Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Seriel blok-ansigt scanning elektron mikroskopi (SBF-SEM) af biologiske vævsprøver

Published: March 26, 2021 doi: 10.3791/62045
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 3,4, 1,4
1College of Optometry, University of Houston, 2Department of Biology, DePauw University, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 4Children’s Nutrition Center, Baylor College of Medicine

Summary

Denne protokol skitserer en rutinemæssig metode til brug af seriel blok-ansigt scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM), en kraftfuld 3D-billedbehandling teknik. Vellykket anvendelse af SBF-SEM afhænger af korrekt fiksering og væv farvning teknikker, samt omhyggelig overvejelse af billedbehandling indstillinger. Denne protokol indeholder praktiske overvejelser for hele denne proces.

Abstract

Seriel blok-ansigt scanning elektron mikroskopi (SBF-SEM) giver mulighed for indsamling af hundreder til tusinder af serielt registrerede ultrastrukturelle billeder, der tilbyder en hidtil uset tre-dimensionel visning af væv mikroanatomi. Mens SBF-SEM har oplevet en eksponentiel stigning i brugen i de seneste år, tekniske aspekter såsom korrekt vævsforberedelse og billeddannelse parametre er altafgørende for succesen af denne billeddannelse modalitet. Dette billedsystem drager fordel af enhedens automatiserede karakter, så man kan forlade mikroskopet uden opsyn under billedprocessen, med automatiseret indsamling af hundredvis af billeder muligt på en enkelt dag. Men uden passende vævsforberedelse kan cellulær ultrastruktur ændres på en sådan måde, at der kan drages forkerte eller vildledende konklusioner. Derudover genereres billeder ved at scanne blokfladen af en harpiks-indlejret biologisk prøve, og dette giver ofte udfordringer og overvejelser, der skal løses. Akkumulering af elektroner i blokken under billeddannelse, kendt som "vævsopladning", kan føre til tab af kontrast og manglende evne til at værdsætte cellulær struktur. Desuden, mens øge elektronstråle intensitet / spænding eller faldende stråle-scanning hastighed kan øge billedopløsningen, kan dette også have den uheldige bivirkning at beskadige harpiks blok og fordreje efterfølgende billeder i billedbehandling serien. Her præsenterer vi en rutinemæssig protokol til fremstilling af biologiske vævsprøver, der bevarer cellulær ultrastruktur og mindsker vævsopladning. Vi leverer også billedbehandling overvejelser for hurtig erhvervelse af høj kvalitet seriebilleder med minimal skade på væv blok.

Introduction

Seriel blok ansigt scanning elektron mikroskopi (SBF-SEM) blev første gang beskrevet af Leighton i 1981, hvor han formet en scanning elektron mikroskop forstærket med en indbygget mikrotomi, som kunne skære og billede tynde dele af væv indlejret i harpiks. Desværre begrænsede tekniske begrænsninger brugen til ledende prøver, da ikke-ledende prøver såsom biologisk væv akkumulerede uacceptable opladningsniveauer (elektronoprustning i vævsprøven)1. Mens belægning blok-ansigt mellem nedskæringer med fordampet kulstof reduceret væv opladning, dette i høj grad øget billedbehandling erhvervelse tid og billedlagring forblev et problem som computerteknologi på det tidspunkt var utilstrækkelig til at styre de store filstørrelser skabt af enheden. Denne metode blev revideret af Denk og Horstmann i 2004 ved hjælp af et SBF-SEM udstyret med et variabelt trykkammer2. Dette gjorde det muligt at indføre vanddamp i billedkammeret, hvilket reducerer opladningen i prøven, hvilket gør billeddannelse af ikke-ledende prøver levedygtig, omend med tab af billedopløsning. Yderligere forbedringer i vævsforberedelse og billeddannelsesmetoder giver nu mulighed for billeddannelse ved hjælp af højt vakuum, og SBF-SEM-billeddannelse er ikke længere afhængig af vanddamp for at sprede opladning3,4,5,6,7,8,9. Mens SBF-SEM har oplevet en eksponentiel stigning i brugen i de seneste år, tekniske aspekter såsom korrekt vævsforberedelse og billeddannelse parametre er altafgørende for succesen af denne billeddannelse modalitet.

SBF-SEM giver mulighed for automatiseret indsamling af tusindvis af serielt registrerede elektronmikroskopibilleder med planaropløsning helt op til 3-5 nm10,11. Væv, imprægneret med tungmetaller og indlejret i harpiks, er placeret i en scanning elektron mikroskop (SEM) indeholder en ultramikromitomi udstyret med en diamant kniv. En flad overflade skæres med diamantkniven, kniven trækkes tilbage, og overfladen af blokken scannes i et rastermønster med en elektronstråle for at skabe et billede af vævs ultrastruktur. Blokken hæves derefter en bestemt mængde (f.eks. 100 nm) i z-aksen, kendt som et "z-trin", og en ny overflade skæres, før processen gentages. På denne måde produceres en 3-dimensionel (3D) blok af billeder, når vævet skæres væk. Dette billedsystem drager yderligere fordel af enhedens automatiserede karakter, så man kan forlade mikroskopet uden opsyn under billeddannelsesprocessen, med automatiseret samling af hundreder af billeder muligt på en enkelt dag.

Mens SBF-SEM-billeddannelse primært bruger backscattered elektroner til at danne et billede af blokfladen, genereres sekundære elektroner under billedprocessen12. Sekundære elektroner kan ophobes sammen med backscattered og primærstråleelektroner, der ikke undslipper blokken, og producere "vævsopladning", hvilket kan føre til et lokaliseret elektrostatisk felt ved blokfladen. Denne elektronakkumulering kan forvrænge billedet eller få elektroner til at blive skubbet ud af blokken og bidrage til det signal, der indsamles af backscatter-detektoren, hvilket reducerer signal-til-støj-forholdet13. Mens niveauet af vævsopladning kan reduceres ved at reducere elektronstrålespændingen eller intensiteten eller reducere strålebotiden, resulterer dette i et formindsket signal-til-støj-forhold14. Når der anvendes en elektronstråle med lavere spænding eller intensitet, eller strålen kun må dvæle inden for hver pixelplads i en kortere periode, skubbes mindre backscattered elektroner ud af vævet og fanges af elektrondetektoren, hvilket resulterer i et svagere signal. Denk og Horstmann håndterede dette problem ved at indføre vanddamp i kammeret og derved reducere ladning i kammeret og på blokfladen på bekostning af billedopløsning. Med et kammertryk på 10-100 Pa spredes en del af elektronstrålen, hvilket bidrager til billedstøj og tab af opløsning, men dette giver også ioner i prøvekammeret, som neutraliserer ladning i prøveblok2. Nyere metoder til neutralisering af ladning i prøveblokken bruger fokal gasindsprøjtning af nitrogen over blokfladen under billeddannelse eller til at indføre negativ spænding til SBF-SEM-fasen for at reducere sondestråle-smedeenergi og øge signal indsamlet6,7,15. I stedet for at indføre fase bias, kammertryk eller lokaliseret kvælstofindsprøjtning for at reducere ladningsopbygning på blokoverfladen, er det også muligt at øge harpiksens ledningsevne ved at introducere kulstof til harpiksblandingen, hvilket giver mulighed for mere aggressive billedindstillinger16. Følgende generelle protokol er en tilpasning af Deerinck et al. protokollen offentliggjort i 2010 og dækker ændringer af vævsforberedelse og billeddannelsesmetoder, som vi fandt nyttige til at minimere vævsopladning, samtidig med at vi opretholdt billedopsamling i høj opløsning3,17,18,19. Mens den tidligere nævnte protokol fokuserede på vævsbehandling og tungmetalimprægnering, giver denne protokol indsigt i den billeddannelse, dataanalyse og genopbygningsarbejdsgang, der er forbundet med SBF-SEM-undersøgelser. I vores laboratorium er denne protokol blevet anvendt med succes og reproducerbart på en lang række væv, herunder hornhinde- og forreste segmentstrukturer, øjenlåg, lacrimal og harderian kirtel, nethinden og synsnerven, hjerte, lunge og luftveje, nyre, lever, cremaster muskel, og hjernebark / medulla, og i en række arter, herunder mus, rotte, kanin, marsvin, fisk, monolayer og stratificeret cellekulturer, svin, ikke-menneskelige primat, samthumane 20,21,22,23. Mens små ændringer kan være umagen værd for specifikke væv og applikationer, har denne generelle protokol vist sig meget reproducerbar og nyttig i forbindelse med vores kernebilledbehandling facilitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr blev håndteret i henhold til de retningslinjer, der er beskrevet i Association for Research in Vision and Oftalmologi Statement for the Use of Animals in Vision and Oftalmic Research og University of Houston College of Optometry animal handling guidelines. Alle dyreforsøg blev godkendt af de institutioner, hvor de blev håndteret: Mus, rotte, kanin, marsvin og ikke-menneskelige primatprocedurer blev godkendt af University of Houston Animal Care and Use Committee, zebrafiskprocedurer blev godkendt af DePauw University Animal Care and Use Committee, og svineprocedurer blev godkendt af Baylor College of Medicine Animal Care and Use Committee. Alt humant væv blev håndteret i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen om forskning i humant væv, og der blev opnået passende godkendelse fra det institutionelle bedømmelsesudvalg.

1. Vævsbehandling

  1. Der fremstilles en stamopløsning på 0,4 M natriumkakocylatbuffer ved at blande natriumkakoodelatpulver i ddH2O. Bland bufferen grundigt, og pH-opløsningen justeres til 7,3. Denne buffer bruges til at lave fiksativ (sammensætning beskrevet nedenfor i trin 1.3), vaskebuffer samt osmium- og kaliumferrocyanidopløsninger.
    BEMÆRK: Perfusionsfiksering er ofte den bedste metode til fiksering til SBF-SEM-undersøgelser, da fiksering sker hurtigt og i hele kroppen. Hvis perfusionsfiksering ikke er mulig i dit studiedesign, skal du gå til trin 1.3.
  2. Udfør perfusionsfiksering med det passende fysiologiske tryk for dyremodellen24,25,26. Dette gøres via transcardial sekventiel perfusion med hepariniseret saltvand efterfulgt af fikseringsmiddel, hver placeret i en bestemt højde (f.eks. 100 cm) over organismen (passende til det fysiologiske tryk af det vaskulære system i dyremodellen), med fiksativ, der strømmer ind i venstre ventrikel, og ud af et snit lavet i højre atrium. Væv af interesse vil blive bleg som blod er erstattet med fikseringsmiddel, hvis alle eller en del af dit væv ikke blanche så væv kan ikke være passende fast og ultrastruktur kan ikke bevares.
  3. Brug et barberblad eller en skarp skalpel til at trimme vævsprøver i blokke, der ikke er større end 2 mm x 2 mm x 2 mm. Hvis trin 1.2 blev sprunget over, skal du gøre dette hurtigt, så væv kan nedsænkes så hurtigt som muligt.
    1. Alternativt dissekere væv under fikseringsmiddel og overføre til frisk fikseringsmiddel for at fuldføre nedsænkningsprocessen. Den endelige sammensætning af fikseringssættet består af 0,1 M natriumkakodronatbuffer, der indeholder 2,5% glutaraldehyd og 2 mM calciumchlorid. Der må gå mindst 2 timer til fastgørelse ved stuetemperatur og højst natten over ved 4 °C. Hvis det er muligt, skal du bruge en rocker/ vippeplade til forsigtigt at omrøre prøver under fastgørelse.
    2. Alternativt, hvis en inverter mikrobølgeovn er tilgængelig, fastsætte væv i ovennævnte fikseringsmiddel under vakuum på 150 watt i 4 cyklusser på 1 minut på, 1 minut off. Mikrobølgefiksering er den foretrukne metode til trin 1.3, da det hurtigt løser væv og bevarer væv ultrastruktur27.
      BEMÆRK: Væv bør aldrig få lov til at tørre under denne protokol, der skal udvises forsigtighed for at overføre væv hurtigt fra den ene opløsning til den næste.
  4. Fast væv vaskes 5x i 3 minutter hver (15 minutter i alt) ved stuetemperatur i 0,1 M natriumkakodrolatbuffer, der indeholder 2 mM calciumchlorid.
  5. Gør følgende osmium ferrocyanidopløsning frisk, helst under de foregående vasketrin. Kombiner en 4% osmium tetroxidopløsning (tilberedt i ddH2O) med et lige volumen på 3% kaliumferrocyanid i 0,2 M cacodylatbuffer med 4 mM calciumchlorid. Efter det foregående vasketrin skal vævet placeres i denne opløsning i 1 time på is i mørke og i røghætten.
    BEMÆRK: Osmium tetroxid er et gult krystallinsk stof, der kommer i en ampule. For at skabe osmium tetroxidopløsningen skal du knække ampulet, tilsæt ddH2O og sonicate i 3-4 timer i mørke, indtil krystallerne er helt opløst. Osmium tetroxidopløsning er en klar gul opløsning, hvis opløsningen er sort, er osmiummet blevet reduceret og bør ikke længere anvendes.
  6. Mens vævet inkuberer i osmium ferrocyanidopløsningen, skal du begynde at forberede thiocarbohydrazidopløsningen (TCH). Forbered denne opløsning frisk og få den let tilgængelig i slutningen af 1 time osmium ferrocyanid fikseringsperioden. 0,1 g thiocarbohydrazid kombineres med 10 ml ddH2O, og denne opløsning anbringes i en ovn på 60 °C i 1 time. For at sikre, at opløsningen opløses, hvirvles forsigtigt hvert 10. minut. Før brug filtreres denne opløsning gennem et 0,22 μm sprøjtefilter.
  7. Før inkubering i TCH vaskes vævet med stuetemperatur ddH2O 5x i 3 minutter hver (15 minutter i alt).
  8. Vævet anbringes i den filtrerede TCH-opløsning i i alt 20 minutter ved stuetemperatur(figur 1A-C).
  9. Efter inkubation i TCH vaskes vævet 5x i 3 minutter hver (15 minutter i alt) i stuetemperatur ddH2O.
  10. Væv anbringes i ddH2O, der indeholder 2% osmiumtetrioxid (ikke osmium reduceret med kaliumferrocyanid) i 30 minutter ved stuetemperatur. Dette skal gøres i røghætten og i mørke, da osmium kan reduceres med lys (f.eks. under aluminiumsfolie)(Figur 1D-F).
  11. Efter osmium tetroxid inkubation, vask væv 5x i 3 minutter hver (15 minutter i alt) i stuetemperatur ddH2O.
  12. Væv anbringes i 1% vandigt uranylacetat (uranylacetatpulver blandet i ddH2O) natten over i køleskab ved 4 °C.
  13. Lige før du fjerner væv fra køleskabet, forberede friske Walton's bly aspartate løsning. Der påbegyndes en opløsning på 0,066 g blynitrat i 10 mL af 0,03 M asparticsyreopløsning (0,04 g aspartisyre i 10 ml destilleret vand) og pH justeres til 5,5 med 1 N KOH (0,5611 g i 10 ml destilleret vand).
    ADVARSEL: Der kan dannes et bundfald ved justering af pH-filen. Det er ikke acceptabelt.
    1. Brug en rørestang, langsomt tilføje 1 N KOH dropwise mens overvågning pH. Forvarm den færdige klare bly aspartatopløsning i en 60 °C ovn i 30 minutter. Hvis der dannes et bundfald, kan opløsningen ikke anvendes, og der skal fremstilles en anden opløsning.
  14. Fjern vævet fra køleskabet og vask 5x i 3 minutter hver (15 minutter i alt) i stuetemperatur ddH2O.
  15. Efter vask anbringes vævet i den opvarmede Waltons bly aspartatopløsning i 30 minutter, samtidig med at temperaturen fastholdes ved 60 °C.
  16. Efter inkubation i Waltons bly aspartat vaskes vævet 5x i 3 minutter hver (15 minutter i alt) i stuetemperatur ddH2O(Figur 1G-I).
  17. Dehydrer vævet gennem en iskold acetone-serie (30%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100% og 100% acetone (i ddH2O, hvor det er relevant) giver 10 minutter for hvert trin i serien.
  18. Efter den iskolde dehydrering serien, sted væv i stuetemperatur acetone i 10 minutter.
    1. I løbet af denne tid formulere Integrere 812 ACM harpiks. Brug opskriften "hard mix", da den er mere modstandsdygtig over for stråleskader. Bland harpiksen grundigt, og læg vævet i Embed 812:acetone (1:3 mix) i 4 timer, efterfulgt af Embed 812:acetone (1:1 mix) i 8 timer eller natten over, og til sidst Integrere 812:acetone (3:1 mix) natten over. Udfør disse harpiksinfiltrationstrin ved stuetemperatur.
  19. Den næste dag, placere vævet i 100% Embed 812 i 4-8 timer, derefter i frisk 100% Embed 812 natten over, og endelig i frisk 100% Embed 812 i 4 timer. Udfør disse harpiksinfiltrationstrin ved stuetemperatur.
    1. Lige før indlejring skal du placere en lille mængde harpiks i en blandingsbeholder og langsomt blandes (en træpind kan bruges til omrøring) i kulsort pulver, indtil harpiksen er mættet med pulveret, men stadig er flydende og ikke bliver kornet. Det skal ligne tykt blæk og være i stand til langsomt at dryppe fra træpinden uden synlige klumper.
  20. Orientere vævsprøver i en silikone gummiform og tage et billede, så prøve orientering i harpiks blok registreres og kan refereres. Dæk prøverne i carbon black mættet harpiks på spidsen af silikoneformen og læg formen i en ovn i ~ 1 time ved 65 °C.
    1. Placer formen på en hældning til at indeholde harpiks på spidsen af formen, hvor det dækker vævsprøven. Der anbringes en etiket med en identifikator for forsøg/vævsprøve i formen i den modsatte ende af harpiksen(figur 2A).
  21. Fjern silikoneformen fra ovnen og fyld resten af formen med klar harpiks (ingen carbon black), og sørg for, at etiketten forbliver synlig. Hærde harpiks infunderes med carbon black nok til ikke umiddelbart at blande med den klare harpiks.
    1. Forbered en ekstra godt i formen, der ikke indeholder væv. Begyndende med den ekstra brønd, fyld resten af formen med klar harpiks.
    2. Hvis den kulsorte infunderede harpiks begynder at bløde ind i den klare harpiks, skal du placere silikoneformen tilbage i ovnen i yderligere tid (f.eks. 15 minutter).
    3. Når alle vævsprøverne er blevet overvæltet med klar harpiks, skal silikoneformen placeres tilbage i ovnen (flad, ingen hældning) ved 65 °C i 48 timer for at fuldføre hærdningsprocessen.

2. Blok forberedelse

BEMÆRK: Metoden afhænger af, hvordan prøven er orienteret i blokken, og hvordan sektionsopdelen skal finde sted. Men den mest almindelige vævsorientering finder vævet centreret i spidsen af harpiksblokken, vinkelret på den lange ende af harpiksblokken.

  1. I de fleste tilfælde skal du først trimme enden af blokken for at finde vævet ved at placere prøveblokken i mikrotompatronen med den koniske ende, der stikker op ca. 5-6 mm ud af patronen. Lås den på plads med sætskruen og læg den under en varmelampe.
  2. Efter flere minutter vil blokken være formbar og let at trimme. Placer spændepatronen i stereomikroskopholderen, og brug et nyt dobbeltkantet barberblad til at gøre tynde sektioner parallelle med blokfladen, indtil vævet er synligt. Dette ses bedst ved at fiske lys over blokfladen, vævsprøven vil være mindre reflekterende og granulær sammenlignet med de dele af harpiksen, der er blottet for væv. Se fotografiet taget af vævsprøver forud for indførelsen af carbon black mættet harpiks for en idé om, hvordan og hvor vævet er placeret.
  3. Sæt en prøve pin holder til side til trimning formål. Denne pinholder placeres aldrig i SEM-kammeret og kan derfor håndteres uden handsker, dette vil blive omtalt som trimningsstiftholderen. Prøveholdere, der er bestemt til at blive anbragt i billedkammeret, må aldrig berøres uden handsker. Dertil kommer fedt og olie ind i mikroskopkammeret.
  4. Placer en aluminium prøvestift i trimning pin indehaveren og lidt stramme sættet skruen med ansigtet (flad overflade) af stiften holdt 3-4mm over stiften indehaveren.
  5. Lav flere dybe, på kryds og tværs ridser i ansigtet af stiften for at give et større overfladeareal til limen, der bruges til at holde prøven på plads. Hvis der anvendes en aluminiumsstift, anbefales en lille skruetrækkeren i stål med flad hovedet til dette trin (Figur 2B).
  6. Placer patronen, der indeholder vævsprøven, tilbage under varmelampen, indtil harpiksen bliver blød og formbar, og placer den derefter i klukkebeholderen under stereomikroskopet.
  7. Brug et tveægget barberblad til at fjerne overskydende harpiks fra den del af harpiksblokken, der indeholder vævsprøven. I sidste ende vil størrelsen af vævsblokken, der er fastgjort til stiften, være ca. 3 mm i diameter og 2-3 mm i højden.
    1. Skub forsigtigt barbermaskinen lige ned i harpiksblokken ca. 1-2 mm, og skub derefter forsigtigt barbermaskinen vandret ind i harpiksblokken i en dybde svarende til det forrige snit. Gør dette langsomt og med stor omhu, da det er muligt at beskadige eller skære den del af blokken, der indeholder vævsprøven, væk. Når de to snit mødes, vil den overskydende harpiks adskille sig fra blokken. Fortsæt med at fjerne harpiks, indtil der kun er et 3 mm x 3 mm hævet område tilbage.
  8. Efter denne indledende trimning skal blokken (stadig i spændepatronen) placeres under varmelampen i flere minutter.
  9. Når harpiksen bliver blød og formbar, skal du placere blokken tilbage under stereomikroskopet. Brug et nyt dobbeltkantet barberblad, afskær toppen af harpiksblokken, ca. 1 mm under den trimmede del, med et enkelt glat snit. En flad overflade er at foretrække, da dette vil blive limet til prøven pin. Pas på ikke at lade prøven gå tabt, da dette trin kræver en vis kraft, som kan overføres til den fjernede del af blokken og få den til at flyve væk. Placer den udskårne og trimmede prøve til side.
  10. Placer trimningsstiftholderen med den udskårne aluminiumsstift i stereomikroskopbeholderen. Påfør et tyndt lag cyanoacrylatlim på pinfladen, så den helt dækker stiften uden at danne en synlig menisk. Pick up den trimmede stykke af væv blok med pincet og sted i på stiften ansigt. Centrer vævsprøven på prøvenålen. Skub den ned og hold den i flere sekunder. Lad limen indstille i flere minutter.
  11. Når limen er grundigt tør, skal du placere trimningsstiftholderen tilbage under stereomikroskopet. Brug en fin fil, fil væk overskydende harpiks, så ingen harpiks er overhængende stiften. Harpiksformen skal ligne det cirkulære pinhoved.
  12. Find vævet på den hævede del af din harpiks blok, skrå belysning er nyttigt for dette. Ved hjælp af en dobbeltkantet barbermaskine skal den hævede del af harpiksen, der indeholder vævsprøven, trimmes til et område, der ikke er større end 1 mm2. Hvis det er muligt, kan blokfladen trimmes endnu mindre, dette vil reducere stress på diamantkniven og forbedre dens levetid.
    1. Fjern så meget overskydende harpiks som muligt, så blokken er lidt længere i en dimension. Dette gøres langsomt og med omhu, da det er muligt for harpiksen, der indeholder vævsprøven, at bryde væk, hvis der påføres for meget kraft. Mens en barbermaskine anbefales, kan en fin metalfil bruges til dette trin.
  13. Med en fin metalfilvinkel er den overskydende harpiks i området uden for den hævede del, der indeholder vævsprøven, ned mod kanten af stiften (Figur 2C).
  14. Fjern harpikspartikler og støv fra den forberedte prøve, før du anvender sølvmaling efterfulgt af guldspudsning. Bland sølv med acetone, så det er en let spredelig væske, beslægtet med neglelak (men ikke så tynd, at det drypper ud af applikatoren) og anvende en tynd frakke til hele prøven blok overflade. Acetone fordamper hurtigt, så det kan være nødvendigt at tilføje yderligere acetone som sølv maling begynder at blive tykkere.
    1. Lad sølvmaling tørre natten over, før den læsses i mikroskopet.
      BEMÆRK: Dette sølvlag skal være tyndt for at undgå at udvide blokfladen ud over 1 mm x 1 mm, og selvom sølvmalingen aldrig har beskadiget diamantkniven, anbefales mindre blokflader stadig at bevare diamantknivens levetid. Acetonen blandet med sølvet skal fordampe helt før guldspudsning eller indlæsning af prøven i mikroskopet for at undgå at indføre acetonedamp i billedkammeret.
    2. Efter påføring af sølvmaling påføres et tyndt lag guld på prøveblokken. Ved hjælp af en standard vakuum sputtering enhed udstyret med en standard guldfolie mål, et kammertryk på 200 milliTorr (Argon gas) og 40 milliampere kører i 2 minutter vil resultere i en 20 nm tyk guld belægning.
  15. Efter belægningen anbringes den monterede og trimmede blok i et rør med den relevante forsøgsetiket fastgjort. Opret brugerdefinerede rør ved hjælp af engangsoverførselspipetter.
    1. Skær overførselspipetten lige under pæren, så en kort del af overførselspipetterøret er fastgjort under pærens ende. Afkort den rørformede del, der blev skåret væk, og skær pipettespidsen tilbage nok, så aluminiumprøven kan skubbes snuggly inde i den.
    2. Placer enden, der indeholder aluminium prøven pin i pæreformet ende af den modificerede overførsel pipette.
  16. Før du lægger en forberedt vævsblok, skal du forsigtigt trimme overskydende sølvmaling væk fra overfladen af blokfladen.

3. SEM-indstillinger for billedbehandling af blokfladen

BEMÆRK: De efterfølgende billedbehandlingsindstillinger blev produceret på den enhed, der bruges af forfatterne, som er angivet i den leverede materialetabel. Mens denne enhed er i stand til variabel trykbilleddannelse, blev de bedste resultater fanget under højt vakuum.

  1. Dvæle tid: Brug 12 μs/px under seriel sektion. Når en region af interesse er blevet identificeret, kan en højere opløsning billede erhverves ved 32 μs/px.
  2. Indstillinger for vakuum: Brug en pistol tryk på 9e-008 Pa, en kolonne tryk på 1.1e-004 Pa, og et kammer tryk på 9.5e-002 Pa.
  3. Hentningstid: Med ovenstående indstillinger skal du tage en billedstak på 2048 x 2048 med en hastighed på 50 sekunder pr. billede. Billeder i højere opløsning af interesseregioner kan hentes ved 4096x4096 px med knap 9 minutter pr. billede.
  4. Sektionstykkelse: Brug 100-200 nm. Mindre er muligt, men kan kræve lavere strålespænding, intensitet eller opholdstid.
  5. Højspænding (HV): Brug 7-12 kV. Samtidig med at øge spændingen reducerer stedet størrelse og øger opløsningen, det indfører flere muligheder for stråleskader. Højere kV øger stråleindtrængning, hvilket resulterer i tab af detaljer. Hvis kV sænkes, forringes signalet til støjforholdet (figur 3)14.
  6. Stråleintensitet (BI): Forfatterens SBF-SEM-enhed tilbyder en stråleintensitetsskala fra 1-20. På denne skala giver værdier på 5-7 kvalitetsbilleder uden overdreven opladning og stråleskader. Jo højere BI jo større opløsning er, er der dog større chance for opladning og stråleskade14.
  7. Forstørrelse af staffagestørrelse og billede: Spotstørrelsen bestemmes ud fra stråleintensiteten og spændingsniveauet. Ideelt set bør staffagestørrelsen ikke være større end den anvendte pixelstørrelse. Pixelstørrelsen bestemmes ved at dividere synsfeltet (FOV) med antallet af pixel. For eksempel ville en 25 μm FOV med en billedstørrelse på 2048x2048 px give 12,2 nm pr. Pixel. Spotstørrelsen bør derfor ikke være større end 12,2 nm. Figur 4 viser, hvordan HV, BI og staffagestørrelse er relateret.
  8. Arbejdsafstand (WD) - Med blokfladebilleddannelse kan arbejdsafstanden ikke justeres. Det er simpelthen en faktor i fokus. Det vil være næsten identisk for alle blokke afbildet. Mens arbejdsafstanden ikke kan justeres, spiller den en afgørende rolle i opløsningen af det optagne billede. Efterhånden som arbejdsafstanden falder, øges opløsningsgrænsen for optagne billeder. I nogle tilfælde kan det være muligt at reducere arbejdsafstanden ved at foretage ændringer i billedkammeret, men disse ændringer skal foretages efter brugerens skøn. For at reducere arbejdsafstanden og øge billedopløsningen løsnede vi dørmonteringsmikrotomskruerne og flyttede mikrotomen, så den hvilede ~ 2 mm tættere på stråledetektoren efter at have retightening skruerne.
  9. Opløsning - Ved hjælp af ovenstående indstillinger er x & y-opløsning så høj som 3,8 nm mulig. Det er vigtigt at bemærke, at opløsningen er begrænset af strålepletstørrelsen samt pixelopløsningen af billedoptagelserne (f.eks. har et 20 μm synsfelt, der er fanget i et billede på 2048 x 2048 pixel, en pixelopløsning på 9,8 nm, selvom der blev brugt en 3,8 nm staffagestørrelse). Billedopløsning i z-plan er afhængig af sektionstykkelse, finder vi, at 100-200 nm fungerer godt sammen med denne protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mus Hornhinden
Denne protokol er blevet anvendt i vid udstrækning på musen hornhinden. Ved hjælp af SBF-SEM-billeddannelse viste det sig, at et netværk af elastinfri mikrokortbundter (EFMB'er) var til stede i hornhinden med voksne mus. Det blev tidligere antaget, at dette netværk kun var til stede under embryonale og tidlige postnatal udvikling. SBF-SEM afslørede et omfattende EFMB-netværk i hele hornhinden, med individuelle fibre fundet at være 100-200 nm i diameter målt i tværsnit. Det blev også konstateret, at dette EFMB-netværk var organiseret i forskellige lag, med fibre tæt forbundet med keratocytter, selv liggende inden for lavvandede invaginationer på keratocytoverfladen (Figur 5). Opdagelsen af EFMB-fibre i den voksne hornhinde førte til immunogold-mærkning transmission elektronmikroskopi (TEM), fluorescens og konfokale undersøgelser for yderligere at forstå karakteren af dette netværk23.

Yderligere anvendelse af denne protokol førte til opdagelsen af en hidtil ukendt population af centrale hornhindenerver, der smelter sammen med basale epitelceller ved den stromale epitelkant (Figur 6). Tidligere blev det antaget, at alle nerver, der interagerede med epitelet ved denne grænse, trængte ind i hornhindeepitelet og forgrenede produktionen af subbasal og epitel plexi. I denne undersøgelse gennemgik ~ 45% af de centrale nerver, der interagerede med det basale epitel, cellecellefusion snarere end simpel penetration. Ved hjælp af stereologiske metoder, der anvendes til SBF-SEM datasæt, var det muligt at vise denne nye nerve befolkning havde en overflade-til-volumen forhold omtrent halvdelen af gennemtrængende nerver, i overensstemmelse med deres "hævede" udseende (Nerve Fusion - 3,32±0,25, Nerve Penetration - 1,39±0,14, p ≤ 0,05). 3D rekonstruktioner af gennemtrængende og fusionere nerve bundter og deres mitokondrier blev skabt, fremhæver manglen på mitokondrier i smeltet dele af nerve bundter. Opdagelsen af neuronal-epitelcellefusion ved hjælp af SBF-SEM førte til fluorescensundersøgelser, der verificerede membrankontinuiteten mellem de to smeltede celler21.

Den centrale hornhinde er et avascular væv, og som sådan er den perifere limbale vaskulatur af særlig betydning for hornhindens generelle sundhed. Cellecellerelationerne og ultrastrukturen i denne region er kompleks. evnen til at værdsætte disse cellecelleinteraktioner og ultrastrukturelle forbindelser har imidlertid været begrænset i fluorescens og enkeltafsnit TEM-undersøgelser. Af denne grund blev en SBF-SEM-billedstak, der indeholder limbal vaskulatur, nervebundter og tilknyttede celler, manuelt segmenteret til 3D-rekonstruktion (Figur 7). I dette billede den tætte sammenhæng mellem vaskulære endotel vejkryds og en overlejring pericyte, de enkelte granulater af en perivascular mast celle, kernen og forkanten af en neutrofil kravle langs den ydre overflade af blodkar væggen, samt en forbipasserende nerve bundt kan ses.

Samlet set viser dette arbejde denne protokols evne til at producere 3D-elektronmikroskopidatasæt af høj kvalitet i væv, der er rige på ekstracellulær matrix og epitel samt vaskulatur og tilknyttede celler.

Højere orden Primat Retina - Nerve Plexus og vaskulære Netværk
Den nethinde nerve fiber lag (RNFL) af højere orden primater indeholder og afhænger af en omfattende vaskulært netværk. Ofte involverer sygdomme i nethinden ændringer i begge parametre i nethindenervefiberlaget såvel som den vaskulatur, der findes i det. Forståelse af forholdet mellem RNFL og dets vaskulære netværk i sundt, ikke-patologisk væv er det første skridt til at forstå eventuelle ændringer, der kan opstå som følge af sygdom. For bedre at forstå dette forhold blev SBF-SEM-protokollen anvendt på normal primathindehinde med højere orden, og genopbygningen af det vaskulære netværk blev udført, og volumetriske data udtrukket fra denne rekonstruktion (Figur 8). Denne 4.642.307 μm3 region af RNFL indeholdt en vaskulær seng 1.207x10-4 μL i volumen, der udgør 2,6% af det samlede volumen af RNFL. Dette arbejde viser denne protokols evne til at producere 3D-elektronmikroskopidatasæt af høj kvalitet i tæt neurologisk væv.

Zebrafisk og Kæmpe Danio Heart - Striated Muskel og udvikling af vaskulatur
Både zebrafisken og den gigantiske danio er vigtige modeller for hjerteudvikling og regenerering. Historisk set anses zebrafiskhjertet for at bestå af to anatomisk adskilte myokardiesegmenter, der fungerer sammen til støtte for zebrafiskens fysiologiske krav. Grænsefladen mellem disse to ventrikulære lag var imidlertid ikke godt forstået. Ved hjælp af denne protokol blev der fundet et tidligere ukendt vejkrydsområde bestående af et tyndt ark fibroblaster. Det blev konstateret, at åbninger i dette ark tillod to separate myokardiesegmenter at komme i kontakt og danne komplekse vedhæftninger, herunder desmosomer og fascia-tilhængere22.

Denne protokol er blevet anvendt i det videre arbejde med at undersøge det vaskulære netværk af det udviklende gigantiske danio-hjerte (Figur 9). Denne metode giver mulighed for 3D påskønnelse af udviklingen hjerte myocyt netværk og dets forhold til at udvikle mikrovasculature. Samlet set viser dette arbejde denne protokols evne til at producere 3D-elektronmikroskopidatasæt af høj kvalitet i muskelvæv og meget vaskulært væv.

Billedindstillinger, opladning og opløsning
Mens passende fiksering og tungmetal farvning er nødvendig for kvalitet SBF-SEM billeddannelse, lige så vigtigt er brugen af ledende harpiks og korrekt billedbehandling indstillinger for de spørgsmål, der behandles. I denne protokol anvendes brugen af carbon black for at øge prøveblokkens ledningsevne og give en kanal til monteringsstiften til frihøjde af sekundære elektroner fra blokfladen. Dette har vist sig at være effektivt til bekæmpelse af vævsopladning, som ofte nedbryder billedkvaliteten i væv, der ikke er fremstillet med carbon black16. Derudover giver sølvmaling og guldspudsning, der påføres blokken, en spredningsvej til elektronopbygning. Nogle enheder giver mulighed for tilsætning af en fokal ladningkompensator, hvilket reducerer opladningen ved at anvende et pust af nitrogen over blokfladen, men vi har haft lignende succes med brugen af carbon black og anvendelsen af sølvmaling og guldsprudlende til blokken15. Manglende prøveledningsevne kan føre til, at elektronopbygning er synlig som vævsopladning (figur 1) samt udledninger, der er synlige som pludselig billedskift og vridning, som dramatisk mindsker billedkvaliteten (Figur 10B & F). Brugen af carbon black giver mulighed for billeddannelse under højt vakuum og brug af billedindstillinger, der resulterer i højt signal-til-støj-forhold og forbedret billedopløsning. En sådan indstilling, der fører til forbedret billedkvalitet, er pixelbotid. SBF-SEM billeddannelsesprocessen indebærer rasterscanning af en elektronstråle over prøveoverfladen for at generere backscattered elektroner, som mikroskopdetektoren kan indsamle og fortolke som signal. Den tid, denne stråle får lov til at dvæle inden for hver pixels område, fører til, at der tildeles en mere nøjagtig pixelværdi til hver pixelplacering (Figur 3A &B)2. Der er dog en balance mellem øget støjsignal, opløsning og skader på blokfladen. Strålen bestråler effektivt blokfladen med højenergielektroner, som kan nedbryde og blødgøre harpiks, hvilket resulterer i billedforringelse og skærekomplikationer (Figur 10)28. Jo tyndere z-opløsningen kræves, jo vanskeligere bliver det at opretholde billedbehandling med høj opløsning. Vi bruger generelt z-trin på 100-200 nm, men z-trin størrelser på 25-50 nm er blevet rapporteret5,29,30,31. Med z-trin af denne størrelse kan nedbrydning og blødgøring af harpiks på grund af stråleskader føre til enten kompression af harpiksen, hvilket får kniven til at gå glip af et snit eller skære blokfladen, men med "snak", hvor kniven springer over overfladen af blokken og skaber krusninger og bånd13. Mens små z-trin er en attraktiv udsigt, er det vigtigt at holde det specifikke forskningsspørgsmål i tankerne, når du vælger et passende z-trin. Overudtagning kan føre til væsentlige overvejelser om datalagring samt en forøgelse af den tid, der kræves for at producere 3D-rekonstruktioner.

Vævsfiksering og farvning
Før tungmetalinkubation skal væv fastgøres i glutaraldehyd. Mens vi varmt anbefaler mikrobølgefiksering under vakuum til bevarelse af væv ultrastruktur27, hvis en mikrobølgeovn af laboratoriekvalitet ikke er tilgængelig, kan en kommerciel inverter mikrobølgeovn med variabel effekt erstattes32,33,34,35. Hvis dette gøres, bør der udvises ekstra omhu for at sikre, at vævsforvrængning ikke opstår. Forkert vævsfiksering kan resultere i ændret vævsmorfologi, som det kan ses i figur 10E. Denne protokol, som de fleste moderne SBF-SEM farvning protokoller, er blevet tilpasset fra farvning procedure skitseret af Deerinck i 201017, baseret på osmium-thiocarbohydrazide-osmium pletter skabt af Willingham og Rutherford i 198436. De tungmetaller, der anvendes i denne protokol, tilføjer kontrast til cellestrukturerne i en vævsprøve (Figur 1). Den oprindelige osmium inkubation sker med reduceret osmium, som binder sig til C = C obligationer i umættede fedtstoffer, der fører til membran og lipid farvning37,38. Osmium reduceres ved kaliumferrocyanid, som hjælper med farvning af mættede lipider og virker også for at stabilisere fosfolipider39,40. Thiocarbohydrazid tilføjes efterfølgende som en mordent, der binder sig til osmium fra den første inkubation, der fungerer som en bro, hvor yderligere osmium er bundet på et senere tidspunkt i protokol41. Uranylacetat, som er et uransalt, er et effektivt kontrasterende middel til lipider, nukleinsyrer og proteiner, mens blycitrat øger kontrasten af proteiner og glykogener. De forskellige affiniteter af disse agenser for cellulære komponenter øger yderligere den samlede kontrast i væv ud over osmiuminkubationerne42.

Billedbehandling af blokfladen
Figur 11, Figur 12, Figur 13 illustrerer de kombinerede virkninger af spænding, pixelbotid og stråleintensitet. Konventionel praksis tyder på, at en kombination af lavspænding, kort opholdstid og lav stråleintensitet er nødvendig for optimal billeddannelse og for at forhindre stråleskader på prøveblokken. I modsætning til disse indstillinger illustrerer figur 11, figur 12, figur 13, at højere spændinger (f.eks. 7 kV), længere opholdstider (32 μs/px) og højere stråleintensiteter (indstilling 6 i vores tilfælde) kan producere overlegen billedkvalitet i forhold til konventionelle indstillinger.

SBF-SEM giver mulighed for indsamling af serielle elektronmikroskopibilleder, der kan indsamles som et 3D-datasæt bestående af voxels. Selvom dette er en utrolig kraftig brug af SBF-SEM, giver denne metode også mulighed for hurtig og repeterbar billeddannelse af sjældne biologiske hændelser eller celler. Billederhvervelse ved hjælp af SBF-SEM kan overvåges for sjældne hændelser, og billedbehandling standsede for at indsamle billeder af højere forstørrelse/opløsning af disse hændelser. Desuden kan blokken fjernes fra mikroskopkammeret og blokfladen, der er sektionsopdelt til transmissionselektronmikroskopi (TEM). På denne måde kan store datasæt af sjældne hændelser indsamles ved hjælp af SBF-SEM samt værdsættes på angstromskalaen ved hjælp af TEM.

Figure 1
Figur 1: SBF-SEM- og TEM-sammenligninger på forskellige trin i protokollen. Denne protokol indeholder flere trin, hvor prøvevæv er farvet med tungmetaller. Dette påvirker ikke kun vævskontrast og påskønnelse af cellulære strukturer og organeller, men også de opladningsniveauer, der opstår, når vævet afbildes. Dette tal indeholder tre forskellige visninger af forberedt væv: en lav forstørrelsesvisning (A, D & G), en høj forstørrelsesvisning (B, E & H) og en TEM-sammenligning af tilberedt muse hornhinde (C, F & I). Det kan bemærkes, at højere forstørrelsesbilleder kan resultere i øget vævsopladning, da elektronstrålen er koncentreret i et mindre vævsområde. Den øverste række (A-C) er en repræsentativ prøve fra væv, der er forarbejdet ved afslutningen af trin 1.8, og er imprægneret med kaliumferrocyanid, osmiumtetrioxid og thiocarbohydrazid. Pilene i de to første kolonner viser epitel-stromal interface som et referencepunkt. Bemærk det lave kontrastniveau i forhold til de nederste to rækker samt de øgede niveauer af vævsopladning. Prøven i den midterste række (D-F) blev behandlet ved afslutningen af trin 1.10 og nyder godt af et ekstra osmium tetroxidtrin og er synligt mere kontrasteret end prøven i øverste række. Mens cellulære strukturer er mærkbare, er opladning stadig til stede. Prøven i nederste række (G-I) nyder godt af den fulde farvningsprotokol og har minimal vævsopladning. TEM imaging afslører væv kontrast niveauer formidles af tungmetaller til stede på hvert trin (højre kolonne): organeller i hornhinden endotel (*) er mere kontrasterende og synlige som vævsbehandling fortsætter gennem protokollen. Derudover stromal kollagen og fibrillin detaljer bliver mere synlige (pilespids), som protokollen er afsluttet. Panel A, D & G skala bar = 50 μm. Panel B, E & H skala bar = 10 μm. Panel C, F & I skala bar = 1 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk over indlejret vævsblok, prøvestift og endelig forberedelse. (A) Væv skal placeres i en kendt retning på selve spidsen af harpiksformen og den øverste tredjedel af formen fyldt med carbon black mættet harpiks. Regionen af formen længst væk fra vævet bør forblive klar, så eksperimentetiketten tydeligt kan ses. (B) Prøvenålens overflade skal ridses for at frembringe et gittermønster, hvilket giver mulighed for et større kontaktområde for cyanoacrylatlimen til hærdning mellem den forberedte prøveblok og pin. (C) Den kulsorte mættede harpiks bør være i stor kontakt med prøvestifthovedet, men det område, der skæres af diamantkniven, må ikke være større end 1x1 mm. Det er god praksis at tilspidse blokken mod spidsen. Dette minimerer skærekræfterne på diamantkniven, og ved at have en bredere base er blokken mere modstandsdygtig over for adskillelse fra stiften under sektionsskæringen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning afbilledoptagelsesindstillinger. Panel A blev oprettet ved hjælp af en 32 μs/pixel dvæle tid ved 4 kV og lider af en formindsket signal til støj-forholdet, som det fremgår af "kornet" udseende af det forstørrede indsættende. Panel B blev oprettet ved hjælp af en 100 μs/pixel-opholdstid ved 4 kV. Forøgelse af pixel dvæle tid øger signalet til støj-forholdet og afslører et øget niveau af cellulære detaljer, men øget pixel dvæle tid har potentiale til at føre til væv opladning og / eller varme ophobning, som blødgør blokken og introducerer skære artefakter (snak) ved sektionsopskæring. Panel C og D sammenligner billeder, der er taget under identiske eksponeringsforhold, men med to forskellige stråle kV-værdier. Væv i disse paneler var imprægneret med guld-tonet nanogold partikler for at gøre forskelle i stråle-penetration dybder mere synlige. Panel C blev taget til fange ved 9 kV, mens panel D blev taget til fange ved 21 kV. Øget kV har den fordel, at kontrasten (D) øges, men detaljer går tabt som følge af indsamling af elektroner fra en større dybde af væv (C). Som et resultat af prøveudtagningen af et større tværsnit er et større antal immunmogoldpartikler, der er specifikke for GAP 43, synlige, mens ikke-specifik mærkning forbliver den samme, hvilket resulterer i et øget signal-til-støj-forhold. Panel A & B skala bar = 2 μm. Panel C & D skala bar = 1 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Stråleintensitet, kV og punktstørrelse. Dråbeformen er en funktion af vævstæthed og tungmetalbegæjdning sammen med stråleenergi og elektronstrålens hældningsvinkel43. Mens røntgenstråler, sneglelektroner og tertiære elektroner produceres under SBF-SEM-billeddannelse, er den primære bekymring med backscattered (mørkeblå) og sekundære (grønne) elektroner13. Det billede, der produceres med SBF-SEM billeddannelse er produceret ved at indsamle backscattered elektroner. Disse elektroner stammer fra elastiske interaktioner mellem strålen og prøven, og det indsamlede signal er stærkt afhængigt af atomantallet af atomer, der interageres med - derfor er der behov for tungmetalbegring44. Sekundære elektroner stammer fra inelastiske interaktioner mellem strålen og prøven, og detektionen af deres signal afhænger i høj grad af overfladeretning. Da blokfladen er flad i SBF-SEM, bidrager sekundære elektroner ikke meningsfuldt til det indsamlede signal13. Faktisk kan sekundær elektronakkumulering på overfladen af blokken være en vigtig kilde til opladning og har en skadelig effekt på billedkvaliteten2. (B) Denne graf viser forholdet mellem stråleintensitet, stråle kV og staffagestørrelse. Staffagestørrelsen er strålens rumlige opløsning og bestemmer opløsningsgrænsen for de billeder, der produceres. Sænkning kV øger spotstørrelsen, men reducerer også billeddybden, hvilket giver mulighed for en finere forståelse af detaljer. Dette har også den virkning, at det påviselige signal mindskes. Stigende stråleintensitet giver en indledende forbedring af stedets størrelse og signaldetektering, men øger hurtigt niveauet af vævsopladning. I sidste ende er de valgte stråleintensitets- og kV-værdier stikprøveafhængige og bedst bestemmes empirisk i forhold til det videnskabelige spørgsmål, der stilles. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Elastin-fri mikrofibril bundt netværk i musen hornhinden. Mikrofibrillerne kan ses ved siden af, og i nogle tilfælde inden for lavvandede riller i, hornhinde keratocytter (pile) (A). Dette netværk af elastin-fri mikrofibriller er organiseret i forskellige lag inden for hornhinden stroma (B). Skalastang = 2 μm. Den rekonstruerede billedblok er 45x45 μm i x & y aksen og 30 μm i z-aksen med voxel en opløsning på 22x22x100 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Rekonstruktion af hornhindenerver, der passerer gennem basal lamina ved den stromale epitelkant. Denne nerve kan ses at bifurcate før penetration. Efter at have trænge ind i epitelet gennemgik begge nervegrene forgrening. Mitokondrier (gul) er synlige i de stromale og epiteldele af nervebundtet. Skalastang = 2,5 μm. Den rekonstruerede billedblok er 25x25 μm i x & y aksen og 14 μm i z-aksen med en voxelopløsning på 12x12x100 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Limbal vaskulatur og tilhørende celler i den perifere muse hornhinde. Et enkelt billede (A) fra en 3D-billedblok (B) kan ses, hvorigennem et fartøj, nervebundt og tilknyttede celler rejser. Panel C viser et rekonstrueret fartøj (rødt) med en tilhørende pericyte (grå) viklet rundt om det, der dækker endotelcellekrydsene. En nerve bundt (blå) bifurcates i nærheden af dette fartøj, da det rejser gennem vævet. En neutrofil (gul) kan ses parallelt med den lange akse af fartøjet, med sin polymorfe kerne synlig i sin celle krop og den efterfølgende uropod synlig som et fremspring mod højre for billedet. En mastcelle (magenta) er synlig på undersiden af beholderen. Panel D isolerer denne mastcelle, hvor dens granulater (grøn) lettere kan ses overlejring af kernen (lilla) i cellen. Panel E fremhæver de cellulære strukturer overlejret på de cellulære rekonstruktioner, med endotelkerner betegnet i blåt, og vedhængende mikropartikler synlige i fartøjet lumen (orange). Pile viser cellecellekanter mellem endotelceller, som yderligere kan ses som hævede højderygge, der strækker sig langs cellerne på fartøjets lysside. Panel A skala bar = 2 μm. Den billedblok, der bruges til at rekonstruere disse celler, er 30x30 μm i x & y-aksen og 42,5 μm i z-aksen med en voxelopløsning på 14,6x14,6x100 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8:Rekonstrueret vaskulært netværk af det ikke-menneskelige primat nethinde nervefiberlag. (A) Et SBF-SEM-billede på 200x200 μm af primathinden taget ved 8192x8192 px. Placeringen stikprøven er ~ 500 mikron fra ringere tidsmæssige fælg margin af et sundt øje uden patologi. Billedserien rekonstrueret i paneler C &D blev taget på 2048x2048 px, med billedbehandling standset, så regioner af interesserede kunne afbildes på 8192x8192 px. Panel B er det indbyggede område i panel A, der er taget direkte fra det oprindelige billede. Bemærk det store antal axoner og deres mitokondrier. (C) Ortoslice sektion gennem en 200x200x200 μm væv volumen af en kontrol øje ringere tidsmæssige nerve fiber lag, med vaskulatur segmenteret. (D) Z-projektion af nervefiber lag vaskulatur. Denne serie illustrerer den mulige opløsning på et stort område ved hjælp af denne metode. Panel A skala bar = 20 μm. Panel B skala bar = 2 μm. Voxel-opløsningen i billedserien er 97,6 x 97,6 x 500 nm. Pixelopløsningen for området af interesse er 24,4 x 24,4 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Segmentering og 3D-volumengengivelse af fartøjer i den gigantiske danio (Devario malabaricus) kompakt hjerte. (A) Todimensionel mikrograf i en billedstak, der viser profilen af en central venularstørrelse fartøj (pil) og en endotelkerne (pilespids), med omkringliggende hjerte myocytter rig på mitokondrier og velorganiserede sarkomenter (*). (B) Todimensionel mikrograf af billedstakken med en kapillærstørrelsesbeholder (pil). (C) Biorthogonale fremskrivninger af mikrografstakken, der viser kapillæren i panel B projiceret gennem en ortogonal skive. (D) 3D-gengivelse af segmenterede endotelceller, der forer det rekonstruerede fartøj. Illustreret i grøn, rød, blå og lilla er fire separate endotelceller; Den endotelcelle, der er afbildet med blåt, kan ses i tværsnit i panel B (pil), mens de endotelceller, der er afbildet med rødt (pil) og grønt (pilespids), ses i tværsnit i panel A. Panel A & B skala bar = 2 μm. Den rekonstruerede billedblok er 30x30 μm i x & y-aksen og 16 μm i z-aksen med en voxelopløsning på 14,6x14,6x100 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: Billedkomplikationer og artefakter. (A) Billedets bølgede og forvrængede karakter er resultatet af billeddannelse ved hjælp af en pixelbotid, der er for lang. Dette opvarmer harpiksblokken og efterlader blokfladen blød og gummiagtig, hvilket resulterer i et forvrænget billede ved skæring. (B) Dette billede indeholder et væld af artefakter. Stjernen angiver en bølget forvrængning forårsaget af forudgående billeddannelse ved en højere forstørrelse og ligner panel A, koncentrere strålen på et mindre område med en længere pixel dvæle tid har blødgjort harpiksen i denne region af interesse. Mens den højere forstørrelse indsamlet billede var fri for artefakter, kan dette føre til en efterfølgende serie af billeder, hvor prøven underliggende regionen af interesse synes forvrænget. Dette panel illustrerer også spørgsmålet om akkumulering af snavs på blokfladen (pilen) under billedbehandling, også angivet med pilen i panel E. Hvis dette bliver et vedvarende billedproblem, vil det være nødvendigt at bryde vakuumet, åbne kammeret og blæse affald, der er akkumuleret på diamantkniven og omkring prøven. Små udladninger af elektroner fra blokfladen kan føre til de hurtige kontrastændringer og linjer, der er angivet med den hvide pilespids. (C) Dette billede illustrerer kniv ridser på blokken ansigt. Dette kan forekomme på grund af en beskadiget kniv eller affaldsakkumulering på kanten af kniven. (D) Den artefakt, der er angivet (pilen), er et resultat af elektronstrålen, der er fokuseret på (uden at dele) blokfladen i en længere periode, hvor prøven stadig er i billedkammeret. (E) Forkert fiksering af væv kan føre til adskillelse af cellestrukturer og bindevæv (*). (F) Hvis der opstår en stor mængde opladning i dit væv eller harpiksblok, kan der forekomme efterfølgende akkumulering og udledning, hvilket fører til, at billedet "springer over", som det ses på dette billede. Bemærk forvrængningen af vævet i billedet ved disse springpunkter (pile). Panel A skala bar = 1 μm. Panel B skala bar = 2 μm. Panel C skala bar = 5 μm. Panel D skala bar = 2 μm. Panel E skala bar = 25 um. Panel F skala bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11:Billedvæv ved 3 kV ved hjælp af forskellige pixelboetider og stråleintensiteter. Alle billeder indsamlede ved hjælp af en 3 kV-stråle, stråleintensiteten er på en enhedsspecifik skala fra 1 til 20. Feltet afbildet er af vaskulære lumen indeholder hvide og røde blodlegemer. På denne lave kV er det svært at sætte pris på cellulære detaljer. Forøgelse af pixel dvæle tid havde ringe effekt. Stigende stråleintensitet til 6 forbedret billedkontrast. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 12
Figur 12: Billedvæv ved 7 kV ved hjælp af forskellige pixelboetider og stråleintensiteter. Alle billeder blev indsamlet ved hjælp af en 7 kV stråle, stråleintensitet er på en enhedsspecifik skala fra 1 til 20. Feltet afbildet er af vaskulære lumen indeholder hvide og røde blodlegemer. Ved 7 kV bidrog stigende stråleintensitet og pixelboetid til billedbehandling af højere kvalitet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 13
Figur 13: Billedvæv ved 12 kV ved hjælp af forskellige pixelboetider og stråleintensiteter. Alle billeder blev indsamlet ved hjælp af en 12 kV stråle, stråleintensitet er på en enhedsspecifik skala fra 1 til 20. Feltet afbildet er af vaskulære lumen indeholder hvide og røde blodlegemer. Ved 12 kV optimeres billeddannelsen ved at justere pixelboetid og stråleintensitet. Opladningen reduceres/fraværende på kortere pixelbotider, mens cellulære detaljer og billedkontrast er bedst med en længere pixel dvæletid og højere stråleintensitet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Formålet med denne metode papir er at fremhæve væv forberedelse og billeddannelse metode, der har gjort det muligt for vores laboratorium til pålideligt at fange høj opløsning seriel elektron mikroskopi billeder, og at påpege kritiske skridt, der fører til dette resultat samt potentielle faldgruber, der kan opstå, når de udfører SBF-SEM billeddannelse. Succes med at bruge denne protokol kræver korrekt fiksering af væv, imprægnering af tungmetaller i prøven, modifikationer af indlejringsharpiksen for at reducere opladningen samt en forståelse af de mikroskop- og billedindstillinger, der bruges til at indsamle billeder. Maksimen " kvalitet ind, kvalitet ud" er et passende aksiom til SBF-SEM-billeddannelse. Da målet med SBF-SEM ofte er opskrivning eller kvantificering af ultrastrukturelle detaljer, skal der udvises ekstra omhu for fikseringsstrategi for at sikre, at vævsforvrængning ikke forekommer. Hvis væv bliver forvrænget på noget tidspunkt i forberedelsen af prøver (dvs. undergår hævelse, krympning eller forstyrrelse af cellulær morfologi), vil vævsrekonstruktion og kvantisering ikke give nøjagtige data. Desuden kan brugen af forkerte billedindstillinger føre til tab af data, der ikke kan generobres, da SBF-SEM-billedbehandling er en destruktiv proces. Derudover skal der udvises forsigtighed ved pålæsning af en vævsprøve, da den sarte diamantkniv kan blive beskadiget af forhastet eller forkert prøveforberedelse. Dette kan resultere i spåner eller brud i kniven, som kan efterlade synlige ridser i billeder (Figur 10C). Diamantkniven kan også blive beskadiget af forkalkede strukturer, hårde granulater eller ved et uheld indlejret glas (f.eks. fra reagensforstærkere).

Mens størstedelen af SBF-SEM litteratur til dato bruger stråle acceleration spændinger i intervallet 1 til 3 kV sammen pixel dvæle gange tættere på 1-5 μs/px (Figur 11)45,46,47,48,49, bruger den aktuelle protokol accelerationsspændinger på 7-12 kV og en pixelbobetid på 12 μs/px til seriebilleddannelse og 32 μs/px til billedbehandlingsområder af interesse (Tal 12 &13). Disse indstillinger, kombineret med en skivetykkelse på 100-200 nm giver mulighed for høj kvalitet og høj opløsning billeddannelse af en bred vifte af biologisk væv. Øget acceleration spænding giver mulighed for en stigning i kontrast, opløsning, samt signal-til-støj-forholdet. Øget opholdstid øger yderligere opløsningen og signal-til-støj-forholdet, mens øget skivetykkelse fører til nedsat opladning på blokoverfladen under sektionsudsnit og bekæmper stråleinduceret skade i efterfølgende billeder14. Selvom denne billedbehandlingsmetode kan afvige fra konventionerne, taler de producerede billeder og datasæt for sig selv. Hvis vi skulle spekulere på årsagen til denne succes, er det muligt, at det er et resultat af vores unikke kombination af høje kV-værdier, længere pixel dvæletider og blokforberedelse. Øget billeddiagnostik kV resulterer i en øget interaktion volumen mellem elektronstrålen og prøven. Denne interaktion volumen er både dybere såvel som bredere resulterer i en teoretisk stigning i antallet af elektroner opdaget, der stammer fra dybere inde i prøven blok, eller fra et bredere tværsnit af væv som stedet størrelse teardrop stiger i diameter. Da SBF-SEM er interesseret i blokkens overfladedetaljer, resulterer dette i et teoretisk fald i signal-til-støj-forholdet. Stigningen i kV skubber imidlertid også elektroner dybere ind i prøven, hvor de er mindre tilbøjelige til at undslippe blokken og bidrage til de elektroner, der indsamles af detektoren. Med den ekstra fordel af et øget signal via længere pixelboetider og højere stråleintensitet er det muligt, at denne billeddannelsesmetode resulterer i en større stigning i signalet fra prøveoverfladen i forhold til støj, der stammer fra interaktionsvolumenet. Derudover hjælper den øgede prøveledningsevne, der introduceres med carbon black samt sølv- og guldbelægning, med at forbedre ladningsopbygningen, som nu forekommer dybere inde i blokken og længere væk fra blokfladen. Faktisk Figur 11, Figur 12, Figur 13 viser, at efterhånden som kV øges, begynder prøveopladningen at falde, da den potentielt skubbes dybere ind i blokken. Prøver, der afbildes ved lav forstørrelse, kan udtages med tilstrækkelig kontrast ved hjælp af de konventionelle indstillinger, men disse billeder mangler ofte detaljer ved nøje inspektion. Vores data viser tydeligt, at når du bruger relativt høj forstørrelse, hvor målet er cellulære detaljer, kan det give ekstraordinære resultater at øge de konventionelle indstillinger. Artiklen fra 2020 af P. Goggin, et al. giver en nyttig tabel, der skitserer effekten af at ændre billedindstillinger på den endelige billedkvalitet, og er en nyttig reference til at konsultere, hvis optimering af protokollen for nyt væv bliver nødvendig14. Den tykkelse på 100-200 nm skive, der anbefales i denne protokol, har den ekstra fordel, at den giver mulighed for at indsamle store SBF-SEM-datasæt hurtigt. Under indsamling af billeder ved 12μs/px for eksempel kræver billeddannelse gennem en 100 μm dybde ved 2048x2048 px ~ 14 timer, mens de sektionsopdelt ved 100nm / sektion, men ville kræve ~ 56 timer, hvis sektion ved 25nm / sektion. Mens x,y opløsning forbliver uændret som følge af sektionstykkelse, der ikke tager højde for den ekstra evne til at billedet ved hjælp af højere kV-værdier og pixelbosættelsestider, der følger med større sektioner, er det vigtigt at bemærke, at opløsningen langs z-aksen lider. Tabet af z-opløsning er en vigtig overvejelse og bør overvejes, når det besluttes, hvordan væv skal orienteres i harpiksblokken og i forhold til billedplanet, og har potentiale til at udelukke undersøgelse af mindre cellefunktioner eller interaktioner (f.eks. synaptiske invaginationer eller intracellulære træk på skalaen af snesevis af nanometer). Men ud over hurtig billedbehandlingstid har denne protokol yderligere ekstra fordele ved, at den hurtigt producerer ideelle datasæt til stereologiske analyser samt undersøgelse af sjældne biologiske hændelser eller celler. Større sektionstykkelse kan også hjælpe med manuel 3D-rekonstruktion, da en 100 μm region opdelt ved 100 nm / sektion ville kræve manuel segmentering af 1.000 billeder, mens den samme region opdelt ved 25 nm / sektion ville kræve manuel segmentering af 4.000 billeder.

SBF-SEM har den fordel, at der genereres store datasæt på relativt kort tid. Mens dataanalyse kan udføres ved hjælp af kvantitative metoder som stereologi, som vil blive diskuteret nedenfor, kan det ofte være informativt at skabe 3D-rekonstruktioner via billedsegmentering. En billedstak skabt ved hjælp af SBF-SEM kan opfattes som en samling af voxels, mens segmentering er processen med at tildele disse voxels til brugerdefinerede objekter og derved skabe 3D-repræsentationer af vævsstrukturer. Disse rekonstruktioner giver ofte et hidtil uset perspektiv på vævets ultrastruktur og cellecelleinteraktion (Figur 5, Figur 6, Figur 7, Figur 8, Figur 9). Når rekonstruktionerne er oprettet, er det desuden muligt at anvende data, der er forbundet med rekonstruktionerne, til at udtrække et væld af oplysninger fra segmenteret væv. Parametre, der spænder fra overfladeareal, volumen, længde og afstand samt kantede data, er alle let tilgængelige, når en rekonstruktion er oprettet50,51. Selvom dette kan være utroligt nyttigt, især når det kombineres med videoer og billeder trukket fra rekonstruerede datasæt, er den tid, der kræves til manuel segmentering, en vigtig overvejelse, når man forsøger at ekstrapolere data fra SBF-SEM-datasæt. Der er i øjeblikket et væld af både gratis og købsbar software til rådighed for manuel og semi-manuel segmentering af SBF-SEM billedstakke. En gratis mulighed for genopbygning software er billedbehandling pakke Fiji for ImageJ, en open source billedbehandling program, som indeholder en segmentering editor plugin, der giver mulighed for manuel segmentering52,53. Derudover tilbyder softwaren Reconstruct en alternativ gratis segmenteringsmulighed54 (Figur 8). Selvom potentielt dyre, købsmuligheder ofte indeholder mere robuste funktionssæt, såsom halvautomatiske segmenteringsprocesser eller film- og billedoprettelsespakker. En sådan mulighed blev brugt til at oprette de rekonstruktioner, der findes i figur 5, figur 6, figur 7 og figur 9 (nærmere oplysninger i materialeoversigten). Derudover er der værktøjer til oprettelse, analyse og gengivelse af kontrastbaserede 3D-rekonstruktioner ved hjælp af virtual reality med potentiale til i høj grad at fremskynde genopbygningsprocessen20,55. Selvom det ikke altid er tilgængeligt for alle applikationer, er et væld af softwareværktøjer tilgængelige til computerassisteret manuel segmentering, som har potentiale til i høj grad at reducere dentid,der kræves til segmentering56,57,58. Uanset hvilken software der anvendes, bør betydelig omtanke og en forståelse af det spørgsmål, der besvares, eller hul i viden, der skal udfyldes, af serielle rekonstruktioner forud segmentering, da processen er besværlig og tidskrævende.

Produktionen af 3D-rekonstruktioner kommer med sine egne overvejelser. Med større datasæt kan processorkraft være en begrænsende faktor, og derfor kan optimering af brugen af systemressourcer være afgørende for at opretholde en produktiv arbejdsgang og fremskynde genopbygnings- og gengivelsesprocessen. Når du gengiver en 3D-rekonstruktion, konverterer de fleste programmer segmenterede billedstakke til en overflade, der består af sammenkoblede trekanter. Hvis et genopbygningsprojekt er stort eller indviklet, kan gengivelsen af disse trekanter kræve en stor computerkraft. Mens du arbejder på en 3D-rekonstruktion, kan det være nyttigt at begrænse antallet af trekanter, som genopbygningssoftwaren kan bruge til at konvertere de segmenterede billeder til rekonstruerede overflader. Dette kan være nyttigt til overvågning af udviklingen i en 3D-rekonstruktion under segmenteringsprocessen. Når segmentering er færdig, kan trekantsgrænsen fjernes, før du gengiver billeder eller videoer af rekonstruktioner. Alternativt, og hvis genopbygningssoftwaren tillader det, har vi fundet succes med at overvåge udviklingen af en genopbygning ved hjælp af volumengengivelse snarere end overfladegenerering. Volumengengivelse, selvom den ikke er så velegnet til billeder eller videoer beregnet til offentliggørelse eller præsentation, kræver langt mindre processorkraft og kan som sådan være nyttig til at give en glat oplevelse, når du rekonstruerer og forbereder billeder og videoer af rekonstruktioner. Derudover er det bedste fremgangsmåde, når du manuelt segmenterer et SBF-SEM-datasæt for at definere alle objekter, der skal rekonstrueres med deres eget entydige id. Hvis et felt af epitelceller f.eks. rekonstrueres i stedet for at tildele alle epitelceller til en voxelgruppe med titlen "epitel", skal hver epitelcelle tildeles sit eget øgenavn (dvs. Epi1, Epi2, Epi3 osv.). Dette giver større frihed, når rekonstruktionen er færdig, da hver celle enten kan inkluderes eller udelukkes fra den endelige gengivelse, tildeles forskellige farver eller transparenter eller fjernes eller introduceres individuelt, hvis der produceres en video. Desuden gør dette det muligt at indsamle målinger som overfladeareal eller volumen fra hvert rekonstrueret objekt i stedet for objektgruppen som helhed.

Et andet utroligt kraftfuldt værktøj til udvinding af kvantitative data fra SBF-SEM-billedstakke er praksis med stereologi. Stereologi udnytter de iboende matematiske relationer mellem tredimensionelle objekter og deres todimensionelle repræsentationer (dvs. elektronmikrografer). SBF-SEM-datasæt er ideelle til anvendelse af stereologi, da denne metode til udvinding af 3D-oplysninger fra store datasæt er betydeligt mindre tids- og arbejdskrævende sammenlignet med segmenteret rekonstruktion. Stereologi består generelt i at anvende geometriske gitre på tilfældige, ensartet samplede billeder og er blevet anvendt i vid udstrækning i løbet af de sidste 50 år for at producere nøjagtige og upartiske skøn over celle/organelletal, længde, overfladeareal og bind21,59,60,61,62,63. Mens 3D-rekonstruktioner kan være imponerende og give et nyt perspektiv på biologisk væv, er det ofte hurtigere, mere præcist, reproducerbart og befordrende for store prøvestørrelser at bruge en stereologisk tilgang til dataudtrækning. Mens der er mange papirer diskuterer den praktiske anvendelse af stereologi64,65,66, en række lærebøger giver nyttige, dybdegående oversigter over metoden samt give en række stereologiske net, som kan anvendes til studiet af væv ultrastruktur67,68,69.

SBF-SEM er en kraftfuld billeddannelse metode, der giver mulighed for tre-dimensionelle påskønnelse af væv ultrastruktur. Mens evnen til at skabe 3D-datasæt med SEM-opløsning sætter tidligere ubesvarlige spørgsmål inden for vores rækkevidde, er korrekt vævsforberedelse og en forståelse af SBF-SEM-billeddannelse altafgørende for succesen af undersøgelser, der bruger denne mikroskopimetode. Det er vores håb, at anvendelsen af denne protokol på fremtidige undersøgelser vil føre til større og større indsigt i de biologiske mysterier, der omgiver os, og fortsætte med at skubbe os længere ind i grænserne for menneskelig viden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Dr. Sam Hanlon, Evelyn Brown og Margaret Gondo for deres fremragende tekniske bistand. Denne forskning blev delvist støttet af National Institutes of Health (NIH) R01 EY-018239 og P30 EY007551 (National Eye Institute), dels af Lion's Foundation for Sight, og dels af NIH 1R15 HD084262-01 (National Institute of Child Health &Human Development).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/16 x 3/8 Aluminum Rivets Industrial Rivet & Fastener Co. 6N37RFLAP/1100 Used as specimen pins.
2.5mm Flathead Screwdriver Wiha Quality Tools 27225
Acetone Electron Microscopy Sciences RT 10000 Used to dilute silver paint.
Aspartic Acid Sigma-Aldrich A8949
Calcium Chloride FisherScientific C79-500
Conductive Silver Paint Ted Pella 16062
Denton Desk-II Vacuum Sputtering Device equipped with standard gold foil target Denton Vacuum N/A This is the gold-sputtering device used by the authors, alternates are acceptable.
Double-edged Razors Fisher Scientific 50-949-411
Embed 812 Electron Microscopy Sciences 14120
Gatan 3View2 mounted in a Tescan Mira3 Field emission SEM Gatan & Tescan N/A This is the SBF-SEM device used by the authors, alternates are acceptable.
Glass Shell Vials, 0.5 DRAM (1.8 ml) Electron Microscopy Sciences 72630-05
Gluteraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320
Gorilla Super Glue - Impact Tough NA NA Refered to as cyanoacrylate glue in text.
Ketjen Black HM Royal EC-600JD Refered to as carbon black in text.
KOH FisherScientific 18-605-593
Lead Nitrate Fisher Scientific L62-100
Microwave Pelco BioWave Pro This is the microwave used by the authors, alternates are acceptable.
Osmium Tetroxide Sigma-Aldrich 201030
Potassium Ferrocyanide Sigma-Aldrich P9387
Silicone Embedding Mold Ted Pella 10504
Sodium Cacodylate Trihydrate Electron Microscopy Sciences 12300
Samco Transfer Pipette ThermoFisher Scientific 202 Used to make specimen pin storage tubes.
Swiss Pattern Needle Files Electron Microscopy Sciences 62115
Thiocarbohydrazide Sigma-Aldrich 223220
Uranyl Acetate Polysciences, Inc. 21447-25
Reconstruction Software
Amira Software Thermo Scientific N/A Used to create the reconstructions found in figures 5-7 and 9.
Fiji (Fiji is Just ImageJ) ImageJ.net N/A TrakEM2 can be added to Fiji to asist in manual segmentation.
Microscopy Image Browser (MIB) University of Helsinki, Institute of Biotechnology N/A
Reconstuct Software Neural Systems Lab N/A
SuRVoS Workbench Diamond Light Source & The University of Nottingham N/A
SyGlass IstoVisio, Inc. N/A Allows for reconstruction in virtual reality and histogram-based reconstruction methods.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).
  2. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLOS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  3. He, Q., Hsueh, M., Zhang, G., Joy, D. C., Leapman, R. D. Biological serial block face scanning electron microscopy at improved z-resolution based on Monte Carlo model. Scientific Reports. 8 (1), 12985 (2018).
  4. Zankel, A., Wagner, J., Poelt, P. Serial sectioning methods for 3D investigations in materials science. Micron. 62, 66-78 (2014).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43 (5), 612-620 (2012).
  7. Bouwer, J. C., et al. Deceleration of probe beam by stage bias potential improves resolution of serial block-face scanning electron microscopic images. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2 (1), 11 (2017).
  8. Kizilyaprak, C., Longo, G., Daraspe, J., Humbel, B. M. Investigation of resins suitable for the preparation of biological sample for 3-D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 189 (2), 135-146 (2015).
  9. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  10. Biazik, J., Vihinen, H., Anwar, T., Jokitalo, E., Eskelinen, E. L. The versatile electron microscope: an ultrastructural overview of autophagy. Methods. 75, 44-53 (2015).
  11. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  12. Piňos, J., Mikmeková, Š, Frank, L. About the information depth of backscattered electron imaging. Journal of Microscopy. 266 (3), 335-342 (2017).
  13. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
  14. Goggin, P., et al. Development of protocols for the first serial block-face scanning electron microscopy (SBF SEM) studies of bone tissue. Bone. 131, 115107 (2020).
  15. Deerinck, T. J., et al. High-performance serial block-face SEM of nonconductive biological samples enabled by focal gas injection-based charge compensation. Journal of Microscopy. 270 (2), 142-149 (2018).
  16. Nguyen, H. B., et al. Conductive resins improve charging and resolution of acquired images in electron microscopic volume imaging. Scientific Reports. 6, 23721 (2016).
  17. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. National Center for Microscopy and Imaging Research. 6 (8), (2010).
  18. Deerinck, T. J., et al. Enhancing Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Enable High Resolution 3-D Nanohistology of Cells and Tissues. Microscopy and Microanalysis. 16, 1138-1139 (2010).
  19. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  20. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy: A provocative technique to define 3-dimensional ultrastructure of microvascular thrombosis. Thrombosis Research. 196, 519-522 (2020).
  21. Courson, J. A., et al. Serial block-face scanning electron microscopy reveals neuronal-epithelial cell fusion in the mouse cornea. PLoS One. 14 (11), 0224434 (2019).
  22. Lafontant, P. J., et al. Cardiac Myocyte Diversity and a Fibroblast Network in the Junctional Region of the Zebrafish Heart Revealed by Transmission and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. PLoS One. 8 (8), 72388 (2013).
  23. Hanlon, S. D., Behzad, A. R., Sakai, L. Y., Burns, A. R. Corneal stroma microfibrils. Experimental Eye Research. 132, 198-207 (2015).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  25. Davenport, A. T., Grant, K. A., Szeliga, K. T., Friedman, D. P., Daunais, J. B. Standardized method for the harvest of nonhuman primate tissue optimized for multiple modes of analyses. Cell Tissue Bank. 15 (1), 99-110 (2014).
  26. Schuster, A., et al. An isolated perfused pig heart model for the development, validation and translation of novel cardiovascular magnetic resonance techniques. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 12 (1), 53 (2010).
  27. Hanlon, S. D., Patel, N. B., Burns, A. R. Assessment of postnatal corneal development in the C57BL/6 mouse using spectral domain optical coherence tomography and microwave-assisted histology. Experimental Eye Research. 93 (4), 363-370 (2011).
  28. Longiéras, N., Sebban, M., Palmas, P., Rivaton, A., Gardette, J. L. Multiscale approach to investigate the radiochemical degradation of epoxy resins under high-energy electron-beam irradiation. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 44 (2), 865-887 (2006).
  29. Hashimoto, T., Thompson, G. E., Zhou, X., Withers, P. J. 3D imaging by serial block face scanning electron microscopy for materials science using ultramicrotomy. Ultramicroscopy. 163, 6-18 (2016).
  30. Rouquette, J., et al. Revealing the high-resolution three-dimensional network of chromatin and interchromatin space: A novel electron-microscopic approach to reconstructing nuclear architecture. Chromosome Research. 17 (6), 801 (2009).
  31. Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
  32. Katoh, K. Microwave-Assisted Tissue Preparation for Rapid Fixation, Decalcification, Antigen Retrieval, Cryosectioning, and Immunostaining. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016, 7076910 (2016).
  33. Login, G. R., Dvorak, A. M. A review of rapid microwave fixation technology: its expanding niche in morphologic studies. Scanning. 15 (2), 58-66 (1993).
  34. Jamur, M. C., Faraco, C. D., Lunardi, L. O., Siraganian, R. P., Oliver, C. Microwave fixation improves antigenicity of glutaraldehyde-sensitive antigens while preserving ultrastructural detail. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 307-311 (1995).
  35. Leong, A. S., Sormunen, R. T. Microwave procedures for electron microscopy and resin-embedded sections. Micron. 29 (5), 397-409 (1998).
  36. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  37. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  38. Belazi, D., Solé-Domènech, S., Johansson, B., Schalling, M., Sjövall, P. Chemical analysis of osmium tetroxide staining in adipose tissue using imaging ToF-SIMS. Histochemistry and Cell Biology. 132 (1), 105-115 (2009).
  39. Rivlin, P. K., Raymond, P. A. Use of osmium tetroxide-potassium ferricyanide in reconstructing cells from serial ultrathin sections. Journal of Neuroscience Methods. 20 (1), 23-33 (1987).
  40. Aguas, A. P. The use of osmium tetroxide-potassium ferrocyanide as an extracellular tracer in electron microscopy. Stain Technology. 57 (2), 69-73 (1982).
  41. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  42. Watson, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. II. Application of solutions containing lead and barium. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 4 (6), 727-730 (1958).
  43. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy. Scanning Microscopy in Nanotechnology. , 1-40 (2006).
  44. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  45. Buchacker, T., et al. Assessment of the Alveolar Capillary Network in the Postnatal Mouse Lung in 3D Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Frontiers in Physiology. 10, 1357 (2019).
  46. Keeling, E., et al. 3D-Reconstructed Retinal Pigment Epithelial Cells Provide Insights into the Anatomy of the Outer Retina. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), (2020).
  47. Shang, P., et al. Chronic Alcohol Exposure Induces Aberrant Mitochondrial Morphology and Inhibits Respiratory Capacity in the Medial Prefrontal Cortex of Mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 561173 (2020).
  48. Pfeifer, C. R., et al. Quantitative analysis of mouse pancreatic islet architecture by serial block-face SEM. Journal of Structural Biology. 189 (1), 44-52 (2015).
  49. Wilke, S. A., et al. Deconstructing complexity: serial block-face electron microscopic analysis of the hippocampal mossy fiber synapse. Journal of Neuroscience. 33 (2), 507-522 (2013).
  50. Cocks, E., Taggart, M., Rind, F. C., White, K. A guide to analysis and reconstruction of serial block face scanning electron microscopy data. Journal of Microscopy. 270 (2), 217-234 (2018).
  51. Borrett, S., Hughes, L. Reporting methods for processing and analysis of data from serial block face scanning electron microscopy. Journal of Microscopy. 263 (1), 3-9 (2016).
  52. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  53. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  54. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, Pt 1 52-61 (2005).
  55. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality Head-mounted displays. arXiv . , arXiv:1804.08197 (2018).
  56. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
  57. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  58. Luengo, I., et al. SuRVoS: Super-Region Volume Segmentation workbench. Journal of Structural Biology. 198 (1), 43-53 (2017).
  59. Anderson, H. R., Stitt, A. W., Gardiner, T. A., Archer, D. B. Estimation of the surface area and volume of the retinal capillary basement membrane using the stereologic method of vertical sections. Analytical & Quantitative Cytology & Histology. 16 (4), 253-260 (1994).
  60. Gibbons, C. H., Illigens, B. M., Wang, N., Freeman, R. Quantification of sweat gland innervation: a clinical-pathologic correlation. Neurology. 72 (17), 1479-1486 (2009).
  61. Knust, J., Ochs, M., Gundersen, H. J., Nyengaard, J. R. Stereological estimates of alveolar number and size and capillary length and surface area in mice lungs. Anat Rec. 292 (1), Hoboken. 113-122 (2009).
  62. Mahon, G. J., et al. Chloroquine causes lysosomal dysfunction in neural retina and RPE: implications for retinopathy. Current Eye Research. 28 (4), 277-284 (2004).
  63. Michel, R. P., Cruz-Orive, L. M. Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. Journal of Microscopy. 150, Pt 2 117-136 (1988).
  64. Weibel, E. R. Stereological methods in cell biology: where are we--where are we going. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (9), 1043-1052 (1981).
  65. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  66. Kristiansen, S. L., Nyengaard, J. R. Digital stereology in neuropathology. Apmis. 120 (4), 327-340 (2012).
  67. Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. 2nd edn. , Garland Science/BIOS Scientific Publishers. (2005).
  68. Reith, A., Mayhew, T. M. Stereology and Morphometry in Electron Microscopy: Problems and Solutions. , Hemisphere Publishing Corporation. (1988).
  69. Mouton, P. R. Principles and practices of unbiased stereology: an introduction for bioscientists. , Johns Hopkins University Press. (2002).

Tags

Biologi Problem 169 Seriel blok-ansigt Scanning Elektron Mikroskopi SBF-SEM 3D-EM 3D-Rekonstruktion Vævsforberedelse Prøve Forberedelse Seriel sektioner Ultrastruktur Høj opløsning Volumetrisk Imaging Biologisk Stor volumen
Seriel blok-ansigt scanning elektron mikroskopi (SBF-SEM) af biologiske vævsprøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Courson, J. A., Landry, P. T., Do,… More

Courson, J. A., Landry, P. T., Do, T., Spehlmann, E., Lafontant, P. J., Patel, N., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples. J. Vis. Exp. (169), e62045, doi:10.3791/62045 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter