使用微生物分子特征评估水力压裂对溪流的影响

水力压裂（HF）或"压裂"是一种天然气开采方法，随着对化石燃料的需求持续上升，这种开采方式变得越来越普遍。这项技术包括使用大功率钻井设备将水、沙子和化学物质混合注入富含甲烷的页岩矿床中，通常释放被困气体^1。

由于这些非常规的采伐技术相对较新，因此必须调查这种做法对附近水道的影响。压裂活动要求清理大片土地，用于设备运输和井垫建设。每口井垫2必须清理约1.2至^1.7公顷的土地，这可能会影响系统³的径流和水质。压裂液的确切化学成分缺乏透明度，包括使用什么杀菌剂。此外，压裂废水往往是高盐度^2。此外，废水可能含有金属和天然放射性物质^2。因此，压裂液因人为错误或设备故障而泄漏和溢出的可能性令人关注。

众所周知，溪流生态系统对周围景观的变化非常敏感^，对于维持整个流域内的生物多样性⁵和适当的养分循环⁶非常重要。微生物是淡水溪流中最丰富的生物，因此对营养循环、生物降解和初级生产至关重要。微生物群落的组成和功能由于对扰动的敏感性而成为获取生态系统信息的绝佳工具，最近的研究表明，基于接近压裂活性的^观察细菌组合发生了明显^变化。例如，贝耶林基亚、伯克霍尔德里亚和甲基细菌被确定为在压裂附近的溪流中富集，而伪心电图、硝基和罗多细菌在不接近压裂⁷的溪流中富集。

下一代测序的16S核糖核糖核瘤RNA（rRNA）基因是一种负担得起的方法来确定细菌群落组成，这是更快和更便宜的全基因组测序方法^9。分子生态学领域的一个常见做法是使用16S rRNA基因高度可变的V4区域进行测序分辨率，通常下降到具有广泛识别⁹的属水平，因为它是不可预知的环境样本的理想选择。这项技术已在已发表的研究中广泛应用，并已成功应用于识别压裂作业对水生环境^的影响。然而，值得注意的是，细菌有不同的拷贝数的16S rRNA基因，这影响其检测到的丰度^10。有几个工具来解释这一点，但他们的功效是值得怀疑的^10。另一种在流行率上迅速增长并缺乏这种弱点的做法是元定性测序，其中对所有RNA进行测序，使研究人员能够识别活性细菌及其基因表达。

因此，与先前发表的研究^{7、8、11、12}的方法不同，本协议还涵盖了用于研究微生物群落功能（元体学）的样本收集、保存、处理和分析。这里详细的步骤使研究人员能够看到压裂对微生物在其溪流中表达的基因和途径（包括抗微生物抗药性基因）产生了什么影响（如果有的话）。此外，还改进了样品收集的详细程度。虽然一些步骤和笔记在有经验的研究人员看来似乎是显而易见的，但对于那些刚刚开始研究的人来说，它们可能是无价的。

在此，我们描述了样品收集和处理的方法，以产生细菌遗传数据，作为根据我们的实验室多年的经验来研究压裂对附近溪流的影响的一种手段。这些数据可用于下游应用，以识别与压裂状态相对应的差异。

1. 收集沉积物样本用于提取核酸

1. 将无菌的 50 mL 圆锥管浸入溪水中。在样品采集过程中戴手套，以避免引入不必要的人类污染。执行此步骤从岸边或朝上，如果在水中。
2. 当圆锥管被淹没时，取下盖子，并用它从1到3厘米的深度中挖出约3mL的沉积物到圆锥管中。
3. 从水中取出锥形管并倾倒所有水，但覆盖沉积物样本（约 1 mL）的薄层除外。
4. 使用 1000 μL 移液器和适当的移液器提示，在收集的样品中加入 3 mL 的 DNA/RNA 防腐剂（参见防腐剂规格 材料表 ）。将移液器提示保存在无菌移液器尖端盒中，仅在使用前立即将其连接并丢弃。倒置封顶锥形管10次，以确保防腐剂和样品被彻底混合。
   注步骤 1.4 是没有必要的，但如果以后要从沉积物中提取RNA，则强烈建议使用。
5. 将样品放在冰上，以进行其余样品采集。从收集回来后，如果样品要用于 16S 分析 （DNA）， 或 -70 °C，如果样品要用于元数据学分析 （RNA），则存放在 -20 °C 的冰柜中。

2. 用于提取核酸的过滤器集合

1. 取下无菌 1 L 瓶盖。当面对上游或从岸边，填充瓶与流水到顶部，然后倾倒出来。重复此过程两次，以调节瓶子。第四次装满整瓶酒并盖上盖子。
   注:如果重复使用1L瓶，可以用10%的漂白剂冲洗2分钟进行消毒，然后用去离子水冲洗3次，然后用70%乙醇冲洗一次，最后用设置自动清洁:30分钟暴露时间在121.1°C和15分钟干燥时间。在自动包装过程中，瓶子上的盖应非常松动，以避免瓶子在这个过程中被压缩。
2. 一旦在稳定的表面上，使用无菌的Luer锁注射器，并绘制一个完整的体积。然后将注射器连接到无菌和脱氧核糖核酸/无RNA 1.7 厘米直径的聚醚硫酮过滤器，孔径为 0.22 μm，通过按下柱塞一路将整个体积推入过滤器。重复此过程，直到瓶子中收集的总体积 （1 L） 通过过滤器。
   注:如果跟踪通过过滤器推入的总水量，注射器的体积可能是可变的。但是，一般来说，首选 60 mL。虽然1L是理想的，传闻，至少200ml的体积可能仍然收集足够的生物质（假设每mL20，000个细胞）提取DNA和RNA。
3. 将大约 20 mL 的空气抽入注射器并推动其通过过滤器，从过滤器中取出多余的水。
   注意:如果执行第 2.4 步，这将有助于防止防腐剂丢失。
4. 使用 P1000 微管，通过通过过滤器较大的开口（将其连接到注射器上）将其放电，同时水平握住滤清器，加入 2 mL 的 DNA/RNA 防腐剂。当移液器处于抑郁状态时，移液器的尖端应位于过滤器的桶内，以确保防腐剂进入过滤器。每次使用后更改提示。
   注:与沉积物收集一样，此步骤是没有必要的，但强烈建议以后增加核酸产量，尤其是RNA。
5. 剥下一平方的石蜡薄膜，紧紧包裹在过滤器的每个开口/末端，以密封。将石蜡薄膜包裹的过滤器放入无菌样品袋中，然后在收集过程中将整个包装在冰上。
   注意:确保用于包装过滤器的侧面是无菌的，即以前未暴露在环境中。
6. 取样后，将过滤器存储在 -20 °C 的 16S 或 -70 °C 的元转录学。

3. 核酸提取和量化

1. 在开始样品转移之前，用 10% 漂白剂和 70% 乙醇清洁工作区域。
2. 对于沉积物（从第 1.5 步开始），通常使用 ±0.25 克样品。火焰通过将金属工具浸入 70% 乙醇的烧嘴中，并在样品之间燃烧乙醇来消毒。
3. 对于过滤器（从第 2.6 步开始），将滤纸移入无菌管进行提取。要做到这一点，请按照下面的步骤进行操作。
   1. 通过折叠铝箔创建无菌、DNA 和 RNA 自由表面，使折叠的内部部分不暴露在外部环境中，并自动将折叠件与设置进行解密:121.1 °C 和 5 分钟干燥时间。
   2. 用 70% 乙醇和明火消毒小火。然后使用 vise 抓地力打破无菌表面上的滤芯外壳，从外壳中取出核心。
   3. 使用无菌手术刀将滤纸从核心切开，在顶部和底部切片，然后沿着接缝切开。使用无菌钳子折叠滤纸，然后使用手术刀将滤清器切成小块。
   4. 将过滤件放入微中心管中进行提取。确保滤纸不会接触到任何未消毒或可能存在核酸的表面，因为这会导致样品受到不必要的污染。
4. 执行前^{述 13} 描述的 DNA 隔离，或使用市售的基于列的工具包（参见 材料表）。下面简要介绍了列出的商业工具包的步骤。
   1. 将样本中的细胞转移到珠子管中，并使其高速受细胞干扰至少5分钟，从而对样本中的细胞进行取景。离心机并将超导管转移到无菌微中心管中。
   2. 将裂解缓冲器添加到超高纳特（1:1 体积），并转移到提供的过滤器（黄色）。离心过滤器。
   3. 将过滤器转移到新的无菌微中心管。添加制备缓冲器 （400 μL）、离心机，并丢弃流经。
   4. 加入洗涤缓冲器 （700 μL）、离心机，并丢弃流经。然后加入洗涤缓冲器 （400 μL），离心机，并再次丢弃流过。
   5. 将过滤器转移到新的无菌微中心管。Elute 配有 50 微升 DNase/RNase 免费水，在离心前在室温下坐 5 分钟。
   6. 在催化期间，准备 III-HRC 过滤器，将其放入收集管中，并在其中添加 HRC 预置解决方案 （600 μL），然后在 8，000 x g下进行 3 分钟的离心步骤。
   7. 将准备好的过滤器移到无菌微中心管上。将脱氧核糖核酸从第 3.4.5 步转移到此过滤器和离心机，速度为 16，000 x g，3 分钟。流经包含提取的DNA。
5. 在 -20 °C 下存储沉积物和过滤器的 DNA 提取物。
   注:DNA提取物可以在-20°C下储存约8年，假设温度稳定，光线暴露有限，且无有害污染物^14。
6. 根据制造商的协议执行 RNA 隔离。将RNA提取物储存在-80°C。
   1. 将样本中的细胞转移到珠子管中，并使其高速受细胞干扰至少五分钟，从而对样本中的细胞进行取景。离心机并将超导管转移到无菌微中心管中。
   2. 将裂解缓冲器添加到超高纳特（1:1 体积）并转移到所提供的列（黄色）。离心柱。
   3. 将等量的 95-100% 乙醇添加到流经中，通过上下管道混合五次。
   4. 将 IICG 柱（绿色）放在无菌微中心管上。将混合溶液转移到柱子和离心机。
   5. 加入洗涤缓冲器 （400 μL）、离心机，并丢弃流经。
   6. 将 5 μL 的 DNase I 和 75 μL 的 DNA 消化缓冲添加到柱中，并在室温下孵育 15 分钟。
   7. 添加预备缓冲器 （400 μL）、离心机，并丢弃流经。
   8. 加入洗涤缓冲器 （700 μL）、离心机，并丢弃流经。然后加入洗涤缓冲器 （400 μL），离心机，并再次丢弃流过。
   9. 将柱子转移到新的无菌微中心管。Elute 配有 50 微升的 DNase/RNase 免费水，让离心前坐 5 分钟。
   10. 在潜伏期，准备III-HRC过滤器，将其放入收集管中，并在其中添加HRC预制液（600微升），然后在8，000 x g下进行3分钟的离心步。
   11. 将准备好的过滤器移到无菌微中心管上。将 el2 RNA 从第 3.6.9 步转移到此过滤器和离心机，速度为 16，000 x g，3 分钟。流经包含提取的RNA。
       注:RNA提取物只能储存一年，然后才开始降解^15。DNA和RNA提取物都通过反复冷冻解冻而降解。有些协议允许从同一样本^16，17中提取DNA和RNA。
7. 使用荧光仪或光谱光度计对提取的DNA和RNA样本进行量化。例如，请参阅表 1的荧计 DNA 浓度值。例如光谱光度计量化协议，请参阅参考^18。材料表中所列工具包的沉积物DNA浓度值一般在1至40 ng/μL之间，而过滤器DNA浓度值一般在0.5至10ng/μL之间。材料表中所列套件的沉积物RNA浓度值一般在1至20ng/μL之间，而过滤RNA浓度值往往较低， 通常范围从 0.5 到 5 ng/μL。

4. 16S rRNA 库创建

1. 用 10% 漂白剂和 70% 乙醇清洁工作区域。工作区域应该是一个封闭的空间，能够产生层流条件（层流罩）。
2. 使用 DNA 提取物（从第 3.5 步开始），使用标准 PCR 协议为 16S rRNA 放大器测序准备样本，例如地球微生物群网站上描述的在层压流条件下放大 16S rRNA¹⁹ 的 V4 超变区域。
3. 准备一个2%的玫瑰凝胶如前所述，让它凝固^17。混合 7 μL 的 PCR 产品和 13 μL 的 DNase 免费水。将凝胶加载染料添加到最终浓度为 1 倍。一旦糖凝固，将此 PCR 产品混合在 2% 的玫瑰凝胶上。
   注意:或者，可以使用预铸凝胶，因为这些凝胶运行得更快，并且是预制的。
4. 使用地球微生物群协议，在 90 V 处运行凝胶 60-90 分钟，以检查带大小为 386，作为 16S rRNA V4 放大器的成功放大。

5. DNA 16S rRNA 库净化

1. 池 10 μL 的 PCR 产品用于产生明亮频带的样品，13 μL 用于在适当大小的无菌微中心管中产生微弱频段的样品。
2. 使用荧光仪或光谱光度计检查产生的池的浓度，并像以前一样准备 2% 的玫瑰凝胶。理想情况下，池的浓度应至少为 10 ng/μL，大多数样品的浓度应约为 25 ng/μL。
3. 浓度和体积允许，在2%的玫瑰凝胶井中装载约150-200 ng。
4. 在 90 伏特下运行凝胶 60-90 分钟。
5. 通过运行 2% 的阿加罗斯凝胶来净化池中库。
   1. 从凝胶中取出386个基点的DNA带，并使用之前^描述的20个商业可用的试剂盒净化池库。用 30 微升 10 m Tris-Cl （pH 8.5） 来提取纯化的 DNA。在与 DNA 或 RNA 提取不同的区域执行此步骤，以防止未来的污染，因为切割凝胶将把 PCR 放大器传播到实验者和周围区域。
6. 使用荧光仪或光谱光度计检查净化池的浓度。如果净化顺利，其浓度应至少是未净化池的一半。一般来说，最终浓度应介于 5 到 20 ng/μL 之间。
7. 发送纯化库进行下一代测序。确保运输过程中保持寒冷，在集装箱中包括干冰。

6. RNA 库创建和净化

1. 可以使用几个商业工具包创建 RNA 库。无论使用哪种，在无菌层压流环境中工作时，请按照制造商的流程书写。 材料表 中套件协议的非常总结版本呈现在²¹以下。
   1. 制作第一股 cDNA 合成主组合（8 μL 无核糖水和第 2 μL 第一链合成 Enyzme 混合），并将其添加到样品中。将样品放在符合协议中指定条件的热循环器中。
   2. 使第二股cDNA合成主组合（8 μL的第二股合成反应缓冲器，4微升第二链合成酶混合，和48微升无核糖水），并添加到样品中。放置在温度循环器设置为 16 °C 一个小时。
   3. 通过添加提供的珠子 （144 μL） 和进行两次 80% 乙醇洗涤 （200 μL） 来净化反应。
   4. 配备提供的 TE 缓冲器 （53 μL）， 并将 50 μL 的超高纳特转移到干净的 PCR 管中。将 PCR 管放在冰上。
   5. 在冰上制作端准备主组合（7 μL 的末端准备反应缓冲器和 3 μL 的端准备酶混合），并将其添加到 PCR 管中。将 PCR 管放入符合协议中指定条件的热循环器中。
   6. 将稀释适配器 （2.5 μL）、配体主混合 （30 μL） 和 Ligation 增强器 （1 μL） 解决方案混合在冰上。将混合溶液添加到样品中，并在 20 °C 下放在热循环器中 15 分钟。
   7. 通过添加提供的珠子 （87 μL） 和执行乙醇洗涤 （200 μL） 和洗涤像以前一样净化反应， 除了只添加 17 μL 的 TE.
   8. 添加指数 （10 μL） 和第 5 季度主混合 （25 μL） 解决方案，并将其放置在符合协议中描述条件的热循环器中。
   9. 通过添加所提供的珠子 （45 μL） 并添加两个乙醇洗涤 （200 μL） 和 23 μL 的 TE 来净化反应。将 20 μL 转移到干净的 PCR 管中。
2. 使用生物分析仪、荧光仪或光谱光谱仪检查库，了解RNA的可检测浓度。
3. 以大致等值的比例将元描述性库池入池中。
4. 按照 16S 库净化的相同协议净化库，但 250 到 400 桶/日之间的切除片段除外。虽然 16S 库有一个代表放大区域的不同波段，但此处的结果是涂片。
5. 检查纯化库的浓度。
6. 将纯化后的库与干冰一起运送到测序设施。
   注:或者，RNA提取物可以发送到大学或私人公司进行图书馆准备和测序。

7. 微生物群落分析

1. 测序完成后，访问样本数据。将其下载到可用的计算机。
   注:理想情况下，该设备应具有至少 16 GB 的 RAM。有关计算要求的讨论（对于 Qiime2），请参阅 https://forum.qiime2.org/t/recommended-specifications-to-run-qiime2/9808。
2. 使用软件（如飞蛾、QIIME2 和 R）分析 16S rRNA 数据。请参阅此处 https://docs.qiime2.org/2020.11/tutorials/moving-pictures/ 示例 QIIME2 16S 分析教程。
3. 对于甲基定性学 （RNA） 数据，请使用 HUMANN2 和 ATLAS 来确定样本中存在哪些基因和通路。
   注:在 补充信息文件中提供了一个以多样性和随机森林分析为高潮的元数据学管道示例。所有命令都通过命令线运行，例如，Mac 用户的终端。

DNA和RNA提取的成功率可以使用各种设备和协议来评估。一般来说，任何可检测到的浓度都足以得出提取成功的结论。然后检查 表 1， 除表 1 外，所有提取都将被称为成功。此步骤的失败通常是由于初始生物量低、样品保存不良或提取过程中的人为错误。在过滤器的情况下，即使浓度低于检测，萃取也可能成功。如果这些提取物没有产生PCR的带（如果做16S）或库准备后可检测到的浓度（元数据学），那么它们可能确实失败了。

如果遵循 16S 协议，则 PCR 放大后的明亮频段（如图 1 中的 4 号和 6 号井）表示成功，而上排其他油井中显示的频段不足则表示失败。此外，凝胶车道中含有负 PCR 控制的明亮带也表示故障，因为假设影响负控制的污染不会影响样品是有风险的。

对于 16S 和元定性学，测序的成功率可以通过查看获得的序列数（图 2）来评估。16S 样品应至少具有 1，000 个序列，其中至少 5，000 个序列是理想的（图 2A）。同样，元数据学样本至少应有50万个序列，其中至少200万个序列是理想的（图2B）。序列少于这些最低序列的样本不应用于分析，因为它们可能无法准确代表其细菌群落。但是，在最小值和理想值之间可以使用样本，但如果许多样本落在该范围内，则应更谨慎地解释结果。

后续下游分析的成功与否仅取决于是否获得了预期的输出文件。无论如何，项目，如QIIME2和R（图3），应允许评估细菌群落之间潜在的重大差异的基础上压裂。 图3 的数据是通过收集13个不同流的21个不同地点的沉积物样本，进行16S和元数据学分析获得的。在这21个地点中，有12个位于压裂活动下游，被列为HF+，其中9个地点位于压裂活动的上游或没有压裂的流域内;这些流被归类为 HF-。除了压裂活动的存在，溪流是可比的。

这些差异可以采取基于压裂状态的一致构图变化的形式。如果是这样的话，HF+和HF样本将有望在PCOA图中彼此分离，图3A和图3B就是如此。为了确认这些明显的转变不仅仅是协调方法的一个伪影，还需要进一步的统计分析。例如，PERMANOVA22对图 3A 和图 3B的距离基质进行测试，该测试基于基于压裂状态的显露显著聚类，这意味着在绘图中观察到的分离与样本细菌群落之间的差异一致，而不是协调的产件。 PERMANOVA 或 ANOSIM 的显著结果是，HF® 和 HF 样本之间一致差异的有力指示，这将表明 HF® 样本受到压裂的影响，而高 p 值则表明样本未受到影响。类似，可以用同样的方法对元数据进行可视化和评估。

检查微分特征（微生物或功能）可以揭示样品也受到影响的证据。确定微分特征的一种方法是创建随机森林模型。随机森林模型可用于查看样品的压裂状态如何正确分类。如果模型的表现比预期的要好，那将是取决于压裂状态的差异的额外证据。此外，最重要的预测器将揭示哪些特征对于正确区分样本（图3C）最为重要。然后，这些特征也会基于压裂状态产生一致不同的值。一旦确定这些差异特征，就可以审查这些文献，看看它们以前是否与压裂有关。然而，找到确定微分函数的研究可能具有挑战性，因为大多数研究只使用了 16S rRNA 组成数据。因此，为了评估微分函数的影响，一种可能的方法是看看它们以前是否与压裂液中常用的杀菌剂的潜在耐药性有关，或者它们是否有助于耐受高盐水条件。此外，检查利息分类的功能配置文件可以揭示压裂的影响的证据（图3D）。例如，如果分类被随机森林模型识别为差分，HF®样本中的抗菌电阻特征可以与HF样本中的特征进行比较，如果差异很大，则可能表明含有杀菌剂的压裂液进入流中。

表1:基于荧光仪1xDSDNA高灵敏度检测的DNA浓度示例。 除14个样本外，所有这些样本的提取都被认为是成功的，因为有可检测到的DNA量。

图1:PCR产品电子凝胶示例。 凝胶在紫外线下预先染色和可视化，导致其上存在的任何DNA发光。PCR 在第一排的 4 号和 6 号井中为样品工作，因为它们都有一个预期尺寸的明亮波段（基于梯子）。其他六口井中样品的PCR出现故障，因为它们没有产生任何波段。正控（第一井，第二排）具有明亮的带，表明PCR执行得当，负控（井6和7，第二排）没有任何带，表明样品没有受到污染。如果阴性有一个像样品一样亮的带子，PCR 将被视为失败，因为假设样品的安培不仅仅是污染的结果是有风险的。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2: 示例序列计数。 （A） 16s 示例序列计数。几乎所有的这16S样本都有超过1000个序列。极少数序列少于1，000个序列的人应该被排除在下游分析之外，因为他们没有足够的序列来准确代表他们的细菌群落。几个序列有1，000到5，000个序列;虽然不理想，他们仍然可以，因为他们超过最低值，大多数样品也超过理想的最低5000。（B） 甲基经学示例很重要。所有样本都超过了最低（500，000）和理想最小（2，000，000）序列数。因此，测序对于所有测序都是成功的，并且都可以用于下游分析。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3: 示例分析。 （A） PCoA 图基于通过 QIIME2 创建和可视化的加权 Unifrac 距离矩阵计算的坐标。（B） PCoA 图基于与 QIIME2 输出的加权 Unifrac 距离矩阵计算的坐标。坐标使用 Phyloseq 进行可视化，R. 元数据载体中的 ggplot2 包使用素食封装安装到图中。每个点表示样本的细菌群落，更近的点表示更相似的社区组成。根据这些 16S 沉积物样本的压裂状态进行聚类（PERMANOVA，p=0.001）。此外，病媒显示，HF®样品的氦、溴、镍和锌含量往往较高，与HF样本相比，这些样本与不同的细菌群落组成相对应。（C） 随机森林模型的最佳预测图，用于测试细菌丰度可用于预测样品中的压裂状态。随机森林模型是通过 R 使用随机森林包创建的。前 20 个预测因素以及由此产生的杂质减少（HF+ 和 HF 样本组合在一起的测量）在使用 Gini 指数的平均减少以单独样品的形式显示。（D） 饼图，显示基于元数据的伯克霍尔德里亚斯配置文件的抗菌电阻配置文件。序列首先与 Kraken2 注释，以确定它们属于哪个分类。然后，BLAST 与这些注释序列和 MEGARes 2.0 数据库一起使用，以确定哪些抗微生物药物耐药基因（以"MEG_#"的形式）正在积极表达。然后提取伯克利雅成员表达的抗微生物药物耐药基因，看看哪些基因在该分类中最为普遍。虽然更昂贵和更耗时，但元数据学确实允许进行功能分析，例如，16S 数据无法完成此分析。值得注意的是，Kraken2 用于此示例分析，而不是 HUMANN2。克拉肯2比胡曼2快:然而，它只输出组成信息，而不是组成，贡献和功能（基因）和路径，如HUMANN2做。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充文件:甲基线学管道示例。 请点击这里下载此文件。

作者没有什么可透露的。