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利用微生物分子特征评估水力压裂对溪流的影响

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DOI：

10.3791/61904

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2021年4月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Juniata College, 2Wright Labs, LLC, 3Department of Biological Sciences, Michigan Technological University, 4Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 5Department of Civil and Environmental Engineering, University of Tennessee

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过分析水体和沉积物中的微生物群落来研究水力压裂对附近溪流影响的实验方案。

摘要

水力压裂（HF），通常称为"压裂"，是利用高压水、砂和化学物质的混合物来压裂岩石，从而释放石油和天然气。这一技术彻底改变了美国的能源产业，使其能够获取以往无法利用的资源，目前美国三分之二的天然气产量均来自该技术。尽管压裂对美国经济产生了积极影响，但多项研究已指出其对环境造成的有害影响。尤其令人关注的是压裂对源头溪流的影响，因为这些溪流对整个流域的健康具有不成比例的重要作用。这些溪流中的细菌可作为溪流健康状况的指示指标，因为在受干扰溪流中存在的细菌种类及其丰度，预期会与条件相似但未受干扰的溪流有所不同。因此，本实验方案旨在利用细菌群落来判断溪流是否受到压裂活动的影响。为此，必须采集靠近压裂作业区域（可能受影响）以及位于压裂活动上游或不同流域（未受影响）的溪流中的沉积物和水样。随后对这些样品进行核酸提取、文库构建和测序，以分析微生物群落组成。接着可采用相关性分析和机器学习模型，识别出能够解释群落差异的关键特征，并鉴定可用于预测压裂影响的生物标志物。这些方法能够揭示不同源头溪流中微生物群落在压裂距离远近上的多种差异，并为今后进一步研究压裂活动的环境影响奠定基础。

引言

水力压裂（HF），或称"压裂"，是一种天然气开采方法，随着化石燃料需求持续上升，该方法正变得日益普遍。该技术利用高压钻探设备，将水、沙子和化学物质的混合物注入富含甲烷的页岩层中，通常用于释放被封存的气体1。

由于这些非常规的开采技术相对较新，因此研究此类作业对附近水道的影响至关重要。水力压裂作业需要清理大片土地，用于设备运输和井场建设。每个井场需清理约1.2至1.7公顷的土地2，可能影响系统的径流和水质3。关于压裂液确切的化学成分，包括所使用的杀菌剂种类，目前缺乏透明度。此外，压裂废水通常具有高盐度2。进一步地，废水中可能含有金属和天然存在的放射性物质2。因此，由于人为错误或设备故障导致压裂液泄漏或溢出的可能性令人担忧。

溪流生态系统对外部环境变化极为敏感4 对于维持生物多样性具有重要意义5 以及适当的养分循环6 在整个流域内，微生物是淡水中数量最丰富的生物类群，因此在养分循环、生物降解和初级生产过程中发挥着关键作用。由于微生物对环境扰动具有高度敏感性，其群落组成与功能可作为获取生态系统信息的重要工具；近期研究表明，根据与水力压裂活动的距离远近，所观测到的细菌群落结构呈现出显著差异。7,8例如， 贝日阿托氏菌属, 伯克霍尔德菌属，以及 Methanobacterium 在压裂作业附近的溪流中被发现富集 Pseudonocardia, Nitrospira，以及 Rhodobacter 在远离水力压裂作业的溪流中富集7.

对16S核糖体RNA（rRNA）基因进行高通量测序是一种经济高效的方法，用于确定细菌群落组成，其速度更快、成本低于全基因组测序方法9。在分子生态学领域，常用16S rRNA基因中高度可变的V4区进行测序，通常可在较广范围内实现属水平的鉴定分辨率9，因此特别适用于不可预测的环境样本。该技术已在大量已发表的研究中广泛应用，并成功用于识别水力压裂作业对水生环境的影响7,8。然而需要注意的是，不同细菌的16S rRNA基因拷贝数存在差异，这会影响其检测丰度10。尽管已有少数工具用于校正这一偏差，但其有效性仍存疑10。另一种迅速普及且无此缺陷的方法是宏转录组测序，该方法对全部RNA进行测序，使研究人员能够同时鉴定出活跃的细菌及其基因表达情况。

因此，与先前已发表研究中的方法7,8,11,12相比，本实验方案还涵盖了用于研究微生物群落功能（宏转录组学）的样品采集、保存、处理和分析。本文详述的步骤可使研究人员了解水力压裂对溪流中微生物所表达的基因和代谢通路（包括抗微生物药物耐药性基因）是否产生影响以及影响程度。此外，本方案在样品采集方面的细节描述更为完善。 尽管其中一些步骤和注意事项对经验丰富的研究人员而言可能显而易见，但对于刚开始从事研究的人员来说，这些内容可能极为宝贵。

本文基于我们实验室多年的实践经验，介绍了用于采集和处理样本以获取细菌遗传数据的方法，旨在研究水力压裂对附近溪流的影响。这些数据可用于后续分析，以识别与水力压裂状态相关的差异。

方案

1. 核酸提取用沉积物样品的采集

  1. 将一个无菌的50 mL锥形管浸入溪流水中。采样时应佩戴手套，以避免引入人为污染。此步骤可在岸边进行，或在水中时面向上游方向操作。
  2. 保持锥形管浸没于水中时，取下管盖，用其从水底1至3 cm深度处舀取约3 mL的沉积物至锥形管中。
  3. 将锥形管从水中取出，倒掉其中所有上清液，仅保留覆盖在沉积物表面的一薄层液体（约1 mL）。
  4. 使用1000 µL移液器及配套的移液器吸头，向采集的样品中加入3 mL DNA/RNA保存液（保存液的具体规格见材料表）。移液器吸头应存放于无菌的吸头盒中，仅在使用前立即安装，并在使用后丢弃。盖紧管盖后，上下颠倒混匀10次，确保保存液与样品充分混合。
    注意：步骤1.4并非必需，但如果后续需从沉积物中提取RNA，则强烈建议执行此步骤。
  5. 在完成后续采样期间，将样品置于冰上。采样结束后，若样品将用于16S分析（DNA），则储存于-20 °C冰箱中；若用于宏转录组分析（RNA），则储存于-70 °C冰箱中。

2. 核酸提取的滤膜收集

  1. 取下一个无菌的1 L瓶子的瓶盖。面对上游或从岸边开始，将溪水灌满瓶子至顶部，然后倒掉。重复此过程两次，以润洗瓶子。第四次将瓶子完全装满后盖上瓶盖。
    注意：如果重复使用1 L瓶子，可通过以下步骤进行灭菌：用10%次氯酸钠溶液冲洗2分钟，接着用去离子水冲洗三次，再用70%乙醇冲洗一次，最后在121.1 °C条件下高压灭菌30分钟，并保持15分钟干燥时间。高压灭菌过程中，瓶盖应拧得非常松，以避免瓶子在过程中受压变形。
  2. 将瓶子置于稳定台面后，使用无菌鲁尔锁式注射器吸取满体积液体。然后将注射器连接至一个无菌且无DNA/RNA的聚醚砜滤膜（直径1.7 cm，孔径0.22 µm），通过完全压下活塞将全部液体推过滤膜。重复此操作，直至瓶中收集的总体积（1 L）全部通过滤膜。
    注意：注射器体积可灵活选择，只要准确记录通过滤膜的总水量即可。通常推荐使用60 mL注射器。虽然1 L为理想体积，但根据经验，至少200 mL的水量（假设每毫升约含20,000个细胞）仍可能足以用于后续DNA和RNA的提取。
  3. 用注射器吸入约20 mL空气，并将其推过滤膜，以去除滤膜中多余的水分。
    注意：此步骤有助于防止在执行步骤2.4时保存剂的损失。
  4. 使用P1000移液器，将2 mL DNA/RNA保存剂通过滤膜较大的开口（即连接注射器的一端）注入，操作时保持滤膜水平放置。按下移液器时，移液枪头应位于滤膜筒内部，以确保保存剂进入滤膜内部。每次使用后更换枪头。
    注意：与沉积物采集类似，此步骤并非必需，但强烈建议执行，以提高后续核酸得率，尤其是RNA。
  5. 撕下一块石蜡膜，紧密包裹滤膜的每个开口/两端以密封。将包裹好的滤膜放入无菌样品袋中，并在采样期间将整个样品袋置于冰上保存。
    注意：确保用于包裹滤膜的石蜡膜表面无菌，即此前未暴露于环境中。
  6. 采样返回后，将滤膜在-20 °C保存用于16S分析，或在-70 °C保存用于宏转录组分析。

3. 核酸提取与定量

  1. 在开始样品转移前，使用10%次氯酸钠溶液和70%乙醇清洁工作区域。
  2. 对于来自步骤1.5的沉积物，通常使用约0.25 g样品。将金属工具浸入盛有70%乙醇的烧杯中，通过火焰灼烧乙醇实现工具的灼烧灭菌，每处理一个样品之间均需进行此操作。
  3. 对于滤膜（来自步骤2.6），将滤纸转移至无菌管中用于提取。操作步骤如下。
    1. 通过折叠铝箔以确保其内层不暴露于外部环境，然后在121.1 °C条件下高压灭菌并设置5分钟干燥时间，从而制备无菌、无DNA和无RNA的表面。
    2. 用70%乙醇和明火对尖嘴钳进行灭菌。然后在无菌表面上用尖嘴钳打开滤器外壳，并从外壳中取出滤芯。
    3. 使用无菌手术刀在芯体的顶部和底部切开，然后沿接缝处切割，将滤纸从芯体上分离。用无菌镊子折叠滤纸，再用手术刀将滤纸切成小片。
    4. 将滤纸片放入微量离心管中用于提取。确保滤纸不接触任何未灭菌或可能含有核酸的表面，以免导致样本发生非预期的污染。
  4. 按照先前所述方法进行DNA提取13 或使用市售的基于柱层析的试剂盒（参见 材料表）。以下简要描述所列商用试剂盒的操作步骤。
    1. 将样品转移至珠管中，使用细胞破碎仪高速处理至少5分钟以裂解细胞。离心后，将上清液转移至无菌微量离心管中。
    2. 向上清液中加入裂解缓冲液（体积比1:1），转移至提供的滤膜（黄色）中，离心过滤。
    3. 将滤膜转移至新的无菌微量离心管中，加入400 µL预处理缓冲液，离心后弃去滤过液。
    4. 加入洗涤缓冲液（700 µL），离心，弃去流出液。然后加入洗涤缓冲液（400 µL），离心，再次弃去流出液。
    5. 将滤膜转移至新的无菌微量离心管中，加入50 µL无DNase/RNase水，室温静置5分钟，然后离心。
    6. 在孵育期间，将III-HRC滤芯放入收集管中，加入HRC预处理液（600 µL），随后以8,000 x g离心3 min。 g.
    7. 将制备好的滤膜移至一支无菌的微量离心管中。将步骤 3.4.5 中洗脱的 DNA 转移至该滤膜上，于 16,000 x g 离心 g 3 分钟。流出液中含有提取的 DNA。
  5. 将沉积物和滤膜的DNA提取物在-20 °C下保存。
    注意：假设温度稳定、避光且无有害污染物，DNA 提取物可在 -20 °C 下保存约 8 年14.
  6. 按照制造商的说明书进行RNA提取。将RNA提取物保存在-80 °C。
    1. 将样品转移至珠管中，使用细胞破碎仪高速处理至少五分钟以裂解细胞。离心后，将上清液转移至无菌微量离心管中。
    2. 向 supernatant 中加入裂解缓冲液（体积比1:1），转移至提供的离心柱（黄色）中。离心柱离心。
    3. 加入等体积的95-100%乙醇至流穿液中，用移液器上下吹打混匀五次。
    4. 将IICG柱（绿色）置于无菌微量离心管上。将混合溶液转移至柱中，离心。
    5. 加入洗涤缓冲液（400 µL），离心后弃去滤过液。
    6. 向柱中加入5 µL DNase I和75 µL DNA消化缓冲液，在室温下孵育15分钟。
    7. 加入预平衡缓冲液（400 µL），离心，弃去流出液。
    8. 加入洗涤缓冲液（700 µL），离心，弃去流出液。然后加入洗涤缓冲液（400 µL），离心，再次弃去流出液。
    9. 将柱子转移至新的无菌微量离心管中，加入50 µL无DNase/RNase水，静置5分钟，然后离心洗脱。
    10. 在孵育期间，将III-HRC滤芯放入收集管中，加入HRC预处理液（600 µL），随后以8,000 x g离心3分钟，完成滤芯的准备。 g.
    11. 将制备好的滤器转移至一支无菌的微量离心管中。将步骤 3.6.9 中洗脱的 RNA 加入此滤器中，于 16,000 x g 离心 g 3 分钟。流出液中含有提取的 RNA。
      注意：RNA 提取物在开始降解前最多只能保存一年15DNA和RNA提取物在反复冻融过程中会被降解。某些实验方案允许从同一样本中同时提取DNA和RNA。16,17.
  7. 使用荧光计或分光光度计对提取的DNA和RNA样本进行定量。参见 表1 例如荧光计测定的DNA浓度值。有关分光光度计定量方案的示例，请参见参考文献18使用所列试剂盒的沉积物DNA浓度值 材料表 通常在 1 至 40 ng/µL 之间，而滤膜 DNA 浓度值通常在 0.5 至 10 ng/µL 之间。使用清单中所列试剂盒测得的沉积物 RNA 浓度值 材料表 通常在1至20 ng/µL之间，而滤膜RNA的浓度值往往较低，通常在0.5至5 ng/µL之间。

4. 16S rRNA 文库构建

  1. 使用10%次氯酸钠和70%乙醇清洁工作区域。工作区域应为能够产生层流条件的封闭空间（层流罩）。
  2. 使用DNA提取物（来自步骤3.5），在层流条件下，按照标准PCR方案制备用于16S rRNA扩增子测序的样品，例如Earth Microbiome网站所述的扩增16S rRNA V4高变区的方案19。
  3. 按先前所述方法制备2%琼脂糖凝胶，并使其凝固17。将7 µL PCR产物与13 µL无DNase水混合，加入凝胶上样染料至终浓度为1×。待琼脂糖凝固后，将该PCR产物混合液上样至2%琼脂糖凝胶。
    注意：也可使用预制胶，因其运行速度更快且已预先制备完成。
  4. 以90 V电压电泳60–90分钟，通过检测约386 bp条带的存在判断16S rRNA V4扩增子是否成功扩增，具体参照Earth Microbiome的实验方案。

5. DNA 16S rRNA 文库纯化

  1. 将产生明亮条带的样品 PCR 产物各取 10 µL，产生微弱条带的样品 PCR 产物各取 13 µL，汇集至适当大小的无菌微量离心管中。
  2. 使用荧光计或分光光度计检测所得混合物的浓度，并按前述方法制备 2% 琼脂糖凝胶。理想情况下，混合物的浓度应至少达到 10 ng/µL，大多数样品的浓度应约为 25 ng/µL。
  3. 在浓度和体积允许的情况下，将约 150–200 ng 的样品上样至 2% 琼脂糖凝胶的加样孔中。
  4. 在 90 伏电压下电泳运行 60–90 分钟。
  5. 通过运行 2% 琼脂糖凝胶对混合文库进行纯化。
    1. 从凝胶中切下 386 bp 的 DNA 条带，并按照先前所述方法使用 commercially available kit（商业化试剂盒）纯化混合文库20。用 30 µL 的 10 mM Tris-Cl（pH 8.5）洗脱纯化后的 DNA。此步骤应在与 DNA 或 RNA 提取不同的区域进行，以防止后续污染，因为切胶操作会将 PCR 扩增子扩散至实验人员及周围环境中。
  6. 使用荧光计或分光光度计检测纯化后混合物的浓度。若纯化效果良好，其浓度应至少为纯化前混合物的一半。通常，最终浓度应在 5 至 20 ng/µL 范围内。
  7. 将纯化后的文库送交进行高通量测序（下一代测序）。确保运输过程中保持低温，需在运输容器中加入干冰。

6. RNA文库构建与纯化

  1. 可使用多种商业试剂盒构建RNA文库。无论使用哪一种试剂盒，均需在无菌的层流环境中严格按照制造商提供的说明书进行操作。下文简要概述了材料表中所列试剂盒的操作流程21。
    1. 配制第一链cDNA合成预混液（8 µL无核酸酶水和2 µL第一链合成酶混合液），加入样本中。将样本放入PCR仪，按照说明书指定的条件进行反应。
    2. 在冰上配制第二链cDNA合成预混液（8 µL第二链合成反应缓冲液、4 µL第二链合成酶混合液和48 µL无核酸酶水），加入样本中。将样本置于设定为16 °C的PCR仪中反应1小时。
    3. 加入提供的磁珠（144 µL）纯化反应产物，并用80%乙醇洗涤两次（每次200 µL）。
    4. 用提供的TE缓冲液（53 µL）洗脱，转移50 µL上清液至新的洁净PCR管中。将PCR管置于冰上。
    5. 在冰上配制末端修复预混液（7 µL末端修复反应缓冲液和3 µL末端修复酶混合液），加入PCR管中。将PCR管放入PCR仪，按照说明书指定的条件进行反应。
    6. 在冰上混合稀释的接头（2.5 µL）、连接预混液（30 µL）和连接增强剂（1 µL）。将混合液加入样本中，置于PCR仪中在20 °C反应15分钟。
    7. 加入提供的磁珠（87 µL）纯化反应产物，用乙醇洗涤（200 µL）并洗脱，操作同前，但仅加入17 µL TE缓冲液。
    8. 加入index引物（10 µL）和Q5预混液（25 µL），放入PCR仪，按照说明书指定的条件进行扩增。
    9. 加入提供的磁珠（45 µL）纯化反应产物，再进行两次乙醇洗涤（每次200 µL），用23 µL TE缓冲液洗脱。转移20 µL至新的洁净PCR管中。
  2. 使用生物分析仪、荧光计或分光光度计检测文库中RNA的可检测浓度。
  3. 将宏转录组文库按大致等摩尔比例混合。
  4. 按照16S文库纯化的相同流程对文库进行纯化，但切取250至400 bp之间的片段。与16S文库具有明显条带不同，此处结果为弥散条带（smear）。
  5. 如前所述，检测纯化后文库的浓度。
  6. 将纯化后的文库用干冰运输至测序机构。
    ​注意：也可将RNA提取物送至大学或私营公司进行文库构建和测序。

7. 微生物群落分析

  1. 测序完成后，获取样本数据，并将其下载到可用的计算机上。
    注意：理想情况下，设备应至少配备 16 GB 的内存。有关计算需求（针对 Qiime2）的讨论，请参见 https://forum.qiime2.org/t/recommended-specifications-to-run-qiime2/9808。
  2. 使用 mothur、QIIME2 和 R 等软件分析 16S rRNA 数据。示例 QIIME2 16S 分析教程请参见 https://docs.qiime2.org/2020.11/tutorials/moving-pictures/。
  3. 对于宏转录组学（RNA）数据，使用 HUMAnN2 和 ATLAS 确定样本中存在的基因和通路。
    注意：示例宏转录组学分析流程（最终进行多样性分析和随机森林分析）见于补充信息文件中。所有命令均通过命令行运行，例如 Mac 用户使用 Terminal。

结果

DNA 和 RNA 提取是否成功可通过多种仪器和方案进行评估。通常，只要能够检测到任一物质的浓度，即可认为提取成功。因此，查看表 1 可知，除一个样本外，其余所有提取均被视为成功。此步骤失败通常源于初始生物量过低、样品保存不佳或提取过程中的人为操作失误。对于滤膜样品而言，即使浓度低于检测限，提取仍可能实际成功。如果这些提取物在 PCR 扩增（如进行 16S 扩增子测序）中未产生条带，或在文库构建后（宏转录组测序）仍无法检测到浓度，则可判定其确实失败。

如果遵循16S实验方案，PCR扩增后出现明亮的条带（如图1中第4和第6孔所示）表明实验成功，而无条带出现（如第一行其他孔所示）则表明实验失败。此外，阴性PCR对照所在的凝胶泳道中若出现明亮条带，也表明实验失败，因为此时很难排除污染是否同样影响了样本。

对于16S和宏转录组测序，均可通过获得的序列数量来评估测序结果的成功与否（图2）。16S样本应至少获得1,000条序列，理想情况下应达到至少5,000条（图2A）。同样，宏转录组样本应至少获得500,000条序列，理想情况下应达到至少2,000,000条（图2B）。序列数低于最低要求的样本不应用于后续分析，因其可能无法准确代表其细菌群落结构。然而，若样本序列数介于最低值与理想值之间，仍可使用，但当大量样本处于该范围时，结果应更加谨慎地解读。

后续下游分析的成功与否，可简单地根据是否获得预期的输出文件来判断。无论如何，QIIME2 和 R 等程序应能够基于水力压裂活动对细菌群落之间可能存在的显著差异进行评估（图3）。图3 的数据来自在13条不同溪流的21个不同地点采集的沉积物样本，用于16S和宏转录组学分析。在这21个采样点中，有12个位于水力压裂活动的下游，被归类为HF+；另外9个位于水力压裂活动的上游，或位于未进行水力压裂的流域内，这些溪流被归类为HF-。除水力压裂活动的存在与否外，这些溪流的其他条件均具有可比性。

这些差异可能表现为基于水力压裂状态的群落组成持续性变化。如果情况如此，HF+ 和 HF- 样本在 PCoA 图中应彼此分开聚类，如图 3A 和 图 3B 所示。为了确认这些明显的差异并非排序方法的人为假象，还需进行进一步的统计分析。例如，对生成图 3A 和 图 3B 所依据的距离矩阵进行 PERMANOVA22 检验，结果显示基于水力压裂状态存在显著聚类，表明图中观察到的分离现象反映了样本间细菌群落的真实差异，而非排序方法所致的人为假象。显著的 PERMANOVA 或 ANOSIM 结果强烈提示 HF+ 与 HF- 样本之间存在一致性的差异，这表明 HF+ 样本受到了水力压裂的影响；而较高的 p 值则表明样本未受水力压裂影响。宏转录组数据同样可以使用相同的方法进行可视化和评估。

分析差异性特征（微生物或功能）可以揭示样本可能受到干扰的证据。确定差异性特征的一种方法是构建随机森林模型。该随机森林模型可用于评估样本的水力压裂状态能否被准确分类。如果模型的分类性能优于随机预期，则进一步表明样本间的差异与水力压裂状态相关。此外，模型中最重要的预测因子将揭示哪些特征在正确区分样本时最为关键（图3C）。这些特征的数值也会根据水力压裂状态表现出持续性的差异。一旦确定了这些差异性特征，便可查阅文献，判断其是否曾被报道与水力压裂相关。然而，寻找关于差异性功能的研究可能具有挑战性，因为大多数研究仅使用了16S rRNA组成数据。因此，在评估差异性功能的意义时，一种可行的方法是分析这些功能是否曾被报道与压裂液中常用生物杀灭剂的潜在抗性相关，或是否有助于耐受高盐环境。此外，分析特定分类单元的功能谱型也可能揭示水力压裂影响的证据（图3D）。例如，若某一分类单元被随机森林模型识别为差异性类群，可将其在HF+样本中的抗微生物耐药谱型与HF-样本中的谱型进行比较；若两者存在显著差异，则提示含有生物杀灭剂的压裂液可能已进入溪流。

样本编号浓度 (ng/µL)
11.5
21.55
30.745
40.805
57.82
60.053
70.248
80.945
91.82
100.804
110.551
121.69
134.08
14低于检测限
157.87
160.346
172.64
181.15
190.951

表1：基于Fluorometer 1x DS DNA高灵敏度检测法测定的DNA浓度示例. 除样品14外，其余所有样品的提取均被视为成功，因其含有可检测量的DNA。

凝胶电泳图，2%琼脂糖凝胶上的DNA分离，泳道分析，分子量标记物。
图1：PCR产物的电泳凝胶示例。 凝胶预先染色，并在紫外光下观察，使凝胶上存在的任何DNA发出荧光。第一行第4和第6孔的样品PCR成功，因为二者均出现一条亮度高且大小符合预期的单一条带（根据DNA ladder判断）。其余六个孔的样品PCR失败，因为未产生任何条带。阳性对照（第二行第一孔）出现明亮条带，表明PCR操作正确；阴性对照（第二行第6和第7孔）无条带，表明样品未受污染。如果阴性对照出现与样品亮度相当的条带，则认为PCR失败，因为无法排除样品中的扩增产物仅来源于污染。 请点击此处查看该图的放大版本。

序列样本的密度分布图；比较数据分析，图A和B。
图2：序列数示例。（A）16S序列数示例。几乎所有这些16S样本的序列数都超过1,000条。极少数序列数少于1,000条的样本应从后续分析中排除，因为其序列数量不足以准确代表相应的细菌群落。部分样本的序列数在1,000至5,000条之间；虽然并非理想，但由于超过了最低要求，仍可使用，且大多数样本也超过了5,000条这一理想最低值。（B）宏转录组学序列数示例。所有样本的序列数均超过了最低要求（500,000）和理想最低值（2,000,000）。因此，所有样本的测序均成功，均可用于后续分析。请点击此处查看此图的放大版本。

显示降维和变量重要性的多变量数据分析图示。
图 3：示例分析。（A）基于通过 QIIME2 创建并可视化的加权 Unifrac 距离矩阵计算出的坐标生成的 PCoA 图。（B）基于从 QIIME2 导出的加权 Unifrac 距离矩阵计算出的坐标生成的 PCoA 图。该坐标的可视化使用 R 中的 Phyloseq 和 ggplot2 软件包完成。使用 Vegan 软件包将元数据向量拟合到图中。每个点代表一个样本的细菌群落，点之间距离越近表示群落组成越相似。在这些 16S 沉积物样本中观察到基于水力压裂状态的聚类现象（PERMANOVA，p=0.001）。此外，向量显示 HF+ 样本中钡、溴化物、镍和锌的含量往往更高，且其细菌群落组成与 HF- 样本不同。（C）随机森林模型的最佳预测因子图，用于检验细菌丰度是否可用于预测样本中的水力压裂状态。该随机森林模型通过 R 中的 randomForest 软件包构建。图中展示了前 20 个预测因子，以及利用这些因子分离样本时所带来的杂质减少程度（即 HF+ 和 HF- 样本被归为同一组的数量减少），以平均 Gini 指数下降值表示。（D）基于宏转录组数据的伯克氏菌目（Burkholderiales）抗菌素耐药性谱的饼状图。首先使用 Kraken2 对序列进行注释以确定其所属分类单元，然后利用这些已注释的序列与 MEGARes 2.0 数据库进行 BLAST 比对，以确定哪些抗菌素耐药基因（以“MEG_#”形式表示）正在被主动表达。随后提取伯克氏菌目成员所表达的抗菌素耐药基因，以分析在该分类单元中最常见的耐药基因类型。尽管宏转录组学成本更高且耗时更长，但它能够实现功能层面的分析，例如本例中的分析，而这是 16S 数据无法实现的。值得注意的是，本示例分析使用了 Kraken2 而非 HUMAnN2。Kraken2 比 HUMAnN2 更快，但它仅输出组成信息，而无法像 HUMAnN2 那样同时提供组成、贡献度、基因（功能）和代谢通路信息。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件：一个宏转录组学分析流程的示例。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文所述方法是在2014年至2018年间由我研究团队发表的多项研究中逐步开发和完善而成的7,8,10，并已成功应用于一项为期三年的协作项目中，用于研究水力压裂对水生群落的影响，该项目即将提交一篇待发表的论文。这些方法将在项目剩余时间内继续使用。此外，目前其他研究水力压裂对溪流和生态系统影响的文献也描述了类似的样品采集、处理和分析方法7,8,10,11。然而，这些文献均未采用宏转录组学分析，因此本文是首篇描述如何利用此类分析方法揭示水力压裂对邻近溪流影响的研究。此外，本文所提出的数据采集方法更为详尽，且在防止污染方面所采取的步骤也更加细致。

本方案中最重要的步骤之一是初始样品的采集与保存。野外采样和收集过程面临某些挑战，因为在采集过程中维持无菌或无菌环境可能较为困难。在此步骤中，避免样品污染至关重要。为此，应佩戴手套，并且仅允许无菌容器和工具接触样品。采集后，样品应立即置于冰上，以减缓核酸降解。在采集时添加商业化的核酸保存剂，也可提高核酸得率，并使样品在采集后能够长期保存。无论何时进行核酸提取，使用适量的样品都非常重要：样品过多可能会堵塞用于提取的离心过滤柱（针对使用此类柱子的方案），而样品过少则可能导致得率偏低。请务必遵循所用试剂盒的说明书操作。

与野外采样类似，在核酸提取和样品制备过程中，避免或尽量减少污染也非常重要，尤其是在处理核酸产量较低的样品时，例如非最佳沉积物样品（含有大量碎石或岩石的样品）或水样。因此，与样品采集一样，在所有这些步骤中都应佩戴手套，以减少污染。此外，实验过程中使用的所有工作台面应在操作前用10%次氯酸钠溶液擦拭消毒，随后再用70%乙醇溶液擦拭。在移液步骤（3–6）中，应使用滤芯吸头，以避免移液器本身带来的污染，并且每次接触非无菌表面后都应更换吸头。所有用于实验操作的工具（包括移液器）均应在使用前后用次氯酸钠和乙醇溶液进行擦拭。为评估污染情况，每次进行核酸提取和PCR反应时都应包含提取空白对照和阴性对照（无菌液体）。如果提取后的定量结果显示阴性对照中可检测到DNA/RNA，则在样品量充足的情况下可重复提取。如果PCR的阴性样品出现扩增，应进行故障排查以确定污染来源，然后重新运行样品。为应对低水平污染，建议对提取空白对照和PCR阴性对照进行测序，以便在必要时通过计算分析识别并去除污染物。相反，PCR扩增也可能因多种原因失败。对于环境样品，PCR反应受到抑制通常是主要原因，这可能是由于多种物质干扰了Taq DNA聚合酶23的活性。若怀疑存在抑制作用，可使用PCR级水（见材料表）稀释DNA提取物。

本方案存在一些显著的局限性和潜在困难。水样和沉积物样品的采集均可能具有挑战性。为了获得足够的生物量，理想情况下需要将1 L的溪流水样通过滤膜过滤。滤膜的孔径需足够小以捕获微生物，但也可能同时截留沉积物颗粒。若因近期降雨导致水体中含有大量沉积物，滤膜容易堵塞，难以将全部水样体积过滤通过。在采集沉积物时，准确估计采样深度也可能较为困难。此外，需确保所采集的沉积物主要成分为土壤，因为砾石和岩石会降低核酸得率，并且可能无法准确代表微生物群落的真实情况。最后，样品采集后必须始终保持在冰上保存，尤其是在未使用保存剂的情况下，这一点至关重要。

尽管本实验方案同时涵盖了宏转录组学和16S的实验操作流程，但需要强调的是，这两种方法在操作过程及其所提供的数据类型方面存在显著差异。16S rRNA基因是细菌和古菌中一个高度保守的常用靶向区域，适用于对样本中的细菌群落进行表征。然而，作为一种靶向性特定方法，其通常难以实现物种水平的分辨，且对新近分化的物种或菌株的鉴定较为困难。相比之下，宏转录组学是一种更广泛的方法，能够捕获样本中所有活跃表达的基因和微生物。16S仅能提供物种鉴定相关数据，而宏转录组学则可提供功能层面的信息，例如基因表达情况和代谢通路。两种方法均具有重要价值，联合使用时可揭示样本中存在哪些细菌以及这些细菌正在表达哪些基因。

本文介绍了在研究水力压裂（fracking）背景下，进行16S rRNA和宏转录组分析的野外样品采集与处理方法。此外，还详细描述了从生物量极低的样品中提取高质量DNA/RNA以及长期保存样品的采集方法。文中所述方法总结了我们在样品采集与处理方面的实践经验，旨在通过分析微生物群落的结构与功能，揭示水力压裂对周边溪流生态系统的影响。微生物对环境扰动响应迅速，因此，存在的微生物种类及其表达的基因可提供有关水力压裂对生态系统影响的重要信息。总体而言，这些方法对于深入理解水力压裂如何影响这些重要生态系统具有重要价值。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者希望感谢为开发这些方法的相关项目提供资助的机构，包括：通过本科前及本科科学教育项目提供资助的霍华德·休斯医学研究所（http://www.hhmi.org），以及通过资助编号为 DBI-1248096 和 CBET-1805549 的项目提供支持的 国家科学基金会（http://www.nsf.gov） 。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
200 证明乙醇Thermo Fisher ScientificA4094需向 Buffer PE 中加入 400 mL（参见 Qiagen QIAQuck 凝胶提取试剂盒说明书），并向 DNA/RNA 洗涤缓冲液中加入 96 mL（参见 ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep 试剂盒说明书）。
ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep 试剂盒和 NEBNext® Ultra™ II RNA 文库构建试剂盒（含样本纯化磁珠）还需额外乙醇。
琼脂糖Thermo Fisher ScientificBP1356-100每瓶 100 g。制备一块 30 mL 的 2% 凝胶需使用 0.6 g 琼脂糖。
消毒漂白剂Walmart (Clorox)无目录号实验前后需使用 10% 漂白剂溶液清洁工作区域
DNA 凝胶上样染料Thermo Fisher ScientificR0611每个自制（非 e-gel）样品均需加入上样染料，比例为每 5 µL 样品加入 1 µL 染料
DNA MarkerMilliporeSigmaD3937-1VL每次电泳（包括 e-gel）均应运行 DNA Marker
DNA/RNA Shield (2x)Zymo ResearchR1200-125每个沉积物样品（50 mL 离心管）需 3 mL，每个水样（滤膜）需 2 mL
溴化乙锭Thermo Fisher ScientificBP1302-10用于染色自制 e-gel
正向引物Integrated DNA Technologies (IDT)51-01-19-06每轮 PCR 反应需 0.5 µL
异丙醇MilliporeSigma563935-1L通常每文库用量少于 2 mL。具体体积取决于切胶片段的质量（参见 Qiagen QIAQuick 凝胶提取试剂盒说明书）。 
PCR 级水MilliporeSigma3315932001每轮 PCR 反应需 13 µL（假设使用 1 µL 样本 DNA 模板）
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)Thermo Fisher Scientific13000012每轮 PCR 反应需 10 µL
反向引物Integrated DNA Technologies (IDT)51-01-19-07每轮 PCR 反应需 0.5 µL
TBE 缓冲液 (Tris-硼酸-EDTA)Thermo Fisher ScientificB52需 1 L 10x TBE 缓冲液（制备一块 30 mL 凝胶需 30 mL 1x TBE 缓冲液）
1 L 瓶Thermo Fisher Scientific02-893-4E每条溪流需一个（若在使用间进行灭菌，同一瓶子可用于多条溪流）
1.5 mL 微量离心管MilliporeSigmaBR780400-450EA每次 DNA 提取需 5 个微量离心管，额外需 3 个用于 RNA 纯化（参见 ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep 试剂盒说明书）
2% 琼脂糖 e-gelThermo Fisher ScientificG401002每块凝胶可运行 10 个样品（因此若包含一个 PCR 阴性对照，则为 9 个；若同时运行提取阴性对照，则为 8 个）
50 mL 离心管CellTreat229421每个沉积物样品需 1 个 50 mL 离心管
500 mL 烧杯MilliporeSigmaZ740580仅需 1 个（用于火焰灭菌）
铝箔Walmart (Reynolds KITCHEN)无编号铝箔可折叠后高压灭菌。未暴露于环境的部分可用作处理滤膜时的无菌、无 DNA 和 RNA 污染的表面
（每个滤膜使用一块折叠铝箔，以避免交叉污染）
高压灭菌器GettingeLSS 130仅需 1 台
离心机MilliporeSigmaEP5404000138-1EA仅需 1 台
保温箱ULINES-22567几乎任何保温箱均可使用。此处列出的型号因由泡沫制成而更轻，便于野外采样时携带。
Disruptor GenieBio-Rad3591456仅需 1 台
电泳槽Bio-Rad1664000EDU仅需 1 台
电泳电源Bio-Rad1645050仅需 1 台
冷冻柜 (-20 °C)K2 SCIENTIFICK204SDF需 1 台用于储存 DNA 提取物
超低温冰箱 (-80 °C)K2 SCIENTIFICK205ULT需 1 台用于储存 RNA 提取物
手套Thermo Fisher Scientific19-020-352目录号对应中号手套。
加热块MilliporeSigmaZ741333-1EA仅需 1 台
实验室喷灯Sterlitech177200-00仅需 1 台
层流罩AirClean SystemsAC624LFUV仅需 1 台
文库纯化试剂盒Qiagen28704每套试剂盒可进行 50 次反应
磁力架AlpaquaA001219仅需 1 个
微量离心机Thermo Fisher Scientific75004061仅需 1 台
移液器 (1000 µL 量程)Pipette.comL-1000仅需 1 支
移液器 (2 µL 量程)Pipette.comL-2仅需 1 支
移液器 (20 µL 量程)Pipette.comL-20仅需 1 支
移液器 (200 µL 量程)Pipette.comL-200R仅需 1 支
NEBNext Ultra II RNA 文库构建试剂盒（含样本纯化磁珠）New England BioLabs Inc.E7775S每套试剂盒包含 24 个样本所需的试剂。
Parafilm 封口膜MilliporeSigmaP7793-1EA每个滤膜需 2 块 1" × 1" 的正方形封口膜
PCR 管Thermo Fisher ScientificAM12230每轮反应需 1 支
移液器吸头 (适用于 1000 µL 量程)Pipette.comLF-1000每包 576 个吸头
移液器吸头 (适用于 20 µL 量程)Pipette.comLF-20每包 960 个吸头
移液器吸头 (适用于 200 µL 量程)Pipette.comLF-250每包 960 个吸头
PowerWulf ZXR1+ 计算机集群PSSC Labs无编号此为一台足够强大的超级计算机示例，可及时完成宏转录组学分析。仅需 1 台。 
Qubit 荧光计启动试剂盒Thermo Fisher ScientificQ33239包含 Qubit 4 荧光计、100 次 DNA 检测所需的试剂以及 500 个 Qubit 管
药勺Thermo Fisher Scientific14-357Q仅需 1 个
无菌刀片AD SurgicalA600-P10-0每个滤膜需 1 片
Sterivex-GP 压力过滤装置MilliporeSigmaSVGP01050每个水样需 1 个滤器
PCR 仪Bio-Rad1861096仅需 1 台
老虎钳Irwin2078500仅需 1 个（用于打开滤器）
Vortex-Genie 2 涡旋振荡器MilliporeSigmaZ258415-1EA仅需 1 台
WHIRL-PAK 袋ULINES-22729每个滤膜需 1 个
ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep 试剂盒Zymo ResearchR2002每套试剂盒包含 50 个样本所需的试剂。 

参考文献

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16S rRNA PERMANOVA

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