Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

على المدى الطويل، زراعة خالية من المصل من النباتات الشبكية الماوس Organotypic مع ظهارة صبغة الشبكية سليمة

Published: November 25, 2020 doi: 10.3791/61868
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Institute for Ophthalmic Research, University of Tübingen
* These authors contributed equally

Summary

يصف البروتوكول النباتات العضوية منشبكية العين العصبيةالماوس , المزروعة جنبا إلى جنب مع ظهارة صبغة الشبكية (RPE), في R16 المتوسطة المحددة, خالية من المصل والمضادات الحيوية. هذه الطريقة بسيطة نسبيا لأداء، وأقل تكلفة، وتستغرق وقتا طويلا بالمقارنة مع التجارب في الجسم الحي، ويمكن تكييفها مع العديد من التطبيقات التجريبية.

Abstract

في أبحاث العيون ، هناك حاجة قوية للنماذج المختبرية للعصبية. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لزراعة الأورغنوتيبيكمن شبكية العين العصبيةالماوس مع ظهارة الصباغ الشبكية سليمة (RPE). اعتمادا على السؤال البحثي، يمكن عزل شبكية العين من الحيوانات البرية أو من نماذج المرض، لدراسة، على سبيل المثال، اعتلال الشبكية السكري أو انحطاط الشبكية الوراثي. عيون من وقت مبكر بعد الولادة اليوم 2-9 يتم تلقيح الحيوانات في ظل ظروف مطهرة. يتم هضمها جزئيا في البروتين K للسماح مفرزة من المشيمي من RPE. تحت المجسمة، يتم إجراء شق صغير في القرنية خلق اثنين من حواف من حيث يمكن تقشير المشيمي والشق بلطف قبالة من RPE و neuroretina. ثم تتم إزالة العدسة ، ويتم قطع العدسة في أربع نقاط لإعطائها شكلا رباعيا يشبه ورقة البرسيم. يتم نقل الأنسجة أخيرا في قطرة معلقة في إدراج ثقافة الخلية عقد غشاء زراعة البولي. ثم يتم الحفاظ على الثقافات في R16 المتوسطة، دون مصل أو المضادات الحيوية، في ظل ظروف محددة تماما، مع تغيير متوسط كل يوم الثاني.

الإجراء الموصوف يتيح عزل شبكية العين والحفاظ على سياقها الفسيولوجي الطبيعي والهسطي لفترات زراعة لا تقل عن أسبوعين. هذه الميزات تجعل الثقافات الضمور الشبكية organotypic نموذجا ممتازا مع قيمة تنبؤية عالية، للدراسات في تطور الشبكية، وآليات المرض، والفيزيولوجيا الكهربية، في حين تمكين أيضا الفحص الدوائي.

Introduction

في البحوث العيون, مجموعة متنوعة من النماذج المتاحة لدراسة شبكية العين, بما في ذلك ثقافات خلايا الشبكية الأولية, خطوط الخلايا المشتقة من شبكية العين, organoids الشبكية, وفي نماذج حيوانية في الجسم الحي 1,2,3,4,5. ومع ذلك، كل من هذه النماذج يعاني من عيوب. على سبيل المثال، تنمو الخلايا في عزلة بينما شبكية العين هي شبكة معقدة مع العديد من التفاعلات بين الخلايا. وبالتالي ، فإن سلوك ثقافات الخلايا المعزولة من المرجح أن يكون مصطنعا مقارنة بتلك التي لوحظت في نسيج كامل. ويمكن علاج هذه المشكلة جزئيا باستخدام في المختبر الأجهزة الشبكية المتمايزة، والتي يمكن استخدامها لدراسة التنمية والبيولوجيا الأساسية6. ومع ذلك ، اعتبارا من اليوم ، لا يزال توليد الجهاز الشبكي يستغرق وقتا طويلا ، وكثيف العمالة ، ويعاني من مشكلات في الاستنساخ ، مما يتطلب المزيد من أعمال التطوير الكبيرة قبل أن يمكن استخدام الأعضاء لأبحاث الشبكية الترجمية. وأخيرا، ترتبط الدراسات على الحيوانات الحية، في حين يمكن القول إن النموذج الأقرب إلى متطلبات أبحاث العيون، بمخاوف أخلاقية قوية. حل وسط جيد بين كفاءة نظم زراعة الخلايا والوضع الواقعي للنماذج الحيوانية في الجسم الحي هي الثقافات الزرع الشبكية organotypic. كما تقلل هذه الثقافات من معاناة الحيوانات حيث لا يتم إجراء تدخلات في الجسم الحي.

وقد وصفت عدة طرق لزراعة النباتات الشبكية من أنواع مختلفة5,7,8. يصف بروتوكولنا تقنية لعزل العصب الفأري جنبا إلى جنب مع ظهارة صبغة الشبكية (RPE). هذه التقنية ستكون مناسبة أيضا لثقافات الشبكية الفئران9. ثقافة neuroretina جنبا إلى جنب مع RPE لها أهمية كبيرة للنجاح. يقوم RPE بوظائف أساسية للشبكية: نقل العناصر الغذائية والأيونات والماء وامتصاص الضوء والحماية من الأكسدة الضوئية وإعادة تسمية جميع أنحاء الشبكية إلى 11-cis-retinal ، وهو أمر حاسم للدورة البصرية ، وداء البلعومية لأغشية المستقبل الضوئي السقيفة ، وإفراز العوامل الأساسية لسلامة الشبكيةالهيكلية 10. الحفاظ على RPE يسمح بتطوير ناجح للشرائح الخارجية والداخلية مستقبلات ضوئية، والحفاظ على شبكية العين قابلة للحياة لفترة أطول11. الإجراء الموصوف أدناه يحافظ على الخصائص الهستوتيبيك والفسيولوجية للشبكية لمدة أسبوعين على الأقل12. وعلاوة على ذلك، فإن زراعة النباتات الشبكية العضوية في وسط خال من المصل والمضادات الحيوية يتجنب وجود مواد غير معروفة ويمكن من تفسير مباشر للنتائج12.

كانت الثقافات الزرع الشبكية Organotypic ضرورية لتحسين معرفتنا على نمو الشبكية وانحطاط7،13،14. نظهر هنا أنها أيضا أداة مفيدة للفحص الدوائي وأنه يمكن استخدامها لنمذجة مجموعة متنوعة من أمراض الشبكية، بما في ذلك اعتلال الشبكية السكري.

Protocol

تم مراجعة البروتوكولات الحيوانية المتوافقة مع الفقرة 4 من القانون الألماني لحماية الحيوان والموافقة عليها من قبل لجنة جامعة توبنغن لحماية الحيوان (Einrichtung für Tierschutz ، Tierärztlichen Dienst und Labortierkunde؛ رقم التسجيل AK02/19M). في هذه الدراسة، تم الحصول على شبكية العين من نوع البرية (WT) والفئران rd1، وهذا الأخير هو نموذج جيد الخصائص لانحطاط الشبكيةالوراثية 15. وكانت الفئران تعيش تحت إضاءة دورية بيضاء قياسية، وكان لديها إمكانية الحصول مجانا على الغذاء والماء، واستخدمت بغض النظر عن نوع الجنس.

1. قائمة مرجعية

  1. لضمان ظروف معقمة وتجنب التلوث، وتنظيف وتطهير غطاء الهواء صفح تدفق مع الإيثانول 70٪. تأكد من السماح للإيثانول تتبخر تماما، لمنع تسمم الثقافات الشبكية.
  2. أدوات الأوتوكلاف (على سبيل المثال، مقص، ملقط، وملعقة كشط المجهر العيون) قبل الاستخدام.
  3. إعداد الوسائط التالية مسبقا تحت غطاء محرك السيارة ذو التدفق اللاسماري، في ظل ظروف معقمة: Basal R16 medium (BM) (يمكن تخزينه عند 4 درجات مئوية لمدة 4 أسابيع)، BM مع مصل العجل الجنيني 20٪ (استخدام نفس اليوم)، BM مع 0 .12٪ بروتيناز K (44 mAnson U/mg) محلول (نفس الاستخدام في اليوم) وكامل R16 المتوسطة مع ملاحق (CM) كما وصفها رومين16 (يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 3 أسابيع) (انظر الجداول S1, S2، و S3).
  4. سخني محلول البروتين K عند 37 درجة مئوية لتنشيطه واستخدامه في الخطوة 2.5.

2. إعداد

  1. التضحية rd1/ WT الحيوان في يوم ما بعد الولادة (P) 5 عن طريق قطع الرأس. بالنسبة للحيوانات التي يزيد عمرها عن P11، استخدمثاني أكسيد الكربون و/أو خلع عنق الرحم، وفقا للوائح حماية الحيوان المحلية.
  2. اعتمادا على عمر الحيوان ، قبل التلقيح ، إذا لزم الأمر ، افتح أغطية العين باستخدام ملقط وفصل أغطية العين بعناية فائقة ، دون لمس العين أو خدشها أدناه.
  3. يملط العينين بسرعة تحت مجسمة باستخدام ملقط منحني.
  4. احتضان العينين في BM لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. احتضان العينين في BM مسخن، مع 0.12٪ بروتين K في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. قم بتنفيذ الخطوات التالية داخل غطاء تدفق الهواء الملمين لضمان ظروف معقمة. لتثبيط البروتين K، نقل العينين إلى BM التي تحتوي على 20٪ FCS واحتضان لمدة 5 دقائق في RT.
  7. تشريح العينين تحت مجسمة، مطهر، في طبق بيتري التي تحتوي على BM الطازجة في RT. بدء تشريح في أقرب وقت ممكن بعد التلقيح. كلما طالت هذه المرة، كلما كان من الصعب تشريح شبكية العين، تصبح العينان ناعمتين للغاية.
    1. مع ملقط، عقد العين من العصب البصري. باستخدام مقص غرامة، وجعل شق صغير في القرنية خلق 2 حواف من حيث القرنية، وترية والشدش يمكن تقشير بلطف باستخدام 2 أزواج من ملقط ناعم (الشكل 1 خطوات A-C). بدلا من ذلك، استخدم قنية ضيقة القياس لإجراء شق أول في القرنية ثم أدخل أحد شفرات المقص في الفتحة.
    2. فهم العدسة مع ملقط غرامة. ضع زوجا ثانيا من ملقط عموديا على الأولى بحيث تكون ملقط الأول بين السيقان 2 من الثانية. سحب لاستخراج العدسة من كأس العين. إذا كان الجسم الزجاجي والكظري لا يزالان ملتصقين بشبكية العين، قم بإزالتها بعناية(الشكل 1 الخطوة D).
      ملاحظة: الخطوتين 2.7.1 و2.7.2 تحتاج إلى الممارسة والتأكد من الحذر لعدم تلف الشبكية.
    3. قطع شبكية العين عمودي على حوافه في أربع نقاط، وخلق شكل البرسيم أربع أوراق(الشكل 1 خطوات E-F).
    4. باستخدام ماصة مع قاعدة قطع على نطاق واسع من طرف 1 مل، عقد شبكية العين في قطرة معلقة من المتوسط ونقله إلى إدراج مرشح طبق الثقافة وضعت في لوحة ثقافة 6-جيدا. يجب أن تواجه طبقة RPE الغشاء(الشكل 1 الخطوة G).
    5. باستخدام ماصة، وإزالة بعناية المتوسط الزائد من إدراج.
    6. من جوانب البئر، أضف 1 مل من CM لكل بئر واحتضن في حاضنة معقمة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. لا تغمر الشبكية في الوسط لأن هذا سيقلل من الأوكسجين ويسبب انحطاط الأنسجة. يجب أن يبقى الإكسبلانت في الواجهة بين السائل والهواء ، ولا يغطيه سوى فيلم رقيق من السائل الناتج عن التوتر السطحي للمياه.
  8. اتركي محاولة إزالة الشبكية دون إزعاج لأول 48 ساعة لتسهيل التعافي بعد إجراء الزرع.
  9. تغيير المتوسطة كل يوم الثاني (48 ساعة). تجاهل 700 ميكرولتر من المتوسط من كل بئر وإضافة 900 ميكرولتر من CM الطازجة إلى البئر. وبهذه الطريقة، يتم استرداد كمية المتوسطة المفقودة عن طريق التبخر وexplant الشبكية يحافظ على بعض العوامل العصبية المنتجة في 48 ساعة السابقة.
  10. احتضان الوسط المزال في أنبوب طرد دقيق منفصل ومغلق جنبا إلى جنب مع الثقافات للسيطرة على التلوث المحتمل وتقييمه (أي تغيير لون الوسط).
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بنباتات شبكية العين في الثقافة لمدة أسبوعين على الأقل12.

3. بعد زراعة

ملاحظة: يمكن استخدام Explants لتطبيقات تجريبية مختلفة (لطخة غربية ، علم الأنسجة ، يتصاعد كله ، التحليل الجيني ، الفيزيولوجيا الكهربية). اعتمادا على التطبيق، يمكن أن تكون المفاجئة explants الشبكية العضوية المجمدة، lysed، أو إعدادها ل cryosectioning. تصف الخطوات أدناه التحضير النسيجي.

  1. إجراء تثبيت لمدة 45 دقيقة مع 4٪ بارافورمالديهايد (PFA)، يليه استئصال التبريد السكروز التدريجي (10٪ السكروز لمدة 10 دقيقة، 20٪ لمدة 20 دقيقة و 30٪ لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو بين عشية وضحاها (ON) في 4 درجة مئوية). إضافة هذه المخازن المؤقتة مباشرة في البئر.
  2. قطع الغشاء حول النباتات الخارجية الشبكية.
  3. تضمين كل من الغشاء وأنسجة الشبكية في الوسط للأنسجة المجمدة.

Figure 1
الشكل 1:إجراء خطوة بخطوة لإعداد الثقافات الزرع الشبكية organotypic. (أ)يتم كذلك اختزال عيون الفأر ونقلها إلى محلول من البروتين K للسماح بفصل الصلبة والكوريد من الشبكية وRPE. يتم إدخال قطع صغير في طبقة الصلبة / المشيمية. (ب)وتستخدم اثنين من ملقط لتقشير طبقة الصلبة / المشيمية. (ج)يمكن رؤية طبقة المشيمية السوداء أثناء التقشير. تظل ظهارة صبغ الشبكية الداكنة (RPE) متصلة بمقلة العين. تتم إزالة الصلبة والchoroid جنبا إلى جنب مع العصب البصري. (د) يتم استخراج العدسة وحيوية مع ملقط.  تتم إزالة الجسم السيلاري المتبقي. (ه)تحتفظ الشبكية بشكل يشبه الوعاء. (F)لتسطيح شبكية العين لاستزراع في طبق، يتم إجراء 4 تخفيضات في مسافة متساوية حول شبكية العين مع مقص، ويعطيها شكل يشبه البرسيم. يتم نقل ثقافة شبكية العين إلى إدراج ثقافة الغشاء في لوحة 6-جيدا مع استخدام قطع 1 مل ماصة تلميح. شبكية العين لا تزال تحتفظ ببعض من شكل وعاء. ومع ذلك ، عند إزالة السائل الزائد المحيط شبكية العين ، فإنه سوف تتكشف إلى هيكل مستو. (G) في إعداد غشاء الثقافة ، يستريح ثقافة الشبكية على غشاء البولي المسامية (PC) فوق محلول متوسط R16 كامل. لضمان البقاء، يجب الاحتفاظ بالثقافة في حاضنة معقمة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2،وينبغي استبدال الوسط كل 48 ساعة.

Representative Results

بعد اتباع البروتوكول، تقوم النباتات الشبكية المضطهدة والمثقفة بالحفاظ على بنية نسيجها الطبيعية، مع طبقات متميزة، من RPE إلى طبقة خلايا العقدة (GCL)، كما هو موضح في الشكل 2. وظل حجم الطبقة النووية الخارجية (ONL) والطبقة النووية الداخلية مستقرا في الغالب لمدة 2-3 أسابيع ، مع فقدان الخلايا الذي يتقدم ببطء والترقق التدريجي لهذه الطبقات يصبح أكثر وضوحا إذا تم تمديد فترة الاستزراع إلى 4 أسابيع وما بعدها. في GCL ، في المقابل ، بسبب استئصال الاكستوم في العصب البصري ، لوحظ عادة ترقق ملحوظ خلال الأيام ال 4 الأولى من الاستزراع. بعد ذلك، فإن السكان الخلية المتبقية في GCL (معظمهم من خلايا amacrine المشردين) سوف تستمر لتكون قابلة للحياة لمدة 3-4 أسابيع أخرى17،18،19.

Figure 2
الشكل 2: أنواع الخلايا الموجودة في زراعة الشبكية. الشبكية explant الثقافة في P11 المستمدة من rd1 متحولة(أ)والحيوانات WT(ب)تظهر تلطيخ النووية مع DAPI (اليسار والأزرق) ، مستقبلات ضوئية قضيب (وسط ، أحمر) وخلايا مولر (اليمين والأخضر). تلطيخ النووية يسلط الضوء على جميع الطبقات الخلوية الرئيسية للشبكية مثل، ظهارة صبغ الشبكية (RPE)، الطبقة النووية الخارجية (ONL)، الطبقة النووية الداخلية (INL)، وطبقة خلايا العقدة (GCL). أنواع الخلايا المحددة في الطبقات النووية، مثل قضبان وخلايا مولر، هي immunolabeled مع اعتقال ألفا26 وجلوتامين synthetase27 الأجسام المضادة، على التوالي. (ج) يظهر مقطع كامل الطول من   شبكية العين الماوسrd1 كله، مع تلطيخ DAPI تسليط الضوء على اتساق والتكامل، وتطوير شبكية العين. تم استزراع شبكية العين هذه لمدة 6 أيام. وصف الإجراء: تم عزل الشبكية وRPE المستمدة من rd1 أو WT في P5 وزرعها كما هو موضح في البروتوكول ، حتى P11 مع تغيير متوسط كل 48 ساعة. تم إصلاح الثقافات مع 4٪ PFA في P11 و cryosectioned. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم

تسمح الوسيلة الخالية من المصل والبيئة المستمرة في المختبر بالتحكم الكامل في الظروف التجريبية. هنا، نقدم مثالين لتطبيقات محددة من هذا البروتوكول.
يوضح المثال الأول إمكانية استخدام النباتات الشبكية لأغراض اختبار المخدرات أو فحصها. تم إعداد ثقافات الزرع الشبكية العضوية من طرازي الفأر البري (WT) و RD1. هذا الأخير هو نموذج جيد الخصائص لانحطاط الشبكية15. في شبكية العين الماوس rd1، يتم تشغيل انحطاط ONL من قبل مستويات عالية بشكل غير طبيعي من cGMP في مستقبلات ضوئية قضيب6،20. يسبب cGMP المفرط زيادة نشاط قنوات الأيونات المسورة بالنيوكليوتيدات الدورية (CNGCs) وكيناز البروتين المعتمد على cGMP (PKG) ، مما يؤدي إلى موت الخلية21. علاج شبكية العين الماوس rd1 مع التماثلية الهيكلية لcGMP (النيوكليوتيدات الدورية #3; تم اختبار CN003) ، الذي يستهدف كل من PKG و CNGC. بعد الزرع في P5، تم اتباع نموذج العلاج الموصوف في الشكل 3A. تم إصلاح الثقافات Explant مع 4٪ PFA في P11 وأعدت ل cryosectioning(الشكل 3A). لتقييم موت الخلية من أقسام الأنسجة من المعالجة، غير المعالجة (NT)، وعينات WT، تم إجراء محطة deoxynucleotidyl transferase dUTP وضع العلامات (TUNEL) المقايسة22. وأظهر تحليل الخلايا المسمى TUNEL نسبة عالية من الخلايا المحتضرة في ONL من العينات rd1 غير المعالجة، في حين CN003 المحمية rd1 مستقبلات ضوئية الماوس عند تطبيقها بتركيز 50 ميكرومتر23 (الشكل 3B).

ومن المضاعفات المتكررة لمرض السكري اعتلال الشبكية السكري، وهو مرض أعمى يصعب تكاثره بأمانة في النماذج الحيوانية5. ويسلط المثال الثاني الضوء على استخدام الثقافات الضفية الشبكية الجهازية لتوصيف قدرة خلايا الشبكية على البقاء في ظل ظروف تحاكي مرض السكري من النوع 2 (T2DM)24. هنا، استخدمنا 20 مليون متر من مثبط انحلال الجليكوليسيس 2-ديوكسي-جلوكوز (2-DG)25 وأعطناه إلى وسيط الثقافة لمدة 24 ساعة من P10 إلى P11. نظهر أن إخضاع النباتات الشبكية WT لمثل هذه الحالات السكري محاكاة في المختبر يؤدي إلى موت الخلايا العصبية واسعة النطاق من شبكية العين(الشكل 3C). ويمكن بعد ذلك استخدام هذا النموذج بدوره، على سبيل المثال، لدراسة الآليات التنكسية أو لاختبار العلاجات الشبكية في سياق مرض السكري.

Figure 3
الشكل 3:مثالان لتطبيقات ثقافات الزرع الشبكية العضوية.( A)وصف الإجراء: تم عزل شبكية العين وRPE المستمدة من rd1 أو WT الحيوانات في يوم ما بعد الولادة (P) 5 ومثقفة كما هو موضح أعلاه، مع تغيير متوسط كل 48 ساعة. في P7 و P9، تم التخلص من المتوسط المستهلك وأضيف إلى اللوحة CM الطازج الذي يحتوي على مركب نشط بتركيز 50 ميكرومتر. تم إصلاح الثقافات مع 4٪ PFA في P11 و cryosectioned. (ب) اختبار المركب على شبكية العين rd1. تم الحصول على أقسام من WT، عولجت (003)، وغير المعالجة (NT) الثقافات اللولب الشبكية العضوية. تم استخدام اختبار TUNEL (أحمر) كعلامة على موت الخلية. تلطيخ النووية مع DAPI (الأزرق). يوضح القياس الكمي الموضح في الرسم البياني الشريطي النسب المئوية للخلايا المحتضرة في حالة WT و RD1 NT و rd1 003. العلاج مع مركب 003 خفضت بشكل ملحوظ rd1 موت خلية مستقبلات ضوئية. (ج)محاكاة داء السكري من النوع 2 (T2DM) على شبكية العين WT باستخدام 2-deoxy-الجلوكوز (2-DG) العلاج. تم إجراء فحص TUNEL على عينات NT و T2DM. ويشير القياس الكمي إلى زيادة كبيرة جدا في موت الخلايا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم

الجدول S1- الجداول الرجاء الضغط هنا لتحميل الجدول  

الجدول S2- الجداول الرجاء الضغط هنا لتحميل الجدول  

الجدول S3- الجداول الرجاء الضغط هنا لتحميل الجدول  

Discussion

يصف البروتوكول المقدم الثقافات التحسسية العضوية لشبكية العين الماوس مع RPE سليمة في متوسط R16 محددة، خالية من المصل والمضادات الحيوية. وقد وضعت هذا البروتوكول أصلا ابتداء من أواخر 1980s7،28 ومنذ ذلك الحين تم صقلها باستمرار6،11،12. وتشمل التطبيقات البارزة دراسات في آليات انحطاط الشبكية الوراثية وتحديد الأدوية الشبكية23،29،30.

11- ومن أجل تجربة ناجحة، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار بعض الاعتبارات الهامة. فيما يلي بعض نقاط استكشاف الأخطاء وإصلاحها الهامة للمساعدة في تحسين جودة الثقافات. أولا، قد تظهر ثقافات الشبكية الإفراط في طي و / أو تشكيلالوردية 31. يمكن أن يحدث هذا عن طريق لمس الشبكية مع ملقط أثناء إجراء الزرع. وعلاوة على ذلك، يجب إزالة الجسم ciliary تماما من explant، لأن هذا يمكن أن تزيد من طي الشبكية أثناء الثقافة. ثانيا، أثناء نقل الشبكية إلى لوحة البئر في قطرة معلقة، إذا كانت شبكية العين تواجه الغشاء الجانب الخطأ إلى أسفل، يبقيه في قطرة تتدلى من طرف ماصة ودفع بلطف جدا المتوسطة داخل وخارج الطرف (دون فصل قطرة معلقة) لقلب شبكية العين حولها. وأخيرا، إذا كان RPE لا تزال تعلق على تصلب ويفصل من شبكية العين، فمن المرجح أن يكون سببها عدم كفاية عسر الهضم من تصلب. ويمكن أن تكون هذه المشكلة مهمة بشكل خاص عند العمل مع عيون الحيوانات القديمة أو الأنواع غير القوارض (مثل الخنازير) ويمكن حلها عن طريق زيادة تركيز البروتين K.

إجراء ثقافات ال جربت الشبكية الجهازية هو إجراء معقد يتطلب التدريب الكافي والخبرة. نقص التدريب يمكن أن يؤدي إلى تباين في نوعية النباتات الشبكية. ولهذه الأسباب، من المهم رصد التحقق من الجدوى وقابلية التكاثر، مع وصف معدل موت الخلايا على سبيل المثال باستخدام المقايسة TUNEL. استخدام وسيلة خالية من المضادات الحيوية يجعل النباتات الشبكية عرضة للتلوث من البكتيريا والفطريات. لتقليل هذا الخطر، نوصي بأن يتم توخي الحذر بشكل خاص للعمل في ظل ظروف مطهرة حقا. وهناك قيد آخر لزراعة الشبكية في المختبر هي الاختلافات في البيئة الفيزيائية الكيميائية بالمقارنة مع شبكية العين الحية (على سبيل المثال، إمدادات الدم المشيمية والشبكية، ومستويات الأكسجين والجلوكوز، والضغط داخل العين، وتكوين الجسم الزجاجي). نظام التشوه المستمر، ربما جزءا لا يتجزأ من مفاعل حيوي مخصص32 يمكن أن تجعل هذا النموذج أقرب إلى حالة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإن استئصال الاكستوم العصب البصري أثناء تشريح الشبكية يؤدي إلى موت الخلايا العقدية، التي يمكن أن تحفز استجابات الإجهاد8. لذلك ، يوصى بأن يترك الإكسبلانت للتكيف مع ظروف الزرع لمدة يومين على الأقل في المختبر قبل أن يتعرض لتلاعب أو علاج محدد.

عادة ما يتم تنفيذ الطريقة الموصوفة على أنسجة الشبكية غير الناضجة ، والتي قد تبقى على قيد الحياة بشكل جيد لمدة 4 أسابيع في المختبر7،33. ومع ذلك، فإن الإجراء قابل للتكييف مع مجموعة متنوعة من التطبيقات، بما في ذلك زراعة شبكية العين للبالغين. على الرغم من أن النهج المختلفة المنشورة تصف عزل شبكية العين البالغة دون RPE34،35، فإن الحضانة بمحلول الباباين لمدة تصل إلى 1 ساعة عند 37 درجة مئوية قبل التشريح تسمح ل RPE بالبقاء ملتصقة بشبكية العين حتى عندما تكون مشتقة من فأر بالغ36.

وتوفر الوسيلة الخالية من المصل والبيئة المختبرية المحددة كيميائيا تلاعبا محددا تماما وقابلا للاستنساخ للظروف التجريبية. لذلك، فإن ثقافات استئصال الشبكية العضوية هي أدوات قيمة في مجال طب العيون وعلم الأعصاب، وقد استخدمت لدراسة أمراض الشبكية37،وتطور الشبكية38،39، والعلاج بالخلايا الجذعية الشبكية40، والتعديلات الوراثية41، والفحص الدوائي. كمثال محدد لاختبار المخدرات، وهنا استخدمنا الثقافات explant الشبكية لاختبار التماثلية cGMP (CN003)، والمعروف للحد من موت الخلايا مستقبلات ضوئية في النماذج الحيوانية لمرض الشبكيةالموروثة 23 (الشكل 3B). ويرد وصف آخر تطبيق ممكن لهذه التقنية في الشكل 3C، والذي يوضح كيف يمكن استغلال السيطرة الدقيقة على بيئة الأنسجة لمحاكاة حالات السكري24. بسبب الحفاظ على هندسة الأنسجة على مدى فترة زراعة الأنسجة بأكملها ، فإن ثقافات إزالة الشبكية العضوية مناسبة أيضا للدراسات الكهربية. وقد تم التحقيق في وظائف الخلايا العصبية على النباتات الشبكية باستخدام التصحيح المشبك تسجيل42 ومتعددة القطب صفيف (MEA) تسجيل33,43. هذا الأخير يسمح بتسجيل النشاط الكهربائي للسكان الخلايا العصبية في نفس الوقت، وقد تم استغلالها لتوصيف مستقبلات ضوئية ووظائف الخلية العقدة في ظروف الثقافة. من منظور أوسع ، يمكن أيضا تطبيق أنظمة زراعة المنظار العضوي في الأبحاث ما قبل السريرية ، حيث تم استخدام الثقافات الإكسبلانت لاختبار الفعالية العلاجية لانخفاض حرارة الجسم44.

تقنية زراعة الحشرات الإكسبتية العضوية بسيطة نسبيا في الأداء ، وعند مقارنتها بتجارب الجسم الحي المقابلة ، فهي أقل تكلفة وتستغرق وقتا طويلا ، وتتجنب المخاوف الأخلاقية المتعلقة بالدراسات الحيوانية الحية. إن التحكم الدقيق في الظروف التجريبية والحفاظ على RPE وتعقيد الأنسجة يجعل من هذه الطريقة أداة قيمة لتحسين معرفتنا بعلم وظائف الأعضاء الشبكية والفيزيولوجيا المرضية وتمكين العديد من التطبيقات التجريبية.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

تلقى هذا العمل البحثي الدعم المالي من الاتحاد الأوروبي (transMed; H2020-MSCA-765441)، مجلس البحوث الألماني (DFG; PA1751/8-1، 10-1) ومجلس المنح الدراسية في الصين.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotin Sigma B4639
(+/-)-α-LipoicAcid (=Thiotic acid) Sigma T1395
BSA Sigma B4639
CDP-Choline-Na Sigma 30290
Corticosterone Sigma C2505
CuSO4 × 5H2O Sigma C8027
DL-Tocopherol Sigma T1539
Ethanolamine Sigma E0135
FCS Sigma F7524
Filtropur BT100, 1L, 0.2µm SARSTEDT 83.3942.101 for Basal Medium
Forceps  F.S.T 15003-08
Glutamine Sigma G8540
Glutathione Sigma G6013
Insulin  Sigma I6634
L-CysteineHCl Sigma C7477
Linoleic Acid Sigma L1012
Linolenic Acid Sigma L2376
MnCl2 x 4H2O Sigma M5005
Na-pyruvate Sigma P3662
NaSeO3 x 5H2O Sigma S5261
Ophthalmic microscope scaping spoon F.S.T. 10360-13
Progesteron Sigma P8783
Proteinase K  MP Biomedicals 21935025 44 mAnson U/mg
R16 Gibco 07491252A
Retinol Sigma R7632
Retinyl acetate  Sigma R7882
Scissors F.S.T 15004-08
Sterile filter 0.22µm MILLEX GP SLGP033RS for supplements
T3  Sigma T6397
Tocopherylacetate Sigma T1157
Transferrin Sigma T1283
Transwell permeable supports Corning 3412
Vitamin B1 Sigma T1270
Vitamin B12 Sigma V6629
Vitamin C Sigma A4034

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).
  2. Llonch, S., Carido, M., Ader, M. Organoid technology for retinal repair. Developmental Biology. 433 (2), 132-143 (2018).
  3. Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
  4. Sanges, D., Comitato, A., Tammaro, R., Marigo, V. Apoptosis in retinal degeneration involves cross-talk between apoptosis-inducing factor (AIF) and caspase-12 and is blocked by calpain inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17366-17371 (2006).
  5. Schnichels, S., et al. Retina in a dish: cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. , 100880 (2020).
  6. Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
  7. Caffe, A. R., Visser, H., Jansen, H. G., Sanyal, S. Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture. Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).
  8. Murali, A., Ramlogan-Steel, C. A., Andrzejewski, S., Steel, J. C., Layton, C. J. Retinal explant culture: A platform to investigate human neuro-retina. Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (2), 274-285 (2019).
  9. Arango-Gonzalez, B., et al. In vivo and in vitro development of S- and M-cones in rat retina. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 51 (10), 5320-5327 (2010).
  10. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  11. Söderpalm, A., Szél, A., Caffé, A. R., van Veen, T. Selective development of one cone photoreceptor type in retinal organ culture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (11), 3910-3921 (1994).
  12. Caffe, A. R., et al. Mouse retina explants after long-term culture in serum free medium. Journal of Chemical Neuroanatomy. 22 (4), 263-273 (2001).
  13. Caffe, A. R., Soderpalm, A. K., Holmqvist, I., van Veen, T. A combination of CNTF and BDNF rescues rd photoreceptors but changes rod differentiation in the presence of RPE in retinal explants. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (1), 275-282 (2001).
  14. Ogilvie, J. M., Speck, J. D., Lett, J. M., Fleming, T. T. A reliable method for organ culture of neonatal mouse retina with long-term survival. Journal of Neuroscience Methods. 87 (1), 57-65 (1999).
  15. Keeler, C. E. The inheritance of a retinal abnormality in white mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (7), 329-333 (1924).
  16. Romijn, H. J. Development and advantages of serum-free, chemically defined nutrient media for culturing of nerve tissue. Biology of the Cell. 63 (3), 263-268 (1988).
  17. Caffe, A. R., et al. Mouse retina explants after long-term culture in serum free medium. Journal of Chemical Neuroanatomy. 22 (4), 263-273 (2001).
  18. Alarautalahti, V., et al. Viability of Mouse Retinal Explant Cultures Assessed by Preservation of Functionality and Morphology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  19. Caffe, A. R., Visser, H., Jansen, H. G., Sanyal, S. Histotypic differentiation of neonatal mouse retina in organ culture. Current Eye Research. 8 (10), 1083-1092 (1989).
  20. Farber, D. B., Lolley, R. N. Cyclic guanosine monophosphate: elevation in degenerating photoreceptor cells of the C3H mouse retina. Science. 186 (4162), 449-451 (1974).
  21. Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PloS One. 9 (11), 112142 (2014).
  22. Loo, D. T. In situ detection of apoptosis by the TUNEL assay: an overview of techniques. Methods in Molecular Biology. 682, 3-13 (2011).
  23. Vighi, E., et al. Combination of cGMP analogue and drug delivery system provides functional protection in hereditary retinal degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (13), 2997-3006 (2018).
  24. Valdés, J., et al. Organotypic retinal explant cultures as in vitro alternative for diabetic retinopathy studies. Altex. 33 (4), 459-464 (2016).
  25. Pajak, B., et al. 2-Deoxy-d-Glucose and its analogs: from diagnostic to therapeutic agents. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2019).
  26. Slepak, V. Z., Hurley, J. B. Mechanism of light-induced translocation of arrestin and transducin in photoreceptors: interaction-restricted diffusion. IUBMB Life. 60 (1), 2-9 (2008).
  27. Paquet-Durand, F., et al. A retinal model of cerebral malaria. Scientific Reports. 9 (1), 3470 (2019).
  28. Romijn, H. J., de Jong, B. M., Ruijter, J. M. A procedure for culturing rat neocortex explants in a serum-free nutrient medium. Journal of Neuroscience Methods. 23 (1), 75-83 (1988).
  29. Azadi, S., et al. CNTF+BDNF treatment and neuroprotective pathways in the rd1 mouse retina. Brain Research. 1129 (1), 116-129 (2007).
  30. Kaur, J., et al. Calpain and PARP activation during photoreceptor cell death in P23H and S334ter rhodopsin mutant rats. PloS One. 6 (7), 22181 (2011).
  31. Samardzija, M., et al. A mouse model for studying cone photoreceptor pathologies. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (8), 5304-5313 (2014).
  32. Achberger, K., et al. Merging organoid and organ-on-a-chip technology to generate complex multi-layer tissue models in a human retina-on-a-chip platform. eLife. 8, (2019).
  33. Alarautalahti, V., et al. Viability of Mouse Retinal Explant Cultures Assessed by Preservation of Functionality and Morphology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  34. Ferrer-Martín, R. M., et al. Microglial cells in organotypic cultures of developing and adult mouse retina and their relationship with cell death. Experimental Eye Research. 121, 42-57 (2014).
  35. Müller, B. Organotypic culture of adult mouse retina. Methods in Molecular Biology. 1940, 181-191 (2019).
  36. Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. A method for the isolation and culture of adult rat Retinal Pigment Epithelial (RPE) cells to study retinal diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 449 (2015).
  37. Sahaboglu, A., et al. Retinitis pigmentosa: rapid neurodegeneration is governed by slow cell death mechanisms. Cell Death & Disease. 4 (2), 488 (2013).
  38. Arai, E., et al. Ablation of Kcnj10 expression in retinal explants revealed pivotal roles for Kcnj10 in the proliferation and development of Müller glia. Molecular Vision. 21, 148-159 (2015).
  39. Demas, J., Eglen, S. J., Wong, R. O. Developmental loss of synchronous spontaneous activity in the mouse retina is independent of visual experience. Journal of Neuroscience. 23 (7), 2851-2860 (2003).
  40. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  41. Hatakeyama, J., Kageyama, R. Retrovirus-mediated gene transfer to retinal explants. Methods. 28 (4), 387-395 (2002).
  42. Moritoh, S., Tanaka, K. F., Jouhou, H., Ikenaka, K., Koizumi, A. organotypic tissue culture of adult rodent retina followed by particle-mediated acute gene transfer in vitro. PloS One. 5 (9), 12917 (2010).
  43. Reinhard, K., et al. Step-by-step instructions for retina recordings with perforated multi electrode arrays. PloS One. 9 (8), 106148 (2014).
  44. Klemm, P., et al. Hypothermia protects retinal ganglion cells against hypoxia-induced cell death in a retina organ culture model. Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (8), 1043-1054 (2019).

Tags

علم الأعصاب، العدد 165، neuroretina، RPE، الثقافات التحسسية العضوية، المتوسط الخالي من المصل، الماوس، ثقافة الأعضاء
على المدى الطويل، زراعة خالية من المصل من النباتات الشبكية الماوس Organotypic مع ظهارة صبغة الشبكية سليمة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Belhadj, S., Tolone, A.,… More

Belhadj, S., Tolone, A., Christensen, G., Das, S., Chen, Y., Paquet-Durand, F. Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (165), e61868, doi:10.3791/61868 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter