生物组织样本的连续块面扫描电子显微镜成像（SBF-SEM）

摘要

本方案概述了一种使用连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）的常规方法，SBF-SEM是一种强大的三维成像技术。SBF-SEM的成功应用依赖于适当的固定和组织染色技术，以及对成像参数的仔细设置。本方案涵盖了该过程各个阶段的实用注意事项。

摘要

连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）能够采集数百至数千张连续对齐的超微结构图像，为组织微解剖结构提供前所未有的三维视图。尽管近年来SBF-SEM的应用呈指数级增长，但适当的技术细节，如组织样本的制备和成像参数的选择，对该成像技术的成功至关重要。该成像系统具有高度自动化的特点，允许在无人值守的情况下运行显微镜，单日内即可自动采集数百张图像。然而，若组织制备不当，细胞超微结构可能发生改变，从而导致错误或误导性的结论。此外，图像通过扫描树脂包埋生物样本的块面生成，这一过程常带来需要特别考虑的技术挑战。成像过程中电子在样本块内积聚，即所谓的“组织充电”现象，可能导致对比度下降，难以清晰分辨细胞结构。同时，虽然提高电子束强度/电压或降低扫描速度可提升图像分辨率，但这也可能带来不利的副作用，例如损伤树脂块并导致后续图像失真。本文介绍了一种常规的生物组织样本制备方案，旨在保持细胞超微结构完整性并减少组织充电效应。同时，我们还提供了成像参数设置建议，以实现高质量连续图像的快速获取，并最大限度减少对组织块的损伤。

引言

连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）最早由Leighton于1981年提出，其设计是在扫描电子显微镜上加装内置的超薄切片机，能够对包埋在树脂中的组织进行连续切片并成像。然而，由于技术限制，该方法最初仅适用于导电样品，因为非导电样品（如生物组织）会积累严重的电荷（即电子在组织样品内部积聚）¹。虽然在每次切片后对块面进行蒸发碳镀膜可减少组织充电，但这显著延长了成像采集时间，同时图像存储也存在问题，因为当时的计算机技术无法有效处理设备生成的大量数据文件。2004年，Denk和Horstmann重新采用SBF-SEM技术，并使用配备可变压力腔室的设备进行改进²。该方法允许向成像腔室内引入水蒸气，从而减少样品内部的电荷积累，使非导电样品的成像成为可能，但图像分辨率有所下降。随着样品制备和成像方法的进一步优化，目前可在高真空条件下进行成像，SBF-SEM已不再依赖水蒸气来消除电荷积累^3,4,5,6,7,8,

方案

所有动物的处理均遵循《视力与眼科研究协会关于在视力与眼科研究中使用动物的声明》以及休斯顿大学视光学院动物处理指南中所述的规定。所有动物实验程序均已获得相应机构的批准：小鼠、大鼠、兔、豚鼠和非人灵长类动物的实验程序已获休斯顿大学动物护理与使用委员会批准，斑马鱼实验程序已获德堡大学动物护理与使用委员会批准，猪的实验程序已获贝勒医学院动物护理与使用委员会批准。所有人体组织的处理均遵循《赫尔辛基宣言》关于人体组织研究的规定，并已获得相应的机构审查委员会批准。

1. 组织处理

1. 通过将二甲胂酸钠粉末溶于ddH₂O中，配制0.4 M二甲胂酸钠缓冲液的储备液。₂O. 充分混匀缓冲液，并将溶液pH值调节至7.3。该缓冲液用于配制固定液（组成见下文步骤1.3）、洗涤缓冲液，以及四氧化锇和亚铁氰化钾溶液。
   注意：对于SBF-SEM研究，灌注固定通常是最佳的固定方法，因为该方法可实现快速且全身范围内的固定。如果研究设计中无法进行灌注固定，请跳至步骤1.3。
2. 以适合该动物模型的生理压力进行灌注固定^24,25,26通过经心脏依次灌注肝素化生理盐水和固定液完成，灌注液置于高于动物体特定高度（例如100 cm，相当于该动物模型循环系统生理压力）....

结果

小鼠角膜
该方案已广泛应用于小鼠角膜研究。通过使用SBF-SEM成像，发现成年小鼠角膜内存在一种无弹性蛋白的微原纤维束网络（EFMBs）。此前人们认为这种网络仅存在于胚胎期和出生后早期发育阶段。SBF-SEM揭示了在整个角膜中广泛分布的EFMB网络，横截面测量显示单根纤维直径为100–200 nm。此外，该EFMB网络呈分层结构排列，纤维与角膜细胞（keratocytes）密切相关，甚至位于角膜细胞表面的浅凹陷内（图5）。成年角膜中EFMB纤维的发现，进一步推动了免疫胶体金标记透射电子显微镜（TEM）、荧光及共聚焦显微技术的研究，以深入理解该网络的性质²³。

进一步应用该方案后，发现了一类此前未知的中央角膜神经群体，这类神经在基质-上皮交界处与基底上皮细胞发生细胞融合（图6）。此前人们认为，在此交界处与上皮相互作用的所有神经均会穿透进入角膜上皮层，并发生分支，形成基底下神经丛.......

讨论

本文方法学论文的目的是重点介绍使我们实验室能够稳定获取高分辨率连续电子显微镜图像的组织制备与成像技术，并指出实现该结果的关键步骤以及在进行SBF-SEM成像过程中可能出现的潜在问题。成功应用本实验方案需要对组织进行适当的固定、将重金属充分渗透入样品、对包埋树脂进行改良以减少电荷积聚，以及充分理解所用显微镜及其成像参数设置。常言道， "质量输入，质量输出" 是进行SBF-SEM成像的合适原则。由于SBF-SEM的目标通常是观察或量化超微结构细节，因此必须格外重视固定策略，以确保组织不发生形变。若在样品制备过程中的任何阶段出现组织形变（例如发生肿胀、收缩或细胞形态破坏），则组织重建与定量分析将无法获得准确数据。此外，若使用不正确的成像参数，可能导致数据丢失，而由于SBF-SEM成像具有破坏性，丢失的数据无法重新获取。同时，在装载组织样品时也需格外小心，因为操作不当或样品制备仓促可能损伤精密的金刚石刀刃，导致刀刃出现缺口或断裂，进而在图像中留下明显的划痕痕迹图10C金刚石刀也可能因钙化结构、硬质颗粒或意外嵌入的玻璃（例如来自试剂安瓿瓶的玻璃）而受损。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1/16 x 3/8 铝制铆钉	Industrial Rivet & Fastener Co.	6N37RFLAP/1100	用作样品针。
2.5 mm 平头螺丝刀	Wiha Quality Tools	27225
丙酮	Electron Microscopy Sciences	RT 10000	用于稀释导电银漆。
天冬氨酸	Sigma-Aldrich	A8949
氯化钙	FisherScientific	C79-500
导电银漆	Ted Pella	16062
配备标准金箔靶材的 Denton Desk-II 真空溅射仪	Denton Vacuum	N/A	这是作者使用的喷金设备，其他替代设备也可接受。
双刃剃刀片	Fisher Scientific	50-949-411
Embed 812 包埋剂	Electron Microscopy Sciences	14120
安装在 Tescan Mira3 场发射扫描电镜中的 Gatan 3View2 系统	Gatan & Tescan	N/A	这是作者使用的 SBF-SEM 设备，其他替代设备也可接受。
玻璃壳小瓶，0.5 dram（1.8 ml）	Electron Microscopy Sciences	72630-05
戊二醛	Electron Microscopy Sciences	16320
强力胶（Gorilla Super Glue - Impact Tough）	NA	NA	文中称为氰基丙烯酸酯胶。
Ketjen Black	HM Royal	EC-600JD	文中称为炭黑。
KOH	FisherScientific	18-605-593
硝酸铅	Fisher Scientific	L62-100
微波炉	Pelco	BioWave Pro	这是作者使用的微波设备，其他替代设备也可接受。
四氧化锇	Sigma-Aldrich	201030
亚铁氰化钾	Sigma-Aldrich	P9387
硅胶包埋模具	Ted Pella	10504
二甲胂酸钠三水合物	Electron Microscopy Sciences	12300
Samco 移液管	ThermoFisher Scientific	202	用于制作样品针储存管。
瑞士式针锉	Electron Microscopy Sciences	62115
硫代碳酰肼	Sigma-Aldrich	223220
醋酸铀酰	Polysciences, Inc.	21447-25
重建软件
Amira 软件	Thermo Scientific	N/A	用于生成图 5–7 和图 9 中的重建图像。
Fiji（Fiji 即 ImageJ）	ImageJ.net	N/A	可向 Fiji 添加 TrakEM2 插件以辅助手动分割。
显微图像浏览器（MIB）	赫尔辛基大学生物技术研究所	N/A
Reconstruct 软件	Neural Systems Lab	N/A
SuRVoS Workbench	Diamond Light Source & 诺丁汉大学	N/A
SyGlass	IstoVisio, Inc.	N/A	支持在虚拟现实中进行重建以及基于直方图的重建方法。