8 (1), 57 (2019).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Horstmann, H., Korber, C., Satzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), 35172 (2012).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Kubota, Y., et al. A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure. Nature Communication. 9 (1), 437 (2018).
- Wacker, I. U., et al. Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes. Journal of Visualized Experiments. (133), e57059 (2018).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Templier, T. MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy. Elife. 8, 45696 (2019).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
- Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb. Nature Neuroscience. 19 (6), 816-825 (2016).
- Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
- Kizilyaprak, C., Bittermann, A. G., Daraspe, J., Humbel, B. M.
- Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, 25916 (2017).
- Hayworth, K. J., et al. Gas cluster ion beam SEM for imaging of large tissue samples with 10 nm isotropic resolution. Nature Methods. 17 (1), 68-71 (2020).
- Maco, B., et al. Correlative in vivo 2 photon and focused ion beam scanning electron microscopy of cortical neurons. PLoS One. 8 (2), 57405 (2013).
- Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Lucas, M. S., Gunthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
- Koga, D., Kusumi, S., Bochimoto, H., Watanabe, T., Ushiki, T. Correlative light and scanning electron microscopy for observing the three-dimensional ultrastructure of membranous cell organelles in relation to their molecular components. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (12), 968-979 (2015).
- Peddie, C. J., et al. Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells. Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).
- Markert, S. M., et al. 3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species. Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).
- Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms. Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).
- Kolotuev, I. Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production. Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).
- Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Daniel, E., et al. Coordination of septate junctions assembly and completion of cytokinesis in proliferative epithelial tissues. Current Biology. 28 (9), 1380-1391 (2018).
- Pasquettaz, R., et al. Peculiar protrusions along tanycyte processes face diverse neural and non-neural cell types in the hypothalamic parenchyma. Journal of Comparative Neurology. , (2020).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
