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माइक्रोबियल आणविक हस्ताक्षरों का उपयोग करके धाराओं पर हाइड्रोलिक फ्रैक्चरिंग के प्रभाव का मूल्यांकन करना

Published: April 4, 2021 doi: 10.3791/61904
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1, 3, 4,5, 1,2
1Department of Biology, Juniata College, 2Wright Labs, LLC, 3Department of Biological Sciences, Michigan Technological University, 4Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 5Department of Civil and Environmental Engineering, University of Tennessee

Summary

यहां, हम उनके पानी और तलछट माइक्रोबियल समुदायों का विश्लेषण करके आसपास की धाराओं पर हाइड्रोलिक फ्रैक्चरिंग के प्रभावों की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

हाइड्रोलिक फ्रैक्चरिंग (एचएफ), जिसे आमतौर पर "फ्रैकिंग" कहा जाता है, तेल और गैस को छोड़ने, चट्टानों को फ्रैक्चर करने के लिए उच्च दबाव वाले पानी, रेत और रसायनों के मिश्रण का उपयोग करता है। इस प्रक्रिया ने अमेरिकी ऊर्जा उद्योग में क्रांतिकारी बदलाव किया, क्योंकि यह उन संसाधनों तक पहुंच प्रदान करता है जो पहले अप्राप्य थे और अब संयुक्त राज्य अमेरिका में कुल प्राकृतिक गैस का दो तिहाई उत्पादन करते हैं। हालांकि fracking अमेरिकी अर्थव्यवस्था पर एक सकारात्मक प्रभाव पड़ा है, कई अध्ययनों से इसके हानिकारक पर्यावरणीय प्रभाव पर प्रकाश डाला है । विशेष चिंता का विषय हेडवॉटर धाराओं पर फ्रैकिंग का प्रभाव है, जो पूरे वाटरशेड के स्वास्थ्य पर उनके असंगत रूप से बड़े प्रभाव के कारण विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। उन धाराओं के भीतर बैक्टीरिया स्ट्रीम स्वास्थ्य के संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में मौजूद बैक्टीरिया और एक अशांत धारा में उनकी बहुतायत के लिए एक अंयथा तुलनीय लेकिन अशान्त धारा में उन लोगों से अलग होने की उंमीद होगी । इसलिए, इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बैक्टीरियल समुदाय का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए करना है कि क्या धाराओं को फ्रैकिंग से प्रभावित किया गया है। इस उद्देश्य के लिए, फ्रैकिंग (संभावित रूप से प्रभावित) और अपस्ट्रीम के पास धाराओं से तलछट, और पानी के नमूने एकत्र किए जाने चाहिए। उन नमूनों को तब न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, पुस्तकालय तैयारी और माइक्रोबियल समुदाय संरचना की जांच करने के लिए अनुक्रमण के अधीन किया जाता है। सहसंबंध विश्लेषण और मशीन लर्निंग मॉडल को बाद में यह पहचानने के लिए नियोजित किया जा सकता है कि समुदाय में भिन्नता की कौन सी विशेषताएं हैं, साथ ही फ्रैकिंग के प्रभाव के लिए भविष्य कहनेवाला बायोमार्कर की पहचान भी। ये तरीके हेडवॉटर धाराओं के बीच माइक्रोबियल समुदायों में विभिन्न प्रकार के मतभेदों को प्रकट कर सकते हैं, जो फ्रैकिंग की निकटता के आधार पर होते हैं, और फ्रैकिंग गतिविधियों के पर्यावरणीय प्रभाव पर भविष्य की जांच के लिए एक नींव के रूप में काम करते हैं।

Introduction

हाइड्रोलिक फ्रैक्चरिंग (एचएफ), या "फ्रैकिंग", प्राकृतिक गैस निष्कर्षण की एक विधि है, जो तेजी से प्रचलित हो गई है क्योंकि जीवाश्म ईंधन की मांग में वृद्धि जारी है। इस तकनीक में पानी, रेत और रसायनों के मिश्रण को मीथेन-समृद्ध शेल जमा में इंजेक्ट करने के लिए उच्च-संचालित ड्रिलिंग उपकरण का उपयोग करना होता है, आमतौर पर फंसी हुई गैसों को छोड़ने के लिए1।

क्योंकि ये अपरंपरागत कटाई तकनीकें अपेक्षाकृत नई हैं, इसलिए आसपास के जलमार्गों पर ऐसी प्रथाओं के प्रभावों की जांच करना महत्वपूर्ण है । फ्रैकिंग गतिविधियों में उपकरण परिवहन और अच्छी तरह से पैड निर्माण के लिए भूमि के बड़े swaths के समाशोधन को अधिदेशित किया गया है। प्रत्येक वेल पैड 2 के लिए लगभग 1.2-1.7 हेक्टेयर भूमि को मंजूरी दी जानी चाहिए , जो संभावित रूप से सिस्टम के अपवाह और पानी की गुणवत्ता को प्रभावित करता है3। फ्रैकिंग तरल पदार्थ की सटीक रासायनिक संरचना के आसपास पारदर्शिता की कमी है, जिसमें बायोसाइड्स का उपयोग किया जाता है। इसके अतिरिक्त, फ्रैकिंग अपशिष्ट जल अत्यधिक खारा 2 होजाताहै। इसके अलावा, अपशिष्ट जल में धातुएं हो सकती हैं और स्वाभाविक रूप से रेडियोधर्मी पदार्थ हो सकते हैं2। इसलिए, मानव त्रुटि या उपकरणों की खराबी के कारण फ्रैकिंग तरल पदार्थ के लीक और फैलने की संभावना से संबंधित है।

स्ट्रीम पारिस्थितिकी प्रणालियों को आसपास के परिदृश्य4 में परिवर्तन के प्रति बहुत संवेदनशील माना जाता है और पूरे वाटरशेड के भीतर जैव विविधता5 और उचित पोषक तत्व साइकिल चालन6 को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सूक्ष्म जल धाराओं में रोगाणु सबसे प्रचुर मात्रा में जीव हैं और इस प्रकार, पोषक तत्व साइकिलिंग, बायोडिग्रेडेशन और प्राथमिक उत्पादन के लिए आवश्यक हैं। माइक्रोबियल समुदाय संरचना और कार्य क्षोभ के प्रति उनकी संवेदनशीलता के कारण पारिस्थितिकी तंत्र के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए महान उपकरण के रूप में काम करते हैं, और हाल के शोध में फ्रैकिंग गतिविधि7,8के निकटता के आधार पर मनाया बैक्टीरियल असेंबल में अलग बदलाव दिखाया गया है। उदाहरण के लिए, बेइजेरिनकिया, बुर्कहोल्डरियाऔर मेथानोबैक्टीरियम को फ्रैकिंग के पास धाराओं में समृद्ध के रूप में पहचाना गया जबकि स्यूडोनोकार्डिया, नाइट्रोस्पिराऔर रोडोबैक्टर को फ्रैकिंग7के पास नहीं धाराओं में समृद्ध किया गया था।

16S रिबोसोमल आरएनए (आरआरएनए) जीन की अगली पीढ़ी अनुक्रमण बैक्टीरियल समुदाय संरचना का निर्धारण करने की एक सस्ती विधि है जो पूरे जीनोम अनुक्रमण दृष्टिकोण9की तुलना में तेज और सस्ता है। आणविक पारिस्थितिकी के क्षेत्र के भीतर एक आम अभ्यास अनुक्रमण संकल्प के लिए 16S rRNA जीन के अत्यधिक चर V4 क्षेत्र का उपयोग करना है, अक्सर पहचान9के व्यापक दायरे के साथ जीनस स्तर तक नीचे, क्योंकि यह अप्रत्याशित पर्यावरणीय नमूनों के लिए आदर्श है। इस तकनीक को प्रकाशित अध्ययनों में व्यापक रूप से लागू किया गया है और जलीय वातावरण पर फ्रैकिंग संचालन के प्रभाव की पहचान करने के लिए इसका सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है7,8. हालांकि, यह देखने लायक है कि बैक्टीरिया 16S rRNA जीन है, जो उनके पता चला बहुतायत10को प्रभावित करता है की कॉपी संख्या अलग है लायक है । इसके लिए कुछ उपकरण हैं, लेकिन उनकी प्रभावकारिता संदिग्ध10है। एक और अभ्यास है कि जल्दी से व्यापकता में बढ़ रहा है और इस कमजोरी का अभाव है metatranscriptomic अनुक्रमण, जिसमें सभी आरएनए अनुक्रम है, शोधकर्ताओं को दोनों सक्रिय बैक्टीरिया और उनके जीन अभिव्यक्ति की पहचान करने की अनुमति ।

इसलिए,पहले प्रकाशितअध्ययनों 7,8,11,12में तरीकों के विपरीत, इस प्रोटोकॉल में माइक्रोबियल सामुदायिक समारोह (मेटाट्रान स्क्रिप्टिक्स) की जांच के लिए नमूना संग्रह, संरक्षण, प्रसंस्करण और विश्लेषण भी शामिल है। यहां विस्तृत कदम शोधकर्ताओं को यह देखने की अनुमति देते हैं कि एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध जीन सहित उनकी धाराओं में रोगाणुओं द्वारा व्यक्त किए गए जीन और रास्तों पर क्या प्रभाव पड़ा है, यदि कोई हो, फ्रैकिंग का क्या प्रभाव पड़ा है । इसके अलावा, नमूना संग्रह के लिए प्रस्तुत विस्तार के स्तर में सुधार हुआ है। हालांकि कदम और नोटों के कई अनुभवी शोधकर्ताओं को स्पष्ट लग सकता है, वे सिर्फ अनुसंधान शुरू करने वालों के लिए अमूल्य हो सकता है ।

इसके साथ ही, हम अपनी प्रयोगशालाओं के कई वर्षों के अनुभव के आधार पर आस-पास की धाराओं पर फ्रैकिंग के प्रभाव की जांच करने के साधन के रूप में बैक्टीरियल जेनेटिक डेटा उत्पन्न करने के लिए नमूना संग्रह और प्रसंस्करण के तरीकों का वर्णन करते हैं। इन डेटा का उपयोग डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में फ्रैकिंग स्थिति के अनुरूप मतभेदों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।

Protocol

1. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए तलछट के नमूनों का संग्रह

  1. धारा पानी में एक बाँझ 50 एमएल शंकु नली जलमग्न। अवांछित मानव संदूषण शुरू करने से बचने के लिए नमूना संग्रह के दौरान दस्ताने पहनें। इस कदम को या तो किनारे से करें या पानी में यदि ऊपर की ओर सामना करना पड़ता है।
  2. जबकि शंकु नली जलमग्न है, टोपी को हटा दें, और इसका उपयोग शंकु नली में 1 से 3 सेमी की गहराई से तलछट के लगभग 3 एमएल स्कूप करने के लिए करें।
  3. पानी से शंकु नली निकालें और तलछट नमूने (लगभग 1 मिलील) को कवर करने वाली पतली परत को छोड़कर सभी पानी को डंप करें।
  4. 1000 माइक्रोट पिपेट और उपयुक्त पिपेट युक्तियों का उपयोग करके, एकत्र नमूने में डीएनए/आरएनए परिरक्षक (परिरक्षक विनिर्देशों के लिए सामग्री की तालिका देखें) के 3 एमएल जोड़ें। पिपेट टिप्स को बाँझ पिपेट टिप बॉक्स में रखें और उपयोग से तुरंत पहले उन्हें संलग्न करें और उपयोग के बाद छोड़ दिया जाए। परिरक्षक और नमूना अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए 10 बार छाया शंकु ट्यूब उलटा।
    नोट चरण 1.4 आवश्यक नहीं है, लेकिन यदि आरएनए को बाद में तलछट से निकाला जाना है तो इसकी दृढ़ता से सिफारिश की जाती है।
  5. नमूना संग्रह के बाकी के लिए बर्फ पर नमूने रखें। संग्रह से लौटने पर, -20 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजर में स्टोर करें यदि नमूनों का उपयोग 16S विश्लेषण (डीएनए), या -70 डिग्री सेल्सियस के लिए किया जाना है, यदि उनका उपयोग मेटाट्रानस्क्रिप्टिक्स विश्लेषण (आरएनए) के लिए किया जाना है।

2. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए फ़िल्टर संग्रह

  1. एक बाँझ 1 एल बोतल की टोपी निकालें। जबकि ऊपर या किनारे से सामना करना पड़ रहा है, ऊपर करने के लिए धारा पानी के साथ बोतल भरें और फिर इसे बाहर डंप । बोतल को कंडीशन करने के लिए इस प्रक्रिया को दो बार और दोहराएं। पूरी बोतल को चौथी बार भरें और इसे कैप करें।
    नोट: यदि 1 एल बोतल का पुन: उपयोग करते हैं, तो इसे 2 मिनट के लिए 10% ब्लीच के साथ रिनसिंग करके निष्फल किया जा सकता है, इसके बाद डियोनाइज्ड पानी के साथ तीन बार और फिर एक बार 70% इथेनॉल के साथ, और अंत में सेटिंग्स के साथ ऑटोक्लेविंग: 121.1 डिग्री सेल्सियस और 15 मिनट सुखाने का समय 30 मिनट का एक्सपोजर समय। ऑटोक्लेविंग के दौरान, बोतल पर टोपी बहुत ढीली होनी चाहिए ताकि बोतल को इस प्रक्रिया में संकुचित होने से बचा जा सके।
  2. एक बार एक स्थिर सतह पर, एक बाँझ Luer ताला सिरिंज का उपयोग करें और एक पूर्ण मात्रा आकर्षित । फिर सिरिंज को बाँझ और डीएनए/आरएनए-मुक्त १.७ सेमी व्यास पॉलीएथर्सल्फोन फिल्टर से ०.२२ माइक्रोन के पोर आकार के साथ कनेक्ट करें और सभी तरह से नीचे गिर दबाकर फिल्टर के माध्यम से पूरी मात्रा को धक्का दें । इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि बोतल (1 एल) में एकत्र की गई कुल मात्रा फिल्टर के माध्यम से धक्का न दे।
    नोट: सिरिंज की मात्रा चर हो सकती है, यदि, फिल्टर के माध्यम से धक्का दिया पानी की कुल राशि ट्रैक किया जाता है । हालांकि, आम तौर पर, 60 एमएल पसंद किया जाता है। जबकि 1 एल आदर्श है, उपाख्यानों, कम से कम 200 एमएल की मात्रा की संभावना अभी भी डीएनए और आरएनए के निष्कर्षण के लिए पर्याप्त बायोमास (प्रति एमएल ~ 20,000 कोशिकाओं को संभालने) एकत्र करेगी।
  3. सिरिंज में हवा के लगभग 20 मिलीएल मूल्य ड्राइंग और फिल्टर के माध्यम से धक्का द्वारा फिल्टर से अतिरिक्त पानी निकालें ।
    नोट: यदि चरण 2.4 किया जाता है तो यह परिरक्षक के नुकसान को रोकने में मदद करेगा।
  4. एक P1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करना, फिल्टर के बड़े उद्घाटन के माध्यम से निर्वहन करके एक डीएनए/आरएनए परिरक्षक के 2 मिलीएल जोड़ें (जहां यह सिरिंज से जुड़ा हुआ था) जबकि फिल्टर क्षैतिज पकड़े । पिपेट की नोक फिल्टर के बैरल के भीतर होनी चाहिए जब पिपेट यह सुनिश्चित करने के लिए उदास होता है कि परिरक्षक फिल्टर में प्रवेश करता है। प्रत्येक उपयोग के बाद टिप बदलें।
    नोट: तलछट संग्रह के साथ के रूप में, यह कदम आवश्यक नहीं है, लेकिन यह दृढ़ता से बाद में बढ़ी हुई न्यूक्लिक एसिड उपज के लिए सिफारिश की है, विशेष रूप से आरएनए के लिए ।
  5. पैराफिन फिल्म के एक वर्ग से छील और यह कसकर प्रत्येक खोलने के आसपास लपेटो/ पैराफिन फिल्म एक बाँझ नमूना बैग में फिल्टर लिपटे प्लेस और फिर संग्रह के दौरान बर्फ पर पूरे बैग जगह है।
    नोट: सुनिश्चित करें कि फ़िल्टर को लपेटने के लिए उपयोग किया जाने वाला पक्ष बाँझ है, यानी, पहले पर्यावरण के संपर्क में नहीं है।
  6. नमूना से लौटने पर, मेटा-ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के लिए 16S या -70 डिग्री सेल्सियस के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर स्टोर करें।

3. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और मात्राकरण

  1. नमूना हस्तांतरण शुरू करने से पहले 10% ब्लीच और 70% इथेनॉल के साथ कार्य क्षेत्र को साफ करें।
  2. तलछट (चरण 1.5 से) के लिए, आम तौर पर, ~ 0.25 ग्राम नमूने का उपयोग करें। ज्वाला 70% इथेनॉल की बीकर में डुबकी लगाकर और नमूनों के बीच इथेनॉल को जलाकर धातु उपकरण को बंद कर देती है।
  3. फिल्टर के लिए (चरण 2.6 से), निष्कर्षण के लिए फिल्टर पेपर को बाँझ ट्यूब में ले जाएं। ऐसा करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
    1. एल्यूमीनियम पन्नी तह द्वारा एक बाँझ, डीएनए और आरएनए मुक्त सतह बनाएं ताकि गुना के भीतरी हिस्से को बाहर के वातावरण के संपर्क में न रखा जा सके और सेटिंग्स के साथ मुड़ा हुआ टुकड़ा ऑटोक्लेविंग न किया जा सके: 121.1 डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट सुखाने का समय।
    2. 70% इथेनॉल और एक खुली लौ के साथ एक शिकंजा-पकड़ को स्टरलाइज करें। फिर बाँझ सतह पर फिल्टर आवरण खोलने को तोड़ने के लिए शिकंजा-ग्रिप का उपयोग करें और आवरण से कोर को हटा दें।
    3. ऊपर और नीचे और फिर सीवन के साथ टुकड़ा करने की क्रिया करके फिल्टर पेपर को कोर से दूर काटने के लिए एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करें। बाँझ चिमटी का उपयोग कर फिल्टर पेपर गुना और फिर स्केलपेल का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में फिल्टर काट।
    4. फिल्टर के टुकड़ों को निकालने के लिए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें। सुनिश्चित करें कि फिल्टर पेपर किसी भी सतह के संपर्क में नहीं आता है जो निष्फल नहीं हैं या जिसमें न्यूक्लिक एसिड मौजूद हो सकता है, क्योंकि इससे नमूने का अवांछित संदूषण हो जाएगा।
  4. डीएनए अलगाव के रूप में पहले13 वर्णित है या एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉलम आधारित किट का उपयोग करके प्रदर्शन (सामग्री की तालिकादेखें) । सूचीबद्ध वाणिज्यिक किट के लिए कदम संक्षेप में नीचे वर्णित हैं ।
    1. नमूने के भीतर कोशिकाओं को एक मनका ट्यूब में स्थानांतरित करके और कम से कम 5 मिनट के लिए उच्च गति पर सेल बाधित करने के लिए अधीन करके Lyse। सेंट्रलाइज और एक बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के लिए सुपरनेट्ट स्थानांतरित करें।
    2. सुपरनैंट (1:1 वॉल्यूम) में लाइसिस बफर जोड़ें और प्रदान किए गए फ़िल्टर (पीला) में स्थानांतरित करें। फिल्टर अपकेंद्रित्र।
    3. फिल्टर को एक नए बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। तैयारी बफर (400 माइक्रोन), अपकेंद्रित्र जोड़ें, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    4. वॉश बफर (700 माइक्रोन), अपकेंद्रित्र जोड़ें, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें। फिर वॉश बफर (400 माइक्रोन), अपकेंद्रित्र जोड़ें, और प्रवाह को फिर से त्यागें।
    5. फिल्टर को एक नए बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। DNase/RNase मुक्त पानी के ५० μL के साथ Elute और अपकेंद्रित्र से पहले कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए बैठते हैं ।
    6. उस दौरान क्यूबेशन अवधि में, इसे संग्रह ट्यूब में रखकर III-एचआरसी फ़िल्टर तैयार करें और एचआरसी प्रेप समाधान (600 माइक्रोल) को जोड़ते हुए, इसके बाद 8,000 x ग्रामपर 3 मिनट का अपकेंद्रित्र चरण।
    7. तैयार फिल्टर को बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पर ले जाएं। एलुयूटेड डीएनए को स्टेप 3.4.5 से इस फिल्टर में ट्रांसफर करें और 3 मिनट के लिए 16,000 एक्स ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। प्रवाह के माध्यम से निकाले गए डीएनए होते हैं।
  5. -20 डिग्री सेल्सियस पर तलछट और फिल्टर दोनों के लिए डीएनए अर्क स्टोर करें।
    नोट: डीएनए अर्क स्थिर तापमान, सीमित प्रकाश जोखिम, और कोई हानिकारक संदूषक14संभालने पर लगभग 8 साल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
  6. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आरएनए अलगाव करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए अर्क स्टोर करें।
    1. नमूने के भीतर कोशिकाओं को एक मनका ट्यूब में स्थानांतरित करके और इसे कम से कम पांच मिनट के लिए उच्च गति पर एक सेल बाधित करने के लिए अधीन करके Lyse करें। सेंट्रलाइज और एक बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के लिए सुपरनेट्ट स्थानांतरित करें।
    2. सुपरनैंट (1:1 वॉल्यूम) में लाइसिस बफर जोड़ें और प्रदान किए गए कॉलम (पीला) में स्थानांतरित करें। कॉलम को सेंट्रलाइज करें।
    3. प्रवाह के माध्यम से प्रवाह में 95-100% इथेनॉल की बराबर मात्रा जोड़ें और पांच बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।
    4. आईआईसीजी कॉलम (हरा) को बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पर रखें। कॉलम और सेंट्रलाइज में मिश्रित समाधान स्थानांतरित करें।
    5. वॉश बफर (400 माइक्रोन), अपकेंद्रित्र जोड़ें, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    6. कॉलम में डीएनए पाचन बफर के 5 माइक्रोन और डीएनए पाचन बफर के 75 माइक्रोन जोड़ें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    7. तैयारी बफर (400 माइक्रोन), अपकेंद्रित्र जोड़ें, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
    8. वॉश बफर (700 माइक्रोन), अपकेंद्रित्र जोड़ें, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें। फिर वॉश बफर (400 माइक्रोन), अपकेंद्रित्र जोड़ें, और प्रवाह को फिर से त्यागें।
    9. कॉलम को एक नए बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। DNase/RNase मुक्त पानी के ५० μL के साथ Elute और अपकेंद्रित्र से पहले 5 मिनट के लिए बैठते हैं ।
    10. उस इनक्यूबेशन अवधि के दौरान, इसे एक संग्रह ट्यूब में रखकर III-एचआरसी फ़िल्टर तैयार करें और एचआरसी प्रेप समाधान (600 माइक्रोन) को जोड़ते हुए, इसके बाद 8,000 x gपर 3 मिनट का अपकेंद्रित्र चरण।
    11. तैयार फिल्टर को बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पर ले जाएं। एलुयूट आरएनए को स्टेप 3.6.9 से इस फिल्टर में स्थानांतरित करें और 3 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। प्रवाह के माध्यम से निकाले गए आरएनए शामिल हैं।
      नोट: आरएनए अर्क केवल एक साल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है इससे पहले कि वे15नीचा शुरू करते हैं । डीएनए और आरएनए दोनों अर्क बार-बार फ्रीज-विगलन द्वारा अपमानित किए जाते हैं। कुछ प्रोटोकॉल डीएनए और आरएनए दोनों को एक ही नमूने16,17से निकालने की अनुमतिदेतेहैं ।
  7. फ्लोरोमीटर या स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निकाले गए डीएनए और आरएनए नमूनों की मात्रा निर्धारित करें। उदाहरण के लिए टेबल 1 देखें फ्लोरोमीटर डीएनए एकाग्रता मूल्य। उदाहरण के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर क्वांटिफिकेशन प्रोटोकॉल, संदर्भ18देखें। सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किट के साथ तलछट डीएनए एकाग्रता मूल्यों आम तौर पर 1 से 40 एनजी/μL के लिए सीमा है, जबकि फिल्टर डीएनए एकाग्रता मूल्यों के लिए ०.५ से 10 एनजी/μL से लेकर करते हैं । तलछट आरएनए एकाग्रता मूल्यों सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किट के साथ आम तौर पर लगभग 1 से 20 एनजी/L से लेकर, जबकि फिल्टर एकाग्रता मूल्यों को कम हो जाते हैं, आम तौर पर 0.5 से 5 एनजी/

4. 16S rRNA पुस्तकालय निर्माण

  1. 10% ब्लीच और 70% इथेनॉल के साथ कार्य क्षेत्र को साफ करें। कार्य क्षेत्र एक संलग्न स्थान होना चाहिए जो लैमिनार प्रवाह की स्थिति (लैमिनार प्रवाह हुड) का उत्पादन करने में सक्षम हो।
  2. डीएनए अर्क (चरण 3.5 से) का उपयोग करें और एक मानक पीसीआर प्रोटोकॉल के साथ 16S आरएनए एम्प्लीकॉन अनुक्रमण के लिए नमूने तैयार करें, जैसे कि पृथ्वी माइक्रोबायोम की वेबसाइट पर वर्णित एक जो लैमिनार प्रवाह स्थितियों के तहत 16S rRNA19 के V4 अतिवर्णीय क्षेत्र को बढ़ाता है।
  3. पहले वर्णित 2% एगरेग्लेड जेल तैयार करें और इसे17को जमना दें। पीसीआर उत्पाद के 7 माइक्रोन और DNase मुक्त पानी के 13 माइक्रोन मिलाएं। 1x की अंतिम एकाग्रता में एक जेल लोडिंग डाई जोड़ें। एक बार एगर उठे हुए जम जाने के बाद, इस पीसीआर उत्पादों को 2% एगर उठे हुए जेल पर मिश्रण करें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, इसके बजाय एक प्री-कास्ट जेल का उपयोग किया जा सकता है, क्योंकि ये जैल तेजी से चलते हैं और पूर्व-निर्मित आते हैं।
  4. पृथ्वी माइक्रोबायोम के प्रोटोकॉल का उपयोग करके, 16S rRNA V4 एम्प्लिकॉन के लिए सफल प्रवर्धन के रूप में 386 के बैंड आकार की जांच करने के लिए 60-90 मिनट के लिए 90 वी पर जेल चलाएं।

5. डीएनए 16S rRNA पुस्तकालय शुद्धि

  1. नमूनों के लिए पीसीआर उत्पादों के पूल 10 माइक्रोल जो उज्ज्वल बैंड और नमूनों के लिए 13 माइक्रोल मिले जो उचित आकार के बाँझ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में बेहोश बैंड मिले।
  2. फ्लोरोमीटर या स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके परिणामी पूल की एकाग्रता की जांच करें और पहले की तरह 2% एग्राजॉइर्ड जेल तैयार करें। आदर्श रूप में, पूल में कम से कम 10 एनजी/μL की एकाग्रता होनी चाहिए, और अधिकांश नमूनों में लगभग 25 एनजी/μL की एकाग्रता होनी चाहिए थी ।
  3. एकाग्रता और मात्रा की अनुमति, 2% एगर उठे जेल के एक कुएं में 150-200 एनजी के आसपास लोड करें।
  4. 90 वोल्ट पर 60-90 मिनट के लिए जेल चलाएं।
  5. 2% एगर उठे जेल चलाकर पूल्ड लाइब्रेरी को शुद्ध करें।
    1. जेल से 386 बीपी डीएनए बैंड को उत्पादित करें और पहले20वर्णित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके पूल्ड लाइब्रेरी को शुद्ध करें। 10 एमएम ट्रिस-सीएल (पीएच 8.5) के 30 माइक्रोन के साथ शुद्ध डीएनए को एल्यूट करें। भविष्य के प्रदूषण को रोकने के लिए डीएनए या आरएनए निष्कर्षण की तुलना में एक अलग क्षेत्र में इस कदम को करें, क्योंकि जेल काटने से प्रयोगकर्ता और आसपास के क्षेत्र दोनों पर पीसीआर एम्प्लिकोन फैल जाएगा।
  6. फ्लोरोमीटर या स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके शुद्ध पूल की एकाग्रता की जांच करें। यदि शुद्धि अच्छी तरह से चला गया, इसकी एकाग्रता अखरूद पूल के कम से कम आधे होना चाहिए। आम तौर पर, अंतिम एकाग्रता 5 से 20 एनजी/μL तक होनी चाहिए ।
  7. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए शुद्ध पुस्तकालयों भेजें। सुनिश्चित करें कि शिपिंग कंटेनर में सूखी बर्फ को शामिल करके परिवहन के दौरान उन्हें ठंडा रखा जाए।

6. आरएनए पुस्तकालय निर्माण और शुद्धिकरण

  1. आरएनए पुस्तकालयों को बनाने के लिए कई वाणिज्यिक किट का उपयोग किया जा सकता है। जो भी उपयोग किया जाता है, वह बाँझ लैमिनार प्रवाह वातावरण में काम करते समय निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें। सामग्री की तालिका में किट के लिए प्रोटोकॉल का एक बहुत ही सारांशित संस्करण21से नीचे प्रस्तुत किया गया है।
    1. पहला स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण मास्टर मिक्स (न्यूक्लियेज-फ्री वॉटर का 8 माइक्रोन और फर्स्ट स्ट्रैंड सिंथेसिस एनिज़्मे मिक्स का 2 माइक्रोन) बनाएं और इसे सैंपल में जोड़ें । प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट शर्तों के साथ थर्मोसाइकिलर में नमूना रखें।
    2. बर्फ पर दूसरा स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण मास्टर मिक्स (सेकंड स्ट्रैंड सिंथेसिस रिएक्शन बफर का 8 माइक्रोन, 4 माइक्रोन सेकंड स्ट्रैंड सिंथेसिस एंजाइम मिक्स, और नाभिक मुक्त पानी का 48 माइक्रोन) बनाएं और इसे नमूने में जोड़ें। एक घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस करने के लिए सेट एक थर्मोसाइकिलर में रखें।
    3. प्रदान किए गए मोतियों (144 माइक्रोन) को जोड़कर प्रतिक्रिया को शुद्ध करें और दो 80% इथेनॉल वॉश (200 माइक्रोन) का प्रदर्शन करें।
    4. प्रदान की गई टीई बफर (53 माइक्रोल) के साथ एल्यूट और सुपरनैंट के 50 माइक्रोन को एक साफ पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें। पीसीआर ट्यूब को बर्फ पर रखें।
    5. बर्फ पर एंड प्रेप मास्टर मिक्स (7 माइक्रोन ऑफ एंड प्रेप रिएक्शन बफर और 3 माइक्रोन ऑफ एंड प्रेप एंजाइम मिक्स) बनाएं और इसे पीसीआर ट्यूब में जोड़ें। प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट शर्तों के साथ पीसीआर ट्यूब को थर्मोसाइकिलर में रखें।
    6. बर्फ पर पतला एडाप्टर (2.5 माइक्रोन), लिगेशन मास्टर मिक्स (30 माइक्रोन) और लिगेशन एन्हांसर (1 माइक्रोल) समाधान मिलाएं। नमूने में मिश्रित समाधान जोड़ें और 20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए थर्मोसाइकिलर में रखें।
    7. प्रदान किए गए मोतियों (87 माइक्रोन) और प्रदर्शन इथेनॉल वॉश (200 माइक्रोन) और पहले की तरह एल्यूशन जोड़कर प्रतिक्रिया को शुद्ध करें, सिवाय केवल 17 माइक्रोन को ते जोड़ें।
    8. सूचकांक (10 माइक्रोन) और क्यू 5 मास्टर मिक्स (25 माइक्रोन) समाधान जोड़ें और प्रोटोकॉल में वर्णित शर्तों के साथ थर्मोसाइकिलर में रखें।
    9. प्रदान किए गए मोतियों (45 माइक्रोन) को जोड़कर प्रतिक्रिया को शुद्ध करें और 23 माइक्रोन के साथ दो इथेनॉल वॉश (200 माइक्रोल) और एल्यूट का प्रदर्शन करें। एक साफ पीसीआर ट्यूब के लिए 20 μL स्थानांतरित करें।
  2. बायोएनालाइजर, फ्लोरोमीटर या स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए की पता लगाने योग्य सांद्रता के लिए पुस्तकालयों की जांच करें।
  3. मोटे तौर पर सममोलीय अनुपात में मेटाट्रानस्क्रिप्टोमिक पुस्तकालयों को पूल करें।
  4. 250 और 400 बीपी के बीच उत्पाद शुल्क के टुकड़ों को छोड़कर, 16S पुस्तकालय शुद्धिकरण के लिए एक ही प्रोटोकॉल के बाद पुस्तकालय को शुद्ध करें। जबकि 16S पुस्तकालय में प्रवर्धित क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करने वाला एक अलग बैंड था, यहां परिणाम एक धब्बा है।
  5. शुद्ध पुस्तकालय की एकाग्रता की जांच पहले की तरह।
  6. एक अनुक्रमण सुविधा के लिए सूखी बर्फ के साथ शुद्ध पुस्तकालय जहाज।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, आरएनए अर्क पुस्तकालय तैयार करने और अनुक्रमण के लिए एक विश्वविद्यालय या निजी कंपनी को भेजा जा सकता है।

7. माइक्रोबियल समुदाय विश्लेषण

  1. एक बार अनुक्रमण पूरा हो जाने के बाद, नमूना डेटा तक पहुंचें। इसे एक इस्सेक कंप्यूटर पर डाउनलोड करें।
    नोट: आदर्श रूप में, डिवाइस में कम से कम 16 गीगाबाइट रैम होनी चाहिए। कंप्यूटिंग आवश्यकताओं की चर्चा के लिए (Qiime2 के लिए), https://forum.qiime2.org/t/recommended-specifications-to-run-qiime2/9808 देखें।
  2. 16S rRNA डेटा का विश्लेषण करने के लिए, मोथुर, QIIME2 और R जैसे सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। उदाहरण के लिए https://docs.qiime2.org/2020.11/tutorials/moving-pictures/ यहां देखें QIIME2 16S विश्लेषण ट्यूटोरियल।
  3. मेटाट्रानस्क्रिप्टोमिक्स (आरएनए) डेटा के लिए, नमूनों में कौन से जीन और रास्ते मौजूद हैं, यह निर्धारित करने के लिए HUMAnN2 और एटलस का उपयोग करें।
    नोट: विविधता और यादृच्छिक वन विश्लेषण में समापन एक उदाहरण मेटाट्रानस्क्रिप्टोमिक्स पाइपलाइन पूरक सूचना फ़ाइलमें प्रस्तुत किया गया है । सभी कमांड्स को कमांड लाइन के माध्यम से चलाया जाता है, उदाहरण के लिए, मैक उपयोगकर्ताओं के लिए टर्मिनल।

Representative Results

डीएनए और आरएनए निष्कर्षण की सफलता के उपकरणों और प्रोटोकॉल की एक किस्म का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । आम तौर पर, या तो किसी भी पता लगाने योग्य एकाग्रता को यह निष्कर्ष निकालने के लिए पर्याप्त माना जाता है कि निष्कर्षण सफल रहा था। तालिका 1 की जांच करना, फिर, एक को छोड़कर सभी निष्कर्षों को सफल करार दिया जाएगा। इस चरण में विफलता अक्सर कम प्रारंभिक बायोमास, खराब नमूना संरक्षण, या निष्कर्षण के दौरान मानव त्रुटि के कारण होती है। फिल्टर के मामले में, एकाग्रता का पता लगाने से नीचे होने पर भी निष्कर्षण सफल हो सकता है। यदि वे अर्क पीसीआर (यदि 16S कर रहे हैं) या पुस्तकालय की तैयारी (metatranscriptomics) के बाद एक पता लगाने योग्य एकाग्रता के लिए बैंड उपज नहीं है, तो वे वास्तव में विफल रहा था ।

यदि 16S प्रोटोकॉल का पालन किया जाता है, तो पीसीआर प्रवर्धन के बाद उज्ज्वल बैंड, जैसा कि चित्र 1में कुओं 4 और 6 में देखा गया है, सफलता का संकेत देता है, जबकि बैंड की कमी, जैसा कि शीर्ष पंक्ति में अन्य कुओं में देखा गया है, विफलता को इंगित करता है। इसके अलावा, जेल लेन में एक उज्ज्वल बैंड जिसमें नकारात्मक पीसीआर नियंत्रण होता है, वह भी विफलता का संकेत देगा क्योंकि यह मानना जोखिम भरा होगा कि नकारात्मक नियंत्रण (ओं) को प्रभावित करने वाले संदूषण ने नमूनों को प्रभावित नहीं किया।

16S और मेटाट्रानस्क्रिप्टोमिक्स दोनों के लिए, अनुक्रमण की सफलता का मूल्यांकन प्राप्त दृश्यों की संख्या(चित्र 2)को देखकर किया जा सकता है। 16S नमूनों में न्यूनतम 1,000 दृश्य होने चाहिए, जिसमें कम से कम 5,000 आदर्श(चित्रा 2 ए)होना चाहिए। इसी तरह, मेटाट्रानस्क्रिप्टोमिक्स नमूनों में न्यूनतम 500,000 दृश्य होने चाहिए, जिसमें कम से कम 2,000,000 आदर्श(चित्रा 2 बी)होना चाहिए। उन न्यूनतम की तुलना में कम दृश्यों वाले नमूनों का विश्लेषण के लिए उपयोग नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि वे अपने जीवाणु समुदाय का सही प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं। हालांकि, नमूने कि ंयूनतम और आदर्श के बीच गिर अभी भी इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि परिणाम और अधिक सावधानी से व्याख्या की जानी चाहिए अगर कई नमूने उस सीमा में गिर जाते हैं ।

बाद के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की सफलता केवल इस आधार पर निर्धारित की जा सकती है कि अपेक्षित आउटपुट फाइलें प्राप्त की गई थीं या नहीं। किसी भी दर पर, QIIME2 और R(चित्रा 3)जैसे कार्यक्रमों को फ्रैकिंग के आधार पर बैक्टीरियल समुदायों के बीच संभावित महत्वपूर्ण मतभेदों के मूल्यांकन के लिए अनुमति देना चाहिए। चित्रा 3 के लिए डेटा 16S और मेटाट्रांस्क्रिप्टिक्स विश्लेषण के लिए तेरह विभिन्न धाराओं में इक्कीस विभिन्न साइटों से तलछट नमूने एकत्र करके प्राप्त किया गया था । उन इक्कीस साइटों में से, उनमें से बारह फ्रैकिंग गतिविधि के डाउनस्ट्रीम थे और एचएफ + के रूप में वर्गीकृत थे, और उनमें से नौ या तो फ्रैकिंग गतिविधि के ऊपर थे या एक वाटरशेड में थे जहां फ्रैकिंग नहीं हो रही थी; इन धाराओं को एचएफ-के रूप में वर्गीकृत किया गया था। फ्रैकिंग गतिविधि की उपस्थिति के अलावा, धाराएं अन्यथा तुलनीय थीं।

वे मतभेद फ्रैकिंग स्थिति के आधार पर लगातार रचनात्मक बदलावों का रूप ले सकते हैं। यदि ऐसा होता, तो एचएफ + और एचएफ-नमूनों को पीसीओए भूखंड में एक दूसरे से अलग क्लस्टर करने की उम्मीद होगी, जैसा कि चित्रा 3A और चित्रा 3 बी में मामला है । इस बात की पुष्टि करने के लिए कि वे स्पष्ट बदलाव केवल समन्वय विधि का विरूपण साक्ष्य नहीं हैं, आगे सांख्यिकीय विश्लेषण की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, दूरी मैट्रिक्स पर एक PERMANOVA22 परीक्षण है कि चित्रा 3A और चित्रा 3B फ्रैकिंग स्थिति के आधार पर महत्वपूर्ण क्लस्टरिंग से पता चला पर आधारित हैं, जिसका अर्थ है कि साजिश में मनाया जुदाई नमूनों के जीवाणु समुदायों के बीच मतभेदों के अनुरूप है, बजाय समन्वय के एक विरूपण । एक महत्वपूर्ण PERMANOVA या ANOSIM परिणाम एचएफ + और एचएफ-नमूनों के बीच लगातार मतभेदों का एक मजबूत संकेत है, जो इंगित करेगा कि एचएफ + नमूनों फ्रैकिंग से प्रभावित थे, जबकि एक उच्च पी-वैल्यू से संकेत मिलता है कि नमूनों को प्रभावित नहीं किया गया था। मेटाट्रानस्क्रिप्टोमिक डेटा को इसी तरह एक ही तरीकों का उपयोग करके कल्पना और मूल्यांकन किया जा सकता है।

अंतर सुविधाओं (रोगाणुओं या कार्यों) की जांच से सबूत पता चल सकता है कि नमूनों को भी प्रभावित किया गया है। अंतर सुविधाओं का निर्धारण करने का एक तरीका एक यादृच्छिक वन मॉडल बनाना है। यादृच्छिक वन मॉडल का उपयोग यह देखने के लिए किया जा सकता है कि नमूनों की फ्रैकिंग स्थिति को कितनी अच्छी तरह वर्गीकृत किया जा सकता है। यदि मॉडल संयोग से उम्मीद से बेहतर प्रदर्शन करता है, तो यह फ्रैकिंग स्थिति पर निर्भर मतभेदों का अतिरिक्त सबूत होगा। इसके अलावा, सबसे महत्वपूर्ण भविष्यवक्ताओं से पता चलता है कि नमूनों(चित्रा 3 सी)को सही ढंग से अलग करने के लिए कौन सी विशेषताएं सबसे महत्वपूर्ण थीं। उन सुविधाओं को भी तो लगातार अलग मूल्यों fracking स्थिति के आधार पर होता है । एक बार जब उन अंतर सुविधाओं का निर्धारण किया जाता है, तो साहित्य की समीक्षा की जा सकती है ताकि यह देखा जा सके कि क्या वे पहले फ्रैकिंग से जुड़े हुए हैं। हालांकि, यह अध्ययन है कि निर्धारित अंतर कार्यों को खोजने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, के रूप में सबसे केवल 16S rRNA रचनात्मक डेटा का इस्तेमाल किया है । इसलिए, अंतर कार्यों के निहितार्थों का मूल्यांकन करने के लिए, एक संभावित विधि यह देखना होगा कि क्या वे पहले से ही फ्रैकिंग तरल पदार्थ में उपयोग किए जाने वाले बायोसाइड्स के संभावित प्रतिरोध से जुड़े हुए हैं या यदि वे अत्यधिक खारी स्थितियों को सहन करने में सहायता कर सकते हैं। इसके अलावा, ब्याज के एक वर्गीकरण के कार्यात्मक प्रोफ़ाइल की जांच फ्रैकिंग के प्रभाव(चित्रा 3 डी)के सबूत प्रकट कर सकता है । उदाहरण के लिए, यदि यादृच्छिक वन मॉडल द्वारा एक टैक्सन को अंतर के रूप में पहचाना जाता है, तो एचएफ + नमूनों में इसकी रोगाणुरोधी प्रतिरोध प्रोफ़ाइल की तुलना एचएफ-नमूनों में इसके प्रोफ़ाइल से की जा सकती है और यदि वे बहुत भिन्न होते हैं, तो यह सुझाव दे सकता है कि बायोसाइड्स युक्त फ्रैकिंग तरल पदार्थ धारा में प्रवेश कर गया।

नमूनाआईडी एकाग्रता (एनजी/μL)
1 1.5
2 1.55
3 0.745
4 0.805
5 7.82
6 0.053
7 0.248
8 0.945
9 1.82
10 0.804
11 0.551
12 1.69
13 4.08
14 Below_Detection
15 7.87
16 0.346
17 2.64
18 1.15
19 0.951

तालिका 1: उदाहरण डीएनए सांद्रता फ्लोरोमीटर 1x डीएस डीएनए उच्च संवेदनशीलता परख के आधार पर। इन सभी नमूनों के लिए निष्कर्षण, 14 को छोड़कर, डीएनए की पता लगाने योग्य मात्रा होने के कारण सफल माना जाएगा ।

Figure 1
चित्रा 1:पीसीआर उत्पादों के साथ उदाहरण ई-जेल। जेल पूर्व दाग और एक यूवी प्रकाश के तहत कल्पना की थी, उस पर मौजूद किसी भी डीएनए चमक के कारण । पीसीआर पहली पंक्ति में कुओं 4 और 6 में नमूनों के लिए काम किया, क्योंकि वे दोनों की उंमीद आकार के एक एकल उज्ज्वल बैंड था (सीढ़ी के आधार पर) । अन्य छह कुओं में नमूनों के लिए पीसीआर विफल रही, क्योंकि उन्होंने कोई बैंड नहीं दिया । सकारात्मक नियंत्रण (पहली अच्छी तरह से, दूसरी पंक्ति) एक उज्ज्वल बैंड था, यह दर्शाता है कि पीसीआर ठीक से प्रदर्शन किया गया था, और नकारात्मक नियंत्रण (कुओं 6 और 7, दूसरी पंक्ति) किसी भी बैंड नहीं था, यह दर्शाता है कि नमूने दूषित नहीं थे । यदि एक नकारात्मक नमूनों के रूप में उज्ज्वल के रूप में एक बैंड था, पीसीआर एक विफलता माना जाता है क्योंकि यह मानना है कि नमूनों amplicons है कि सिर्फ संदूषण का परिणाम नहीं थे जोखिम भरा होगा । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:उदाहरण अनुक्रम मायने रखता है। (A)16S उदाहरण अनुक्रम मायने रखता है । लगभग इन सभी 16S नमूनों में 1,000 से अधिक दृश्य थे। बहुत कुछ है कि कम से १,००० दृश्यों था डाउनस्ट्रीम विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए, क्योंकि वे अपर्याप्त दृश्यों को सही अपने जीवाणु समुदायों का प्रतिनिधित्व किया था । कई दृश्यों में 1,000 और 5,000 दृश्यों के बीच था; आदर्श नहीं होने के दौरान, वे अभी भी इसलिए भी इसलिए होंगे क्योंकि वे नंगे न्यूनतम से अधिक हैं, और अधिकांश नमूने 5,000 के आदर्श न्यूनतम से भी अधिक हैं। (ख)मेटाट्रानस्क्रिप्टोमिक्स उदाहरण मायने रखता है । सभी नमूनों दोनों न्यूनतम (500,000) और आदर्श न्यूनतम (2,000,000) दृश्यों की संख्या से अधिक है। इसलिए, अनुक्रमण उन सभी के लिए सफल रहा था, और वे सभी डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:उदाहरण विश्लेषण। (A)QIIME2 के माध्यम से बनाए गए और कल्पना किए गए भारित यूनिफ्रैक डिस्टेंस मैट्रिक्स के साथ गणना किए गए निर्देशांक के आधार पर पीसीओए प्लॉट। (ख)QIIME2 से निर्यात भारित यूनिफ्रैक दूरी मैट्रिक्स के साथ गणना निर्देशांक के आधार पर पीसीओए प्लॉट। आर मेटाडेटा वैक्टर में फिलोसेक और ggplot2 पैकेजों का उपयोग करके निर्देशांकों की कल्पना की गई थी जो शाकाहारी पैकेज का उपयोग करके साजिश में फिट किए गए थे। प्रत्येक बिंदु एक नमूना के जीवाणु समुदाय का प्रतिनिधित्व करता है, करीब अंक अधिक समान समुदाय रचनाओं का संकेत के साथ । इन 16S तलछट नमूनों के लिए फ्रैकिंग स्थिति के आधार पर क्लस्टरिंग (PERMANOVA, p= 0.001) मनाया गया था। इसके अलावा, वैक्टर से पता चलता है कि एचएफ + नमूनों में बेरियम, ब्रोमाइड, निकल और जिंक का उच्च स्तर होता है, जो एचएफ-नमूनों की तुलना में विभिन्न जीवाणु समुदाय संरचना से मेल खाता था। (ग)एक यादृच्छिक वन मॉडल के लिए सर्वश्रेष्ठ भविष्यवक्ताओं की साजिश है कि परीक्षण जहां जीवाणु बहुतायत नमूनों के बीच fracking स्थिति की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । रैंडम फॉरेस्ट पैकेज का उपयोग करके आर के माध्यम से यादृच्छिक वन मॉडल बनाया गया था। शीर्ष 20 भविष्यवक्ताओं को दिखाया जाता है और साथ ही परिणामस्वरूप अशुद्धता में कमी आती है (एचएफ + और एचएफ-नमूनों की संख्या का माप एक साथ समूहित) गिनी इंडेक्स में मीन कमी के रूप में जब उनका उपयोग नमूनों को अलग करने के लिए किया जाता है। (घ)पाई चार्ट मेटाट्रानस्क्रिप्ट्रोमिक डेटा के आधार पर बर्कहोल्डरियाल्स प्रोफाइल के एंटीमाइक्रोबियल रेजिस्टेंस प्रोफाइल को दिखाता है । दृश्यों को पहले Kraken2 के साथ एनोटेट किया गया था ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि वे किस टैक्सा से संबंधित थे। ब्लास्ट तो उन एनोटेटेड दृश्यों और मेगारेस 2.0 डेटाबेस के साथ इस्तेमाल किया गया था निर्धारित करने के लिए जो रोगाणुरोधी प्रतिरोध जीन ("MEG_ ##" के रूप में) सक्रिय रूप से व्यक्त किया जा रहा था। बर्कहोल्डरियाल के सदस्यों द्वारा व्यक्त किए गए रोगाणुरोधी प्रतिरोध जीन को तब यह देखने के लिए निकाला गया था कि उस टैक्सा के बीच कौन से प्रचलित थे। जबकि अधिक महंगा और समय लेने वाला, मेटाट्रानस्क्रिप्टोमिक्स कार्यात्मक विश्लेषणों के लिए अनुमति देता है, जैसे कि यह 16S डेटा के साथ नहीं किया जा सकता है। विशेष रूप से, Kraken2 का उपयोग इस उदाहरण विश्लेषण के लिए किया गया था, बजाय HUMAnN2। Kraken2 HUMAnN2 की तुलना में तेज है; हालांकि, यह केवल रचना, योगदान, और कार्यों (जीन) और HUMAnN2 जैसे रास्तों के बजाय रचनात्मक जानकारी को आउटपुट करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फाइल: एक उदाहरण मेटाट्रानस्क्रिप्टोमिक्स पाइपलाइन। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें। 

Discussion

इस पत्र में वर्णित तरीकों को २०१४ और २०१८7,8,10 के बीच हमारे समूह द्वारा प्रकाशित कई अध्ययनों के दौरान विकसित और परिष्कृत किया गया है और तीन साल की परियोजना में जलीय समुदायों पर फ्रैकिंग के प्रभावों की जांच करने के लिए एक सहयोगी परियोजना में सफलतापूर्वकनियोजित किया गया है जो जल्द ही प्रकाशन के लिए एक पत्र प्रस्तुत करेगा । इन तरीकों का उपयोग परियोजना के शेष के दौरान किया जाता रहेगा । इसके अतिरिक्त, धाराओं और पारिस्थितिकी प्रणालियों पर फ्रैकिंग के प्रभाव की जांच करने वाले अन्य वर्तमान साहित्य नमूना संग्रह,प्रसंस्करण और विश्लेषण7, 8,10, 11के लिए समान तरीकों का वर्णनकरतेहैं। हालांकि, उन कागजों में से कोई भी मेटाट्रानस्क्रिप्ट्रोमिक विश्लेषण का उपयोग नहीं करता है, इस कागज को पहले यह वर्णन करने के लिए बनाता है कि उन विश्लेषणों का उपयोग आस-पास की धाराओं पर फ्रैकिंग के प्रभाव को स्पष्ट करने के लिए कैसे किया जा सकता है। इसके अलावा, नमूना संग्रह के लिए यहां प्रस्तुत तरीकों और अधिक विस्तृत हैं, के रूप में संदूषण से बचने के लिए उठाए गए कदम हैं ।

हमारे प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक प्रारंभिक नमूना संग्रह और संरक्षण है। क्षेत्र नमूना और संग्रह कुछ चुनौतियों के साथ आता है, के रूप में संग्रह के दौरान एक aseptic या बाँझ वातावरण को बनाए रखने मुश्किल हो सकता है । इस चरण के दौरान, नमूनों को दूषित करने से बचने के लिए यह महत्वपूर्ण है। ऐसा करने के लिए, दस्ताने पहने जाने चाहिए, और केवल बाँझ कंटेनरों और उपकरणों को नमूनों के संपर्क में आने की अनुमति दी जानी चाहिए। न्यूक्लिक एसिड क्षरण को कम करने के लिए संग्रह के बाद नमूनों को तुरंत बर्फ पर रखा जाना चाहिए। संग्रह पर एक वाणिज्यिक न्यूक्लिक एसिड परिरक्षक जोड़ने से न्यूक्लिक एसिड उपज भी बढ़ सकती है और नमूनों को संग्रह के बाद लंबे समय तक संग्रहीत करने की अनुमति मिल सकती है। जब भी न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण किया जाता है, तो उचित मात्रा में नमूने का उपयोग करना महत्वपूर्ण होता है, बहुत अधिक निष्कर्षण के लिए उपयोग किए जाने वाले स्पिन फिल्टर को रोक सकते हैं (उन प्रोटोकॉल के लिए जो उनका उपयोग करते हैं) लेकिन बहुत कम पैदावार हो सकती है। जो भी किट का उपयोग किया जाता है उसके लिए निर्देशों का पालन करना सुनिश्चित करें।

क्षेत्र संग्रह के समान, नाभिक एसिड निष्कर्षण और नमूना तैयारी के दौरान प्रदूषण से बचना या कम करना भी महत्वपूर्ण है, खासकर जब कम न्यूक्लिक एसिड उपज नमूनों के साथ काम करना, जैसे कि सबऑप्टिमल तलछट नमूने (बड़ी मात्रा में बजरी या चट्टानों वाले नमूने) या पानी के नमूने। इसलिए, नमूना संग्रह के साथ के रूप में, दस्ताने संदूषण को कम करने के लिए इन सभी चरणों के दौरान पहना जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के दौरान उपयोग की जाने वाली सभी कार्य सतहों को 10% ब्लीच समाधान के साथ पोंछते हुए पहले से निष्फल किया जाना चाहिए, इसके बाद 70% इथेनॉल समाधान होता है। पाइपिंग चरणों (3-6) के लिए, पिपेट के कारण प्रदूषण से बचने के लिए फ़िल्टर युक्तियों का उपयोग किया जाना चाहिए, हर बार जब वे एक गैर-बाँझ सतह को छूते हैं तो युक्तियों को बदला जा सकता है। पाइपेट सहित प्रयोगशाला कार्य के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों को ब्लीच और इथेनॉल समाधानों से पहले और बाद में मिटा दिया जाना चाहिए। संदूषण का मूल्यांकन करने के लिए, न्यूक्लिक एसिड एक्सट्रैक्टिंग और पीसीआर प्रतिक्रियाओं के हर सेट के दौरान निष्कर्षण रिक्त स्थान और नकारात्मक (बाँझ तरल) को शामिल किया जाना चाहिए। यदि निष्कर्षण के बाद मात्राकरण नकारात्मक में डीएनए/आरएनए की एक पता लगाने योग्य राशि का पता चलता है, निष्कर्षण दोहराया जा सकता है अगर वहां पर्याप्त नमूना छोड़ दिया है । यदि पीसीआर के लिए नकारात्मक नमूने प्रवर्धन दिखाते हैं, तो स्रोत निर्धारित करने के लिए समस्या निवारण किया जाना चाहिए और फिर नमूनों को फिर से चलाना चाहिए। संदूषण के निम्न स्तर के लिए खाते में, यह सिफारिश की जाती है कि निष्कर्षण रिक्त स्थान और पीसीआर नकारात्मक अनुक्रमित किया जाए ताकि कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के दौरान यदि आवश्यक हो तो संदूषकों की पहचान की जा सके और उन्हें हटाया जा सके । इसके विपरीत, पीसीआर प्रवर्धन भी विभिन्न कारणों के कारण विफल हो सकता है। पर्यावरण के नमूनों के लिए, पीसीआर प्रतिक्रिया का अवरोध अक्सर अपराधी होता है, जो ताक पॉलीमरेज23के साथ हस्तक्षेप करने वाले विभिन्न पदार्थों के कारण हो सकता है। यदि अवरोध संदिग्ध है, तो पीसीआर ग्रेड पानी (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग डीएनए अर्क को पतला करने के लिए किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में कुछ उल्लेखनीय सीमाएं और संभावित कठिनाइयां हैं। नमूना संग्रह पानी और तलछट दोनों नमूनों के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। पर्याप्त बायोमास प्राप्त करने के लिए, आदर्श रूप से 1 एल स्ट्रीम पानी को फिल्टर के माध्यम से धकेलने की आवश्यकता होती है। फिल्टर के छिद्रों को रोगाणुओं पर कब्जा करने के लिए छोटे होने की आवश्यकता होती है लेकिन तलछट को भी फंसा सकते हैं। यदि तलछट का एक बहुत हाल ही में वर्षा के कारण पानी में है, फिल्टर यह मुश्किल फिल्टर के माध्यम से पूरी मात्रा धक्का करने के लिए रोकना कर सकते हैं । तलछट संग्रह के लिए, संग्रह के दौरान तलछट की गहराई का अनुमान लगाना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि एकत्र तलछट मुख्य रूप से मिट्टी है, क्योंकि कंकड़ और चट्टानों से न्यूक्लिक एसिड की उपज कम हो जाएगी और माइक्रोबियल समुदाय का सटीक प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है। अंत में, यह महत्वपूर्ण है कि नमूनों को संग्रह के बाद बर्फ पर रखा जाता है, खासकर यदि एक परिरक्षक का उपयोग नहीं किया जाता है।

हालांकि इस प्रोटोकॉल में मेटाट्रानस्क्रिप्टॉमिक्स और 16S लैब प्रोटोकॉल दोनों को शामिल किया गया है, लेकिन इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि ये दोनों तरीके प्रक्रिया में और उनके द्वारा प्रदान किए जाने वाले डेटा के प्रकार में बहुत अलग हैं। 16S rRNA जीन एक आमतौर पर लक्षित क्षेत्र है, अत्यधिक बैक्टीरिया और archaea में संरक्षित है, और एक नमूने में जीवाणु समुदाय की विशेषता के लिए उपयोगी है । हालांकि एक लक्षित और विशिष्ट दृष्टिकोण, प्रजातियों के स्तर पर संकल्प अक्सर अप्राप्य है, और नई अलग प्रजातियों या उपभेदों की विशेषता मुश्किल है । इसके विपरीत, मेटाट्रानस्क्रिप्टोमिक्स एक व्यापक दृष्टिकोण है जो एक नमूने के भीतर मौजूद सभी सक्रिय जीन और रोगाणुओं को कैप्चर करता है। जबकि 16S पहचान के लिए केवल डेटा प्रदान करता है, मेटाट्रानस्क्रिप्टोमिक्स व्यक्त जीन और मेटाबोलिक रास्ते जैसे कार्यात्मक डेटा प्रदान कर सकते हैं । दोनों मूल्यवान हैं और जब संयुक्त, वे प्रकट कर सकते है जो बैक्टीरिया मौजूद है और जो जीन वे व्यक्त कर रहे हैं ।

यह पेपर फ्रैकिंग का अध्ययन करने के संदर्भ में 16S आरआरएनए और मेटाट्रानस्क्रिप्टॉमिक विश्लेषण दोनों के लिए क्षेत्र संग्रह और नमूना प्रसंस्करण के तरीकों का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, यह कम बायोमास नमूनों से और दीर्घकालिक भंडारण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए/आरएनए के लिए संग्रह विधियों का विवरण देता है । यहां वर्णित तरीके नमूना संग्रह और प्रसंस्करण के साथ हमारे अनुभवों की परिणति हैं, यह जानने के लिए कि उनके माइक्रोबियल समुदायों की संरचना और कार्य की जांच के माध्यम से आसपास की धाराओं को कैसे प्रभावित करता है। रोगाणुओं गड़बड़ी के लिए जल्दी से प्रतिक्रिया, और फलस्वरूप, जो रोगाणुओं मौजूद है और जीन वे व्यक्त पारिस्थितिकी प्रणालियों पर fracking के प्रभाव के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं । कुल मिलाकर, ये तरीके हमारी समझ में अमूल्य हो सकते हैं कि फ्रैकिंग इन महत्वपूर्ण पारिस्थितिकी प्रणालियों को कैसे प्रभावित करता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को परियोजनाओं है कि इन तरीकों के विकास के लिए नेतृत्व के लिए धन स्रोतों को स्वीकार करना चाहते हैं, उन स्रोतों के साथ किया जा रहा है: हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान (http://www.hhmi.org) Precollege और स्नातक विज्ञान शिक्षा कार्यक्रम के माध्यम से, साथ ही साथ राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (http://www.nsf.gov) द्वारा NBI पुरस्कार DBI-१२४८०९६ और CBET-१८०५५४९ ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 Proof Ethanol Thermo Fisher Scientific A4094 400 mL need to be added to Buffer PE (see Qiagen QIAQuck Gel Extraction kit protocol) and 96 mL needs to be added to the DNA/RNA Wash Buffer (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol).
Additional ethanol is needed for the ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep and NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep with Sample Purification Beads kits.
Agarose Thermo Fisher Scientific BP1356-100 100 g per bottle. 0.6 g of agarose would be needed to make one 2% 30 mL gel.
Disinfecting Bleach Walmart (Clorox) No catalog number Use a 10% bleach solution for cleaning the work area before and after lab procedures
DNA gel loading dye Thermo Fisher Scientific R0611 Each user-made (i.e. non-e-gel) should include loading dye with all of the samples in the ratio of 1 µL dye to 5 µL sample
DNA ladder MilliporeSigma D3937-1VL A ladder should be run on every gel/e-gel
DNA/RNA Shield (2x) Zymo Research R1200-125 3 mL per sediment sample (50 mL conical) and 2 mL per water sample (filter)
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302-10 Used for staining user-made e-gels
Forward Primer Integrated DNA Technologies (IDT) 51-01-19-06 0.5 µL per PCR reaction
Isopropanol MilliporeSigma 563935-1L Generally less than 2 mL per library. Volume needed varies by mass of excised gel fragment (see Qiagen QIAQuick Gel Extraction kit protocol). 
PCR-grade water MilliporeSigma 3315932001 13 µL per PCR reaction (assuming 1 µL of sample DNA template is used)
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000012 10 µL per PCR reaction
Reverse Primer Integrated DNA Technologies (IDT) 51-01-19-07 0.5 µL per PCR reaction
TBE Buffer (Tris-borate-EDTA) Thermo Fisher Scientific B52 1 L of 10x TBE buffer (30 mL of 1x TBE buffer would be needed to make one 30 mL gel)
1 L bottle Thermo Fisher Scientific 02-893-4E One needed per stream (the same bottle can be used for multiple streams if it is sterilized between uses)
1.5 mL Microcentrifuge tubes MilliporeSigma BR780400-450EA 5 microcentrifuge tubes are needed per DNA extraction and an additional 3 are needed to purify RNA (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol)
2% Agarose e-gel Thermo Fisher Scientific G401002 Each gel can run 10 samples (so 9 with a PCR negative and 8 if the extraction negative is run on the same gel)
50 mL Conicals CellTreat 229421 1 50 mL conical needed per sediment samples
500 mL Beaker MilliporeSigma Z740580 Only 1 needed (for flame sterilization)
Aluminum foil Walmart (Reynolds KITCHEN) No number Aluminum foil can be folded and autoclaved. The part not exposed to the environment can then be used as a sterile, DNA and RNA free surface for processing filters
(one folded piece per filter to avoid cross-contamination)
Autoclave Gettinge LSS 130 Only one needed
Centrifuge MilliporeSigma EP5404000138-1EA Only 1 needed
Cooler ULINE S-22567 Just about any cooler can be used. This one is listed due to being made of foam, making it lighter and thus easier to take along for field sampling.
Disruptor Genie Bio-Rad 3591456 Only one needed
Electrophoresis chamber Bio-Rad 1664000EDU Only 1 needed
Electrophoresis power supply Bio-Rad 1645050 Only 1 needed
Freezer (-20 C) K2 SCIENTIFIC K204SDF One needed to store DNA extracts
Freezer (-80 C) K2 SCIENTIFIC K205ULT One needed to store RNA extracts
Gloves Thermo Fisher Scientific 19-020-352 The catalog number is for Medium gloves.
Heat block MilliporeSigma Z741333-1EA Only one needed
Lab burner Sterlitech 177200-00 Only one needed
Laminar Flow Hood AirClean Systems AC624LFUV Only 1 needed
Library purification kit Qiagen 28704 One kit has enough for 50 reactions
Magnet Plate Alpaqua A001219 Only one needed
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75004061 Only one needed
Micropipette (1000 µL volume) Pipette.com L-1000 Only 1 needed
Micropipette (2 µL volume) Pipette.com L-2 Only 1 needed
Micropipette (20 µL volume) Pipette.com L-20 Only 1 needed
Micropipette (200 µL volume) Pipette.com L-200R Only 1 needed
NEBNext Ultra II RNA Library Prep with Sample Purification Beads New England BioLabs Inc. E7775S One kit has enough reagents for 24 samples.
Parafilm MilliporeSigma P7793-1EA 2 1" x 1" squares are needed per filter
PCR Tubes Thermo Fisher Scientific AM12230 One tube needed per reaction
Pipette tips (for 1000 µL volume) Pipette.com LF-1000 Pack of 576 tips
Pipette tips (for 20 µL volume) Pipette.com LF-20 Pack of 960 tips
Pipette tips (for 200 µL volume) Pipette.com LF-250 Pack of 960 tips
PowerWulf ZXR1+ computer cluster PSSC Labs No number This is just an example of a supercomputer powerful enough to perform metatranscriptomics analysis in a timely manner. Only one needed. 
Qubit fluorometer starter kit Thermo Fisher Scientific Q33239 Comes with a Qubit 4 fluorometer, enough reagent for 100 DNA assays, and 500 Qubit tubes
Scoopula Thermo Fisher Scientific 14-357Q Only one needed
Sterile blades AD Surgical A600-P10-0 One needed per filter
Sterivex-GP Pressure Filter Unit MilliporeSigma SVGP01050 1 filter needed per water sample
Thermocycler Bio-Rad 1861096 Only one needed
Vise-grip Irwin 2078500 Only one needed (for cracking open the filters)
Vortex-Genie 2 MilliporeSigma Z258415-1EA Only 1 needed
WHIRL-PAK bags ULINE S-22729 1 needed per filter
ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit Zymo Research R2002 One kit has enough reagents for 50 samples. 

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References

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JoVE में इस महीने अंक १७० हाइड्रोलिक फ्रैक्चरिंग प्राकृतिक गैस नमूना बैक्टीरिया धाराओं आनुवंशिक विश्लेषण
माइक्रोबियल आणविक हस्ताक्षरों का उपयोग करके धाराओं पर हाइड्रोलिक फ्रैक्चरिंग के प्रभाव का मूल्यांकन करना
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Chen See, J. R., Wright, O., Unverdorben, L. V., Heibeck, N., Techtmann, S. M., Hazen, T. C., Lamendella, R. Evaluating the Impact of Hydraulic Fracturing on Streams using Microbial Molecular Signatures. J. Vis. Exp. (170), e61904, doi:10.3791/61904 (2021).

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