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普遍性与组织特异性RNA靶向 黑腹果蝇 使用 CRISPR/CasRx

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DOI：

10.3791/62154

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2021年2月5日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology, University of California

本文内容

摘要

本文概述了在果蝇中使用靶向RNA的Cas13D酶（RfxCas13D）的详细实验方案。

摘要

CasRx 是一种靶向 RNA 的 Cas13 家族成员，作为 CRISPR/Cas 技术的新成员，在细胞和生物体水平上均表现出高效的基因转录本降低能力以及优良的脱靶效应特征，具有广阔的应用前景。最近有报道称，CRISPR/CasRx 系统可用于实现广泛性及组织特异性的基因转录本降低 黑腹果蝇．本文详细介绍了近期研究中的方法，包含三个部分：1）普遍存在的 利用双组分CasRx系统进行体内内源性RNA靶向；2）利用三组分CasRx系统进行广泛性体内外源性RNA靶向；以及3）利用三组分CasRx系统进行组织特异性体内RNA靶向。所观察到的RNA靶向效应包括靶基因特异性的表型改变、靶向RNA转录本的减少，以及与CasRx蛋白高表达和旁切活性相关的偶发致死表型。总体而言，这些结果表明，CasRx系统能够在生物体水平上以可编程且高效的方式实现靶向RNA转录本的降低，证明了体内转录组靶向与改造的可行性，为未来基于CRISPR的体内RNA靶向技术奠定了基础。

引言

自成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术问世以来，该领域的研究重点主要集中于DNA编辑，其在医学和生物技术领域具有变革性的应用前景1。然而，由于伦理方面的考量，永久性改变DNA序列并不总是理想的选择。鉴于此，近期研究开始开发基于CRISPR的RNA靶向工具，并已证明CRISPR技术确实可在多种生物系统中用于RNA靶向2,3,4,5,6,7。在已测试的许多系统中，目前广泛使用的RNA靶向和转录本降低方法是RNA干扰（RNAi），但该方法远非完美，在体内应用时常表现出疗效差异大和脱靶活性高的问题8,9,10,11,12,13,14,15,16,17。因此，鉴于这些技术的现状，进一步探索基于CRISPR的RNA靶向工具的潜力具有重要意义。

最近一项引人注目的研究报道，核糖核酸酶CasRx（属于Cas13d家族）能够在人源细胞培养体系中高效降低基因转录水平，并具有理想的脱靶效应特征4。这一发现引发了一个问题：这种新型核糖核酸酶是否能在生物体水平上维持其对RNA靶向的高效性及低脱靶率。最近一项研究通过证明CasRx系统可用于在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中实现广泛性及组织特异性的基因转录抑制，回答了这一问题5。

为简化这一近期发表方法的使用，本实验方案详细描述了该研究中的方法，主要包括以下三个部分：1）普遍适用的体内 使用双组分CasRx系统进行RNA靶向；2）使用三组分CasRx系统实现体内广泛性外源RNA靶向；3）使用三组分CasRx系统实现组织特异性体内RNA靶向。

设计了在组成型启动子控制下靶向不同目的基因的向导RNA（gRNA），并构建了表达这些含gRNA元件的果蝇品系。同时设计了在组成型启动子或可由GAL4转录因子激活的条件性上游激活序列（UASt）启动子控制下的CasRx元件，并构建了携带这些含CasRx元件的果蝇品系。还设计了催化失活的CasRx元件（dCasRx），并用作阴性对照。通过将表达gRNA的果蝇品系与组成型表达CasRx的果蝇品系杂交，可在果蝇中实现全身体细胞的RNA靶向。子代果蝇同时表达靶向特定基因转录本的gRNA元件和CasRx蛋白，从而导致靶向基因转录本在全身广泛减少。果蝇中的组织特异性RNA靶向则通过以下步骤实现：首先将表达gRNA的果蝇与表达UASt-CasRx的果蝇杂交，获得同时携带gRNA和UASt-CasRx元件的反式杂合子果蝇；再将此类果蝇与组织特异性表达GAL4的果蝇杂交，从而在果蝇中实现组织特异性的CasRx表达及RNA靶向。

CasRx 系统的可编程性使其具备定制化与优化的潜力，有助于实现在体内进行RNA靶向时的高效性与低脱靶活性。基于CRISPR的RNA靶向技术具有广泛的应用前景，包括在实验室中替代RNA干扰（RNAi）技术，以及在自然环境中助力昆虫媒介的控制。其中，当前全球尚未满足的重要需求之一，是开发高效工具以应对通过蚊子传播的RNA病毒所引发的感染。许多RNA病毒，如登革病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒，均通过蚊子传播，危害人类健康并导致死亡。尽管已有多种通过基因改造使蚊群具备抗病毒能力以预防疾病传播的设想被提出，但目前尚无任何技术能够使蚊子同时对所有重要的RNA病毒产生抗性18,19,20,21,22,23。RNA靶向的Cas系统可能为实现此类技术提供起点，因其可构建一个可编程的平台，用于靶向所有通过蚊子传播的RNA病毒。

方案

1. 使用双组分 CasRx 系统进行体内广泛性 RNA 靶向

  1. 构建Ubiq-CasRx和Ubiq-dCasRx表达载体
    1. 使用引物1050E.C3和1050E.C4，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增原始CasRx质粒pNLS-RfxCas13d-NLS-HA（pCasRx）中的CasRx序列；使用引物1050E.C3和1050E.C4，通过PCR扩增原始dCasRx质粒pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA（pdCasRx）中的dCasRx序列4 (表1). 使用胶回收试剂盒对扩增的 CasRx 和 dCasRx 片段进行胶纯化。
    2. 用限制性内切酶 SwaI 和 PacI 消化基础载体（Addgene 质粒 #112686）24在所得产物中，使用试剂盒对较大的片段进行凝胶纯化，该片段称为基础载体骨架。
    3. 使用Gibson组装方法，将Ubiq-CasRx载体与基础载体骨架和CasRx片段进行组装；使用Gibson组装方法，将Ubiq-dCasRx载体与基础载体骨架和dCasRx片段进行组装25.
      注意：Ubiq-CasRx 载体（OA-1050E）的 Addgene 编号为 #132416，Ubiq-dCasRx 载体（OA-1050R）的 Addgene 编号为 #132417。
  2. 构建gRNA表达载体
    1. 根据以下标准设计每条gRNA片段：靶序列长度为30个核苷酸；靶序列中多聚尿苷酸（poly-U） stretches 的最大长度为4个碱基对；靶序列的GC含量在30%–70%范围内；预测靶序列不形成强RNA发夹结构；且靶序列所含的RNA二级或三级结构预测尽可能少。5.
      注意：本研究将每条gRNA设计为4个串联序列，每个序列长30个核苷酸，由长36个核苷酸的正向重复序列隔开，并在两端均以7个胸腺嘧啶（T）作为终止子5对于外源性靶基因GFP，遵循上述相同标准，并额外添加一个OpIE2-GFP片段。5.
    2. 使用引物 1043.C1 和 1043.C23，以 Addgene 质粒 #112688 为模板，通过 PCR 扩增 U6:3 启动子序列表1)26使用凝胶纯化试剂盒对扩增的 U6:3 片段进行凝胶纯化。
    3. 用限制性内切酶 AscI 和 XbaI 消化 Addgene 质粒 #11268824在所得产物中，使用试剂盒对较大的片段进行凝胶纯化，该片段称为预置碱基载体骨架。
    4. 使用 Gibson 组装方法，将预基础载体骨架与 U6:3 片段组装成基础载体25基础载体此后命名为 OA-1043。
      注：质粒 OA-1043 的 Addgene 编号为 #164586。
    5. 使用外部基因合成服务合成目标基因的gRNA片段。
    6. 用限制性内切酶 PstI 和 NotI 消化基础载体 OA-104324保留全部消化产物，该产物称为消化后的OA-1043。
    7. 使用Gibson组装方法，将经消化的OA-1043与靶基因gRNA片段组装成gRNA表达载体25.
      注意：共研究了四个靶基因：其中三个为内源性基因（白色, Notch, 黄色），其中一个为外源性（GFP）。它们的 Addgene 编号为：#132420（gRNAw），#132421（gRNAN），#132425（gRNAy）和 #133304（gRNAGFP).
  3. 转基因果蝇的制备
    1. 使用外部果蝇胚胎注射服务，将表达载体注入携带特定基因的果蝇胚胎中 ØC31 整合位点。将注射后的胚胎在26℃下培养 °C. 
      注意：attp40w（在2号染色体上具有整合位点）nd 染色体）品系用于生成 CasRx 品系，以及 8622（整合位点位于 3rd 染色体）品系用于产生各种gRNA品系。
    2. 将果蝇保持为纯合品系或平衡杂合品系。
      注意：Ubiq-CasRx 和 Ubiq-dCasRx 果蝇以 CyO 为平衡染色体维持为杂合平衡品系。此外，Ubiq-CasRx 和 Ubiq-dCasRx 载体均含有 dsRed 标记基因。因此，Ubiq-CasRx 和 Ubiq-dCasRx 果蝇具有以下三种表型：dsRed 阳性、卷翅和白眼。表达 gRNA 的果蝇品系维持为纯合品系。其布卢明顿果蝇资源中心（BDSC）果蝇品系编号分别为：#84118（Ubiq-CasRx）、#84119（Ubiq-dCasRx）、#84124（gRNA）w），#84122（gRNAN），#84123（gRNAy），#84986（gRNAGFP).
  4. 果蝇遗传学图1A)
    1. 从纯合gRNA品系中收集10只新生雌性成虫，从平衡杂合Ubiq-CasRx/CyO品系中收集5只雄性成虫。将所收集的雌性和雄性果蝇（称为亲代果蝇）放入含有干酵母粉的小瓶中图1A).
    2. 重复上一步3次，以生成3个重复样本。对于对照组，使用Ubiq-dCasRx/CyO品系，其余条件保持不变。
      注意：对于常规玻璃小瓶的果蝇食物，0.1 g 干酵母粉已足够。使用 BDSC 的果蝇食物配方。
    3. 将含有亲本果蝇的小瓶置于26 ℃培养 °℃下培养48小时。然后从每个试管中移除所有亲代果蝇。随后将试管继续置于26 °在至少20天内保持在C条件下。
    4. 观察  每天检查试剂瓶，观察是否有新的成年子代从F1代蛹中羽化。若有，将连接至二氧化碳气罐的导管插入果蝇试剂瓶中，打开气流开关10秒，利用二氧化碳麻醉果蝇。
    5. 当果蝇变得无法活动后，将它们从试管中倒出至连接二氧化碳气罐的果蝇操作垫上，二氧化碳会持续从操作垫中流出。
    6. 使用连接彩色相机的荧光体视显微镜对麻醉后的果蝇表型进行评分并拍照。统计具有不同表型的子代数量。采用图像处理软件进行图像后期处理与整合。图2A 二维).
      注意：根据孟德尔遗传学，每次杂交后代中预期会出现两种类型的果蝇图1A).
  5. RNA-Seq（图 2E – 2G)
    1. 样本采集
      注意：从以下3个示例中选择合适的样品采集方法；每种不同类型的样品需设置3个重复。
      1. 成年果蝇头部样本采集
        1. 从纯合gRNA品系中收集10只新生雌性成虫，从平衡杂合Ubiq-CasRx/CyO品系中收集5只雄性成虫。将收集的雌雄成虫（即亲代果蝇）放入含有干酵母粉的小瓶中。
        2. 重复上述步骤3次，共设3个重复。对于对照组，使用Ubiq-dCasRx/CyO品系，其余条件保持不变。
        3. 在26℃下培养含有亲代果蝇的试管 °C孵育48小时。随后移除每个小瓶中的所有亲代果蝇，继续将小瓶置于26 °C，直至子代从蛹中羽化。
        4. 收集10只具有正确表型的1日龄成年果蝇。用二氧化碳麻醉果蝇后，切下果蝇头部，并将头部放入装有干冰的1.5 mL离心管中。将离心管置于-80 ℃保存。 °C. 重复此步骤3次，共3个重复。
      2. 17–20小时龄胚胎样本采集
        1. 从纯合gRNA品系中收集8-10只羽化后未交配的成年雌蝇。从平衡杂合Ubiq-CasRx/CyO品系中收集4-5只成年雄蝇。将收集到的雌蝇和雄蝇（即亲代果蝇）放入含有干酵母粉的小瓶中。
        2. 重复上述步骤3次，共设3个重复。对照组使用Ubiq-dCasRx/CyO品系，其余条件保持不变。
        3. 将含有亲本果蝇的试管置于26 ℃培养 °C孵育48小时。
        4. 每个重复实验准备一个葡萄汁胚胎收集装置，配方如下：376 mL 水、126 mL 葡萄汁、15 g 琼脂和 6 g 蔗糖。将上述成分加入 1 L 烧杯中，高火微波加热 5–6 分钟，期间密切观察烧杯内培养基是否产生气泡或泡沫。若出现气泡或泡沫，立即停止微波，待其消退后再继续加热，重复此过程直至气泡完全消失、液体澄清。切勿在气泡完全消失前搅动。最后加入 10 mL 100% 乙醇和 5 mL 乙酸，充分混匀后，用 25 mL 血清移液管将培养基转移至 35 mm 培养皿中。待培养基在培养皿中凝固后即可使用。
        5. 48小时孵育结束后，将亲代果蝇转移至葡萄汁胚胎收集装置中，并在26℃下继续孵育 °C孵育3小时。随后移除成虫，将新产的胚胎留在葡萄汁培养板上，在26℃继续培养17小时 °C.
        6. 孵育后，从葡萄汁培养基平板上收集50–100个胚胎，通过将其浸入去离子水中清洗胚胎表面，然后转移至预冷的1.5 mL离心管中，置于冰上。于-80℃保存 °C. 重复此步骤3次，共进行3个重复实验。
      3. 一龄幼虫样本采集
        1. 从纯合gRNA品系中收集8-10只羽化后未交配的成年雌蝇，从平衡杂合Ubiq-CasRx/CyO品系中收集4-5只成年雄蝇。将收集的雌蝇和雄蝇（即亲代果蝇）放入添加干酵母粉的培养瓶中。重复此步骤3次，共设置3个重复组。对照组使用Ubiq-dCasRx/CyO品系，其余操作保持相同。
        2. 在26℃下培养含有亲代果蝇的试管 °C下培养48小时。然后将成虫转移至另一含常规培养基的新离心管中，在26℃下过夜孵育（16小时） °C. 然后，移除成蝇。
        3. 将含有胚胎的瓶子置于26 °在 24 小时后，使用基于明显标记的显微镜观察并记录反式杂合的一龄幼虫表型。收集 15–30 只表型正确的幼虫，放入 1.5 mL 离心管中，并于 -80 ℃ 保存 °C. 重复此步骤3次，共进行3个重复。
    2. 测序
      1. RNA提取：使用 commercially available RNA提取试剂盒，并按照试剂盒说明书处理所有样品。随后，将提取的RNA样品与 commercially available 脱氧核糖核酸酶共同孵育，并按照其说明书去除样品中可能存在的污染DNA。
      2. 使用市售的紫外-可见分光光度计测量RNA浓度。使用市售的RNA完整性检测试剂盒检测样品中RNA的完整性。
      3. 使用市售的RNA文库制备试剂盒构建RNA-seq文库。
      4. 使用外部测序服务进行文库测序，测序参数设置如下：单端测序模式；读长：50nt，测序深度：每个文库2000万条读段。使用RTA 1.18.64进行碱基识别，随后通过bcl2fastq 1.8.4将数据转换为FASTQ格式。
        注意：原始测序数据可在中国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）序列读长数据库中获取（提交编号：SUB6818910 [BioProject：PRJNA600654]）。
    3. 生物信息学
      1. 将测序数据的读段比对至伯克利果蝇基因组计划（Berkeley Drosophila Genome Project）发布的黑腹果蝇 Release 6 基因组（GenBank 登录号：GCA_000001215.4）以及外源序列 CasRx 和 GFP 使用 STAR 比对工具的默认参数设置对序列进行比对28 添加“-outFilterType BySJout”过滤选项以及来自ENSEMBL的基因转移格式文件“-sjdbGTFfile Drosophila_melanogaster.BDGP6.22.97.gtf”
      2. 使用“-t exon -g gene_id -M -O --fraction”选项，通过featureCounts35工具确定每个注释转录本的原始转录本计数。然后，使用“addTpmFpkmToFeatureCounts.pl” Perl脚本，基于总转录本计数对原始转录本计数进行标准化。
      3. 在 DESeq2 分析流程中，采用最大后验概率法结合原始收缩估计器来估计每个基因转录本的对数倍数变化（LFC）。

2. 使用三组分 CasRx 系统在体内广泛靶向外源 RNA

  1. 构建外源靶标泛表达载体
    1. 使用引物 1052B.C1 和 1052B.C2 对 Ubiq 启动子片段进行 PCR 扩增，模板为 Addgene 质粒 #11268626然后，使用引物908A.1和908A.2从Addgene质粒#112686中PCR扩增T2A-eGFP片段（表1)26然后，使用 Addgene 质粒 #112686 及引物 908A.3 和 908A.4，通过 PCR 扩增出呈反向序列的 Ubiq 启动子片段（表1)26使用凝胶纯化试剂盒对Ubiq启动子片段、T2A-eGFP片段以及反向的Ubiq启动子片段进行凝胶纯化。
    2. 订购一段定制的萤火虫荧光素酶编码序列，以及一段包含p10 3’非翻译区片段、反向的海肾荧光素酶和SV40 3’非翻译区片段的定制片段。
    3. 用限制性内切酶 AscI 和 XbaI 消化 Addgene 质粒 #11268824使用凝胶纯化试剂盒对产物中的较大片段进行凝胶纯化，所得产物称为基础载体骨架。
    4. 使用Gibson组装法将基础载体与载体骨架以及以下片段进行组装：Ubiq启动子片段、T2A-eGFP片段、反向Ubiq启动子片段、萤火虫荧光素酶编码序列，以及随后连接SV40 3’非翻译区片段的反向海肾荧光素酶片段25.
      注：所得双荧光素酶表达载体（OA-1052B）的 Addgene 编号为 #132426。
  2. 生成gRNA表达载体
    1. 使用引物1043.C1和1043.C23，以Addgene质粒#112688为模板，通过PCR扩增U6:3启动子序列表1)26使用凝胶纯化试剂盒对扩增的U6:3片段进行凝胶纯化。
    2. 用限制性内切酶 AscI 和 XbaI 消化 Addgene 质粒 #11268824使用凝胶纯化试剂盒对产物中的较大片段进行凝胶纯化，该片段称为预基础载体骨架。
    3. 使用 Gibson 组装方法将预基础载体骨架与 U6:3 片段组装成基础载体25基础载体此后命名为 OA-1043。
    4. 使用外部基因合成服务合成目标基因的gRNA片段。
    5. 用限制性内切酶 PstI 和 NotI 消化基础载体 OA-104324保留全部消化产物，该产物称为消化后的 OA-1043。
    6. 使用Gibson组装方法，将经消化的OA-1043载体与靶基因gRNA片段组装成gRNA表达载体25.
      注：所得质粒（OA-1052K）的 Addgene 编号为 #132422。
  3. 转基因果蝇的制备
    1. 将OA-1052B载体注射到含有该载体果蝇的胚胎中 Ø第3号染色体上的C31整合位点，BDSC果蝇品系编号9744，通过外部果蝇胚胎显微注射服务进行注射。同样地，将OA-1052K载体注射到含有该位点的果蝇品系的胚胎中 Ø第3号染色体上的C31整合位点，BDSC果蝇品系编号8622。将注射后的胚胎在26℃下培养 °C.
    2. 将表达双荧光素酶的果蝇和gRNA果蝇保持为纯合品系；通过将第1节中构建的单平衡杂合Ubiq-CasRx品系与携带带有刚毛（Stb）标记的TM6平衡染色体的平衡品系进行杂交，将Ubiq-CasRx品系维持为双平衡杂合品系，并仅保留同时具有白眼、卷翅和dsRed荧光表型的双平衡后代。
      注意：BDSC果蝇品系编号为：#84127（Ubiq-Fluc-Rluc），#84125（gRNA）荧光素酶).
  4. 果蝇遗传学图1B 和 图3A)
    1. 从表达双荧光素酶的品系中收集8-10只新生雌性成虫，从平衡杂合子Ubiq-CasRx/CyO; +/TM6, Stb品系中收集4-5只表现为白眼、卷翅且同时显示dsRed荧光的雄性成虫。将所收集的雌性和雄性成虫（即亲代果蝇）放入含有干酵母粉的试管中（以下简称第一步杂交）。
    2. 重复上述步骤3次，共进行3个重复实验。对于对照组，使用Ubiq-dCasRx/CyO; +/TM6, Stb品系，其余条件保持不变。
    3. 将含有亲代果蝇的第1步杂交小瓶在26 ℃下培养 °C孵育48小时。随后移除每个小瓶中的所有亲代果蝇，并将小瓶继续置于26 °在25°C下至少培养14天。在此期间，从纯合的萤火虫荧光素酶靶向gRNA品系中收集8-10只雌性 virgin。重复此步骤3次，以获得3个重复样本。
    4. 每天观察第一步杂交小瓶，检查是否有新的成蝇出现 出现 从蛹中羽化后，若成虫已羽化，用二氧化碳麻醉，从后代中收集5只同时表达Ubiq-CasRx（或Ubiq-dCasRx）和双荧光素酶报告基因的雄蝇，与10只来自靶向萤火虫荧光素酶gRNA品系的处女雌蝇一同放入新的培养瓶中（以下简称第二步杂交）。重复该步骤3次，共进行3个重复实验。
    5. 从步骤1的杂交瓶中收集另外5只表达Ubiq-CasRx（或Ubiq-dCasRx）和双荧光素酶报告基因的一日龄雄性果蝇，于26 °C下培养2–4天。 °C. 然后将其转移至1.5 mL离心管中，并于-80℃保存 °C. 对三个重复样本重复此步骤3次。
    6. 将含有亲本果蝇的第2步杂交小瓶置于26 ℃培养 °C 培养 48 小时。然后移除每个小瓶中的所有亲代果蝇。随后将小瓶置于 26 °至少 20 天保持在 C 条件下。
    7. 每天观察第二步杂交小瓶，检查是否有新羽化的成虫从蛹中孵出。若有，用二氧化碳麻醉，记录麻醉后果蝇的表型，并使用配备彩色相机的荧光体视显微镜进行成像。统计具有不同表型后代的数量。使用图像处理软件对图像进行后期处理与整合。图3B – 3C).
      注意：根据孟德尔遗传学，如果所有果蝇均可存活，则在步骤2杂交的后代中预期会出现4种类型的果蝇，每种各占群体的25%（图1B 和 图3A).
  5. 荧光素酶检测图3D)
    1. 通过重复步骤 2.4.1-2.4.5 生成三重杂合子果蝇及对照果蝇。收集出生时的雄性果蝇，并饲养至 3 日龄。
    2. 将3日龄的果蝇转移至1.5 mL离心管中，使用研杵及 commercially available luciferase assay kit 中的荧光素酶裂解缓冲液进行裂解。
    3. 使用 5 µ使用市售的荧光素酶检测试剂盒和发光仪，分别测定各样本中 100 μL 裂解组织液的海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶活性。

3. 使用三组分 CasRx 系统进行组织特异性体内 RNA 靶向

  1. 构建UASt-CasRx和UASt-dCasRx表达载体
    1. 使用质粒 pJFRC81 和引物 1041.C9 与 1041.C11 通过 PCR 扩增 UASt 启动子序列；然后使用质粒 OA-1050E（Addgene ID #132416）和引物 1050L.C1 与 1050E.C4 通过 PCR 扩增 CasRx 片段；再使用质粒 OA-1050R（Addgene ID #132417）和引物 1050L.C1 与 1050E.C4 通过 PCR 扩增 dCasRx 片段（表1)26使用凝胶纯化试剂盒对扩增的UASt启动子序列、CasRx和dCasRx片段进行凝胶纯化。
    2. 用限制性内切酶 NotI 和 PacI 消化基础载体（Addgene 质粒 #112686）24在所得产物中，使用凝胶纯化试剂盒对较大片段（称为基础载体骨架）进行凝胶纯化。
    3. 使用Gibson组装法，将UASt-CasRx载体与基础载体骨架、UASt启动子序列及CasRx片段进行组装；随后使用Gibson组装法，将UASt-dCasRx载体与基础载体骨架、UASt启动子序列及dCasRx片段进行组装。25.
      注：UASt-CasRx 载体为 Addgene 质粒 #132418，UASt-dCasRx 载体为 Addgene 质粒 #132419
  2. 转基因果蝇的制备
    1. 使用果蝇胚胎注射服务，将 UASt-CasRx 载体注入果蝇胚胎中，胚胎来源于果蝇 Ø2号染色体上的C31整合位点8621nd 染色体；然后使用果蝇胚胎显微注射服务，将UASt-dCasRx载体注入果蝇胚胎中，胚胎来源于果蝇 ØC31整合位点8621位于其2号染色体上nd 染色体。在26℃下培养注射后的胚胎 °C.
    2. 将果蝇以带有 CyO 和 Sb 标记的双平衡杂合品系形式保种。注：BDSC 中果蝇品系的编号为 84121（UASt-CasRx）和 84120（UASt-dCasRx）。
  3. 果蝇遗传学图1C)
    1. 从BDSC订购所需的GAL4品系；获取步骤3.2.2中相关的gRNA品系（或从BDSC获取）。
      注意：实验中使用了来自 BDSC 的以下 2 种 GAL4 果蝇：GAL4-GMR（BDSC 编号：#29967）、GAL4-y（BDSC 编号：#44373）。同时使用了第一部分中构建的相同 3 株 gRNA 品系：gRNAw （BDSC编号：#84124），gRNAN （BDSC 编号 #84122），gRNAy （BDSC 编号：#84123）
    2. 从gRNA品系中收集5-10只羽化后未交配的成年雌蝇。从双平衡杂合子UASt-CasRx/CyO; +/TM6, Sb品系中收集2-4只具有白眼、卷翅和dsRed荧光表型的成年雄蝇。将所收集的雌蝇和雄蝇（即亲代果蝇）放入一个常规培养基小瓶中（以下简称第一步杂交）。重复此步骤3次，共设置3个重复。对照组使用UASt-dCasRx/CyO; +/TM6, Sb品系，其余操作保持相同。
    3. 在26℃下培养含有亲本果蝇的第1步杂交小瓶 °C孵育48小时。随后移除每个小瓶中的所有亲代果蝇，并将小瓶继续置于26 °在25°C下至少培养14天。在此期间，从GAL4品系中收集5-10只雌性处女蝇。重复此步骤3次，以获得3个重复样本。
    4. 每天观察第1步杂交小瓶，检查是否有新的成蝇出现 出现 从蛹中收集。若满足条件，则用二氧化碳麻醉，从子代中同时具有dsRed荧光和刚毛表型的个体里收集2-4只表达UASt-CasRx（或UASt-dCasRx）和gRNA载体的雄蝇。将步骤1杂交中收集的雄蝇与5-10只从GAL4品系中收集的 virgin 雌蝇（此后称为步骤2杂交）一同放入新试管中。重复此步骤3次，共进行3个重复。
    5. 将含有亲本果蝇的第2步杂交小瓶置于26℃培养 °C下培养48小时。随后移除每个小瓶中的所有亲代果蝇，并将小瓶继续置于26 °在至少20天内保持在C条件下。
    6. 每天观察第2步杂交小瓶，检查是否有新的成年果蝇出现 出现 从蛹中孵化。若如此，用二氧化碳麻醉果蝇，在配备荧光体视显微镜的彩色相机下观察并记录麻醉后果蝇的表型，对其进行成像。统计具有不同表型后代的数量。使用图像处理软件进行图像的后期处理与整合。图4).
      注意：根据孟德尔遗传学，若所有果蝇均可存活，则在步骤2杂交的后代中预期会出现4种类型的果蝇，每种各占群体的25%（图1C).

结果

使用双组分 CasRx 系统实现体内广泛存在的 RNA 靶向
F1 同时表达Ubiq-CasRx和靶向内源及外源基因的gRNA构建体的反式杂合果蝇，相较于表达Ubiq-dCasRx和gRNA构建体的对照果蝇，表现出显著的表型差异。图2 和 图4）。具体而言，与转座杂合子 dCasRx 果蝇相比，转座杂合子 CasRx 果蝇的存活率显著降低，表明 Ubiq-CasRx 系统具有毒性（图2A 和 图 4A）。值得注意的是，两种反式杂合的 CasRx 和 dCasRx 果蝇的遗传率均低于 50%，而根据孟德尔遗传学，预期比例应为 50%。在三个靶基因中，Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ 果蝇与 Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAy/+ 果蝇无法存活（遗传率为 0%），且无法发育超过二龄幼虫阶段（图2A-2B存活的 Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAw/+ 果蝇的遗传率为12.9%，表现出明显的完全外显的白眼表型（图2B）。除了与 CasRx 相关的可观察性状外，我们还能够证实 3 个靶基因的靶标基因转录本水平均显著降低： Notch, 黄色，以及 GFP (图2E-2G）。还原 白色 在 Ubiq-CasRx/+, U6-gRNA 中观察到基因转录本w/+ 果蝇与对照 Ubiq-dCasRx/+、U6-gRNA 相比w/+ 果蝇中，尽管这种减少未达到统计学显著性（图2E - 2F）。通过比较表达 CasRx 的果蝇样本与表达 dCasRx 的果蝇样本之间的差异表达转录本，发现了 CasRx 引发脱靶效应的证据（图 2E，2G）。显著差异表达的非靶标转录本数量如下： 白色，253（占转录本总数的1.4%）； Notch, 300 (1.7%); 黄色, 41 (0.23%); GFP, 5,880 (33%) (图2G). 在总共17,779种不同的转录本中，有6种非靶向转录本在全部4组样本中均表现出显著差异表达。其中鉴定出的6种转录本之一为Gadd45，该基因在果蝇中参与细胞凋亡和细胞周期阻滞，提示CasRx的酶活性可能直接引发细胞凋亡，或间接导致其他基因的异常表达，从而诱发凋亡。此外值得注意的是，Ubiq-CasRx和Ubiq-dCasRx果蝇无法建立纯合品系，推测是由于广泛性高表达带来的毒性所致。因此，实验中采用杂合子Ubiq-CasRx/CyO和Ubiq-dCasRx/CyO果蝇与纯合gRNA果蝇品系进行杂交。综上所述，双组分Ubiq-CasRx系统能够实现对内源性和外源性靶标RNA的广泛靶向，导致可观察的表型变化及转录本水平下降。这些结果还表明，CasRx介导的RNA靶向可能在体内引发毒性效应。

利用三组分 CasRx 系统实现体内广泛存在的外源 RNA 靶向
两步杂交实验的结果表明，尽管靶基因为外源性（即 Fluc），在 F2 代三重杂合子（Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc）中同时表达三种转基因时导致 100% 致死率，而对照杂交中使用 Ubiq-dCasRx 时，F2 代三重杂合子（Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc）未观察到致死现象（图 3B-C）。更具体而言，仅当三种转基因同时存在（Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc）时才出现 100% 致死率（图 3B 和 D），而基因型为（Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/TM6）和（Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6）的个体均可存活，且无明显表型，其遗传比例符合预期的孟德尔遗传规律，表明只有当靶序列（即 萤火虫荧光素酶）与 Ubiq-CasRx/+ 及 gRNAFluc 共同存在时才会引发观察到的致死表型，这可能源于 Cas13 酶的附带活性2,8。此外，与 Ubiq-dCasRx 对照组（Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ 或 Ubiq-dCasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+）相比，F1 代杂合子（Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/+ 或 Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+）未表现出可区分的表型或遗传比例的显著变化（图 3B），说明催化活性酶的存在是产生致死表型所必需的。此外，所有可存活基因型果蝇中的 Fluc 和 Rluc 表达水平显示，与双荧光素酶报告基因对照相比，Ubiq-dCasRx 三重杂合子（Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc）中 Fluc 表达未显著降低，表明 dCasRx 靶向并未减少 Fluc 蛋白的表达水平（图 3D）。综上所述，在两种不同的 CasRx 介导的广泛 RNA 靶向实验中均观察到一致的致死表型，表明当 CasRx 介导的 RNA 靶向在组织中广泛表达时，可能对生物体具有毒性。

利用三组分 CasRx 系统实现组织特异性体内 RNA 靶向 组织特异性, 体内, RNA 靶向, CasRx, 三组分系统, 基因调控, RNA 编辑, 递送系统, 动物模型, 分子治疗
在广泛性RNA靶向实验中观察到的高水平毒性促使我们探索使用方法部分详述的三组分CasRx系统设计进行组织特异性RNA靶向。事实上，与使用Ubiq启动子相比，当采用UASt启动子降低整体CasRx表达水平时，所观察到的毒性水平有所降低，这一点体现在以下三个方面：1）UASt-CasRx和UASt-dCasRx品系可维持为纯合品系，尽管根据两步杂交方案，实际杂交实验中使用的是双平衡的UASt-CasRx和UASt-dCasRx品系；2）所有F2 dCasRx 三重杂合子的遗传率在子代中符合预期的25%孟德尔遗传率，且3）F2 CasRx 三重杂合致死表型在子代中有所减弱。在 白色 靶向实验中，预期在F代出现25%的孟德尔遗传率2 三重杂合子，仅有0.57%的成年果蝇存活（UASt-CasRx/+; gRNAw/GMR-Gal4）中均观察到严重的眼部特异性色素沉着和形态学表型（图4A 和 4B）。对于 白色靶向杂交，表达CasRx的三重杂合F2 遗传率显著低于表达dCasRx的三重杂合对照组（27.6%）图 4A）。在 Notch 靶向实验中，携带全部三种转基因的表达CasRx的三重杂合子完全致死，而dCasRx对照的遗传率为29.3%（图4A）。在 黄色 靶向实验，F2 三重杂合CasRx表达、gRNAy，以及 y-GAL4 显示几丁质色素轻微减少，表现为胸部和腹部出现小块黄色表皮，遗传率为 2.67%，远低于 dCasRx 对照组（25.2%）图4A所有dCasRx对照三重杂合子果蝇均未表现出与CasRx表达果蝇类似的明显表型，表明CasRx的催化活性是导致所观察表型的原因。CasRx三重杂合子组中较低的遗传率提示CasRx介导的RNA靶向存在两种毒性来源：其一是与CasRx高表达相关，通过限制性表达CasRx可降低其毒性；其二是与旁切活性相关。综上所述，这些结果表明CasRx系统可借助经典的Gal4/UASt系统实现组织特异性的体内RNA靶向，同时降低毒性。然而，与组成型表达策略相比，尽管毒性及偶发致死表型的严重程度有所降低，但仍可观察到一定程度的毒性，表明旁切切割活性与毒性相关。

figure-results-1
图1使用Cas13D系统进行RNA靶向的总体概述 （A）利用双组分 CasRx 系统在体内广泛性 RNA 靶向中进行一步遗传杂交的示意图。（B）在广泛性 体内利用三组分CasRx系统进行外源RNA靶向。(C) 利用三组分CasRx系统在组织特异性体内RNA靶向中进行两步遗传杂交的示意图。 请点击此处以查看此图的放大版本。

figure-results-2
图2：使用双组分 CasRx 系统实现广泛存在的体内 RNA 靶向（重印自5）。 （A）携带 Ubiq-CasRx（或 Ubiq-dCasRx）和 gRNA 的反式杂合果蝇的总遗传百分比。箱形图中的蓝色阴影表示表型外显率。（B）反式杂合果蝇的表型。箭头指示眼部组织坏死。标有“X”的黑白果蝇代表致死性。（C）Ubiq-CasRx（或 Ubiq-dCasRx）与 gRNAGFP-OpIE2-GFP 果蝇之间双向杂交的反式杂合子代的总遗传百分比。M，CasRx 的母系遗传；P，CasRx 的父系遗传。（D）父系杂交产生的 F1 代幼虫子代。（E）转录本的后验最大估计值，表示对数倍数变化。使用了 DESeq2 分析流程。（F）被 CasRx 或 dCasRx 靶向的每百万转录本数（TPM）。（G）CasRx 依赖性差异表达转录本占所有转录本的百分比。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3
图3：利用三组分 CasRx 系统实现普遍性体内外源 RNA 靶向。 （A）两步遗传杂交示意图。（B）F2 代中出现的所有基因型的总遗传比例。F2 后代中同时遗传三个转基因（Ubiq-CasRx、Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc 和 gRNAFLuc）导致 100% 致死率，显著低于 Ubiq-dCasRx 三重反式杂合子对照组（p = 0.001，t 检验）。（C）单独携带 Ubiq-CasRx/gRNAFluc 或仅携带 Ubiq-CasRx 与 Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc 均未引起严重致死效应，且 Ubiq-CasRx 与 Ubiq-dCasRx 反式杂合子之间的遗传比例无显著差异（p = 0.41 和 p = 0.51，分别为 t 检验）。（D）将 Fluc 读数归一化为 Rluc 读数后的荧光素酶比值。表达 Ubiq-CasRx、Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc 和 gRNAFLuc 的三重反式杂合果蝇表现为胚胎致死，以带“X”的果蝇表示，因此未检测荧光素酶表达。Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6, Stb 反式杂合子的 Fluc/Rluc 比值显著低于其他表达 Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc 的组别（p = 1.2e-06 或更低，t 检验）。仅表达 gRNAFLuc 组的结果显著低于所有其他组别（p = 1.2e-06 或更低，t 检验）。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-4
图4：利用三组分 CasRx 系统实现组织特异性体内 RNA 靶向（重印自5）。 （A）携带三个转基因（UASt-CasRx 或 UASt-dCasRx、gRNA 和 Gal4 驱动子）的三重杂合子果蝇的总遗传比例。（B）三重杂合子果蝇的表型。白色箭头指示胸部几丁质色素减少。用“X”标记的黑白果蝇代表致死性。请点击此处查看该图的放大版本。

构建体描述引物引物序列（5’ 至 3’）PCR 模板
OA-1050ECasRx1050E.C3TACTAATTTTCCAC
ATCTCTATTTTGAC
CCGCAGATTAATTA
ATGAGCCCCAAGA
AGAA		pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx)
1050E.C4CAATTGATTTGTTA
TTTTAAAAACGATT
CATTCTAGCTAGCT
TAAGCGTAATCTGG
AACA
OA-1050RdCasRx1050E.C3TACTAATTTTCCAC
ATCTCTATTTTGAC
CCGCAGATTAATTA
ATGAGCCCCAAGA
AGAA		pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)
1050E.C4CAATTGATTTGTTA
TTTTAAAAACGATT
CATTCTAGCTAGCT
TAAGCGTAATCTG
GAACA
OA-1050LUASt 启动子1041.C9GCGGGTTCTCGA
CGGTCACGGCGG
GCATGTCGACGC
GGCCGCAACCAA
CAACACTAGTAG		pJFRC81
1041.C11CTGGCCTCCACC
TTTCTCTTCTTCT
TGGGGCTCATGT
TTAAACCCAATT
CCCTATTCAGA
CasRx1050L.C1AATACAAGAAGA
GAACTCTGAATA
GGGAATTGGGT
TTAAACATGAGC
CCCAAGAAGAA		pCasRx
1050E.C4CAATTGATTTGT
TATTTTAAAAAC
GATTCATTCTA
GCTAGCTTAAG
CGTAATCTGGA
ACA
OA-1050SUASt 启动子1041.C9GCGGGTTCTC
GACGGTCACG
GCGGGCATGT
CGACGCGGCC
GCAACCAACAA
CACTAGTAG		pJFRC81
1041.C11CTGGCCTCCA
CCTTTCTCTTC
TTCTTGGGGCT
CATGTTTAAAC
CCAATTCCCTA
TTCAGA
dCasRx1050L.C1AATACAAGAAG
AGAACTCTGAAT
AGGGAATTGGG
TTTAAACATGAG
CCCCAAGAAGAA		pdCasRx
1050E.C4CAATTGATTTGT
TATTTTAAAAAC
GATTCATTCTAG
CTAGCTTAAGCG
TAATCTGGAACA
OA-1043U6:3 启动子1043.C1GGGAATTGGGA
ATTGGGCAATAT
TTAAATGGCGGC
GCGCCGAATTCT
TTTTTGCTCACCT		Addgene 质粒 #164586
1043.C23ACACTAGTGGAT
CTCTAGAGGTAC
CGTTGCGGCCG
CAAAAAAGTTGT
AATAGCCCCTCA
AAACTGGACCTT
CCACAACTGCAG
CCGACGTTAAAT
TGAAA
OA-1052BUbiq 启动子1052B.C1GGGAATTGGGCA
ATATTTAAATGGC
GGCTGCAGCGC
GCAGATCGCCGAT		Addgene 质粒 #112686
1052B.C2TTTCTTTATGTTT
TTGGCGTCTTCC
ATCCTAGGTCTG
CGGGTCAAAATA
GAGATG
T2A-eGFP908A1ATAAAGGCCAAG
AAGGGCGGAAA
GATCGCCGTGG
AGGGCAGAGGA
AGTCTTCTAACAT
GC		Addgene 质粒 #112686
908A2TTGTTATTTTAAAA
ACGATTCATTCTA
GGCGATCGCTTA
CTTGTACAGCTC
GTCCATGCC
反向 Ubiq 启动子908A3ACCGTGACCTAC
ATCGTCGACACTA
GTGGATCTCTAGA
CGCGCAGATCGC
CGATG		Addgene 质粒 #112686
908A4GGATCATAAACTT
TCGAAGTCATGC
GGCCGCTCTGCG
GGTCAAAATAGAG
ATGT

表1：本研究中使用的分子构建体和引物列表。 该列表包含所有构建体（包括编号和描述）以及每个构建体所用的相应引物（包括编号和序列（5' 至 3'））和模板。

讨论

通过 CasRx 系统的三种不同应用设计，本研究在果蝇中实现了 体内可编程的 RNA 靶向。不同的策略可满足不同的项目需求，例如内源性与外源性基因靶向，以及普遍性与组织特异性 RNA 靶向。RNA 靶向的效果包括靶基因特异性的表型变化、靶 RNA 转录本的减少，以及与 CasRx 蛋白高表达和旁切活性相关的偶发致死表型。总体而言，这些结果表明 CasRx 系统能够在生物体水平上以可编程且高效的方式实现靶 RNA 转录本的降低。

成功定制CasRx系统的关键因素之一是gRNA的设计。具体建议如下：靶序列长度约为30个核苷酸，靶序列中poly-U序列的长度不超过4个碱基对，靶序列的GC含量在30%至70%之间，靶序列不应被预测形成稳定的RNA发夹结构，且靶序列应具有最少的预测RNA二级或三级结构5。

除了gRNA设计之外，每个实验方案中的果蝇遗传学步骤也是成功实施的关键。子代中是否出现由亲本遗传而来的特定表型，对于鉴定和量化CasRx系统在反式杂合子代中诱导的表型具有重要意义。同时，平行设置使用dCasRx果蝇的对照杂交实验，也有助于排除反式杂合子代中的非特异性表型。

值得注意的是，这些结果揭示了在果蝇中普遍表达 CasRx 和 dCasRx 蛋白所引发的毒性问题，这是 CasRx 系统的一个局限性。仅在 Ubiq 启动子驱动下普遍表达 CasRx 或 dCasRx 蛋白（不包含 gRNA）即带来显著的适合度代价，因为无法建立 Ubiq-CasRx 或 Ubiq-dCasRx 的纯合品系。相反，UASt-CasRx 和 UASt-dCasRx 果蝇可以培育为健康的纯合品系，尽管由于杂交方案的设计，它们被维持为双平衡品系，这一事实进一步支持了普遍性 CasRx 蛋白表达可诱导毒性的结论。另一项支持性证据来自涉及催化失活 dCasRx 的对照实验：在 F1 代果蝇中，同时携带 dCasRx 和 gRNA 构建体的果蝇比例始终低于 50%，而根据孟德尔遗传规律，若无 dCasRx 相关毒性，该比例应为 50%。这表明普遍表达 dCasRx 蛋白并伴随 gRNA 表达会在果蝇中引发毒性，导致遗传比例低于预期。对于转基因杂合的 UASt-dCasRx、gRNA、GAL4 果蝇，其遗传比例符合孟德尔遗传规律，再次提示毒性特异性地由 CasRx 和 dCasRx 蛋白的普遍表达所引起。CRISPR/Cas 系统中的毒性问题并非首次发现。已有研究表明，高水平的 Cas9 蛋白在包括果蝇在内的多种生物中具有毒性29,30,31,32。最近一项研究开发了一种定制的 GAL4/UAS 系统，可通过在 UAS-Cas9 构建体中 UAS 序列与 Cas9 序列之间插入不同长度的开放阅读框来调节果蝇中 Cas9 蛋白的表达量33。因此，探索通过调节 CasRx 蛋白表达水平以降低 CasRx 诱导毒性的策略具有重要意义。

除了CasRx和dCasRx蛋白普遍表达所引起的毒性外，实验结果还显示CasRx系统存在与非特异性附带脱靶效应相关的致死性，这是多种CRISPR系统的一个特征1, 2, 7, 34。在部分表达CasRx和非必需基因gRNA的双杂合或三杂合果蝇中，例如靶向Notch基因时，CasRx双杂合果蝇的存活率显著低于dCasRx双杂合果蝇。在对这些表达CasRx和gRNA的双杂合果蝇进行RNA-seq分析时，不仅观察到靶基因转录本水平的降低，也观察到非靶基因转录本的减少。这些附带效应依赖于CasRx和靶标的表达，仅在同时表达CasRx蛋白和gRNA的双杂合果蝇中出现。值得注意的是，当CasRx靶向white基因时，其转录本仅表现出有限的、无统计学显著性的下降，这与明显的色素减少表型形成对比。推测这可能是因为：1）RNA-seq样本采集时间与white基因在早期发育阶段表达高峰的时间不匹配；2）white基因在眼部的局部表达使得在仅能采集全身体组织的早期发育阶段难以获取相关组织。为降低CasRx系统的附带活性，未来研究需在个体水平上深入阐明脱靶现象的潜在机制。

有趣的是，最近一项研究35在果蝇中描述了靶向RNA的Cas13工具，似乎减轻了与CasRx表达相关的普遍毒性，可能出于以下几个原因。首先，作者对Cas13转基因进行了密码子优化，以提高其在Drosophila中的表达效率，并使用了表达强度较弱的启动子（actin 5C），相比之下，本研究使用的是泛素启动子，这可能导致Cas13表达水平较低，从而减少毒性。事实上，这一推测得到了支持：由UASt驱动的CasRx和dCasRx表达本身并不具有毒性，因为本研究以及文献35中的作者均未在UASt-CasRx果蝇中观察到明显的致死效应。此外，这些作者设计gRNA的方式与本研究不同，这可能影响了gRNA的表达并降低了在Cas13/gRNA反式杂合果蝇中系统的毒性。例如，在他们的研究中，两个gRNA由U6:3启动子驱动表达，并被tRNA序列包围，使得gRNA可在tRNA成熟过程中被加工，而无需依赖CasRx35。相反，本研究中gRNA被设计为阵列形式，每个基因最多靶向4个位点，模拟细菌中天然存在的Cas13阵列结构，这种结构需要Cas13酶本身对每个gRNA进行加工。这些不同的策略可能导致gRNA表达水平及其他因素的差异，进而对整个系统的毒性产生内在影响。最后，Huynh等人所靶向的基因与本研究不同，导致靶标与Cas/gRNA之间的相互作用及旁切活性存在差异，可能影响所观察到的致死水平。这些在毒性表现上的差异值得进一步研究，以探索整体系统优化的途径。

总体而言，本研究首次在D. melanogaster中实现了功能性的、可遗传编码且可编程的靶向RNA的Cas系统。然而，为进一步降低脱靶相关的致死性并提高CasRx在靶位点的切割效率，仍需对该系统进行进一步优化（与已有报道35中所述一致）。利用Cas酶靶向RNA是一个快速发展的研究领域，具有广泛的应用前景，从昆虫媒介控制到治疗用途均有涉及1,2,3,4,5,6,7。本实验方案为任何希望在果蝇中设计首个CasRx系统的研究者提供了一个入门工具包，同时支持系统的个性化定制和进一步优化。本文展示的实例反映了在体内应用该系统时可能遇到的一系列结果，可为其他研究者评估CasRx系统在其特定应用中的表现提供参考基准。

披露

O.S.A 是 Agragene 公司的创始人，持有该公司股权，并担任公司的科学咨询委员会成员。该安排的条款已由加州大学圣地亚哥分校根据其利益冲突政策进行审查并批准。其他所有作者声明不存在竞争利益。

致谢

本工作部分得到了 DARPA Safe Genes 项目资助（HR0011-17-2-0047）以及授予 O.S.A. 的 NIH 奖项（R21RAI149161A，DP2AI152071）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100% 葡萄汁Welch Foods Inc.N/A
活性干酵母（908g）Red Star Yeast Company, LLCN/A
DMC4500 彩色相机Leica MicrosystemsDMC4500
双荧光素酶报告基因检测系统PromegaE1910
GAL4-GMR 果蝇Bloomington Drosophila Stock Center29967
GAL4-y 果蝇Bloomington Drosophila Stock Center44373
Glomax 20/20 发光仪PromegaE5331
Illumina HiSeq2500 测序仪Illumina, Inc.HiSeq2500
M165FC 荧光体视显微镜Leica MicrosystemsM165FC
Nanodrop OneC 紫外-可见分光光度计ThermoFisherNDONEC-W
NEBNext Ultra II RNA 文库构建试剂盒New England Biolabs, Inc.E7770
质粒 # 112686Addgene112686
质粒 # 112688Addgene112688
质粒 # 132416Addgene132416
质粒 # 132417Addgene132417
质粒 # 132419Addgene132419
质粒 # 132420Addgene132420
质粒 # 132421Addgene132421
质粒 # 132422Addgene132422
质粒 # 132425Addgene132425
质粒 # 132426Addgene132426
质粒 # 133304Addgene133304
质粒 # 164586Addgene164586
质粒 #132418Addgene132418
质粒 pJFRC81Addgene36432
Qiagen RNeasy Mini 试剂盒Qiagen74104
限制性内切酶 AscINew England Biolabs Inc.R0558L
限制性内切酶 NotINew England Biolabs Inc.R0189L
限制性内切酶 PacINew England Biolabs Inc.R0547L
限制性内切酶 PstINew England Biolabs Inc.R0140L
限制性内切酶 SwaINew England Biolabs Inc.R0604L
限制性内切酶 XbaINew England Biolabs Inc.R0145L
Bioanalyzer 用 RNA 6000 Pico 试剂盒Agilent Technologies5067-1513
Turbo DNaseInvitrogenAM2238
U6-3:4-gRNA-Fluc 果蝇Bloomington Drosophila Stock Center84125
U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP 果蝇Bloomington Drosophila Stock Center84986
U6-3:4-gRNA-N 果蝇Bloomington Drosophila Stock Center84122
U6-3:4-gRNA-w 果蝇Bloomington Drosophila Stock Center84124
U6-3:4-gRNA-y 果蝇Bloomington Drosophila Stock Center84123
UASt-CasRx 果蝇Bloomington Drosophila Stock Center84121
UASt-dCasRx 果蝇Bloomington Drosophila Stock Center84120
Ubiq-CasRx 果蝇Bloomington Drosophila Stock Center84118
Ubiq-dCasRx 果蝇Bloomington Drosophila Stock Center84119
Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla 果蝇Bloomington Drosophila Stock Center84127
Zymoclean 凝胶 DNA 回收试剂盒Zymo Research CorporationD4007

参考文献

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RNA Cas13
普遍性与组织特异性RNA靶向 黑腹果蝇 使用 CRISPR/CasRx
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