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Immunology and Infection

시투 혼성화에서 면역 RNA-형광을 이용한 SARS-CoV-2의 시각화

Published: December 23, 2020 doi: 10.3791/62067
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2, 1,2, 3,4, 3,4, 1
1Malopolska Centre of Biotechnology, Jagiellonian University, 2Microbiology Department Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, 3Department of Cardiac, Vascular and Endovascular Surgery and Transplantology, The Medical University of Silesia in Katowice, 4Silesian Centre for Heart Diseases

Summary

여기서, 우리는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) RNA를 시각화하기 위하여 정시 혼성화 (RNA-FISH)와 면역형광에 있는 RNA 형광을 결합하는 간단한 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 SARS-CoV-2 RNA 숙주 상호 작용의 분자 특성에 대한 이해를 증가시킬 수 있다.

Abstract

본 원고는 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) RNA를 인간 기도 상피의 3차원(3D) 배양으로 시각화하기 위해 면역형광과 결합된 시상 혼성화 연쇄 반응(HCR)에서 프로토콜을 제공한다. 이 방법은 프로브 국소화에 의해 시작된 HCR에 의존하여 바이러스 RNA의 매우 구체적이고 민감한 시각화를 허용합니다. 분할 시이터 프로브는 형광으로 표지된 증폭기로 신호를 증폭시켜 공초점 현미경 검사법의 무시할 수 있는 배경 형광을 초래합니다. 다양한 형광염료를 가진 앰프를 라벨링하면 다양한 표적을 동시에 인식할 수 있습니다. 이것은, 차례차례로, 단세포 수준에서 바이러스성 병인 및 복제를 더 잘 이해하기 위하여 조직에 있는 감염의 매핑을 허용합니다. 면역 형광과 이 방법을 결합하면 숙주 후성 유전체 및 면역 반응 경로의 교대를 포함하여 숙주 바이러스 상호 작용에 대한 더 나은 이해를 촉진 할 수 있습니다. 민감하고 구체적인 HCR 기술 덕분에 이 프로토콜을 진단 도구로도 사용할 수 있습니다. 또한 미래에 나타날 수 있는 비코딩 RNA 및 RNA 바이러스를 포함하여 임의의 RNA의 검출을 가능하게 하기 위하여 기술이 쉽게 수정될 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

Introduction

SARS-CoV-2는 2019년 말에 등장한 새로운 인간 베타코로나바이러스로, 몇 달 후 전례 없는 전염병을 일으켰습니다. 바이러스는 과학에 새로운 때문에, 그것의 생물학및 호스트 세포에 그것의 충격의 대부분은 알려지지 않은 남아 있습니다. 따라서, 감염 시 바이러스 세포 및 조직 트트로피를 매핑하는 것은 그것의 기본적인 생물학적 특성 및 호스트에 대한 그 효력이 이해되어야 하는 경우에 중요합니다. 몇몇 기술은 생화학, 생물학 및 물리적 분석을 포함하여 바이러스 호스트 상호 작용을 검토하기 위하여 이용됩니다. 시상 혼성화는 세포 또는 조직에서 특정 DNA 또는 RNA 서열에 국한되는 표지된 상보DNA, RNA 또는 변형된 핵산 프로브를 사용하는 일반적인 방법입니다.

신분 혼성화(RNA-FISH) 방법의 새로운 RNA 형광은 HCR1을통해 신호 대 잡음 비율을 증폭시킴으로써 감도를 높이기 위한 변형을 통합하는 것으로 개발되었다. HCR은 단세포 수준에서 RNA 현지화의 연구를 허용합니다. 높은 특이성, 감도 및 해상도로 인해 이 방법은 기초 과학 연구뿐만 아니라 진단과 같은 적용 프로젝트에도 유용합니다. 최근에는, 본 방법의 타당성은 완전히 분화된 3D 인간기도 상피(HAE) 배양2내의 섬모 세포에 국소화된 SARS-CoV-2 RNA를 검출하기 위한 것이 입증되었다. HAE 배양은 "자연 감염" 마이크로환경3,4의맥락에서 바이러스 감염을 연구하는 데 사용되는 가장 진보된 도구 중 하나를구성한다.

SARS-CoV-2를 포함한 인간 코로나바이러스(HCoV)에 대한 여러 보고서는 HCoV 감염 및 병리학에 대한 후성유전학적 변형의 중요성을 강조합니다[5], 예를 들어, 안지오텐신 변환 효소 2(ACE-2) 수용체2를코딩하는 유전자의 메틸화 패턴, 예를 들어, 후성유전학적 변형의중요성을강조한다. 흥미롭게도, 질량 분광 스크리닝 은 SARS-CoV-2 proteome 8과 상호 작용하는 몇몇 후성 유전학 요인을확인했습니다. 보다 구체적으로, 비구조적 단백질 5(NSP5)는 후생유전학 적 레귤레이터에 결합하고, 히스톤 deacetylase 2, 및 촉매비활성 NSP5(C145A)는 tRNA 메틸트랜스퍼라제 1(24)과 상호작용한다. 또한, NSP16 메틸트랜스퍼효소 활성은 메틸트랜스퍼효소 억제제, 시네풍진9에의해 차단된다. 그러나, COVID-19에 있는 이 후성유전학 요인의 정확한 역할은 불분명합니다. HCoV의 복제는 감염된 세포의 세포질에서 일어나고, 후성 유전학 수정에 의해 조절되는 염증 반응을트리거10.

예를 들어, HCoV-229E 미세 조정 핵 인자-카파 B 시그널링 및 특정 지역에서 H3K36 및 H4K5의 아세틸화를 증가시켜 호스트 셀룰러 크로마틴 풍경을 심오하게 재프로그램11. 중동 호흡기 증후군 관련 코로나바이러스 감염은 H3K27me3의 수준을 증가시키고 특정 인터페론 에민감한 유전자의 서브세트의 프로모터 영역에서 H3K4me3을고갈시킨다(12). 또한, 바이러스 RNA는플라비바이러스(13),레트로바이러스14,15,및 코로나바이러스(16)에 대해 입증된 바와 같이 세포 면역 반응을 유발한다. 바이러스 RNA에 후성 유전학 마커는 인간 면역 결핍 바이러스-1 RNA17의m7A 메틸화에 대해 도시된 바와 같이 세포 센서에 의해 인식에 역할을 할 수 있다. 그러나, 질문은 남아 있습니다: 면역 반응에 SARS-CoV-2 RNA의 충격은 무엇이며, 후성 유전학 표시는 관련되습니까?

여기서, 세포주 및 3D 조직의 면역형광 분석과 결합된 최적화된 RNA-FISH 방법(완전히 분화된 HAE)이 설명되고 있다. FISH 및 면역형광과 같은 세포학적 방법이 널리 사용되지만, HCR을 기반으로 한 시상 혼성화 방법의 이 신세대는 바이러스 검출에 사용된 적이 없다(최근 간행물을 제외하고)2. 일반적으로 면역 염색 및 FISH는 다음과 같은 단계를 필요로 합니다: 프로브 또는 항체의 침투를 가능하게 하기 위하여 투과성; 셀룰러 물질이 고정되고 보존되는 고정; 항체 또는 핵산 프로브가 적용되는 검출; 마지막으로 시각화를 위한 샘플 장착.

기존 프로토콜은 이러한 일반적인 기능을 공유하지만 관련된 매개 변수와 관련하여 현저하게 다릅니다. 여기서, 최적화된, 간단한, 면역 RNA-FISH 프로토콜은 HAE 배양 및 베로 세포에서 SARS-CoV-2 RNA를 검출하기 위하여 기술되었다. 기술은 다음과 같은 단계를 포함한다: (1) 파라포름알데히드를 가진 세포의 고정; (2) 세제 또는 메탄올과 과구 (MeOH); (3) 등급이 매겨진 일련의 MeOH 솔루션을 통한 재수화(HAE 배양만); (4) 검출; (5) HCR 기술을 이용하여 증폭하여 SARS-CoV-2 RNA를 검출하는; (6) 면역 염색; 및 (7) 공초점 현미경의 밑에 화상 진찰.

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Protocol

1. 버퍼 준비

  1. 2x PHEM 버퍼500mL의 경우 18.14 g의 파이프라진-N,N,N-bis(2-에탄설포닉산) (파이프S), 6.5 g4-(2-하이드록예트)를 결합합니다. hyl)-1-파이프라진 에탄 에탄황포닉산(HEPES), 에틸렌 글리콜 테트라아세산(EGTA), 황산 마그네슘 0.99g(MgSO4). 증류수(dH2O)로최대 ~400mL의 부피를 만들고, 수산화칼륨(KOH) 또는 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 pH를 7.0으로 조정한다. 최종 볼륨을 최대 500mL로 한 다음 50mL 알리쿼트로 분할합니다. 필요할 때까지 -20°C에 보관하십시오.
    참고: pH가 7.0에 도달할 때까지 버퍼가 명확하지 않습니다.
  2. /v 파라포름데히드(PFA)를 37% 순매수한다. 50mL의 경우 18.5g의 PFA와 35mL의 dH2O를 유리 병에 섞는다. 가열마그네틱 교반기 위에 병을 놓습니다. 1M KOH 또는 NaOH의 900 μL을 추가하고 용액이 명확해질 때까지 저어줍니다. 식히고 50mL 원심분리기 튜브로 이송할 수 있습니다. dH2O로 최대 50mL를 차지합니다. 용액은 필요할 때까지 -20 °C에서 저장할 수 있습니다.
    참고: 포름알데히드는 보호 장갑과 실험실 코트를 착용하는 동안 연기 후드로 처리해야합니다.
  3. 고정 버퍼를 준비합니다(PHEM으로 버퍼링된 PFA 3.7%). 50mL의 경우 5mL 37% PFA 용액 5mL, 2x PHEM 버퍼 25mL, dH2O20mL를 50mL 원심분리관에 결합한다. 필요할 때까지 -20°C에 보관하십시오.
    참고: 해동 후 버퍼를 최대 3개월 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.
  4. PBST준비(1x 인산염 완충식염[PBS]에서 0.1% Tween-20)을 준비한다. 50mL의 경우 100% Tween-20 ~ 50mL의 50 μL을 1x PBS로 추가하고 잘 섞습니다.
    참고: 솔루션은 실온(RT)에 저장할 수 있습니다.
  5. 3:1, 1:1 및 1:3의 비율로 MeOH/PBST를 결합하여 재수화 버퍼를 준비합니다(각 값의 100mL의 최종 부피; 표 1참조).
    참고 : MeOH는 매우 독성과 인화성입니다. 시신경을 손상시킬 수 있으므로, 어떤 화염을 피하는 연기 후드에서 처리해야합니다. MeOH와 PBST를 혼합하면 비동반응을 일으키므로 얼음에 대한 솔루션을 결합합니다.
  6. 20x SSC의 1000mL의 경우, 염화나트륨 175.3g과 구연산 나트륨 88.2g을 비커에 넣고, 800mL의 dH2O. 저어서 녹을 때까지 저어주어 NaOH를 사용하여 7.2로 pH를 조정한다. dH2O를 총 부피 1000mL에 추가하고 0.22 μm 필터를 통해 오토클레이브 또는 필터링을 오토클레이브 병에 넣습니다.
  7. 5x SSCT의 50mL의 경우 20x SSC 버퍼 12.5mL과 dH2O 37.5mL을 결합하고 100% Tween-20의 50 μL을 추가합니다. 잘 섞으세요.
  8. 50% 5x SSCT/50% PBST의 50mL의 경우 25mL의 5x SSCT와 25mL의 PBST를 결합하십시오.
  9. 2x SSC의 50mL의 경우, 10x SSC 버퍼 5mL과 dH2O. 믹스45mL을 잘 결합합니다.
    참고: 모든 SSC 버퍼는 어두운 곳에 RT에 저장해야 합니다.

2. 표적 정의, 프로브 및 증폭기

  1. 제조업체 의 웹 사이트에서 사용할 수있는 도구를 사용하여 앰프 및 프로브를 설계하십시오. 프로브가 SARS-CoV-2 N유전자(보충 도 1)의역DNA 가닥에 상보적이있는지 확인합니다.
  2. 최상의 프로브 집합 크기를 결정합니다(20개의 프로브 집합이 시각화에 충분합니다).
  3. 표적 RNA 검출에 사용되는 증폭기를 설정합니다.
    1. 알렉사 플루어 647로 표시된 HCR 앰프 B1을 사용하십시오.
      참고: HCR 앰프는 메타안정HCR 헤어핀 h1 및 h2로 구성됩니다. 멀티플렉스 실험은 이 프로토콜을 사용하여 설계할 수 있습니다. 이 계획된 경우, 동일한 샘플 내에서 이미지되는 각 표적 RNA에 대해 다른 HCR 증폭기(B1, B2, ...)를 선택하십시오(예를 들어, 표적 1용 앰프 B1, 표적 2용 앰프 B2,...).

3. SARS-CoV-2를 가진 세포 배양 및 감염

  1. 배양 베로 (원숭이 신장 상피 세포) 덜벡코의 수정 된 독수리 배지에서 세포 5% 태아 소 혈청을 포함.
    1. 12웰 플레이트에 50,000개의 셀을 커버립(1번, 15번 × 15mm)에 시드합니다.
  2. 투과성 트랜스웰 인서트지지체(직경 = 6.5mm)와 기관지 상피 성장 배지에서 완전히 분화된 HAE 배양을 완전히 컨블릴 때까지 준비한다.
  3. 바이러스 감염
    1. 1000x 중간 조직 배양 전염량(TCID 50)에서 SARS-CoV-2를 가진 접종 세포 (TCID50)mL 당
    2. 37°C에서 2h의 세포를 배양합니다.
    3. PBS로 셀을 두 번 세척하여 언바운드 바이러스를 제거합니다.
    4. 48 h용 배양 세포.

4. 커버립에 배양된 베로 세포에서 SARS-CoV-2 RNA-FISH

1일차

  1. 세포 고정 및 투과성
    1. 감염된 세포를 RT에서 1h에 대해 3.7%w/v PFA 용액으로 수정합니다.
    2. 3.7% PFA 용액을 흡인하고 1x PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다.
    3. 동요와 RT에서 10 분 동안 PBST 용액으로 세포를 과미로 처리합니다.
    4. PBST를 흡인하고 1x PBS로 셀을 두 번 세척합니다.
  2. 탐지
    1. 1x PBS 용액을 흡인하고 RT에서 2배 SSC로 셀을 두 번 세척합니다.
    2. 2x SSC 용액을 흡인하고, 프로브 혼성화 버퍼의 최소 300μL을 추가하여 시료를 미리 혼성화한다. 세포를 포함하는 우물을 덮고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
    3. 프로브 혼성화 버퍼에 프로브 혼합물의 1.2 pmol을 추가하여 프로브 용액을 준비합니다.
      1. 1 μM 프로브 스톡의 1.2 μL을 사용하여 작업 재고 300 μL을 준비하십시오.
    4. 사전 혼성화 용액을 제거하고 커버립을 가습 챔버로 옮기습니다.
      1. 피펫 30-50 μL의 프로브 용액이 파라필름에 들어와 개별 물방울을 형성합니다.
    5. 37°C에서 하룻밤 사이에 시료(12-18h)를 배양한다.

      2일차
    6. 커버립을 다시 12웰 플레이트로 옮기고, 37°C에서 400μL의 프로브 세척 버퍼로 4 x 5분 동안 세척하여 여분의 프로브 용액을 제거합니다.
      참고: 30-50 μl 알리쿼트를 파라필름과 인큐베이션커버립 아래에 배치하는 대안으로, 300μL의 프로브 용액을 12웰 플레이트의 커버립에 직접 추가합니다. 이 절차는 간단하지만 상당한 양의 시약이 필요합니다. 사용하기 전에 프로브 세척 버퍼를 37 °C로 가열합니다. 필요한 버퍼의 양을 계산하고 15 mL 원심 분리튜브로 전송합니다.
    7. RT에서 5배 SSCT로 2 x 5분 동안 샘플을 세척합니다.
    8. 5x SSCT 용액을 1x PBS로 교체하고 증폭될 때까지 샘플을 4°C로 저장합니다.
  3. 증폭
    1. 우물에서 1x PBS 용액을 제거하고 증폭 버퍼의 최소 300 μL을 각 웰에 추가합니다. RT에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.
    2. 각 HCR 헤어핀(h1 및 h2)을 별도의 튜브에서 원하는 볼륨을 스냅 냉각하여 준비합니다.
      1. 증폭 용액의 300 μL을 준비하려면 각 헤어핀의 18 pmol을 사용하십시오 (예 : 300 μL의 경우 3 μM 스톡 헤어핀 용액의 6 μL을 사용하십시오).
      2. 헤어핀 용액을 튜브로 옮긴다.
      3. 90s용 95°C에서 배양합니다.
      4. 어둠 속에서 30 분 동안 RT로 식힙니다.
    3. 증폭 버퍼에 스냅 냉각 "h1"과 "h2"헤어핀을 추가하여 헤어핀 혼합물을 준비합니다.
    4. 30-50 μL의 헤어핀 혼합물을 파라필름에 놓습니다.
    5. RT의 어둠 속에서 하룻밤 사이에 샘플을 배양 (12-18 h).

      3일차
    6. 커버립을 12웰 플레이트로 다시 옮기고, RT에서 5x SSCT로 5x 5분 동안 세척하여 과도한 헤어핀을 제거합니다.
    7. 5배 SSCT 버퍼를 흡인하고 1배 PBS로 바꿉니까.
      참고: 필요한 경우, 표준 면역 형광 분석에서 RNA-FISH 샘플을 사용하고 핵염색(섹션 5 참조).
  4. 핵 염색 및 슬라이드 장착
    1. 1x PBS 용액을 흡인하고 1x PBS 솔루션에서 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI, 0.2 μg/mL)로 대체하십시오.
    2. 어둠 속에서 RT에서 10 분 동안 샘플을 배양합니다.
    3. DAPI 용액을 흡인하고 1배 PBS로 셀을 두 번 세척합니다.
    4. 장착 매체의 각 10 μL의 두 방울을 놓습니다; 두 개의 커버립을 단일 슬라이드에 배치할 수 있도록 방울이 충분히 분리되었는지 확인합니다.
    5. 깨끗한 수건에 덮개를 눌러 여분의 액체를 제거한 다음, 셀이 아래로 향하는 안티페이드 장착 배지에 넣습니다.
    6. 장착된 샘플을 건조하고 평평한 표면에 어둡게 놓고 치료하게 합니다.
    7. 경화 후, 샘플이 건조되지 않도록 VALAP 실란트 또는 매니큐어로 커버립의 가장자리를 밀봉하십시오.

5. HAE 배양에서 SARS-CoV-2 RNA-FISH

1일차

  1. 해문화 의 고치고 침투
    1. 매체를 흡인시키고, RT에서 1h용 3.7% PFA 용액을 사용하여 감염된 세포를 수정한다.
    2. 3.7% PFA 용액을 흡인하고, 1배 PBS로 셀을 두 번 세척한다.
      1. 3.7% PFA 용액을 트랜스웰 인서트 에서 1배 PBS로 교체합니다.
    3. PBS를 폐기하고 - 20 °C에 100 % MeOH로 2 x 5 분 세차스를 사용하여 샘플을 탈수합니다.
    4. 두 번째 세척 후, 트랜스웰 인서트 에서 투과화를 위해 버퍼를 신선하고 차가운 MeOH로 교체하십시오. -20 °C에서 하룻밤 을 저장합니다.

2일차

  1. 리하이드레이션
    얼음에 MeOH/PBST 솔루션(각각 5분)의 등급이 매겨진 계열, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS, 100% PBST(2회)를 통해 샘플을 재수화합니다.
    1. 50% 5x SSCT/50% PBST로 얼음에 5분 동안 셀을 세척합니다.
    2. 5배 SSCT로 얼음에 5분 동안 셀을 세척합니다.
    3. 5x SSCT 버퍼를 1배 PBS로 바꿉니까.
  2. 탐지
    1. 프로브 혼성화 버퍼의 100 μL와 얼음에 5 분 동안 셀 (트랜스 웰 삽입 내부)를 배양. 다음으로, 플레이트를 37°C(사전 혼성화)에서 30분 동안 인큐베이터로 옮는다.
      참고: 프로브 혼성화 버퍼는 사용하기 전에 37°C로 예열되어야 합니다. 필요한 체적을 계산합니다: 단일 Transwell 인서트에 100 μL이 필요합니다.
    2. 프로브 솔루션을 준비합니다. 프로브 용액 1mL에 4pmol의 프로브가 필요하므로 1 μM 프로브 스톡 솔루션의 4 μL을 프로브 혼성화 버퍼 1mL에 추가하고 잘 혼합합니다.
      참고: RNA 검출의 경우 트랜스웰 인서트당 100 μL의 프로브 용액을 사용하십시오. 프로브 용액을 사전 혼성화 단계가 끝날 때까지 얼음 위에 둡니다.
    3. 사전 혼성화 솔루션을 제거하고 프로브 솔루션을 추가합니다.
    4. 세포를 37°C에서 하룻밤 동안(12-18h)으로 배양한다.

      3일차
    5. 37°C에서 프로브 세척 버퍼 100μL로 4 x 15분 동안 세척하여 여분의 프로브를 제거합니다.
    6. RT에서 5배 SSCT로 샘플을 2 x 5분 동안 세척합니다.
    7. 5x SSCT를 1x PBS로 교체하고 증폭될 때까지 샘플을 4°C로 저장합니다.
  3. 증폭
    1. RT에서 30분 동안 증폭 버퍼로 샘플을 배양하여 시료를 미리 배양합니다.
    2. 별도의 튜브에서 원하는 볼륨을 스냅 냉각하여 각 헤어핀을 준비합니다.
      1. 증폭 용액 500 μL을 준비하려면 각 헤어핀의 30 pmol을 사용하십시오 (예 : 500 μL의 경우 3 μM 스톡 헤어핀 용액의 10 μL을 사용하십시오).
      2. 헤어핀 용액을 튜브로 전송합니다.
      3. 90s용 95°C에서 배양합니다.
      4. 어둠 속에서 30 분 동안 RT로 식힙니다.
    3. 모든 스냅 냉각 헤어핀을 RT에서 증폭 버퍼의 500 μL에 추가하여 헤어핀 솔루션을 준비합니다.
    4. 사전 증폭 솔루션을 제거하고 전체 헤어핀 솔루션을 추가합니다.
    5. 어둠 속에서 RT에서 하룻밤 (12-18 h)에 샘플을 배양.
    6. 2 x 5 분, 2 x 15 분, 1 x 5 분 : 다음과 같이 RT에서 5 배 SSCT로 세척하여 과도한 헤어 핀을 제거합니다.
    7. 5x SSCT 용액을 1x PBS로 교체하고 4°C에 저장하여 2-3일 이상 보관하거나 핵 염색으로 직접 진행하십시오.
      참고: 필요한 경우 표준 면역 형광 분석에서 RNA-FISH 샘플을 사용하고 핵 염색(섹션 6 참조).
  4. 핵 염색 및 슬라이드 장착
    1. 1x PBS 용액을 흡인하고 1x PBS에서 DAPI 용액(0.2 μg/mL)으로 교체합니다.
    2. 어둠 속에서 RT에서 10 분 동안 샘플을 배양합니다.
    3. DAPI 용액을 흡인하고 1배 PBS로 셀을 두 번 세척합니다.
    4. 트랜스웰 인서트에서 잘라낸 멤브레인을 10μL에 놓고 셀이 위를 향하도록 하는 안티페이드 장착 배지의 10μL에 놓고 멤브레인에 추가 장착 매체(5 μL)를 추가합니다.
    5. 커버립으로 멤브레인을 덮습니다.
    6. 어두운 건조한 평평한 표면에 장착된 시료를 치료합니다.
    7. 경화 후, 샘플이 건조되지 않도록 VALAP 실란트 또는 매니큐어로 커버립의 가장자리를 밀봉하십시오.

6. 베로 세포 및 HAE 배양의 면역 형광 분석

참고: HAE 배양을 위해 세포주 또는 4일째에 대한 면역형광 분석을 3일째에 수행한다. 각 모델에 대해 다른 접근 방식을 사용합니다. 모든 차이점은 명확하게 표시됩니다.

  1. 우물에서 1x PBS 솔루션을 흡인합니다.
  2. PBST 용액에서 소 세럼 알부민을 1%w/w/w/37°C에서 30분 동안 인큐베이션하여 시료를 차단합니다.
  3. 차단 용액에 적절한 희석을 준비하여 1 차 항체를 준비하고 인큐베이션하십시오.
    1. 커버립의 베로 셀의 경우:
      1. 습도 챔버에서 파라필름에 항체 용액의 방울(30-50 μL)을 놓습니다.
      2. 커버립을 항체 방울에 놓고 세포가 아래로 향하도록 합니다.
    2. HAE의 경우, 인서트의 차단제를 항체 용액(100 μL)으로 교체하고 가습 챔버에서 시료를 배양한다.
      참고: 1차 항체로 각 배양의 시간과 온도를 조정합니다. 일반적인 매개 변수는 RT에서 2 시간 또는 4 °C에서 하룻밤입니다.
  4. PBST로 샘플을 3 x 5분 동안 세척합니다.
    1. 커버립의 셀의 경우 12웰 플레이트로 옮기고 PBST 용액을 추가합니다.
    2. HAE 배양의 경우 항체 용액을 PBST 용액으로 대체하십시오.
  5. 공초점 현미경에 사용할 수 있는 광원과 필터를 확인합니다.
  6. 숙주 종에 따라 이차 항체를 선택하십시오. 플루오로포레 파라미터(사용 가능한 광원에 따라 발아 및 방출 파장, 스펙트럼 너비 및 흥분 효율)을 선택합니다.
    참고: 스펙트럼 매개 변수는 온라인 도구를 사용하여 모델링할 수 있습니다(재료 표참조).
  7. 차단 용액으로 희석하여 적절한 이차 항체 용액을 준비하십시오.
  8. 이차 항체(6.3에서와 같이)로 배양하지만 37°C에서 1h의 배양을 한다.
  9. 6.4 단계에서와 같이 샘플을 세척하십시오.
  10. 핵 염색 및 슬라이드 장착
    1. 커버립의 셀용
      1. PBST를 흡인하고 1x PBS 용액에서 DAPI(0.2 μg/mL)로 바꿉니다.
      2. 어둠 속에서 RT에서 10 분 동안 샘플을 배양합니다.
      3. DAPI 용액을 흡인하고 1배 PBS로 셀을 두 번 세척합니다.
      4. 커버립을 장착 매체의 10 μL 방울에 놓고 셀이 아래로 향합니다.
      5. 매니큐어로 커버립을 밀봉합니다.
    2. HAE 문화를 위한
      1. 1x PBST를 흡인하고 1x PBS 용액에서 DAPI(0.2 μg/mL)로 바꿉니다.
      2. 어둠 속에서 RT에서 10 분 동안 샘플을 배양합니다.
      3. DAPI 용액을 흡인하고 1배 PBS로 셀을 두 번 세척합니다.
      4. 절단 멤브레인을 장착 매체10μL의 방울에 놓고 셀이 위향을 향하도록 하고 멤브레인에 추가(5 μL) 장착 매체를 추가합니다.
      5. 커버립으로 멤브레인을 덮습니다.
      6. 매니큐어로 커버립을 밀봉합니다.

7. 공초점 현미경 검사법

  1. 사용된 형광을 지정하여 트랙을 정의합니다.
  2. 스캐닝 모드와 속도를 선택합니다.
  3. 각 형광에 대한 레이저 전력, 게인 및 오프셋 값을 각각의 부정적인 컨트롤과 비교하여 조정합니다: 바이러스, 모의 감염 세포; 세포 단백질의 경우, 적절한 숙주에서 등류형 대조군 항체로 염색된 샘플.
  4. 3D 이미지를 가져오려면 z 스택 모드를 활성화하고 상단 및 하단 제한을 설정합니다. 단계 크기/번호를 설정합니다.
    참고: 코로나바이러스 이미징에 대한 자세한 내용은19를참조하십시오.

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Representative Results

본 원고에 기재된 면역-RNA-FISH 프로토콜은 베로 세포주 및 3D HAE 배양이라는 두 가지 세포 시스템을 사용하여 수행되었다. 두 셀룰러 모델의 주요 단계는 표 2에표시됩니다. HAE 배양에서 SARS-CoV-2의 시각화를 위한 RNA-FISH 프로토콜에는 조직 샘플, 즉 100% MeOH를 통한 투과성 및 0.1% Tween 솔루션을 통한 재수화를 위한 단계가 포함됩니다. 면역형광은 RNA-FISH가 완료된 후에 수행되었다. Zstack 이미지를 획득하여 처리했습니다.

도 1은 SARS-CoV-2에 감염된 모의 접종 조절 베로 세포 또는 세포에서 면역 RNA FISH를 나타낸다. 도 2는 SARS-CoV-2에 감염된 모의 접종 제어 HAE 배양 또는 배양에서 면역 RNA FISH를 나타낸다. 도 3은 베로 세포내의 충혈성 프로토콜의 최적화를 나타낸다: RT에서 5분 동안 PBS에서 -20°C 또는 0.1% Tween-20에서 하룻밤 사이에 70% 에탄올이 발생하며, 이단을 사용하는 반면, 이단은 흐라이지는 이미지에 초점을 맞춘 SARS-CoV-2 서브게놈 RNA에 대한 명확하고 구체적인 신호가 생성된다.

Figure 1
그림 1: 베로 세포에서 SARS-CoV-2 RNA 및 β-tubulin을 검출하는 면역 RNA-FISH. SARS-CoV-2 형발주 RNA의 국소화(A)감염 및(B)모의 접종 베로 세포. 바이러스 RNA는 FISH (빨강)에 의해 시각화되었다. β-튜룰린은 마우스 β5tubulin (1:100, 4°C에서 하룻밤 잠복)에 대한 항체로 염색되고 알렉사 불소로포레 488-공주 이차 항체(RT에서 1:400, 1h 인큐베이션). 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. 각 이미지는 단일 공초점 평면입니다. 스케일 바 = 20 μm. 약어: SARS-CoV-2 = 심한 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2; FISH = 시상 혼성화에서형광; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: SARS-CoV-2에 감염된 인간 기도 상피 세포. (A)감염 및(B)모의 접종 HAE 배양에서 SARS-CoV-2 체증 RNA의 국소화. 바이러스 RNA는 FISH (빨강)에 의해 시각화되었다. Ciliated 세포는 마우스 β5-tubulin에 대하여 항체를 사용하여 시각화됩니다 (1:100, 4°C에서 하룻밤 인큐베이션) 및 알렉사 플루오로포레 488-공주 이차 항체로 (1:400, RT에서 1 h 인큐베이션). 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. 각 이미지는 공초점 이미지 스택(두께 = 3 μm)에서 재구성된 최대 투영을 나타냅니다. 스케일 바 = 10 μm. 약어: SARS-CoV-2 = 심한 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2; FISH = 시상 혼성화에서형광; HAE = 인간의 기도 상피; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 베로 세포에 대한 투과 성 비조건의 최적화. 베로 세포의 투과성(A)70% 에탄올과(B)를PBS에서 0.1% Tween-20으로 하였다. 세제를 사용하는 투과성화는 SARS-CoV-2 체증 RNA에 대한 명확한 특정 신호를 초래하는 반면, 에탄올은 흐릿한 이미지를 초래한다. 바이러스 성 RNA는 빨간색으로 표시됩니다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색되었다. 각 이미지는 공초점 이미지 스택(두께 = 3 μm)에서 재구성된 최대 투영을 나타냅니다. 스케일 바 = 10 μm. 약어: SARS-CoV-2 = 심한 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2; PBS = 인산염 완충식식염; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 1: SARS-CoV-2 N 유전자 서열 (5'-3')   이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

완충기 메탄올의 부피 [mL] PBST의 부피 [mL]
75% MeOH/25% PBST 75 25
50% MeOH/50% PBST 50 50
25% MeOH/75% PBST 25 75
100% PBST 0 100
합계 100 mL

표 1: 재수화를 위한 그라데이션 메탄올/PBST 솔루션 준비. 절대 메탄올 (MeOH)에서 하룻밤 잠복 후 인간의 기도 상피 샘플을 재수화하려면 환경의 느린 교환이 필요합니다. 이렇게 하려면 MeOH 및 PBST의 비율이 점진적으로 변화하는 버퍼(1x 인산염 버퍼식염수에 0.1% Tween-20)를 배양하여 느린 교환이 발생해야 합니다. 각 솔루션의 100mL를 준비하기에 충분한 시약 볼륨이 여러 실험을 수행할 수 있을 정도로 나열됩니다.

모듈 걸음 베로 세포 해 문화
RNA 형광시 내의 혼성화(RNA FISH) 고정 (3.7% PFA) 실온 또는 실온에서 하룻밤 10-40분
투과성 (PBST: 1x PBS에서 0.1% Tween-20) 실온에서 10분 (1x PBS에서 0.1% 트위엔-20) 2× 5분 실온
하룻밤 -20 °C에서 (100 % MeOH)
리하이드레이션 (등급 메탄올 (MeOH)/PBST) 5 x 5 분, 50 % 5 x SSCT / PBST 세척 5 분, 5 x SSCT 세척 5 분 얼음
검출(사전 혼성화) (프로브 혼성화 버퍼) 37°C에서 30분, 200-300 μL (프로브 혼성화 버퍼) 얼음 5분, 37°C에서 30분, 100 μL
탐지 (프로브 용액) 37°C에서 12-18h, 30 -50 μL (프로브 용액) 37°C에서 12-18h, 100 μL
프로브 세척 (프로브 세척 버퍼) 4 x 5 분 (프로브 세척 버퍼) 4 x 15 분
(5 × SSCT) 2 x 5 분
증폭(사전 증폭) (증폭 버퍼) 실온에서 30분, 200-300 μL (증폭 버퍼) 실온에서 30분, 100 μL
증폭 (증폭기 용액) 어두운 곳에서 실온에서 12-18 h, 30-50 μL (증폭기 용액) 어두운 곳에서 실온에서 12-18 h, 100 μL
앰프 세척 (5x SSCT) 5 x 5 분 (5x SSCT) 2 x 5분, 2 x 15분, 1 x 5분
면역성광 (IF) 블로킹 (PBST에서 1% BSA) 37°C에서 30분
1차 항체 배양 (차단용의 아프로프리아테 농도의 항체 용액) 실온/하룻밤 4°C, 30-50 μL (차단용의 아프로프리아테 농도의 항체 용액) 실온/하룻밤 4°C, 100 μL
1차 항체 세척 (PBST) 실온에서 3 x 5 분
이차 항체 배양 (차단용에 있는 아프로피아테 농도의 항체 용액) 37°C에서 1h, 30-50 μL (차단 용액에 적절한 농도의 항체 용액) 1h 에서 37 °C, 100 μL
이차 항체 세척 (PBST) 실온에서 3 x 5 분
핵 염색 (DAPI 용액) 실온에서 10분, 1x PBS로 2 x 5분

표 2: 세포주 및 HAE 배양에서 면역 RNA-FISH 프로토콜의 워크플로우. 면역 RNA-FISH는 두 세포 모델모두에서 가능하지만 다른 접근법이 필요합니다. 주요 단계는 사용되는 버퍼(괄호)와 함께 표시되며, 그 다음으로 인큐베이션의 지속 시간 및 온도가 표시됩니다. 몇 단계에서는 계산을 단순화하기 위해 샘플당 배양 시약의 부피에 중요한 차이가 주어집니다. 부피가 지정되지 않으면 임의로 선택되어 교반으로 샘플(일반적으로 200 μL)을 완전히 덮습니다. 약어: 물고기 = 시상 혼성화의 형광; HAE = 인간의 기도 상피; PFA = 파라포름알데히드; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌; BSA = 소 세럼 알부민; PBS = 인산염 완충식식염; MeOH = 메탄올.

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Discussion

면역 RNA-FISH는 RNA 와 세포 단백질의 이중 염색을 위한 신뢰할 수 있는 방법입니다. 여기서, 변형된 면역-RNA-FISH 프로토콜은 세포주 및 HAE 배양에서 SARS-CoV-2 RNA 및 세포단백질의 검출을 가능하게 하는 것으로 기술되었다. 이 프로토콜은 세포 단층 또는 특정 조직을 포함하는 다른 세포 모형에서 사용하기 위하여 적응될 수 있습니다. 이 방법은 적절한 프로브 현지화로 시작된 HCR의 개념에 의존합니다. 다음으로, 형광 표지 증폭기에 의한 신호증폭을 시작하기 위한 분할 개시기 프로브를 사용하면 공초점 현미경을 사용하여 관찰될 때 최소한의 배경 형광을 초래한다. 앰프는 서로 다른 형광 염료로 표지될 수 있으며 다양한 표적을 인식하도록 설계된 다른 프로브와 호환됩니다. 따라서 동시에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명된 절차는 간단하지만 시간이 많이 소요됩니다(3-4일). 그럼에도 불구하고, 결과는 직접 표지형 형광 프로브를 사용하는 다른 프로토콜과 달리 낮은 노이즈 대 신호 비율을 특징으로합니다.

베로 세포와 HAE 배양은 여기에서 사용되었습니다. 조직 배양에 있는 표지 전표 및 세포에 있는 세포에 다른 프로토콜이 필요합니다. 대부분의 차이점은 세포(커버슬립 또는 멤브레인)와 사용되는 물질의 양을 처리할 때 발생합니다. 일반 RNA-FISH 프로토콜은 에탄올 또는 메탄올 용액을 이용한 투과화뿐만 아니라 -20°C의 하룻밤 배양을 필요로 한다. 중요한 것은, 투과화를 위한 세제를 사용하는 것은 면역형광에 더 유익하고, 절차를 1일 단축하고, 실험의 보다 효율적인 계획을 가능하게 한다. 주요 접근은 어떤 바람직하지 않은 효력이 눈에 띄는 지 확인하기 위하여 알콜 또는 세제를 가진 투과화를 관련시키는 일반적인 프로토콜을 따르는 것이었습니다. 중요한 것은, 베로 세포의 하룻밤 투약화70% 에탄올 용액은 특이하지 않고 흐린 신호를 초래했습니다. 대조적으로, Tween20을 가진 투과화는 SARS-CoV-2 RNA의 명확하고 특정적인 시각화를 허용하고 프로토콜을 1일 단축(도 3).

동일한 접근법은 -20°C에서 절대 메탄올을 가진 하룻밤 배양 후 HAE 배양(조직 샘플에 대한 일반적인 RNA-FISH 프로토콜에 따라) 및 Tween20을 5분 동안 0.1% Tween20으로 테스트하여 이 시약을 실격시키는 비특이적 신호(나타나지 않음)를 분석하였다. 메탄올을 가진 하룻밤 잠복은 유물없이 매우 구체적인 신호로 이어졌다. 중요한 것은, 메탄올이 접착제를 용해했기 때문에 트랜스웰 멤브레인의 분리가 관찰되었다. 이 문제는 멤브레인을 분리하고 커버 슬립 프로토콜을 진행하여 처리되었습니다. 고전적인 RNA-FISH 절차는 단백질을 제거하고 RNA 단백질 복합체를 지우므로 감도를 향상시키기 위해 단백질을 사용하여 화학 물질과 염료에 의해 침투 할 수 있습니다. 본 프로토콜은 단백질분석 K가 단백질 염색을 방지함에 따라 이 단계를 생략했다. 단백질Ae K가 없을 때 RNA-FISH의 감도에서 차이가 관찰되지 않았다 (데이터는 표시되지 않음).

RNA-FISH 에 이어 면역 형광 분석법을 수행하면 RNA 신호에 영향을 미치지 않았고 두 가지 방법의 성공적인 조합이 초래되었습니다. 따라서, 완전한 프로토콜은 RNA와 단일 세포 수준에서 단백질과의 상호 작용을 시각화하는 편리한 방법을 나타낸다. 참고로, 세포의 고정 (면역 RNA-FISH에 필요한)은 단일 세포 수준에서 동적 이벤트를 검사하는 시간 경과 실험을 허용하지 않습니다. SARS-CoV-2 RNA의 시각화는 세포 내의 SARS-CoV-2 복제의 분석을 허용하고, 면역 형광과 결합될 때, 후성유메트와의 상호 작용을 포함하는 세포 내 SARS-CoV-2 RNA/숙주 단백질 상호 작용의 연구를 허용합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 단일 세포 해상도에서 SARS-CoV-2 및 기타 신흥 바이러스의 검출을 포함하여 다양한 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 민감하고 구체적인 HCR 기술 덕분에 진단 도구로도 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 SARS-CoV-2에 대한 연구를 위해 과학 고등 교육부에 의해 지원되었으며 국립 과학 센터 (UMO2017/27 /B / NZ6 /02488에서 K.P.와 UMO-2018/E/NZ1/00874 ~ A.K.K.P.의 보조금)을 지원했습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Confocal Microscope LSM 880 ZEISS
Grant Bio, Mini Rocker- Shaker Fisher Scientific 12965501
Incubator Galaxy170R New Brunswick CO170R-230-1000
Thermomixer Comfort Eppendorf 5355 000 011
Materials
15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips LabSolute 7695022
1.5 mL tubes FL-MEDICAL 5.350.023.053
12-well plate TTP 92412
Conical centrifuge tube Sarstedt 5.332.547.254
parafilm Sigma P7793-1EA
serological pipets VWR Collection 612-5523P, 612-5827P
slide glass PTH CHEMLAND 04-296.202.03
Transwell ThinCerts Grainer bio-one 665641
Reagents
Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies Invitrogen
β5-tubulin Santa Cruz Biotechnology sc-134234
DAPI Thermo Scientific D1306
Disodium phosphate Sigma S51136-500G
EGTA BioShop EGT101.25
HCR Amplification Buffer Molecular Instruments, Inc. BAM01522 Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 Molecular Instruments, Inc. S013922
HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 Molecular Instruments, Inc. S012522
HCR Probe Hybridization Buffer Molecular Instruments, Inc. BPH03821 Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid Molecular Instruments, Inc. PRE134
HCR Probe Wash Buffer Molecular Instruments, Inc. BPW01522 Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HEPES BioShop HEP001.100
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma 63138-250G
Methanol Sigma 32213-1L-M
Monopotassium phosphate Sigma P5655-100G
Paraformaldehyde Sigma P6148-1KG
PIPES BioShop PIP666.100
Potassium Chloride Sigma P5405-250G
Prolong Diamond Antifade Mounting Medium Invitrogen P36970
Sodium Chloride BioShop SOD001.5
Trisodium Citrate 2-hydrate POCH 6132-04-3
Tween-20 BioShop TWN580.500
Software
Fluorescence Spectraviewer Modeling spectral parameters
ImageJ Fiji Acquiring and processing z-stack images

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References

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면역학 및 감염 문제 166 SARS-CoV-2 RNA-FISH 혼성화 연쇄 반응 면역 형광 인간 기도 상피 (HAE) 침투 공초점 현미경 검사
시투 혼성화에서 면역 RNA-형광을 이용한 SARS-CoV-2의 시각화
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