使用微生物分子特征评估水力压裂对溪流的影响

此协议可用于回答水力压裂是否以及如何影响附近溪流中的细菌以及扩展流本身的问题。该技术的主要优点是其整体性，因为它通过数据分析从样本收集一路走来。演示这个程序的将是杰里米·钱西，我的实验室生物信息学家，悉尼富豪，朱尼亚塔学院的本科生，以及我的实验室经理吉莉安·莱斯特。

要收集用于提取核酸的沉积物样本，请使用手套将盖有盖的无菌 50 毫升圆锥管从岸边浸入溪水中。当管子被淹没时，取下盖子，用盖子将大约三毫升的沉积物从一到三厘米的深度挖入管中。采集样本后，将除约一毫升水外的所有水倒出管中，并使用 1000 微升移液器在样品中加入 3 毫升 DNA/RNA 防腐剂。

将盖住的圆锥管旋转五秒钟，彻底混合防腐剂和样品，并将样品储存在冰上。返回实验室后，将样品储存在零下 20 摄氏度，用于 16S DNA 分析，或零下 70 摄氏度进行元数据学 RNA 分析。对于过滤器收集，完全填充和清空整个无菌的一升瓶与流水三次，以条件的瓶子之前，灌装瓶子最后一次。

在稳定的表面上，将大量流水抽入无菌的引诱锁注射器中，并将注射器与无菌和脱氧核糖核酸/RNA无1.7厘米直径的聚醚硫酮过滤器连接起来，孔径为0.22微米。通过过滤器冲洗整个流水量。当以同样的方式过滤整个样品体积时，将大约 20 毫升的空气抽入注射器中，将空气推入过滤器，以去除过滤器中的任何多余的水。

接下来，使用 P1000 微管将两毫升 DNA/RNA 防腐剂添加到滤清器的较大开口中，同时用过滤器桶中的移液器尖端水平保持滤网，以确保防腐剂进入过滤器。然后用紧密包裹的石蜡片方块密封过滤器，并将滤镜放入冰上无菌样品袋中。从采样返回后，将过滤器存储为 16S 或如所示用于元描述性分析。

在开始样品转移之前，用 10% 漂白剂和 70% 乙醇清洁工作区域。要从沉积物样品中提取核酸，请使用火焰和乙醇灭菌金属工具将大约 250 毫克的样品转移到微中心管中。对于从过滤器样品中提取的核酸，使用 70% 乙醇和火焰消毒的副抓地力打破无菌表面上的滤芯外壳，从外壳中取出核心。

使用无菌手术刀在核心的顶部、底部和接缝处切片，并使用无菌钳子将滤纸折叠起来，然后用手术刀将其切成小块。然后小心地将滤件放入微中心管中，而不接触任何未消毒的表面。要在任一类型的样品中解裂细胞，要使管子高速受细胞干扰。

至少五分钟后，离心取样，将超强剂转移到新的无菌微中心管中。以一对一的比例将裂解缓冲器添加到超纳特中，并将解决方案转移到所提供的过滤器中。将过滤器放入新的微中心管中，并在管中加入 400 微升制备缓冲器。

离心后，在管子中加入700微升的洗涤缓冲器，并再次离心过滤器。丢弃流过后，在管中加入 400 微升洗涤缓冲器，进行额外的离心，并将过滤器转移到新的无菌微中心管中。为了提取DNA，在室温下用50微升无DNase/无酶水处理过滤器5分钟。

同时，将三个 HRC 过滤器放入收集管中，并添加 600 微升 HRC 预制解决方案。离心后，将过滤器转移到新的无菌微中心管中，并将脱氧核糖核酸转移到过滤器进行离心。流经包含提取的DNA。

要创建 DNA 16S RNA 库，请首先使用新提取的 DNA 产品进行 16S 核糖体RNA放大，并采用标准 PCR 协议。将产生的 PCR 产品的 7 个微升器和 13 个无 DNase 水的微升器混合，并将 PCR 溶液加载到 2% 的玫瑰凝胶上。然后以 90 伏特的速度运行凝胶 60 到 90 分钟，以检查带大小为 386 个碱基对，作为成功放大的证据。

为了净化DNA 16S核糖核酸RNA库，将产生明亮带的PCR产品的10微升和样品的13微升池，在无菌微中心管中产生微弱的带，并将每个汇集样品的约150至200毫克装入新的2%凝胶的单独井中。如所示，在运行凝胶后，从凝胶中切除 386 个碱基对带，并使用商业套件净化 DNA。然后用30微升10毫摩尔盐酸三酯提取纯化DNA，将纯化库装在干冰中，然后装运下一代测序。

在这个具有代表性的分析中，除一个外，所有提取都将被称为成功。PCR 放大后观察到的亮带表示 16S 协议的成功。16S样本应至少具有1000个序列，至少5000个序列是理想的，而元数据体样本应有至少50万个序列，其中至少200万个序列是理想的。

显示了来自 13 个不同流的 21 个不同站点的沉积物样本，用于 16S 和元描述学分析。在这21个地点中，12个位于压裂活动下游，并被列为水力压裂阳性，9个地点属于压裂活动上游或没有压裂的流域，并被列为水力压裂阴性。根据PERMANOVA分析评估，水力压裂正负数据之间的分离表明，水力压裂阳性样品受到压裂的影响。

最重要的随机森林预测器将揭示哪些特征对于正确区分样本最为重要。如果随机森林模型确定分类很重要，则其水力压裂阳性样品中的抗微生物药物耐药性特征可与其水力压裂阴性样品的轮廓进行比较。如果它们差异很大，这可能表明含有杀菌剂的压裂液进入流中。

微生物无处不在，因此污染是这类工作的潜在重大问题。初始样本转移步骤特别容易发生这种情况。如果对微生物生物降解或其他新陈代谢感兴趣，则 RNA 的猎枪测序可用于研究活性微生物基因表达。

该技术使研究原位细菌群落的分子技术标准化，以及细菌序列数据的生物信息学分析。